CN105929146A - 一种新颖的免疫细胞示踪方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。本申请还提供了用于免疫细胞示踪方法的试剂盒。本申请的方法及试剂盒不引进新的基因、不添加底物，操作简便，快捷，可为生命科学领域特别是免疫学研究领域深入了解免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的机制以及肿瘤的过继性免疫细胞治疗的基础科研工作和临床应用提供技术支持，将进一步促进肿瘤临床治疗技术的发展。

Description

一种新颖的免疫细胞示踪方法
技术领域
本申请属于免疫医学研究领域，涉及一种检测免疫细胞的方法和试剂盒，具体涉及一种示踪法检测免疫细胞的方法和试剂盒。
背景技术
随着环境污染对人们生存空间和食品安全的影响，以及社会发展导致人们生活方式的改变，心血管疾病、癌症、糖尿病和慢性肺部疾病等非传染性疾病引起的死亡率不断上升，据统计在2012年导致全球死亡总数的68％，比2000年的60％有所上升。其中，特别是全球癌症病例将迅猛增长，因此抗肿瘤药物和疗法市场极其巨大。
传统的癌症治疗方法化疗、放疗、手术治疗后因其强烈的副作用和免疫排斥反应，治疗效果并不尽人意。免疫细胞过继疗法出现后，正方兴未艾，因其来源于患者自体细胞，可在一定程度上避免发生强烈免疫排斥反应，因此成为未来癌症在治疗的新技术发展方向。
肿瘤过继性细胞免疫治疗属于生物治疗方法中的一种，它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞，先进行扩增和功能的鉴定，最后再输送到患者体内，以杀伤患者体内肿瘤细胞。过继免疫细胞在体内发挥作用受许多因素的影响，其中一个重要因素就是免疫效应细胞能否到达靶器官，实现与肿瘤细胞的直接接触，从而有效杀伤肿瘤细胞，因此在过继免疫细胞疗法的临床前研究中，用快速、方便、低成本的监测方法了解免疫活性细胞的分布、迁徙和存活时间成为限制过继免疫细胞疗法的临床前研究以及癌症治疗新技术的关键和重要技术。
当前观察免疫活性细胞的分布、迁徙和存活时间的方法包括组织病理学技术、核素成像技术、磁共振成像技术、光学成像技术。其中，组织病理学技术须在不同的时间点将组织从活体中取出或者处死实验动物进行标记从而了解细胞在体内的情况，具有不能实时动态观察同一移植细胞在体内的分布和迁移的缺陷；核素成像技术即应用相机、单光子发射计算机断层显像(SPECT)和正电子发射断层显像(PET)等技术，所需PET和SPECT都是观察体内细胞分布方面高灵敏度和高分辨率的仪器，仪器昂贵并且需采取专门措施防护辐射污染。磁共振成像技术即利用人体组织中某种原子核的核磁共振现象，将所得射频信号经过电子计算机处理，重建出人体某一层面的图像的诊断技术，仪器也较昂贵，且需要造影剂，造影剂存在一定毒性。
最近，运用生物发光剂和内源性荧光报告基因或者是外源性探针检测分子和生化进程的光学成像技术因其无放射性污染并且不许昂贵仪器优势，成为观察免疫活性细胞的分布、迁徙和存活时间的新发展方向。但是采用检测内源性报告基因示踪免疫细胞的方法由于需要将外源性基因转导到细胞内，可能存在一些不可预知的影响。常规生物发光剂(如荧光素酶)需要额外的向体内注射发光底物，且单次注射后持续发光时间短，并且特异性差，检测信号中包含多种非靶标细胞，影响对目标细胞种类及含量的正确评估。
因此，在过继免疫细胞治疗研究领域，仍然亟待一种新的，简便高效，特异性强，可区分不同免疫细胞种类及同种免疫细胞不同亚群的分布、迁徙和存活时间的免疫细胞示踪方法。
发明内容
本申请的目的是提供一种无创，简便高效，特异性强的免疫细胞示踪方法，用于免疫细胞示踪的试剂盒和偶联荧光染料的抗体在制备用于免疫细胞示踪的试剂盒中的用途。
本申请根据抗原抗体特异性结合反应以及抗体结合的荧光物质的激发光和发射光靠近偏红外，可穿过组织和皮肤而被检测到的原理，采用偶联荧光染料的特异性荧光抗体标记免疫细胞，将荧光抗体标记的免疫细胞注射到实验小动物体内，用小动物活体成像仪检测注射部位荧光信号强弱情况，确定免疫细胞的分布情况和数量。
本申请提供了一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、免疫调节细胞、造血母细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括CD3+、CD4+；所述B细胞包括CD19+；所述NK细胞包括CD3-/CD(16+56)+；所述免疫调节细胞包括CD4+/CD29+；所述造血母细胞包括CD33+和CD34+。在一些实施方案中，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞为CD3+。在一些实施方案中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料选自共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白和其他探针。在一些实施方案中，所述共轭结合探针包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red；所述Alexa Fluor系列荧光染料包括Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647；所述Cy系列荧光染料包括Cy3.5；所述细胞功能探针包括SNARF、Fluo-3；所述荧光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。在一些实施方案中，所述荧光抗体为别藻蓝蛋白-抗CD3抗体(APC anti-human CD3)。