CN102559917A - 一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，属生物医学检测分析技术领域。本发明将核酸适配子与血清标本孵育，然后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察结果并采集紫外滤光图像，通过凝胶图像分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，定量分析病例与对照之间的差异，从而实现定量诊断。本发明以肝癌血清核酸适配子应用于肝癌诊断为研究模型，敏感度、特异度和准确度均高达90%以上。本发明方法简便易，实用价值大，诊断效率高，应用前景良好。
Description
技术领域
本项发明属生物医学检测分析技术领域。
背景技术
核酸适配子（aptamer）是一种生物靶分子的人工单链寡核苷酸配体，通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将靶标与文库共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的核酸与靶标形成复合物，分离后者并洗脱核酸，以洗脱的核酸作为模板进行体外扩增，制备成新的随机单链寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮筛选（孵育、分离、扩增），与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端固定序列与文库相符的寡核苷酸即为核酸适配子；测定各适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选择能高特异性和高亲和力结合靶标的核酸适配子应用于靶标的检测分析。
核酸适配子筛选过程中所用文库中的寡核苷酸序列两端为固定序列，中间为随机序列。固定序列为PCR引物提供结合部位，便于SELEX筛选过程中进行PCR扩增，以制备下一轮筛选的文库。随机序列使文库中核酸序列的多样性极为丰富，当随机区长度为25个核苷酸时，文库的多样性理论上能达到1015（425=1.12615）。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体（G-quartet）等。通过分子构象间的“锁钥”匹配，核酸适配子与靶分子相互适配，加上氢键、范德华力等的作用，两者形成稳定的复合物。1015的文库多样性所拥有的丰富的寡核苷酸分子构象可为自然界存在的几乎所有种类的分子找到能“锁钥”匹配的核酸序列（核酸适配子）。目前，通过SELEX技术已筛选出各种不同类型靶分子的核酸适配子，包括与基因调控有关的核酸结合蛋白（如噬菌体T4 DNA 聚合酶、HIV-1 Rev蛋白、核糖体蛋白S1），非核酸结合蛋白（如凝血酶、各种细胞因子、辅因子、缓激肽、IgE抗体），小分子有机物（如ATP、茶碱、氨基酸、维生素），甚至金属离子、多糖、有机染料，以及完整的细胞、病毒、孢子等。
核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点：①高特异性和高亲性：核酸适配子能够分辨出靶分子结构上细微的差别，亲和力甚至强于天然配体；②靶标广泛：从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶标；③稳定性好：核酸适配子可长期保存，通过人工合成而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易：可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用优势：核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。
核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。Golden等用核酸适配子检测碱性成纤维生长因子（bFGF），其敏感性高于商业化ELISA试剂盒近20倍，且特异性良好。Liu等用核酸适配子纳米传感器可以快速、敏感、特异地检出循环血液中的肿瘤细胞。McCauley等研制出核酸适配子传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标志物。Hicke等用放射性核素标记黏韧素-C的核酸适配子，成功应用于人胶质母细胞瘤和乳腺癌动物模型的肿瘤显像。
目前核酸适配子应用于靶标检测的方法有流式细胞术、生物芯片技术、双位点结合试验（夹心法）、分子信标、生物传感器等，但这些方法或需要昂贵的仪器设备，或对核酸适配子有特殊要求，或需要复杂的实验技术，实用价值差，以致迄今为止，尚无真正意义上的核酸适配子临床诊断应用。建立具有临床实用价值且简便易行的核酸适配子诊断应用新技术具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是创建一种简便易行的核酸适配子检测应用技术，为相应靶标的分析提供一种具有实用价值的方法，便于临床诊断应用。
本发明采用的技术方案：先分别确定核酸适配子的合适用量和液态标本的合适用量，再将合适用量的核酸适配子与合适用量的待测标本进行孵育，然后直接进行凝胶电泳、核酸染色和灰度测定，对灰度测定指标进行统计学分析，确定阳性与阴性的判别界值，评估核酸适配子的临床诊断效率。
