PL238703B1 - Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych - Google Patents
Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych Download PDFInfo
- Publication number
- PL238703B1 PL238703B1 PL420395A PL42039517A PL238703B1 PL 238703 B1 PL238703 B1 PL 238703B1 PL 420395 A PL420395 A PL 420395A PL 42039517 A PL42039517 A PL 42039517A PL 238703 B1 PL238703 B1 PL 238703B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hydrogel
- layer
- layers
- glass
- elastomer
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 22
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title description 10
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 83
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 60
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 claims description 22
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 claims description 21
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 21
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 18
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 17
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 16
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 14
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 claims description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 11
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002346 layers by function Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 7
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 5
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 5
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 239000003522 acrylic cement Substances 0.000 claims description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 claims description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 claims description 2
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 2
- ARJOQCYCJMAIFR-UHFFFAOYSA-N prop-2-enoyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OC(=O)C=C ARJOQCYCJMAIFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920006267 polyester film Polymers 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 3
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 3
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 2
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000010147 laser engraving Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 150000003961 organosilicon compounds Chemical group 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000016 photochemical curing Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B38/00—Ancillary operations in connection with laminating processes
- B32B38/0004—Cutting, tearing or severing, e.g. bursting; Cutter details
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B17/00—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres
- B32B17/06—Layered products essentially comprising sheet glass, or glass, slag, or like fibres comprising glass as the main or only constituent of a layer, next to another layer of a specific material
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B25/00—Layered products comprising a layer of natural or synthetic rubber
- B32B25/20—Layered products comprising a layer of natural or synthetic rubber comprising silicone rubber
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
- B32B27/06—Layered products comprising a layer of synthetic resin as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material
- B32B27/065—Layered products comprising a layer of synthetic resin as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material of foam
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
- B32B27/06—Layered products comprising a layer of synthetic resin as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material
- B32B27/08—Layered products comprising a layer of synthetic resin as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material of synthetic resin
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
- B32B27/30—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising vinyl (co)polymers; comprising acrylic (co)polymers
- B32B27/308—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising vinyl (co)polymers; comprising acrylic (co)polymers comprising acrylic (co)polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
- B32B27/36—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising polyesters
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B3/00—Layered products comprising a layer with external or internal discontinuities or unevennesses, or a layer of non-planar shape; Layered products comprising a layer having particular features of form
- B32B3/26—Layered products comprising a layer with external or internal discontinuities or unevennesses, or a layer of non-planar shape; Layered products comprising a layer having particular features of form characterised by a particular shape of the outline of the cross-section of a continuous layer; characterised by a layer with cavities or internal voids ; characterised by an apertured layer
- B32B3/266—Layered products comprising a layer with external or internal discontinuities or unevennesses, or a layer of non-planar shape; Layered products comprising a layer having particular features of form characterised by a particular shape of the outline of the cross-section of a continuous layer; characterised by a layer with cavities or internal voids ; characterised by an apertured layer characterised by an apertured layer, the apertures going through the whole thickness of the layer, e.g. expanded metal, perforated layer, slit layer regular cells B32B3/12
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B3/00—Layered products comprising a layer with external or internal discontinuities or unevennesses, or a layer of non-planar shape; Layered products comprising a layer having particular features of form