在一些实施方案中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为0.2～7.8μL，所述免疫细胞的用量为1～15×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为5mins～60mins，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～200s。在一些实施方案中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为1～6μL，所述免疫细胞的用量为3～7×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins～40mins，所述结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～80s。在一些实施方案中，所述步骤(3)中，将荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内遵守如下操作要求：A、所述小动物包括裸鼠，兔子，狗、猫，绵羊；B、荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内的部位选自腹部皮内注射，背部皮内注射，体内经尾静脉注射中的一种；C、接受所述荧光抗体标记的免疫细胞注射的小动物年龄为整个存活周期，优选存活中期；D、所述注射深度为皮下0～1cm组织。
在本申请的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，免疫细胞为CD3+T细胞。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一些具体实施例中，荧光抗体是APC anti-human CD3。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为0.2μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为1μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为3μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为4.6μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为5.4μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为6.6μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，APC anti-human CD3的用量为7.8μL。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，T细胞的用量为3×106个细胞。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，T细胞的用量为5×106个细胞。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，T细胞的用量为7×106个细胞。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，T细胞的用量为9×106个细胞。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为30mins。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为60mins。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为1s。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为50s。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为200s。
本申请的新颖的免疫细胞活体示踪方法的一实施方式中，小动物为裸鼠。
本申请的新颖的免疫细胞活体示踪方法的一个具体实施例中荧光抗体标记的免疫细胞从腹部皮内注射入小动物体内。
本申请的新颖的免疫细胞活体示踪方法的一个具体实施例中荧光抗体标记的免疫细胞从背部皮内注射入小动物体内。
本申请的新颖的免疫细胞示踪方法的一个具体实施例中荧光抗体标记的免疫细胞经尾静脉注射入小动物体内。
本申请的新颖的免疫细胞活体示踪方法的一具体实施例中，免疫细胞注射深度为皮下0.5cm。
本申请的一个具体实施例中，所述小动物是裸鼠。
本申请还提供了一种用于免疫细胞示踪的试剂盒，包括偶联荧光染料的抗体和缓冲液，其中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料包括共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白，所述缓冲液为磷酸缓冲液(PBS)。
本申请还提供了偶联荧光染料的抗体在制备用于免疫细胞示踪的试剂盒中的用途，当使用所述试剂盒时，包括以下步骤：(1)提供免疫细胞；(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、免疫调节细胞、造血母细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括CD3+、CD4+；所述B细胞包括CD19+；所述NK细胞包括CD3-/CD(16+56)+；所述免疫调节细胞包括CD4+/CD29+；所述造血母细胞包括CD33+和CD34+。在一些实施方案中，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞为CD3+。