本发明的方法包括以下步骤。
a. 核酸适配子用量确定：由于核酸适配子的核苷酸序列不同，相同摩尔量的不同核酸适配子在凝胶电泳中的条带强弱可以不同。因此，在将核酸适配子应用于标本检测之前，应确定其合适的用量，方法如下：以最低量为2pmol的等差梯度量的核酸适配子溶液进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定条带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子用量。
b. 标本用量确定：核酸适配子与标本的反应物在凝胶电泳中可表现为结合带和游离带，游离带的强弱与标本用量有关，在进行核酸适配子的标本检测之前，应确定合适的标本用量，方法如下：将步骤a确定的核酸适配子用量与最低量为2μl的等差梯度体积的所要诊断疾病的混合体液标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为标本用量。
c. 标本检测及数据采集：收集患有所要诊断疾病（如肝癌）的患者的体液标本归为病例组和不患有所要诊断疾病（如各种非肝癌）的患者的体液标本归为对照组，以步骤a确定核酸适配子用量和步骤b确定的标本用量为条件，将核酸适配子分别与病例组和对照组的各标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值。同时每块凝胶均以结合缓冲液代替标本做一孔适配子对照。
d. 诊断价值评估：获取凝胶分析软件测定的核酸适配子游离带的灰度相关指标（灰度值、灰度构成比、框选面积、平均灰度值及其标准差、平均密度），并计算各标本与同块凝胶的适配子对照的灰度比值。对灰度比值进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，获得其ROC曲线下面积（AUC）和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度；对灰度相关指标进行多因素Logistic回归分析，并以Logistic回归方程的概率预测值为指标进行ROC曲线分析，获得多指标联合检测的AUC和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度。
其中上述步骤中所述的核酸适配子为通过SELEX技术筛选出来的具有特异性识别靶标的特定单链核酸序列（ssDNA或RNA）。
其中上述步骤中所述的常规凝胶电泳是指以常用凝胶为介质的低压电分离技术，包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。
其中上述步骤中所述的核酸染色为使用核酸染料对凝胶中的核酸适配子进行染色，优选使用GelRed染料。
其中上述步骤中所述的紫外灯下观察实验结果和图像采集，是通过紫外透射仪观察，并借助其紫外滤光照相附件和数码相机拍摄图像完成，或通过凝胶电泳成像分析系统完成结果观察和图像采集。
其中上述步骤中所述的体液标本是指各种液态生物标本，如血清、血浆、体腔积液、尿液、细胞培养液及组织细胞裂解液等；混合体液标本是指用一组性质相同但背景各异的标本（如一组肝癌患者个体的血清标本）等量混合而成。
其中上述步骤中所述的标本与适配子对照的灰度比值是将标本的灰度值除以适配子对照的灰度值得出的比值。
其中上述步骤中所述的Logistic回归分析通过统计软件（如SPSS）完成，因变量为结果变量（诊断），自变量为灰度值相关各指标。
其中上述步骤中所述的受试者工作特征（ROC）曲线分析通过统计软件（优选）或手工计算和绘制完成，因变量为结果变量（诊断），自变量为灰度比值（单指标检测）或通过Logistic回归方程换算得到的样本组别概率预测值（多指标检测）。
本发明的有益效果：本发明方法能简便易行地将核酸适配子应用于液态标本的检测，为核酸适配子在疾病诊断中的应用提供了实用的新方法，具有许多独特优势：本发明方法只需要常规的电泳设备和凝胶图像分析系统即可完成，不似核酸适配子芯片等技术需要昂贵的仪器设备；本发明方法将核酸适配子与标本直接进行反应，无需额外地对核酸适配子进行修饰和对标本进行前期处理，不似核酸适配子分子信标技术、双位点结合试验等需要对核酸适配子进行荧光或其他类似标记；本发明方法应用于肝癌的检测，其准确度在90%左右，高于目前经典的AFP检测对肝癌的诊断价值。总之，本发明方法简便易行，实用价值大，具有良好的应用前景。
附图说明
图1 为使用梯度量核酸适配子进行12%（W/V）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和GelRed染色图。泳道1~9的核酸适配子用量分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10pmol。
图2为根据图1的结果绘制的曲线，横坐标为核酸适配子量，纵坐标为核酸适配子带的灰度值。
图3为使用梯度体积的肝癌混合血清分别与等量核酸适配子混合孵育后进行12%（W/V）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和GelRed染色图。泳道1~9的血清标本体积分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10μl。
图4为根据图3的结果绘制的曲线，横坐标为血清体积，纵坐标为游离核酸适配子带灰度值。
