KR101902521B1

KR101902521B1 - 인공 지방간 형성 방법 , 지방간 분석 방법과 이를 위한 지방간 칩 및 지방간-지방세포 칩

Info

Publication number: KR101902521B1
Application number: KR1020170035851A
Authority: KR
Inventors: 성종환; 이승연; 전중원
Original assignee: 홍익대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2018-09-28

Abstract

인공 지방간 형성 방법이 개시되며, 상기 인공 지방간 형성 방법은, (a) 배양된 장 세포가 배치되고 유입되는 물질이 상기 장 세포를 통과하도록 형성되는 장 채널부, 및 배양된 간 세포가 배치되고 상기 장 세포를 통과한 물질 중 적어도 일부가 상기 간 세포와 접촉되도록 상기 장 채널부와 연결되는 간 채널부를 포함하는 생체 모사 마이크로 칩을 준비하는 단계; 및 (b) 유리지방산(FFA(free fatty acid))이 상기 장 세포를 통과하여 상기 간 세포에 공급되어 인공 지방간이 형성되도록, 유리지방산을 상기 장 채널부에 유입시키는 단계를 포함 한다.

Description

인공 지방간 형성 방법 , 지방간 분석 방법과 이를 위한 지방간 칩 및 지방간-지방세포 칩{METHOD OF MAKING ARTIFICIAL FATTYLIVER, METHOD OF ANALYZING FATTYLIVER, FATTYLIVER CHIP AND FATTYLIVER-ADIPOCYTE CHIP}

본원은 장 세포와 간 세포, 또는 장 세포와 간 세포와 지방세포가 배양된 미세유체 칩을 이용하여 인공적으로 지방간을 형성하고, 항비만 효능을 평가하기 위해 간세포와 지방세포를 배양하는 데에 활용될 수 있는 인공 지방간 형성 방법 및 지방간 분석 방법과 이를 위한 지방간 칩 및 지방간-지방세포 칩에 관한 것이다.

비만은 각종 성인병의 원인으로 신체적인 질병뿐만 아니라 심리적인 질병도 동반하므로, 현재 비만은 사회적인 문제로 대두되고 있고, 비만을 효과적으로 관리하는 것이 중요한 과제로 인식되고 있다. 따라서 비만을 치료하고 개선하는 약물이나 식품 등의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 이와 관련하여 항비만 기능성 평가 기술이 있다. 항비만 기능성 평가 기술은 항비만 효능이 있는 약물, 식품 등을 개발하기 위해서 항비만 효과가 있을 것으로 추정되는 물질을 대상으로 기능성을 평가하고 인체에 적용 가능 한지 검증하는 기술이다.

그런데, 기존 in vitro 항비만 모델은 흡수-대사와 같은 세부적인 생물학적 프로세스에 대한 구체적인 모사가 이루어지지 않아, 실제 인체 내에서 이루어지는 작용 결과의 예상에 있어 한계가 있었다. 좀 더 구체적으로, 기존의 in vitro 비만 모델은 간세포 또는 지방세포를 배양하고, 지방산 또는 지방산과 약물을 같이 투여하여, 간세포 또는 지방세포에 축적되는 지방의 양을 정량하여 비만 유발 정도를 평가하는 방식인데, 이는, 실제 지방 성분이 인체에서 거치는 소화/흡수/대사 과정이 모사되지 않아 부정확한 결과를 보일 가능성이 높다. 즉 항비만 효능이 있는 신약이나 새로운 식품 소재를 개발하기 위해서는 신약 또는 식품의 성분들을 투여하거나 섭취했을 경우 흡수-대사 과정을 거치면서 그 성분들이 어떻게 변화하는지에 대한 정확한 정보가 필요한데, 종래의 지방간 모델은 흡수기관인 소장이 모사되어 있지 않아 흡수에 대한 정보를 얻을 수 없기 때문에 실제 인체 반응과의 차이가 크다는 단점이 있다.

본원의 배경이 되는 기술은 Sung et al., Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans, Lab on a chip, 2013, 13, p1201에 개시되어 있다.

본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 지방 성분이 실제 인체에서 거치는 흡수/대사 과정을 모사한 비만 모델을 재현할 수 있는 인공 지방간 형성 방법, 지방간 분석 방법과 이를 위한 지방간 칩 및 지방간-지방세포 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.

상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면에 따른 인공 지방간 형성 방법은, (a) 배양된 장 세포가 배치되고 유입되는 물질이 상기 장 세포를 통과하도록 형성되는 장 채널부, 및 배양된 간 세포가 배치되고 상기 장 세포를 통과한 물질 중 적어도 일부가 상기 간 세포와 접촉되도록 상기 장 채널부와 연결되는 간 채널부를 포함하는 생체 모사 마이크로 칩을 준비하는 단계; 및 (b) 유리지방산(FFA(free fatty acid))이 상기 장 세포를 통과하여 상기 간 세포에 공급되어 인공 지방간이 형성되도록, 유리지방산을 상기 장 채널부에 유입시키는 단계를 포함할 수 있다.

본원의 제2 측면에 따른 지방간 분석 방법은, (a) 제1 측면에 따른 인공 지방간 형성 방법에 의해 지방간 칩을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 지방간을 형성한 간 세포를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본원의 제3측면에 따른 지방간 칩은, 상기 생체 모사 마이크로 칩을 포함하되, 상기 간 세포는 상기 장 세포를 통과하여 공급된 유리지방산에 의해 지방이 축적되는 것일 수 있다.

또한, 본원의 제4 측면에 따른 지방간-지방세포 칩은, 상기 생체 모사 마이크로 칩을 포함하되, 상기 간 세포는 상기 장 세포를 통과하여 공급된 유리지방산에 의해 지방이 축적되고, 상기 생체 모사 마이크로 칩은 상기 간 채널부와 연결되는 지방세포 챔버를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 간세포에 지방이 축적된 후, 시약을 사용하여 상기 간세포에 축적된 지방의 양을 정량화 할 수 있고, 이러한 정량화는 세포가 칩에 부착된 상태에서, 또는 세포를 칩에서 분리한 후에 이루어질 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 간 세포에 유리지방산이 직접적으로 주입되는 것이 아니라, 유리 지방산이 장 세포를 거쳐 간 세포에 도달하므로, 지단백질을 포함한 지방 흡수 및 대사 메커니즘을 동시에 모사하는 시스템의 구현이 가능하다. 이에 따라, 장에서 간으로 이어지는 초회통과 대사기반의 메커니즘이 재현될 수 있어 실제 인체 조직과의 유사도를 향상시킬 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법을 설명하기 위한 개략적인 순서도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법의 생체 모사 마이크로 칩의 개략적인 단면도로서, 장 챔버 및 간 챔버를 횡축 방향으로 가로지르며 절개한 단면도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법의 S300 단계를 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법의 S500 단계를 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 5a는 유리지방산이 마이셀을 형성하기 이전에 갖는 거동을 설명하기 위한 개략적인 개념도이고, 도 5b는 유리지방산이 마이셀을 형성하면서 갖는 거동을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법의 생체 모사 마이크로 칩의 개략적인 평면도이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법의 생체 모사 마이크로 칩의 개략적인 단면도로서, 지방세포 챔버를 종축 방향으로 가르지르며 절개한 단면도이다.
도 8a 및 도 8b는 콤솔 시뮬레이션에 의해 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법에 있어서 종축 방향 주입구에서 흘려주는 물질의 속도에 따른 물질 확산 양상을 나타낸 농도 그래프가 도출되는 것을 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 지방간 분석 방법의 리저버 유닛이 간 층 상에 배치되는 것을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 지방간 분석 방법의 간 챔버를 fixative 용액으로 처리하는 것을 설명하기 위한 개략적인 단면도이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 지방간 분석 방법의 간 세포를 염색하는 것을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 12는 본원의 일 실시예에 따른 지방간 분석 방법의 간 세포를 분석하는 것을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 13은 유리지방산을 처리를 하지 않은 간 세포를 oil red o로 염색한 현미경 사진이다.
도 14는 3.8 mM 농도로 유리지방산이 포함된 용액으로 간 세포를 처리한 후, 간 세포를 oil red O로 염색한 현미경 사진이다.
도 15는 도 13의 간 세포와 도 14의 간 세포 각각의 색소 추출후의 흡광도를 500 nm에서 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

참고로, 본원의 실시예에 관한 설명 중 방향이나 위치와 관련된 용어(상측, 하측 등)는 도면에 나타나 있는 각 구성의 배치 상태를 기준으로 설정한 것이다. 예를 들면, 도 2에서 보았을 때 전반적으로 12시 방향이 상측, 전반적으로 6시 방향이 하측 등이 될 수 있다.