在一些实施方案中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料选自共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白和其他探针。在一些实施方案中，所述共轭结合探针包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red；所述Alexa Fluor系列荧光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647；所述Cy系列荧光染料包括Cy3.5；所述细胞功能探针包括SNARF、Fluo-3；所述荧光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。在一些实施方案中，所述荧光抗体为别藻蓝蛋白-抗CD3抗体(APC anti-human CD3)。在一些实施方案中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为0.2～7.8μL，所述免疫细胞的用量为1～15×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为5mins～60mins，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～200s。在一些实施方案中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为1～6μL，所述免疫细胞的用量为3～7×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins～40mins，所述结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～80s。在一些实施方案中，所述步骤(3)中，所述步骤(3)中，荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内的方式包括但不限于腹部皮内注射，背部皮内注射，体内经尾静脉注射。
以上本申请的免疫细胞示踪方法，用于免疫细胞示踪的试剂盒和偶联荧光染料的抗体在制备用于免疫细胞示踪的试剂盒中的应用才用到的免疫细胞注射操作，为免疫研究实验领域普通的熟练技术人员按照有关实验手册和实验室制定的操作规程如国家实验动物规范中心发布的《实验动物常规手册》(http://www.dxy.cn/bbs/topic/5936828)、《动物免疫技术操作规程》或操作注意事项都能容易掌握的一种常规操作技术。注射免疫细胞到小动物体内的操作不存在个体差异，能重复再现，是能够产业化的。
本申请的有益效果是，本申请的基于荧光抗体的新颖免疫细胞示踪方法及试剂盒能实现特异性强，快速、准确对特定种类免疫细胞及其细分亚群和免疫细胞内的细胞器和特定分子在不同发育时期，各种实验动物中的分布、迁徙和存活时间、含量进行实时动态的观察，并且不引进新的基因、不添加底物，可为生命科学领域特别是免疫学研究领域深入了解免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的机制以及肿瘤的过继性免疫细胞治疗的基础科研工作和临床应用提供技术支持，将进一步促进肿瘤临床治疗技术的发展。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1.T细胞经APC anti-human CD3标记后流式细胞仪检测结果；
A.流式细胞仪检测经APC anti-human CD3标记的T细胞的散点图
(横坐标：前向角散射，纵坐标：侧向角散射)
B.P1门样品(多通道)检测直方图
(横坐标：别藻蓝蛋白A浓度，纵坐标：T细胞和别藻蓝蛋白A标记的T细胞计数)
图2.不同体积APC anti-human CD3标记3×106个细胞后检测到的光子数。横坐标为APC Anti-human CD3体积(μL)，纵坐标为荧光强度(光子/s)；
图3.以测得的APC anti-human CD3标记T细胞的最适比例，即5μL/3×106个细胞标记小动物后检测荧光强度(光子/s)和细胞数的关系。横坐标为细胞个数，纵坐标为荧光强度，数据见表2；
图4.96孔板检测不同浓度的APC anti-human CD3标记T细胞产生荧光，其中孔A1、3、5细胞数为9×106，孔A7、9、11细胞数为7×106，孔C1、3、5细胞数为5×106，孔C7、9、11细胞数为3×106，孔E1、3、5细胞数为1×106，孔E7、9、11细胞数为9×105，孔G1、3、5细胞数为7×105，孔G7、9、11细胞数为5×105。孔F12为阴性对照，细胞数为1×107；
图5.以APC anti-human CD3标记T细胞的最适比例，即5μL/3×106个细胞标记5×105个细胞后检测荧光强度(光子/s)随时间的变化。横坐标为时间(min)，纵坐标为荧光强度(光子/s)，数据见表3；
图6.为APC标记杀伤性T细胞体外检测和经腹部皮内注射体内检测(左侧为对照鼠，右侧为实验鼠)：A为APC标记杀伤性T细胞体外检测；B为A中APC标记杀伤性T细胞经皮内注射后体内检测；C将B图中小鼠翻转时候荧光检测；D为B中小鼠次日荧光检测图；E为在体外(in vitro)和体内第1天(in vivo1)和第2天(in vivo2)光子/s随细胞数的变化关系坐标图，其中纵坐标为荧光强度，横坐标为细胞数。
图7.APC标记杀伤性T细胞体外检测和经背部皮内注射体内检测：A为APC标记杀伤性T细胞体外检测；B为A中APC标记杀伤性T细胞经皮内注射裸鼠背部后体内检测；C为B中小鼠次日荧光检测图；D为在体外(A)和体内(B)光子/s随细胞数的变化关系；