图5~图8为将核酸适配子分别与肝癌及非肝癌血清标本混匀孵育后进行12%（W/V）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和GelRed染色图。泳道Ap为适配子对照，其他泳道为血清标本。其中：图5为肝癌血清标本与核酸适配子作用的结果；图6为肝硬化血清标本与核酸适配子作用的结果；图7为乙型肝炎血清标本与核酸适配子作用的结果；图8为正常人血清标本与核酸适配子作用的结果。由图5~图8可见肝癌血清标本的游离核酸适配子带明显弱于肝硬化、乙型肝炎和正常人血清标本的游离核酸适配子带。
图9、图10 为本发明方法应用于肝癌临床诊断的ROC曲线图。其中：图9为以灰度比值为单项指标的ROC曲线图；图10为以灰度值、平均灰度值及其标准差为指标建立的Logistic回归方程的预测概率值的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过基于中性聚丙烯酰胺凝胶电泳的肝癌血清核酸适配子检测肝癌的具体实施例，对本发明的方法作进一步说明。
一、材料。
1．核酸适配子：在本课题组前期工作中，通过SELEX技术以肝癌混合血清为靶标筛选出核酸适配子AP-HCS-9-90，由上海Sangon公司合成。将合成的核酸适配子用结合缓冲液（20 mmol/L Hepes-Na，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2）溶解，配制成浓度为10pmol/μl核酸适配子母液，分装后-20℃保存备用。
2．血清标本：收集来南昌大学第一附属医院就诊的诊断明确的原发性肝癌、肝硬化、乙型病毒性肝炎及参加健康体检且各项检查均正常的健康人外周血标本（非抗凝），常规分离血清，-80℃保存备用。随机取20例肝癌血清标本各取50μl 并混匀，配制成肝癌混合血清，-80℃保存备用。
上述各种疾病的诊断标准如下。
原发性肝癌：符合下列条件之一：（1）血清AFP>400μg/L，影像学检查发现肝占位性病变并诊断为原发性肝癌，排除妊娠、生殖系肿瘤及转移性肝癌等；（2）血清AFP<400μg/L，两种影像学检查发现肝占位性病变并诊断为原发性肝癌，排除妊娠、生殖系肿瘤及转移性肝癌等；（3）手术和/或病理组织学证实是原发性肝癌。
乙型病毒性肝炎：符合下列全部条件：（1）HBsAg阳性；（2）有肝炎的临床表现，肝功能检查符合肝炎改变；（3）排除肝硬化、肝癌、消化道肿瘤。
肝硬化：符合条件（1）~（3）和/或（4）：（1）可有病毒性肝炎、长期饮酒、血吸虫感染等相关病史；（2）有肝功能减退的临床表现及实验室检查结果；（3）有门脉高压症的临床表现及医学影像学检查结果证实；（4）肝活检见假小叶形成。
二、方法。
1．核酸适配子用量确定。
（1）制胶：配制含10%甘油的12%中性聚丙烯酰胺凝胶溶液12ml，灌胶，室温下放置60min以上凝固待用。
（2）预电泳：凝胶凝固后装配于垂直电泳槽内，注入适量0.5×TBE缓冲液，拔出梳子，用注射器彻底冲洗加样孔，200V预电泳15min，备用。
（3）核酸适配子变性：取核酸适配子母液用结合缓冲液稀释成浓度为1pmol/μl的核酸适配子工作液。取9只0.5ml EP管，依次加入2、3、4、5、6、7、8、9、10μl核酸适配子工作液和8、7、6、5、4、3、2、1、0μl结合缓冲液，振荡混匀，瞬时离心，置干式恒温器中95℃加热5min，取出后立即冰浴5min。
（4）孵育：置4℃冰箱中孵育30min。
（5）电泳：取出反应管，每管加入2.5μl 50%甘油溶液（用结合缓冲液稀释），振荡混匀，瞬时离心，用微量注射器吸取全部反应物上样于上述预制的聚丙烯酰胺凝胶加样孔中，以200V电泳30min。
（6）染色：取下凝胶，将其浸泡于GelRed染色液中染色5~10min。
（7）图像采集：将凝胶置于紫外透射仪上，接上紫外滤光配件，用数码相机采集紫外滤光图像并保存于电脑中。
（8）灰度测定：采用Quantity One软件测定各泳道核酸适配子带的灰度值，具体步骤按照软件说明书进行，包括减除背景、去除斑点、矩形框选核酸适配子带、读取并保存灰度值。
（9）结果分析：随核酸适配子量增加，目测可见条带不断变浓，至6pmol以后变化不明显（图1）；灰度测定结果显示，2~5pmol各点的灰度值呈线性，此后不再呈线性（图2），故核酸适配子用量确定为5pmol。
2．标本用量确定。
（1）制胶和预电泳：配制含10%甘油的12%中性聚丙烯酰胺凝胶溶液并灌胶，凝固后预电泳备用，方法同上。
（2）核酸适配子变性：用结合缓冲液将核酸适配子母液稀释成浓度为1pmol/μl的核酸适配子工作液。取9只0.5ml EP管，每管分别加入5μl核酸适配子工作液，置干式恒温器中95℃加热5min，取出后立即冰浴5min。
（3）孵育：各管依次分别加入肝癌混合血清2、3、4、5、6、7、8、9、10μl，振荡混匀，瞬时离心，置4℃冰箱孵育30min。
（4）上样电泳、GelRed染色、图像采集：方法同上。
（5）灰度测定：采用Quantity One软件测定各泳道游离核酸适配子带的灰度值，具体步骤按照软件说明书进行，包括减除背景、去除斑点、矩形框选游离核酸适配子带、读取并保存灰度值。
（6）结果判读：肉眼观察可见随血清量增加，游离核酸适配子带逐渐变淡（图3）。5μl血清量点的条带微弱但可见、灰度值最小但仍在线性范围内（图4），故血清用量确定为5μl。
3．标本检测及数据采集。