본원은 인공 지방간 형성 방법, 지방간 분석 방법, 지방간 칩 및 지방간-지방세포 칩에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원은 장 세포와 간 세포가 배양된 미세 유체 칩, 또는 장 세포와 간 세포와 지방세포가 배양된 미세유체 칩을 이용하여 인공적으로 지방간을 형성하고, 항비만 효능을 평가하기 위해 간세포와 지방세포를 배양하는 데에 활용될 수 있는 인공 지방간 형성 방법 및 지방간 분석 방법과 이를 위한 지방간- 칩 및 지방간-지방세포 칩에 관한 것이다.

먼저, 본원의 일 실시예에 따른 인공 지방간 형성 방법(이하 '본 인공 지방간 형성 방법'이라 함)에 대해 설명한다.

도 1은 본 인공 지방간 형성 방법을 설명하기 위한 개략적인 순서도이다.

도 1을 참조하면, 본 인공 지방간 형성 방법은 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 준비하는 단계(S100)를 포함한다.

도 2는 본 인공 지방간 형성 방법의 생체 모사 마이크로 칩의 개략적인 단면도로서, 장 챔버 및 간 챔버를 횡축 방향으로 가로지르며 절개한 단면도이다. 참고로, 일부 장 리저버(43, 45)는 원래는 도 2에 도시되지 않아야 하지만 생체 모사 마이크로 칩의 구조를 설명하기 위해 도시하였다.

도 2를 참조하면, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 배양된 장 세포(Caco-2)(3111)가 배치되고 유입되는 물질이 장 세포(3111)를 통과하도록 형성되는 장 채널부(31)를 포함한다. 또한, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 배양된 간 세포(HepG2)(2111)가 배치되고 장 세포(3111)를 통과한 물질 중 적어도 일부가 간 세포(2111)와 접촉되도록 장 채널부(31)와 연결되는 간 채널부(21)를 포함한다.

도 2를 참조하면, 예시적으로, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 베이스 층(1), 베이스 층(1) 상에 적층되고 간 채널부(21)가 형성되는 간 층(2), 간 층(2) 상에 적층되고 장 채널부(31)가 형성되는 장 층(3) 및 장 층(3) 상에 적층되고 간 채널부(21)와 연결되는 간 리저버(41, 42) 및 장 채널부(31)와 연결되는 장 리저버(43, 44, 45)가 형성되는 리저버 층(4)을 포함할 수 있다. 참고로, 리저버 층(4)은 배양액이 담기는 저장 층 역할을 할 수 있다.

간 채널부(21)는 간 세포(2111)가 배치되는 간 챔버(211)를 포함할 수 있다. 또한, 장 채널부(31)는 간 챔버(211)의 상측과 연결되는 장 챔버(311)를 포함할 수 있다.

장 세포(3111)는 간 층(2)과 장 층(3) 사이에 개재되는 멤브레인(5) 상에 직접적으로 또는 간접적으로 안착되어 장 챔버(311)에 배치될 수 있다. 장 세포(3111)가 멤브레인(5) 상에 간접적으로 안착되는 것은 멤브레인(5) 상에 배치된 장 세포 배양 구조물 상에 안착되는 것을 의미할 수 있다. 장 세포 배양 구조물은 도면에는 도시되지 않았지만, 3차원 형상의 구조물, 이를테면, 3차원 콜라겐 세포지지체일 수 있다. 3차원 콜라겐 세포지지체는 융모를 모사한 구조물로서, 복수의 돌기를 가질 수 있다. 이러한 경우, 장 세포(3111)는 돌기 상에 돌기를 전반적으로 덮으며 위치할 수 있다(3차원 세포 배양). 또한, 장 세포(3111)가 멤브레인(5) 상에 직접적으로 안착될 경우, 장 세포(3111)는 멤브레인(5) 상에 2차원상으로 배양될 수 있다( 2차원 세포 배양).

참고로, 멤브레인(5)은 장 세포(3111)를 통과한 물질이 간 세포(2111)로 갈 수 있도록 장 챔버(311)와 간 챔버(211) 사이에 위치한다. 이러한 멤브레인(5)은 다공성일 수 있다.

도 3은 본 인공 지방간 형성 방법의 S300 단계를 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.

도 1 및 도 3을 참조하면, 본 인공 지방간 형성 방법은 장 세포(3111) 및 간 세포(2111)에 대해 starvation을 수행하는 단계(S300)를 포함한다.

S300 단계는 세포 주기가 동기화되고 세포 증식이 제한되도록 FBS를 포함하지 않고 BSA 및 P/S를 첨가한 DMEM으로 starvation을 수행할 수 있다. 예시적으로, S300 단계는 후술하는 S500 단계가 수행되기 소정 시간 전에, 이를테면, 1일 전에 FBS가 들어 있지 않고, BSA (1% w/v)와 P/S(1% w/v)를 첨가한 DMEM에 장 세포(3111) 및 간 세포(2111)를 소정 시간, 이를테면, 24시간 배양시켜 세포 주기를 동기화 해주고 증식을 제한해 증식관련 단백질 발현을 통제하는 등 실험에 제약이 되는 부분들을 제한할 수 있다.

즉, 본 인공 지방간 형성 방법은 S300 단계를 통해, 유리지방산 처리(S500 단계) 전에 성장 인자(예를 들면 분열 인자 ‘미토겐‘)가 제거된 배지를 공급하여 세포 주기를 동기화시키고 결과의 신뢰도를 높인다.

도 4는 본 인공 지방간 형성 방법의 S500 단계를 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.

도 1 및 도 4를 참조하면, 본 인공 지방간 형성 방법은 유리지방산(FFA(free fatty acid))이 장 세포(3111)를 통과하여 간 세포(2111)에 공급되어 인공 지방간이 형성되도록, 유리지방산을 장 채널부(31)에 유입시키는 단계(S500)를 포함한다. 예를 들어, 도 4를 참조하면, 유리지방산은 장 리저버(43, 44, 45)를 통해 주입되어 장 세포(3111)를 통과해 간 세포(2111)에 도달할 수 있다. 이러한 S500 단계는 장 채널부(31)와 간 채널부(21)를 소정의 시간 동안 유리지방산이 포함된 용액으로 처리할 수 있다. 여기서 소정의 시간은 24시간일 수 있다.

도 5a는 유리지방산이 마이셀을 형성하기 이전에 갖는 거동을 설명하기 위한 개략적인 개념도이고, 도 5b는 유리지방산이 마이셀을 형성하면서 갖는 거동을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.

또한, 유리지방산이 포함된 용액은 인체에서 지방이 위를 지나 췌장리파제(pancreatic lipase)에 의해 분해되어 장으로 유입되는 흐름이 모사되도록, 올레인산(oleic acid)과 팔미트산(palmitic acid)을 혼합하여 제조될 수 있다. 예시적으로, 유리지방산이 포함된 용액은, 올레인산(oleic acid)과 팔미트산(palmitic acid)이 혼합된 다음 Sodium taurocholate가 첨가되고 쉐이킹(shaking)되어 마이셀(micelle)이 형성된 것일 수 있다.

유리지방산이 올레인산 및 팔미트산과 적절히 배합됨으로써, 인체에서 지방이 위를 지나 췌장리파제(pancreatic lipase)에 분해되어 장으로 유입되는 흐름이 모사될 수 잇다.

또한, 도 5a와 도 5b를 비교하여 참조하면, 유리지방산을 담즙산과 함께 계면성질을 갖게 되는 형태인 마이셀(micelle)로 형성시키면, 담즙산에 의해 계면성질을 부여받은 유리지방산은 세포 사이의 길(paracellular route)로 쉽게 흡수가 가능해진다.