图8.在体外(in vitro)和在体内检测APC标记杀伤性T细胞体：左侧为对照鼠，右侧为实验鼠。图A、B、C：A为尾静脉注射前；B为尾静脉注射后立即检测；图C为尾静脉注射后1h检测。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本申请的范围仅由所附权利要求界定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。
下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实验仪器：
试剂：
APC anti-human CD3 Biolegend Catalog：300312
无荧光鼠粮 北京科澳协力饲料有限公司
怡美宁(异氟烷) 山东科沥制药有限公司
实验动物：
裸鼠 斯贝福(北京)实验动物科技有限公司
实施例1流式细胞仪检测APC anti-human CD3标记的T细胞
将培养基中T细胞计数后，取1×106细胞于1mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用100μL预冷的PBS重悬细胞，取APC anti-human CD3抗体1μL加入细胞中，混匀后冰浴条件下孵育30min，加入600μL预冷的PBS重悬细胞，800g离心6min，将上清弃去，重复洗涤一次，用100μL预冷的PBS重悬，作为实验组。在对照组中用PBS缓冲液代替APC anti-human CD3抗体，其他操作与实验组完全相同。流式细胞仪分析APC anti-human CD3标记的T细胞(图1)。
从图1的A和B判断，APC标记人T细胞后形成APC-Anti-human CD3。
实施例2.APC anti-human CD3标记人T细胞的最适用量
用不同体积APC anti-human CD3标记3×106个细胞，以0.2μL梯度取0-7.8μL间的40个点。检测空板(background)和加入细胞后(细胞+空板)的光子数(表1)
具体步骤如下：将培养基中T细胞计数后，取1.5×108细胞于50mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞至终浓度3×107/mL，将细胞分装成40管，每管100μL，按0、0.2、0.4……7.4、7.6、7.8μL以0.2μL梯度每管加APC anti-human CD3抗体(表1)，混匀后冰浴条件下孵育60min，800g离心6min，将上清弃去，用500μL预冷的PBS重悬，800g离心6min，将上清弃去，用100μL预冷的PBS重悬细胞，将细胞悬液置于96孔板中，使用小动物成像仪测定荧光强度。
图2中，荧光强度(光子/s)与APC anti-human CD3用量呈抛物线趋势，二项式曲线y＝-1×107x2+1×108x+1×108，R2＝0.914，即APC anti-human CD3最适体积为5μL/3×106个细胞(图2)。采用0.2～7.8μL的体积APC anti-human CD3都可获得可检测的标记T细胞，APC anti-human CD3最适体积为5μL/3×106个细胞。
表1.96孔板对应上样孔和加入不同体积APC anti-human CD3标记3×106个细胞后检测到的光子数
实施例3.以最适体积标记人T细胞后可检测到荧光的最小细胞数
以APC anti-human CD3的最适体积标记T细胞，即5μL/3×106个细胞。每组设有三个平行孔，100μL细胞悬液中的细胞数分别为5×105、7×105、9×105、1×106、3×106、5×106、7×106、9×106，分别进行1s、10s、20s、30s、50s、100s、200s曝光。具体步骤如下：将培养基中T细胞计数后，取1×108细胞于50mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞，取APC anti-humanCD3抗体167μL加入细胞中，混匀后冰浴条件下孵育50min，800g离心6min，将上清弃去，用5mL预冷的PBS重悬，800g离心6min，将上清弃去，用1mL预冷的PBS重悬细胞至终浓度1×108/mL，按下表中的浓度用预冷的PBS稀释细胞后，将细胞悬液置于96孔板中，使用小动物成像仪测定荧光强度。每个样做3次重复。对照组：未经APC anti-human CD3标记的T细胞。将分装好的96孔板，按不同条件曝光后观察并记录结果。
由图3可见，结果都只能在9×106、7×106、5×106和3×106个细胞处有效检测到荧光(图3，曝光200s)。在10s到200s曝光条件下的R2值分别为0.975、0.975、0.974、0.973、0.969和0.961。在1s曝光条件下，在3×106～9×106个细胞范围内光子数与细胞个数呈良好的线性关系R2＝0.976(表2和图4)。可有效检测到荧光的最少T细胞数为3×106个细胞。
表2.曝光1s条件下，以APC anti-human CD3标记T细胞的最适比例，即5μL/3×106个细胞，标记细胞后检测不同细胞数的荧光强度(光子/s)
实施例4.以最适体积标记人T细胞后荧光强度随时间的变化关系
以得到的APC anti-human CD3的最适体积标记T细胞，即5μL/3×106个细胞。每组设三个平行孔，每个孔有5×106个细胞。分别在标记0、2、4……18、20、25……50、55、60min进行1s曝光(表3)。
具体步骤如下：将培养基中T细胞计数后，取1.5×107细胞于50mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞，取APC anti-human CD3抗体25μL加入细胞中，混匀后冰浴条件下孵育40min，800g离心6min，将上清弃去，用500μL预冷的PBS重悬，800g离心6min，将上清弃去，用300μL预冷的PBS重悬细胞至终浓度5×107/mL，按表3中的浓度用预冷的PBS稀释细胞后，将细胞悬液置于96孔板中，使用小动物成像仪测定荧光强度。
由图5可知，在APC anti-human CD3与免疫细胞孵育0至60min光子数无明显变化，都可有效检测到荧光。