根据上述实验结果确定的核酸适配子佳用量和标本用量为条件进行血清标本检测，具体步骤如下。
（1）制胶及预电泳：制配含10%甘油的12%中聚丙烯酰胺凝胶溶液并灌胶、装配于垂直电泳槽及预电泳，方法同上。
（2）核酸适配子变性：取核酸适配子母液用结合缓冲液稀释成浓度为1pmol/μl的核酸适配子工作液。取若干只0.5ml EP管，每管分别加入5μl核酸适配子工作液，置干式恒温器中95℃加热5min，取出后立即冰浴5min。
（3） 孵育：上述各管依次血清标本5μl，振荡混匀，瞬时离心，置4℃冰箱中孵育30min。适配子对照以结合缓冲液代替血清标本。
（4）电泳、染色、图像采集：方法同上。
（5）灰度分析：采用Quantity One软件测定各泳道游离核酸适配子带的灰度值（方法同上），获取每个标本的下列数据：灰度值（Volume，INT）、框选面积（Area，mm2）、平均灰度值（Mean Value，INT）、标准差（Std. Deviation）、密度（Density，INT/mm2）。计算各标本与适配子对照的灰度比值。
4．核酸适配子的诊断价值评估。
共检测血清标本180例，其中肝癌组72例，非肝癌组108例（肝硬化、乙型肝炎及正常人各36例）。目测可见肝癌血清标本的游离核酸适配子带绝大多数微弱甚至几乎消失（图5），而肝硬化（图6）、乙型肝炎（图7）和正常人（图8）血清标本的游离核酸适配子带均较浓，两者差异明显。
以肝癌血清标本为病例组，以非肝癌标本为对照组，以上述灰度测定的相关数据为指标，评估核酸适配子对肝癌的诊断价值。
（1）灰度比值单指标对肝癌的诊断价值：以标本的灰度比值为指标进行ROC曲线分析，曲线下面积（AUC）为0.893（图9），以0.121为诊断界值，灰度比值诊断肝癌的敏感度、特异度和准确度分别为85.2%、84.7%和84.4%。将肝癌与非肝癌各亚组分别进行灰度比值的ROC曲线分析，AUC为0.877（肝癌vs肝硬化）、0.939（肝癌vs乙型肝炎）和0.863（肝癌vs正常血清）。上述结果表明，以灰度比值为单项指标进行肝癌诊断，可获得良好的诊断效率，AUC达到“良”或“优”档，敏感度、特异度和准确度均达85%左右。
（2）多指标联合分析对肝癌的诊断价值：以灰度值、平均灰度值及其标准差为指标进行多因素二值Logistic回归分析，建立回归方程，以方程换算的预测概率值进行ROC曲线分析，AUC为0.965（图10），以0.5为诊断界值，诊断肝癌的敏感度、特异度和准确度分别为90.7%、90.3%和90.6%。将肝癌与非肝癌各亚组分别进行多因素Logistic回归分析，以所建回归方程换算的预测概率值为指标进行ROC曲线分析，AUC分别为0.984（肝癌vs肝硬化）、0.988（肝癌vs乙型肝炎）和0.937（肝癌vs正常血清）。上述结果表明，多指标联合分析可获得比灰度比值单项指标更为理想的诊断效率，AUC均为“优”档，敏感度、特异度和准确度均达90%以上。
Claims (3)
1.一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，其特征是包括以下步骤：
a. 以最低量为2pmol的等差梯度量的核酸适配子溶液进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定条带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子用量；
b. 以步骤a确定的核酸适配子用量与最低量为2μl的等差梯度体积的所要诊断疾病的混合体液标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为标本用量；
c. 收集所要诊断疾病的患病个体的体液标本归为病例组和不患有该疾病的个体的体液标本归为对照组，以步骤a确定的核酸适配子用量和以步骤b确定的标本用量为条件，将核酸适配子分别与病例组和对照组的各标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值；同时每块凝胶均以结合缓冲液代替标本做一孔适配子对照；
d. 获取凝胶分析软件测定的核酸适配子游离带的灰度指标：灰度值、灰度构成比、框选面积、平均灰度值及其标准差、平均密度，并计算各标本与所在胶片的适配子对照的灰度比值；对灰度比值进行受试者工作特征曲线分析，获得其曲线下面积和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度；对灰度指标进行多因素Logistic回归分析，并以Logistic回归方程的概率预测值为指标进行受试者工作特征曲线分析，获得多指标联合检测的曲线下面积和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度。
2.根据权利要求1所述的基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，其特征是所述的常规凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
3.根据权利要求1所述的基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，其特征是所述的体液标本是指血清、血浆、体腔积液、尿液、细胞培养液或组织细胞裂解液。
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