예시적으로, 유리지방산이 포함된 용액은 최종 유리지방산의 농도가 3.8 mM가 되도록 올레인산(oleic acid)과 팔미트산(palmitic acid)이 2:1 몰(mole) 비율로 혼합되고, 10 mM의 Sodium taurocholate가 첨가되어 1 시간 이상 37℃에서 쉐이킹 되어 마이셀이 형성된 것일 수 있다.

기존에 개발된 항비만 효능을 평가하는 in vitro기술들은 간세포 하나만을 배양하고 간세포에 지방을 주입시켜 만든 모델에 국한되어있어 장기 조직간의 상호 작용을 모사하지 못했다. 그런데, 최근에 소장에서 타겟 물질의 흡수를 돕거나 방해하는 메커니즘들이 규명되고 있으므로, 소장에서의 흡수 메커니즘을 포함한 항비만 평가 시스템이 필요하다.

구체적으로, 기존의 항비만 연구들은 유리지방산을 간세포에 직접 주입하여 항비만 메커니즘의 일부만을 모사하였다. 하지만 실제로 식이 지방(dietary fat)은 섭취되어 인체에 유리지방산으로 흡수되기 전에 소장에서 지단백질(lipoprotein)의 형태로 변환되고 소화 효소에 의해 다시 유리지방산으로 유리되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 지단백질을 포함한 지방 흡수 및 대사 메커니즘을 동시에 모사하는 시스템이 필요하다.

본 인공 지방간 형성 방법에 의하면, 간 세포에 유리지방산이 직접적으로 주입되는 것이 아니라, 유리 지방산이 장 리저버(43, 44, 45)를 통해 유입되어 장 챔버(311)의 장 세포(3111)를 거쳐 간 세포(2111)에 도달하므로, 지단백질을 포함한 지방 흡수 및 대사 메커니즘을 동시에 모사하는 시스템의 구현이 가능하다. 또한, 장기 조직간의 상호 작용이 모사되므로, 장 세포(3111)에서의 흡수 매커니즘을 포함한 항비만 평가 시스템의 구현이 가능하다.

또한, 물체로부터 분리한 세포를 배양기나 배양액에서 영양분을 주어 증식시키는 기술을 세포 배양이라고 하는데, 세포 배양 기술로 생체 외 실험이 가능해 졌으나, 기존의 세포 배양 기술은 다종의 세포 혹은 조직 간의 상호작용을 구현할 수 없는 단층 조직 세포 배양이므로 실제 생체내의 반응을 재현하기에 한계가 있다. 특히, 기존 in vitro 항비만 모델에서 기존에 개발된 항비만 효능을 평가하는 기술들은 세포들의 배양 환경이 2차원적인 환경에 예속돼있거나, 흐름이 없는 정적인 환경에 있어 in vivo에서의 미세 환경과 많은 차이가 있었다. 이에 따라 조직세포에 맞는 고유한 발현형을 보여줄 수 있고, 생리적 유사성이 높은 3차원적인 조직구조 모델에서의 장 세포 배양 시스템이 필요하였다.

본 인공 지방간 형성 방법은 장 챔버(311)와 간 챔버(211)가 높이 차를 두고 다른 별개의 층 각각에 위치한 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 이용하므로 장 세포(3111)로 유입된 물질이 별도의 구동력 없이도 중력에 의해 자연스럽게 간 세포(2111)로 유입되게 하는 작용 등이 이루어질 수 있다. 이에 따르면, 인체에 대한 생리적 유사성이 높은 3차원적인 조직구조 모델에서의 장 세포 배양 시스템을 구현할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 인공 지방간 형성 방법은 3차원 형상의 3차원 콜라겐 세포지지체 상에 배치된 장 세포(3111)를 이용할 수 있다. 이에 따르면, 3차원 환경에 대한 모사도가 향상될 수 있으므로 실제 인체 조직과의 유사도 역시 향상될 수 있다.

즉, 본 인공 지방간 형성 방법은 생체 외 실험에서 비만 모델을 재현하는 시스템으로서, 장 세포(3111)와 간 세포(2111)를 공동 배양하는 칩 시스템에서 유리지방산을 이용해, in vitro에서 관찰할 수 있는 인공 지방간을 형성시킨 모델이다. 또한, 본 인공 지방간 형성 방법은 장에서 간으로 이어지는 초회통과 대사기반의 메커니즘을 재현할 수 있는 생체 모사 마이크로 유체 칩(1000)을 이용함으로써 실제 인체 조직과의 유사도를 확보할 수 있다.

또한, 본 발명은 기존의 간세포만을 이용한 In vitro 항비만 기능성 평가 기술에서 재현하지 못한 장과 간 사이의 장기간 상호작용을 재현할 수 있다.

다시 말해, 본 인공 지방간 형성 방법은 실제 인체 조직의 3차원적인 구조와 배치를 모사함으로써, 실제 일차 통과 대사와 유사성이 높은 모델로 항비만과 관련된 지방 대사를 평가할 수 있고, 신약 개발에도 활용이 가능하다.

또한, 장 챔버(311)를 거친 물질 혹은 대사체가 간 챔버(211)로 이동할 수 있는 물질(예를 들면 장 세포에서 형성되는 지단백질), 또는 면역반응(TNF-α 등의 cytokine)과 같이 기존 in vitro 대사 모델로 구현이 불가능했던 생리적인 현상이 인공적으로 구현될 수 있고, 메커니즘을 연구하는데 활용이 가능하다.

도 6은 본 인공 지방간 형성 방법의 생체 모사 마이크로 칩의 개략적인 평면도이고, 도 7은 본 인공 지방간 형성 방법의 생체 모사 마이크로 칩의 개략적인 단면도로서, 지방세포 챔버를 종축 방향으로 가르지르며 절개한 단면도이다. 참고로, 도 6은 장 챔버, 간 챔버 및 지방세포 챔버의 위치를 설명하기 위해, 장 챔버, 간챔버 및 지방세포 챔버를 점선으로 도시하였다.

도 6 및 도 7을 참조하면, S100 단계에서, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 간 채널부(21)에서 간 세포(2112)가 위치하는 간 챔버(211)와 연결되는 지방세포 챔버(221)를 포함하도록 준비될 수 있다. 예시적으로, 지방세포 챔버(221)는 지방세포가 간 세포(2112)와 동일한 층 레벨에서 배양되도록 형성될 수 있는데, 예를 들어, 지방세포 챔버(221)는 간 층(2)에 형성될 수 있다. 또한, S100 단계에서 준비되는 생체 모사 마이크로 칩(1000)의 지방세포 챔버(221)에는 배양된 지방세포가 구비될 수 있다.

예를 들면, S100 단계에서 간 세포(2111)는, 장 세포(3111)가 배양되고 나서 간 세포(2111)가 포함된 용액이 간 챔버(211)로 공급되어 시딩(seeding)될 수 있다. 또한, S100 단계에서 지방세포는, 장 세포(3111)가 배양되고 나서 지방세포가 포함된 용액이 지방세포 챔버(221)로 공급되어 시딩(seeding)될 수 있다.

예시적으로, 장 세포(3111)가 배양된 지 소정 기간 이후에(이를 테면 장 세포(3111)가 배양된 지 11일되는 시점에) 간 세포(2111)를 희석한 세포 용액과 지방세포를 희석한 세포 용액이 각각의 주입구를 통해 유입될 수 있다. 도 6에 간 리저버(41, 42), 지방세포 리저버(48, 49) 및 간 세포와 지방세포의 물질교환을 위한 리저버(46, 47)가 도시되어 있는데, 간세포(2111)가 포함된 희석 용액이 간 리저버(41, 42)를 통해 주입되고, 지방 세포가 포함된 희석 용액이 지방세포 리저버(48.49)를 통해 주입됨으로써, 간 세포(2111) 및 지방세포 각각은 간 챔버(211) 및 지방세포 챔버(221) 각각으로 공급되어 시딩될 수 있다. 또한, 간 세포(2111) 및 지방세포가 각개 따로 포함된 용액들 각각은 지방세포 및 간 세포(2111) 각각이 지방세포 챔버(221) 및 간 챔버(211) 각각에 45000개씩 부착될 수 있도록, 지방세포 및 간 세포(2111)가 희석된 농도를 가질 수 있고, 최소 60 μL씩 주입될 수 있다. 또한, 세포 용액은 기포가 생기지 않도록 주입될 수 있다.