表3.曝光1s条件下，以APC anti-human CD3标记T细胞的最适比例，即5μL/3×106个细胞，标记5×105个细胞后检测荧光强度(光子/s)随时间的变化
实施例5裸鼠体内检测APC标记杀伤性T细胞
以APC anti-human CD3的最适体积标记细胞，即5μL/3×106个细胞。
经皮内注射裸鼠腹部
皮内注射裸鼠腹部具体步骤如下：将培养基中T细胞计数后，取7×107细胞于50mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞，取APC anti-human CD3抗体110.5μL加入细胞中，混匀后冰浴避光条件下孵育25min，800g离心6min，将上清弃去，用5mL预冷的PBS重悬，800g离心6min，将上清弃去，用7mL预冷的PBS重悬细胞至终浓度1×107/mL。分成3组，每组分别取重悬液1mL、2mL和4mL。800g离心6min，将上清弃去，每组用200μL预冷的PBS重悬细胞。每组细胞重悬液用规格为0.45×16的无菌注射器经皮内注射100μL，使用小动物成像仪测定荧光强度。
在5×106、1×107和2×107个细胞注射的部位均可见到形状规则的荧光信号，在曝光时间相同的条件下(曝光50s)，这与体外检测结果基本一致(图6A、B)，将小鼠翻转之后没有检测到明显的荧光信号(图6C)。次日，对经皮内注射的裸鼠腹部进行跟踪检测，腹部仍可检测到形态规则的荧光信号(图6D)。
经皮内注射裸鼠背部
皮内注射裸鼠背部具体步骤如下：将培养基中T细胞计数后，取4×107细胞于50mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞，取APC anti-human CD3抗体66.5μL加入细胞中，混匀后冰浴避光条件下孵育30min，800g离心6min，将上清弃去，用1mL预冷的PBS重悬，800g离心6min，将上清弃去，用4mL预冷的PBS重悬细胞至终浓度1×107/mL。分成3组，每组分别取重悬液600μL、1.4mL和2mL。800g离心6min，将上清弃去，每组用200μL预冷的PBS重悬细胞。每组细胞重悬液用规格为0.45×16的无菌注射器经皮内注射100μL，使用小动物成像仪测定荧光强度。
在7×106和1×107个细胞注射部位均可见到形状规则的荧光信号，在曝光时间相同的条件下(曝光50s)，这与体外检测结果基本一致(图7A、B)。次日，对经皮内注射的裸鼠背部进行跟踪检测，背部检测不到形态规则的荧光信号(图7C)。与APC anti-human CD3标记的T细胞经皮内注射在裸鼠背部相比，皮内注射在裸鼠腹部荧光持续时间更长。
经尾静脉注射裸鼠体内
具体步骤如下：将培养基中T细胞计数后，取2×107细胞于50mL离心管中，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞后，800g离心6min，将上清弃去，用预冷的PBS重悬细胞，取APC anti-human CD3抗体33.5μL加入细胞中，混匀后冰浴避光条件下孵育30min，800g离心6min，将上清弃去，用1mL预冷的PBS重悬，800g离心6min，将上清弃去，200μL预冷的PBS重悬细胞。细胞重悬液用规格为0.45×16的无菌注射器经皮内注射100μL，使用小动物成像仪测定荧光强度。
以APC anti-human CD3的最适体积标记细胞，即5μL/3×106个细胞。1×107个细胞，在腹部左下处检测到荧光信号(图8B)，1h后检测到荧光信号形态变规则(图8C)。
由本实施例可知，经腹部、背部尾部皮内注射APC anti-human CD3标记的免疫细胞，都可采用小动物成像仪检测荧光信号形态变了解到免疫细胞在动物体内的分布和迁徙及数量信息。本申请为研究免疫细胞在动物体内的分布和迁徙及数量信息提供了一种简单有效及特异性强的方法。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (21)

1.一种免疫细胞示踪方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供免疫细胞；
(2)用偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞，然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；
(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；
(4)采用动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；
(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、免疫调节细胞、造血母细胞。
3.根据权利要求2所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述T细胞包括CD3+、CD4+；所述B细胞包括CD19+；所述NK细胞包括CD3-/CD(16+56)+；所述免疫调节细胞包括CD4+/CD29+；所述造血母细胞包括CD33+和CD34+。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞为CD3+。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料选自共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白和其他探针。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述共轭结合探针包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red；所述Alexa Fluor系列荧光染料包括Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647；所述Cy系列荧光染料包括Cy3.5；所述细胞功能探针包括SNARF、Fluo-3；所述荧光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。