도 8a 및 도 8b는 콤솔 시뮬레이션에 의해 본 인공 지방간 형성 방법에 있어서 종축 방향 주입구에서 흘려주는 물질의 속도에 따른 물질 확산 양상을 나타낸 농도 그래프가 도출되는 것을 설명하기 위한 도면이다.

도 8a 및 도 8b를 참조하면, 지방 세포와 간 세포(2111)를 동시에 시딩하기 위해 콤솔(Comsol) 시뮬레이션을 통해 유속, 흘려주는 시간을 결정할 수 있다. 콤솔 시뮬레이션을 통해 종축 방향 주입구에서 흘려주는 속도에 따른 물질 확산 양상을 나타낸 농도 그래프가 도출될 수 있다.

예를 들어, 용액이 30°의 종축 방향 경사각도를 가지고 중력에 의해 흘러내려 세포 용액이 지방세포 챔버(221)에 고르게 분포할 수 있도록 하는 경우, 30°의 경사 각도를 가지고 흐르는 세포 용액의 속도는 1.5E-3(m/s)이다. 만약, 세포 용액의 유속이 상기 속도보다 너무 느릴 경우 지방세포 챔버(221)에 세포가 고르게 분포되기도 전에 도 8a의 (c) 부분(도 6을 참조하면, 횡축 스트림(stream)에서 종축으로 빠져나가는 유동장의 출구, 즉, 종축 유출구)으로 세포가 유출될 수 있다. 또한, 유속이 상기 속도보다 너무 빠를 경우 도 8a의 (a) 부분(도 6을 참조하면, 지방세포 챔버(221) 부분)에서 세포 부착 면적이 협소해지며, 세포가 지방세포 챔버(221)에 가득 채워지기 전에 중앙부 기준으로 면적당 세포농도가 너무 높게 시딩될 수 있다. 따라서 도 8a 및 도 8b를 참조하면, 콤솔(Comsol) 시뮬레이션을 통해 최적의 유속(경사: 30°)와 유류시간(t = 160)을 도출하고, 이를 실제 칩에 적용할 수 있다.

간 세포(2111) 및 지방세포의 시딩 직후 PBS로 세척하여(예를 들어, 3번) 부착되지 못한 세포들을 씻어낼 수 있다. 다음으로, 주입구를 1 시간 이상 채우지 않고 PBS를 적신 whatman 필터용 종이를 곁에 두어 채널이 건조돼 막히지 않도록 해준다. 일정 시간(예를 들어 8 시간)이 지나면 지방 세포와 간세포가 배지를 공유하며 공급받을 수 있도록 흐름 조건을 재개 해준다.

이러한, 본 인공 지방간 형성 방법에 의하면, 간 챔버(211)와 연결된 지방세포 챔버에서 기존 in vitro 모델에서 구현 할 수 없었던 호르몬(예를 들어 GLP-1, GIP 등)의 상호작용을 재현 할 수 있어 보다 인체에 가까운 모델로써 항비만 효능 약물 스크리닝에 이용가능 하다.

한편, 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 준비하는 단계(S100)에 있어서, 생체 모사 마이크로 칩(1000)의 프레임인 칩 구조체는 이하와 같이 제조될 수 있다.

먼저, Master fabrication 단계가 수행될 수 있다. 예시적으로, Master fabrication 단계는, 웨이퍼(wafer)에 SU-8 50을 도포하기 위해 spin coater의 속도를 500 rpm 5 sec, 1000 rpm, 30 sec 조건으로 설정할 수 있다. 그 후에 웨이퍼를 65 ℃ Hot plate에 10 분간 올려둔 뒤, 95 ℃ Hot plate에 30분 동안 올려두어 Soft bake해줄 수 있다. 다음으로, MA6 AlignerⅡ(4인치 전용)을 이용하여 photolithography를 진행할 수 있다. 이 후, 다시 Hot plate에 올려놓아 PEB를 해줄 수 있다. 그 뒤에 SU-8 Developer를 이용하여 10 분 이상 Develop을 함으로써, 가교가 되지 않은 SU-8을 제거하여 원하는 구조의 양각 형상을 갖는 웨이퍼를 얻는다. Master fabrication 단계의 결과, 예시적으로, 너비가 200 μm이고 높이가 120 μm 인 채널 모양의 양각 형상이 얻어질 수 있다.

다음으로 PDMS layer를 제작하는 단계가 수행될 수 있다. PDMS layer를 제작하는 단계는, 리저버 층(4)으로 사용될 소정 높이(이를테면 4 mm)의 PDMS를 만들기 위해 Sylgard A: Sylgard B = 10:1의 비율로 섞은 후(PDMS 용액), 진공 챔버(vaccum chamber)를 이용해 degassing 해준다. PDMS의 기포가 모두 제거되면 dish에 PDMS 용액을 상기 소정 높이에 맞춰서 부은 뒤에 60 ℃ 오븐에서 2 시간 이상 굳힌 뒤, 슬라이드 글래스(slide glass) 크기에 맞게 잘라줄 수 있다. 슬라이드 글래스는 상술한 베이스 층(1)으로 적용된다.

또한, PDMS layer를 제작하는 단계는, 장 층(3)으로 사용될 소정 높이(이를테면 3 mm)의 PDMS를 만들기 위해, PDMS용액을 상기 양각형상을 갖는 웨이퍼에 상기 소정 높이로 부어 기포를 없애 준 뒤 60 ℃ 오븐에서 2 시간 이상 굳히고 양각형상을 갖는 웨이퍼와 PDMS를 분리함으로써, 원하는 음각의 장 채널부(31)을 갖는 형상의 PDMS를 형성할 수 있다.

또한, PDMS layer를 제작하는 단계는, 간 층(2)으로 사용될 소정 높이(이를테면 0.3 mm)의 PDMS를 만들기 위해, spin coating machine(spin-1200D, MIDAS)을 사용하여(조건: 300 rpm, 30 sec) 양각형상을 갖는 웨이퍼 상에 PDMS를 상기 소정 높이로 얇게 만들고, 장 층(3)과 같은 방법으로 굳히고 양각형상을 갖는 웨이퍼와 PDMS를 분리함으로써, 원하는 음각의 간 채널부(21)를 갖는 형상의 PDMS를 형성할 수 있다.

다음으로 본딩(bonding)하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 리저버 층(4)으로 사용될 PDMS에 간 리저버(41, 42)와 장 리저버(43, 44, 45)를 이루는 5 개의 구멍이 Biopsy punch(Miltex)에 의하여 형성될 수 있는데, 8 mm의 직경을 갖도록 형성될 수 있다. 또한, 장 층(3)으로 사용될 PDMS에 장 챔버(311)가 형성될 수 있으며(이를테면, 직경은 6 mm가 되도록), 장 층(3)의 장 채널부(31) 중 장 리저버(43, 44, 45)와 장 챔버(311)를 연결하는 부분이 형성될 수 있다(직경은 1 mm를 갖도록). 또한, 간 층(2)으로 사용될 PDMS에 간 챔버(211)가 형성될 수 있고(직경은 8 mm가 되도록), 간 채널부(21) 중 간 리저버(41, 42)와 간 챔버(211)를 연결하는 부분이 형성될 수 있다(직경이 2 mm가 되도록).

또한, 지방세포의 형성을 위해, 리저버층(4)으로 사용될 PDMS에 지방세포 리저버(도 6 참조, 48, 49)가 형성될 수 있고(예를 들어, 직경 8 mm를 가지도록), 물질교환을 위한 리저버(46, 47)(예를 들어, 직경 8 mm를 가지도록)가 형성될 수 있다. 또한, 간 층(2)으로 사용될 PDMS에 지방세포 챔버(221)가 형성될 수 있다.

다음으로, 슬라이드 글래스와 PDMS를 모두 air plasma 처리하고 슬라이드 글래스(베이스층(1) 상에 간 층(2)으로 사용될 PDMS를 간 채널부(21) 중 간 리저버(41, 42)와 간 챔버(211)를 연결하는 부분이 슬라이드 글래스를 향하도록 배치하고, 간 층(2)으로 사용될 PDMS 상에 장 층(3)으로 사용될 PDMS를 장 채널부(31) 중 장 리저버(43, 44, 45)와 장 챔버(311)를 연결하는 부분이 상측을 향하도록 배치하며, 장 층(3)으로 사용될 PDMS 상에 리저버 층(4)으로 사용될 PDMS를 배치할 수 있다. 예시적으로, 상호 결합을 위해 플라즈마 본딩(plasma bonding)이 이루어지며 배치가 이루어질 수 있다. 플라즈마 본딩의 조건은 다음과 같을 수 있다. Power - 70 W, Generation time - 30 sec, Base pressure - 1.00 x 10-1 torr, MFC #1- 33 sccm.

이러한 과정에 따라, 세포가 배양되는 공간(장 챔버(311) 및 간 챔버(211))만 공유되고 나머지 채널은 서로 교차할 수 있다.

다음으로, 형성된 생체 모사 마이크로 칩의 프레임인 칩 구조체에 대한 멸균이 이루어질 수 있다. 세균의 내생포자를 파괴하기 위해서는 100 ℃ 이상에서 높은 증기압으로 멸균해야 하므로 칩 구조체를 멸균시키려면 고압멸균(autoclave)이 필요하다. 따라서, 칩 구조체를 멸균시키는 단계에 있어서, 고압멸균(autoclave)이 121 ℃의 온도와 15 lb psi의 압력에서 약 15 분 정도 진행될 수 있다.

또한, 3차원 콜라겐 세포지지체의 제조 방법을 예시적으로 설명하면 다음과 같다.

우선, 역몰드(reverse mold)를 형성한다. 구체적으로, 상면에 복수의 홈이 함몰된 웨이퍼에 SU-8을 도포하여 경화한 다음 웨이퍼로부터 SU-8을 분리(peel of)해 역몰드를 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, 웨이퍼에 SU-5을 도포하기 위해 spin coater의 속도를 500 rpm 5 sec, 1000 rpm, 30 sec 조건으로 맞추어 사용하고, 그 후에 65 ℃ Hot plate에 10 분간 올려둔 뒤, 95 ℃ Hot plate에 30 분 동안 올려두어 Soft bake해주며, MA6 AlignerⅡ(4인치 전용)을 이용하여 photolithography를 진행하고, 다시 Hot plate에 올려놓아 PEB를한 후에 SU-8 Developer를 이용하여 10 분 이상 Develop을 하면 가교가 되지 않은 SU-8은 제거가 되어 복수의 홈이 형성된(음각 형상을 갖는) 역(리버스) 몰드가 형성될 수 있다.

다음으로, 역 몰드 상에 PDMS를 부은 후 떼어내어(peel of) 빌리 몰드(villi mold)를 형성할 수 있다. 예를 들어, Sylgard A: Sylgard B = 10:1의 비율로 섞은 후, vaccum chamber를 이용하여 degassing해 PDMS의 기포를 제거하고, 기포가 모두 제거되면 리버스 몰드 상에 2 mm로 높이를 맞춰서 붓고 60 ℃ 오븐에서 2시간 이상 굳혀 다수의 돌기가 배치된 양각형상의 빌리 몰드를 얻을 수 있다.

다음으로 빌리 몰드에 알지네이트 몰딩(alginate molding)을 한 후 빌리 몰드를 떼어내어(peel off) 알지네이트 리버스 몰드(alginate reverse mold)를 형성한다. 예시적으로, 알지네이트(alginic acid - 4 wt%, Sigma)를 빌리 몰드에 붓고 CaCl₂로 6 시간 이상 가교시켜 단단히 굳힌 뒤 떼어내어(peel of) 알지네이트 리버스 몰드를 형성할 수 있다. 이러한 알지네이트 리버스 몰드는 상면에 복수의 홈이 함몰된 상태로 형성된다. 다음으로, 알지네이트 리버스 몰드 상에 콜라겐을 채운후 알지네이트를 용해시키면 상면에 복수의 돌기를 갖는 3차원콜라엔 세포지지체가 형성될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐이 채워진 알지네이트 리버스 몰드를 Ca² ⁺와 킬레이트 화합물을 만들 수 있는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 용액에 24시간 이상 처리해 알지네이트를 제거할 수 있다. 이에 따라, 3차원 콜라겐 세포지지체가 완성될 수 있다.

또한, 장 세포(3111) 및 간 세포(2111)가 배양되기 전에 칩 구조체는 워싱될 수 있다. 구체적으로, 칩 구조체 내에 에탄올을 주입해서 칩 구조체의 채널부(21, 31)에서 유체가 잘 흐를 수 있도록 washing을 해준다. 구체적으로 칩 구조체를 기울여놓고 에탄올이 아래로 잘 흐르는지 확인이 이루어질 수 있다. 예시적으로, 채널의 한쪽 끝에 에탄올을 흘려주어 채널을 따라 흐르도록 하고 에탄올이 어느 정도 흐르는 것이 확인이 되면 유체를 PBS로 교체하고 기울여서 흘려준다. PBS가 잘 흐르면 유체를 배지로 교체하여 기울여서 흘려주고 잘 흐르는지 확인이 이루어질 수 있다.

다음으로, 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 준비하는 단계(S100)에 있어서, 칩 구조체 내에서 장 세포(3111) 및 간 세포(2111)의 배양이 이루어질 수 있다.

먼저, 장 세포(3111) 배양에 대해 설명한다.

예를 들어, Caco-2 세포 2x105 cells/ml의 농도로 100 μL가 장 챔버(311)에 주입될 수 있다 예시적으로, 1 일 내지 2 일에 한 번 씩 배지(DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco, 10 (v/v)% Fetal bovine serum, Welgene, 1(v/v)% Penicilin&streptomycin, Sigma)의 교체가 이루어질 수 있다. 세포가 배양된 칩은 square dish안에 넣어지고, 배지가 마르지 않도록 수분을 유지하기 위해 멸균 처리가 된 필터용 종이가 PBS에 적셔 함께 square dish에 넣어 진다. 총 14일간 배양하는데 7일 동안은 세포가 잘 달라붙고 자라나기 위해 정적인 환경을 유지할 수 있다.. 또한, 나머지 7일 동안은 square dish를 gravity flow machine위에 올려두어 흐름을 공급하여 배양할 수 있다.

한편, 생체 모사 마이크로 칩(1000)이 3차원 콜라겐 세포지지체를 포함하는 경우, 장 세포(3111)는 이하와 같은 방법에 의해 배양될 수 있다.