7.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述荧光抗体为别藻蓝蛋白-抗CD3抗体(APC anti-human CD3)。
8.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为0.2～7.8μL，所述免疫细胞的用量为1～15×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为5mins～60mins，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～200s。
9.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为1～6μL，所述免疫细胞的用量为3～7×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins～40mins，所述结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～80s。
10.根据权利要求1所述的免疫细胞示踪方法，其中，所述步骤(3)中，将荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内遵守如下操作要求：
A、所述小动物包括裸鼠，兔子，狗、猫，绵羊；
B、荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内的部位选自腹部皮内注射，背部皮内注射，体内经尾静脉注射中的一种；
C、接受所述荧光抗体标记的免疫细胞注射的小动物年龄为整个存活周期，优选存活中期；
D、所述注射深度为皮下0～1cm组织。
11.一种用于免疫细胞示踪的试剂盒，包括偶联荧光染料的抗体和缓冲液，其中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料包括共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白，所述缓冲液为磷酸缓冲液(PBS)。
12.偶联荧光染料的抗体在制备权利要求11的用于免疫细胞示踪的试剂盒中的用途，当使用所述试剂盒时，包括以下步骤：
(1)提供免疫细胞；
(2)用所述偶联荧光染料的抗体标记步骤(1)获得的免疫细胞；然后体外检测标记免疫细胞的荧光强度；
(3)将标记好的免疫细胞注射到实验动物体内；
(4)采用小动物活体成像仪检测实验动物体内荧光强度；
(5)计算数据，确定免疫细胞在体内的分布、迁徙和存活时间。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、免疫调节细胞、造血母细胞。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述T细胞包括CD3+、CD4+；所述B细胞包括CD19+；所述NK细胞包括CD3-/CD(16+56)+；所述免疫调节细胞包括CD4+/CD29+；所述造血母细胞包括CD33+和CD34+。
15.根据权利要求12所述的用途，其中，所述免疫细胞为T细胞，所述T细胞为CD3+。
16.根据权利要求12所述的用途，其中，所述荧光抗体上偶联的荧光染料选自共轭结合探针、Alexa Fluor系列荧光染料、Cy系列荧光染料、细胞功能探针、荧光蛋白和其他探针。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述共轭结合探针包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red；所述Alexa Fluor系列荧光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647；所述Cy系列荧光染料包括Cy3.5；所述细胞功能探针包括SNARF、Fluo-3；所述荧光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。
18.根据权利要求12所述的用途，其中，所述荧光抗体为别藻蓝蛋白-抗CD3抗体(APCanti-human CD3)。
19.根据权利要求12所述的用途，其中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为0.2～7.8μL，所述免疫细胞的用量为1～15×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为5mins～60mins，结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～200s。
20.根据权利要求12所述的用途，其中，所述步骤(2)是将免疫细胞与荧光抗体混匀后冰浴条件下孵育，所述孵育反应体系中，所述荧光抗体的用量为1～6μL，所述免疫细胞的用量为3～7×106个细胞，所述荧光抗体和免疫细胞结合的孵育时间为18mins～40mins，所述结合荧光抗体的免疫细胞体外检测的曝光时间为0.1s～80s。
21.根据权利要求12所述的用途，其中，所述步骤(3)中，荧光抗体标记的免疫细胞注射入小动物体内的方式包括但不限于腹部皮内注射，背部皮内注射，体内经尾静脉注射。
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