먼저, 3차원 콜라겐 세포지지체에서 돌기 부분을 제외한 주변부 collagen은 장 챔버(311)에 배치될 수 있도록, 다듬어질 수 있다. 예를 들어, 메스나 면도칼에 의해 다듬어질 수 있다. 또한, 혼합 콜라겐이 제조될 수 있는데, Type Ⅰ collagen 480 μL와 10X DMEM media 50 μL, 1 N NaOH in PBS 20 μL가 혼합되어 혼합 콜라겐을 이룰 수 있다. 다음으로, 생체 모사 마이크로 칩(1000)의 멤브레인(5)에 혼합 콜라겐이 배치될 수 있다. 예를 들어 혼합 콜라겐 약 10 μL가 멤브레인(5)상에 균일하게 적층될 수 있다. 다음으로, 3차원 콜라겐 세포지지체가 멤브레인(5)에 배치될 수 있는데, 3차원 콜라겐 세포지지체는 핀셋에 의해 집어져 멤브레인(5)에 배치될 수 있고, 멤브레인(5)에 붙을 수 있다. 이 후, 예를 들어, 36 ℃ 인큐베이터에서 30 분간 경화가 이루어질 수 있다. 또한, 혼합 collagen 을 더욱 견고하게 만들기 위해 PBS에 0.1 (v/v)%의 농도로 glutaraldehyde을 녹인 용액을 200 μl 를 넣어 36 ℃ incubator에서 1 시간 처리해줄 수 있다. 다음으로, 1 M HCl solution에 L-glutamic acid를 7 (w/v)%의 농도로 녹인 용액을 칩의 장 챔버(3111)에 200 μl 넣어 36 ℃ incubator에서 4 시간 처리한 뒤 제거한다. 다음으로, PBS를 하루에 한번 교체하고 이 과정을 3 회 이상 진행하여 혼합 콜라겐에 남은 독성 및 산성 용액을 제거한다. 이후에 Caco-2 세포를 장 챔버(311)에 주입한다. 예시적으로, Caco-2를 2x105 cells/ml의 농도로 포함하는 용액 100 μL가 장 챔버(311)에 주입될 수 있다. 다음으로, 1 일 내지 2 일에 한번씩 DMEM이 교체될 수 있다. 장 세포(3111)가 배양되는 칩 구조체는 square dish 안에 배치될 수 있고, 배지가 마르지 않도록 수분을 유지하기 위해 멸균 처리가 된 필터용 종이가 PBS에 적셔져 square dish에 함께 배치될 수 있다. 총 14일간 배양될 수 있는데, 7일 동안은 장 세포(3111)가 잘 달라붙고 자라나도록 환경을 조성해준다. 나머지 7일 동안은 square dish를 gravity flow machine위에 올려두어 배지의 흐름을 공급하며 장 세포(3111)를 배양할 수 있다.

또한, 장 세포(3111)가 배양된 다음 소정의 기간(예를 들면 11일)이 경과하고 나서 간 세포(2111)가 배양될 수 있다. 간 세포(2111) 배양은 예시적으로 이하와 같이 이루어질 수 있다.

간 세포(2111)를 배양하기 전, 베이스 층(1)에 간 세포(2111)를 부착시키기 위해 Fibronentin(F0895, Sigma Aldrich) 용액을 간 리저버(41, 42)에 주입하여 베이스 층(1) 표면에 punch 처리해 세포가 잘 부착될 수 있는 환경을 만들어준다. 예를 들어, 상기 용액은 5μg/mL가 사용될 수 있다. 다음으로, fibronectin 용액이 주입된 하나의 리저버와 반대편에 형성된 다른 리저버로 유출되도록 칩 구조체를 기울이는데, 이를 2 번 반복한다. 다음으로, 한 시간 동안 인큐베이터에서 코팅한 후, 칩 구조체를 DMEM으로 washing한다. 다음으로, HepG2가 포함된 용액을 2x105 cells/ml의 농도로 준비한다. 남아 있는 DMEM을 모두 제거하고 yellow tip을 사용하여 HepG2가 포함된 용액을 주입한다. 소정 시간, 이를테면, 4 시간 후에 간 리저버(41, 42) 및 장 리저버(43, 44, 45)에 DMEM을 모두 채워준다. DMEM은 1 일 내지 2 일에 한번 씩 교체한다.

또한, 상술한 바와 같이, 간 세포(2111)는 지방세포가 시딩될 때 시딩될 수 있다.

또한, 본 인공 지방간 형성 방법은 장 세포(3111)와 간 세포(2111)가 개별적으로 지직실질의 기능을 발현할 수 있도록 배지의 공급 속도, 세포의 농도, 배양 기간을 조절할 수 있다. 참고로, 배지의 공급 속도는 중력 유동 디바이스(Gravity-flow device)에 의해 조절될 수 있다. 중력 유동 디바이스를 이용한 유체 공급 방식을 이용해 생리적인 범위 내에서 미세유체 칩의 배지 공급 속도를 조절할 수 있다.

중력 유동 디바이스는 기기와 연결된 컴퓨터의 Lab view 프로그램을 통해 기울기와 기울기 속도, 머무름 시간을 자동화 할 수 있는 장치이다. 이 기기를 이용하여 배지가 일정한 volume flow rate을 가지고 흐를 수 있게 할 수 있다. 또한, 파라미터(parameter(기울임 속도, 기울기, 머무름 시간))가 Lab view 프로그램에 입력되면 중력 유동 디바이스가 입력된 파라미터 값에 따라 작동하므로, 생체 모사 마이크로 칩의 구동이 자동화될 수 있다. 예시적으로, 기울임 속도는 0.1 degree/s, 기울기는 10 degrees, 머무름 시간은 500 s 등으로 파라미터가 설정될 수 있다.

이와 같이, 본원은 실린지 펌프 없이 칩 속 유체의 흐름을 제어할 수 있는 시스템으로써 기존 방식에 비해 사용자 편의성과 재현성을 증대함으로써 실험의 효율성을 극대화 시켰다. 현재까지 개발된 장기 온어 칩 시스템의 경우 일반적으로 펌프와 연결되어 구동되도록 설계되어 있고 오염 및 누수 등의 단점이 많다. 반면에, 본원에 의하면 펌프의 필요가 없으므로, 사용법을 익히는데 진입 장벽이 낮고, 보다 많은 연구자들이 사용할 수 있는 시스템이 구현될 수 있다. 이에 따라, 미세유체 칩 또는 장기 온어 칩 기술의 활용도와 산업화 가능성을 높일 수 있다.

참고로, 장기 온어 칩 기술이라 함은, 미세 공정 기술로 제작한 미세 유체 채널이 구현된 칩 위에 특정 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써, 해당 장기의 기능과 특성뿐만 아니라, 세포운동이나 물리 화학적 반응의 메커니즘을 상세하게 연구할 수 있는 기술이다. 또한 다종의 조직 또는 장기 세포를 다중 장기 온어 칩 기술을 이용하여 동시에 배양하면 다종의 세포 또는 조직 간의 물리 화학적 세포 환경과 상호작용을 구현할 수 있어 보다 인체와 유사한 모델로서 주목되고 있는 기술이다. 또한, 각 장기의 역할이나 기능에 대하여 타 장기나 조직이 어떠한 영향을 미치는지, 더 고차원적인 연구가 가능하며, 신약개발이나 독성평가에 대한 모델로서 이용될 것으로 기대 받고 있다. 본원은 이러한 장기 온어 칩 기술의 활용도와 산업화 가능성을 높일 수 있다.

이하에서는, 본원의 일 실시예에 따른 지방간 분석 방법(이하 '본 지방간 분석 방법'이라 함)에 대해 설명한다. 참고로, 본 지방간 분석 방법에 있어서, 지방간은 인공 지방간일 수 있다.

본 지방간 분석 방법은 상술한 본 인공 지방간 형성 방법에 따른 인공 지방간 형성 방법에 의해 지방간 칩을 제조하는 단계를 포함한다.

상술한 바와 같이 본 인공 지방간 형성 방법은 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 이용하는 것이므로, 지방간 칩은 베이스 층(1), 베이스 층(1) 상에 적층되고 간 채널부(21)가 형성되는 간 층(2), 간 층(2) 상에 적층되고 장 채널부(31)가 형성되는 장 층(3) 및 장 층(3) 상에 적층되고 간 채널부(21)와 연결되는 간 리저버(41, 42) 및 장 채널부(31)와 연결되는 장 리저버(43, 44, 45)가 형성되는 리저버 층(4)을 포함할 수 있다. 또한, 간 채널부(21)는 간 세포(2111)가 배치되는 간 챔버(211)를 포함할 수 있다. 또한, 장 채널부(31)는 간 챔버(211)와 상측으로 연결되는 장 챔버(311)를 포함할 수 있다. 장 세포(3111)는 간 층(2)과 장 층(3) 사이에 개재되는 멤브레인(5) 상에 직접적으로 또는 간접적으로 안착되어 장 챔버(311)에 배치될 수 있다.

또한, 본 지방간 분석 방법은 간 세포(2111)를 고정하는 단계를 포함할 수 있다.

도 9는 본 지방간 분석 방법의 리저버 유닛이 간 층 상에 배치되는 것을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.

도 9를 참조하면, 간 세포(2111)를 고정하는 단계는 생체 모사 마이크로 칩(1000)에서 리저버 층(4), 장 층(3) 및 멤브레인(5)을 분리하고, 리저버 홀(61)이 형성된 리저버 유닛(6)을 리저버 홀(61)이 간 챔버(211)와 상측으로 연결되도록 간 층(2) 상에 배치하는 단계를 포함할 수 있다. 참고로, 리저버 층(4), 장 층(3) 및 멤브레인(5)의 분리는 상술한 S500 단계 이후에 조심스럽게 수행될 수 있다. 또한, 리저버 유닛(6)은 PDMS 레이어(layer)에 8 mm biopsy punch에 의해 간 챔버(211)에 대응되는 홀(구멍)이 형성됨으로써 제조될 수 있다. 그 후 리저버 유닛(6)은 간 층(2) 상에 배치될 수 있다.

도 10은 본 지방간 분석 방법의 간 챔버를 fixative 용액으로 처리하는 것을 설명하기 위한 개략적인 단면도이다.

도 10을 참조하면, 간 세포(2111)를 고정하는 단계는 리저버 유닛(6)을 통해 간 챔버(211)를 fixative 용액으로 처리하고 워싱(washing) 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적으로, 이 단계는 포름알데하이드(Formaldehyde) 40 wt%(10X)를 PBS에 1:10 농도로 희석하여 fixative 용액을 준비하고, fixative 용액을 간 챔버(211)에 소정 양으로(예를 들어 100 μL씩) 처리하고 소정 시간(15 분) 동안 대기할 수 있다. 소정 시간이 지난 후, 키트(kit)에 동봉된 워시 솔루션(wash solution) 소정 양(예를 들어 100 μL)로 소정 시간(이를테면 5분)으로 소정 횟수(이를 테면 2 번)로 간 챔버(211)에 남은 fixative용액을 씻어내고 음압 흄 후드(fume hood)에서 지방간 칩을 완전히 말릴 수 있다.

도 11은 본 지방간 분석 방법의 간 세포를 염색하는 것을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.

도 11을 참조하면, 본 지방간 분석 방법은 간 세포(2111)를 염색하는 단계를 포함할 수 있다.

간 세포(2111)를 염색하는 단계는 Oil red O working solution으로 간 세포(2111)를 염색할 수 있다. 예시적으로, 본 지방간 분석 방법은 Oil red O 용액을 증류수에 60 %의 농도로 희석한 후, 0.45 μm syringe filter로 여과하여 Oil red O working solution을 준비할 수 있다. 이후 간 챔버(211)에 Oil red O working solution을 소정량(이를테면, 100 μL씩) 1회 넣은 후, 소정 시간(20분) 대기하고, 그 후, Oil red O solution을 제거하고 증류수로 붉은색이 나오지 않을 때 까지 여러 번 워싱할 수 있다. 또한, wash solution 100 μL로 2번씩 5분간 워싱할 수 있다. 그 후, wash solution을 제거하고 음압의 흄 후드에서 지방간 칩을 방치시켜 완전히 말릴 수 있다.

도 12는 본 지방간 분석 방법의 간 세포를 분석하는 것을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.

도 12를 참조하면, 본 지방간 분석 방법은 지방간을 형성한 간 세포(2111)를 분석하는 단계를 포함한다. 예시적으로, 간 세포(2111)를 분석하는 단계는 간 채널부(21)를 소정의 시간 동안 dye extraction solution으로 처리하여 상기 간 세포에 대해 소정의 파장으로 흡광도를 측정할 수 있다. 예를 들어, 간 세포(2111)를 분석하는 단계는 간 챔버(211)에 dye extraction solution을 100 μL 씩 넣어주고 부드럽게 15~20분간 섞어준 후 490 nm 내지 520 nm의 파장으로 흡광도를 측정할 수 있다.

도 13은 유리지방산을 처리를 하지 않은 간 세포(2111)를 oil red O로 염색한 현미경 사진이고, 도 14는 3.8 mM 농도로 유리지방산이 포함된 용액으로 간 세포(2111)를 처리한 후, 간 세포(2111)를 oil red O로 염색한 현미경 사진이며, 도 15는 도 13의 간 세포(2111)와 도 14의 간 세포(2111) 각각의 색소 추출후의 흡광도를 500 nm에서 측정한 결과를 도시한 그래프이다. 흡광도를 측정한 후의 결과는 도 15와 같이 정리될 수 있다.

상술한 바에 따르면, 본원은 항비만 기능성 물질의 스크리닝이 가능한 다중 장기 온 어 칩의 설계 및 제조방법에 관한 것으로 (장/간의) 초회통과 후 지방간 생성을 억제하는 물질들을 평가할 수 있는 항비만 연구 기술이라 할 수 있다.

또한, 본원은 상술한 본 인공 지방간 형성 방법에 의해 제조되는 지방간 칩을 제공한다. 본원에 의한 지방간 칩은 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 포함한다. 간 세포(2111)는 장 세포(3111)를 통과하여 공급된 유리지방산에 의해 지방이 축적된 것이다.

도 2를 참조하면, 상기 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 배양된 장 세포(Caco-2)(3111)가 배치되고 유입되는 물질이 장 세포(3111)를 통과하도록 형성되는 장 채널부(31)를 포함한다. 또한, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 배양된 간 세포(HepG2)(2111)가 배치되고 장 세포(3111)를 통과한 물질 중 적어도 일부가 간 세포(2111)와 접촉되도록 장 채널부(31)와 연결되는 간 채널부(21)를 포함한다.

예시적으로, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 베이스 층(1), 베이스 층(1) 상에 적층되고 간 채널부(21)가 형성되는 간 층(2), 간 층(2) 상에 적층되고 장 채널부(31)가 형성되는 장 층(3) 및 장 층(3) 상에 적층되고 간 채널부(21)와 연결되는 간 리저버(41, 42) 및 장 채널부(31)와 연결되는 장 리저버(43, 44, 45)가 형성되는 리저버 층(4)을 포함할 수 있다. 참고로, 리저버 층(4)은 배양액이 담기는 저장 층 역할을 할 수 있다.

생체 모사 마이크로 칩(1000)에서, 유리지방산(FFA(free fatty acid))이 장 세포(3111)를 통과하여 간 세포(2111)에 공급됨으로써, 간 세포(2111)에는 인공 지방간이 형성될 수 있다. 이러한 인공 지방간 형성을 위해, 유리지방산은 장 채널부(31)에 유입될 수 있다. 이러한 생체 모사 마이크로 칩(1000)에 대한 설명은 전술한 인공 지방간 형성 방법에서 기서술된 바 있으므로 상세한 설명은 생략하기로 한다.

또한, 본원은 상술한 인공 지방간 형성 방법에 의해 제조되는 지방간-지방세포 칩을 제공한다. 본원에 의한 지방간-지방세포 칩은 생체 모사 마이크로 칩(1000)을 포함한다. 간 세포(2111)는 장 세포를 통과하여 공급된 유리지방산에 의해 지방이 축적된 것이다. 또한, 생체 모사 마이크로 칩은 간 채널부(21)와 연결되는 지방세포 챔버(221)를 포함한다.

상기 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 배양된 장 세포 (3111)가 배치되고 유입되는 물질이 장 세포(3111)를 통과하도록 형성되는 장 채널부(31)를 포함한다. 도 6을 참조하면, 장 채널부(31)는 장 챔버(311)를 포함할 수 있다. 장 세포(3111)는 장 챔버(311)에 배치될 수 있다.

또한, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 배양된 간 세포(2111)가 배치되고 장 세포(3111)를 통과한 물질 중 적어도 일부가 간 세포(2111)와 접촉되도록 장 채널부(31)와 연결되는 간 채널부(21)를 포함한다. 간 채널부(21)는 간 챔버(211)를 포함할 수 있다. 간 세포(2111)는 간 챔버(211)에 배치될 수 있다. 또한, 도 7 을 참조하면, 장 챔버(311)는 간 챔버(211)의 상측과 연결될 수 있다. 또한, 도 6을 참조하면, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 간 채널부(21)와 연결되는 간 리저버(41, 42) 장 채널부(31)와 연결되는 장 리저버(43, 44, 45)를 포함할 수 있다.

또한, 생체 모사 마이크로 칩(1000)에서, 유리지방산(FFA(free fatty acid))이 장 세포(3111)를 통과하여 간 세포(2111)에 공급됨으로써, 간 세포(2111)에는 인공 지방간이 형성될 수 있다. 이러한 인공 지방간 형성을 위해, 유리지방산은 장 채널부(31)에 유입될 수 있다.

또한, 도 6을 참조하면, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 간 챔버(211)와 연결되는 지방세포 챔버(221)를 포함한다. 예시적으로, 지방세포 챔버(221)는 지방세포가 간 세포(2112)와 동일한 층 레벨에서 배양되도록 형성될 수 있는데, 예를 들어, 도 7을 참조하면, 지방세포 챔버(221)는 간 층(2)에 형성될 수 있다. 또한, 지방세포 챔버(221)에는 지방세포가 배치될 수 있다. 또한, 생체 모사 마이크로 칩(1000)은 지방세포 리저버(48, 49) 및 간 세포와 지방세포의 물질교환을 위한 리저버(46, 47)를 포함할 수 있다. 이러한 생체 모사 마이크로 칩(1000)에 대한 설명은 전술한 인공 지방간 형성 방법에서 기서술된 바 있으므로 상세한 설명은 생략하기로 한다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

1000: 생체 모사 마이크로 칩
1: 베이스 층
2: 간 층
21: 간 채널부
211: 간 챔버
2111: 간 세포
221: 지방세포 챔버
3: 장 층
31: 창 채널부
311: 장 챔버
3111: 장 세포
4: 리저버 층
41: 간 리저버
42: 간 리저버
43: 장 리저버
44: 장 리저버
45: 장 리저버
46: 물질교환을 위한 리저버
47: 물질교환을 위한 리저버
48: 지방세포 리저버
49: 지방세포 리저버
6: 리저버 유닛
61: 리저버 홀

Claims

(a) 배양된 장 세포가 배치되고 유입되는 물질이 상기 장 세포를 통과하도록 형성되는 장 채널부, 및 배양된 간 세포가 배치되고 상기 장 세포를 통과한 물질 중 적어도 일부가 상기 간 세포와 접촉되도록 상기 장 채널부와 연결되는 간 채널부를 포함하는 생체 모사 마이크로 칩을 준비하는 단계; 및
(b) 유리지방산(FFA(free fatty acid))이 상기 장 세포를 통과하여 상기 간 세포에 공급되어 인공 지방간이 형성되도록, 유리지방산을 상기 장 채널부에 유입시키는 단계를 포함하는, 인공 지방간 형성 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는,
상기 장 채널부와 상기 간 채널부를 소정의 시간 동안 유리지방산이 포함된 용액으로 처리하는 것인, 인공 지방간 형성 방법.
제2항에 있어서,
상기 유리지방산이 포함된 용액은, 인체에서 지방이 위를 지나 췌장리파제(pancreatic lipase)에 의해 분해되어 장으로 유입되는 흐름이 모사되도록, 올레인산(oleic acid)과 팔미트산(palmitic acid)을 혼합하여 제조되는 것인, 인공 지방간 형성 방법.
제3항에 있어서,
상기 유리지방산이 포함된 용액은, 올레인산(oleic acid)과 팔미트산(palmitic acid)을 혼합한 다음 Sodium taurocholate를 첨가하고 쉐이킹(shaking)하여 마이셀(micelle)을 형성하는 것인, 인공 지방간 형성 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계와 상기 (b) 단계 사이에,
(c) 상기 장 세포 및 상기 간 세포에 대해 starvation을 수행하는 단계를 포함하는, 인공 지방간 형성 방법.
제5항에 있어서,
상기 (c) 단계는, 세포 주기가 동기화되고 세포 증식이 제한되도록 FBS를 포함하지 않고 BSA 및 P/S를 첨가한 DMEM으로 starvation을 수행하는 것인, 인공 지방간 형성 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서, 상기 생체 모사 마이크로 칩은 상기 간 채널부에서 간 세포가 위치하는 간 챔버와 연결되는 지방세포 챔버를 포함하도록 준비되고,
상기 지방세포 챔버에는 배양된 지방세포가 구비되는 것인, 인공 지방간 형성 방법.
제7항에 있어서,
상기 (a) 단계에서, 상기 간 세포의 시딩(seeding)은 상기 장 세포가 배양되고 나서 상기 간 세포가 포함된 용액이 상기 간 챔버로 공급되어 이루어지고, 상기 지방세포의 시딩은 상기 장 세포가 배양되고 나서 상기 지방세포가 포함된 용액이 상기 지방세포 챔버로 공급되어 이루어지는 것인, 인공 지방간 형성 방법.
(a) 제1항에 따른 인공 지방간 형성 방법에 의해 생체 모사 마이크로 칩에 인공 지방간을 형성하여, 인공 지방간이 형성된 지방간 칩을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 인공 지방간을 형성한 간 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 지방간 분석 방법.
제9항에 있어서,
상기 (a) 단계에서, 상기 생체 모사 마이크로 칩은,
베이스 층;
상기 베이스 층 상에 적층되고 상기 간 채널부가 형성되는 간 층;
상기 간 층 상에 적층되고 상기 장 채널부가 형성되는 장 층; 및
상기 장 층 상에 적층되고 상기 간 채널부와 연결되는 간 리저버 및 상기 장 채널부와 연결되는 장 리저버가 형성되는 리저버 층을 포함하되,
상기 간 채널부는 간 세포가 배치되는 간 챔버를 포함하고,
상기 장 채널부는 상기 간 챔버와 상측으로 연결되는 장 챔버를 포함하며,
상기 장 세포는 상기 간 층과 상기 장 층 사이에 개재되는 멤브레인 상에 직접적으로 또는 간접적으로 안착되어 상기 장 챔버에 배치되는 것인, 지방간 분석 방법.
제10항에 있어서,
상기 (a) 단계와 상기 (b) 단계 사이에,
(c) 상기 간 세포를 고정하는 단계; 및
(d) 상기 간 세포를 염색하는 단계를 포함하는, 지방간 분석 방법.
제11항에 있어서,
상기 (c) 단계는,
(c1) 상기 생체 모사 마이크로 칩에서 상기 리저버 층, 상기 장 층 및 상기 멤브레인을 분리하고, 리저버 홀이 형성된 리저버 유닛을 상기 리저버 홀이 상기 간 챔버와 상측으로 연결되도록 상기 간 층 상에 배치하는 단계; 및
(c2) 상기 리저버 유닛을 통해 상기 간 챔버를 fixative 용액으로 처리하고 워싱(washing) 및 건조하는 단계를 포함하는 것인, 지방간 분석 방법.
제12항에 있어서,
상기 (c2) 단계에서, 상기 fixative 용액은 포름알데하이드(Formaldehyde) 40 wt% 와 PBS가 wt% 기준 1:10 농도로 희석된 것인, 지방간 분석 방법.
제11항에 있어서,
상기 (d) 단계는 Oil red O working solution으로 상기 간 세포를 염색하고,
상기 (b) 단계는 상기 간 채널부를 소정의 시간 동안 dye extraction solution으로 처리하여 상기 간 세포에 대해 소정의 파장으로 흡광도를 측정하는 것인, 지방간 분석 방법.
제1항에 따른 인공 지방간 형성 방법에 의해 생체 모사 마이크로 칩에 인공 지방간을 형성하여 제조되는 지방간 칩으로서,
상기 생체 모사 마이크로 칩을 포함하되,
상기 간 세포는 상기 장 세포를 통과하여 공급된 유리지방산에 의해 지방이 축적되는 것인, 지방간 칩.
제7항에 따른 인공 지방간 형성 방법에 의해 생체 모사 마이크로 칩에 인공 지방간을 형성하여 제조되는 지방간-지방세포 칩으로서,
상기 생체 모사 마이크로 칩을 포함하되,
상기 간 세포에는 상기 장 세포를 통과하여 공급된 유리지방산에 의해 지방이 축적되고,
상기 생체 모사 마이크로 칩은 상기 간 채널부와 연결되는 지방세포 챔버를 더 포함하는 것인, 지방간-지방세포 칩.