- B32B3/26—Layered products comprising a layer with external or internal discontinuities or unevennesses, or a layer of non-planar shape; Layered products comprising a layer having particular features of form characterised by a particular shape of the outline of the cross-section of a continuous layer; characterised by a layer with cavities or internal voids ; characterised by an apertured layer
- B32B3/30—Layered products comprising a layer with external or internal discontinuities or unevennesses, or a layer of non-planar shape; Layered products comprising a layer having particular features of form characterised by a particular shape of the outline of the cross-section of a continuous layer; characterised by a layer with cavities or internal voids ; characterised by an apertured layer characterised by a layer formed with recesses or projections, e.g. hollows, grooves, protuberances, ribs
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B7/00—Layered products characterised by the relation between layers; Layered products characterised by the relative orientation of features between layers, or by the relative values of a measurable parameter between layers, i.e. products comprising layers having different physical, chemical or physicochemical properties; Layered products characterised by the interconnection of layers
- B32B7/04—Interconnection of layers
- B32B7/12—Interconnection of layers using interposed adhesives or interposed materials with bonding properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
- B81C—PROCESSES OR APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS
- B81C1/00—Manufacture or treatment of devices or systems in or on a substrate
- B81C1/00015—Manufacture or treatment of devices or systems in or on a substrate for manufacturing microsystems
- B81C1/00023—Manufacture or treatment of devices or systems in or on a substrate for manufacturing microsystems without movable or flexible elements
- B81C1/00119—Arrangement of basic structures like cavities or channels, e.g. suitable for microfluidic systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2250/00—Layers arrangement
- B32B2250/02—2 layers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2250/00—Layers arrangement
- B32B2250/24—All layers being polymeric
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2255/00—Coating on the layer surface
- B32B2255/10—Coating on the layer surface on synthetic resin layer or on natural or synthetic rubber layer
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2266/00—Composition of foam
- B32B2266/12—Gel
- B32B2266/122—Hydrogel, i.e. a gel containing an aqueous composition
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2307/00—Properties of the layers or laminate
- B32B2307/70—Other properties
- B32B2307/714—Inert, i.e. inert to chemical degradation, corrosion
- B32B2307/7145—Rot proof, resistant to bacteria, mildew, mould, fungi
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2310/00—Treatment by energy or chemical effects
- B32B2310/08—Treatment by energy or chemical effects by wave energy or particle radiation
- B32B2310/0806—Treatment by energy or chemical effects by wave energy or particle radiation using electromagnetic radiation
- B32B2310/0843—Treatment by energy or chemical effects by wave energy or particle radiation using electromagnetic radiation using laser
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2315/00—Other materials containing non-metallic inorganic compounds not provided for in groups B32B2311/00 - B32B2313/04
- B32B2315/08—Glass
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B2457/00—Electrical equipment
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B37/00—Methods or apparatus for laminating, e.g. by curing or by ultrasonic bonding
- B32B37/12—Methods or apparatus for laminating, e.g. by curing or by ultrasonic bonding characterised by using adhesives
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
- B81B—MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS, e.g. MICROMECHANICAL DEVICES
- B81B2201/00—Specific applications of microelectromechanical systems
- B81B2201/05—Microfluidics
- B81B2201/058—Microfluidics not provided for in B81B2201/051 - B81B2201/054
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
- B81C—PROCESSES OR APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS
- B81C2203/00—Forming microstructural systems
- B81C2203/03—Bonding two components
- B81C2203/032—Gluing
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania urządzenia mikrofluidalnego (bioczipu) do prowadzenia hodowli tkankowych w układzie przepływowym oraz prowadzenia badań procesów biologicznych przebiegających w obrębie sztucznych tkanek. Mikrourządzenia tego typu znajdują zastosowanie w biologii, medycynie, farmacji, biotechnologii, inżynierii biomedycznej i inżynierii tkankowej do prowadzenia badań mechanizmów różnicowania komórek oraz sposobów sygnalizacji międzykomórkowej, badań odpowiedzi tkanek na uszkodzenia o podłożu fizycznym, chemicznym i biologicznym oraz wzrostu tkanki nowotworowej w obecności czynników bioaktywnych i cytostatyków. Urządzenia te umożliwiają wytworzenie in silico warunków dynamicznych będących efektem przepływu płynu w naczyniach układu krwionośnego i limfatycznego oraz w obrębie macierzy zewnątrzkomórkowej, naśladujących zjawiska obecne w organizmach żywych, a niemożliwe do odwzorowania in vitro podczas klasycznych hodowli tkankowych: kulturach zawiesinowych, na podłożach stałych i rusztowaniach. Sposób wytwarzania urządzeń mikrofluidalnych do prowadzenia hodowli tkankowych umożliwia bezpośrednie wytwarzanie złożonych trójwymiarowych struktur hydrożelowych o zadanej, powtarzalnej geometrii mikrokanałów w obrębie komór hodowlanych, bez potrzeby stosowania półprzepuszczalnych membran, przez co znajduje zastosowanie w produkcji masowej mikrourządzeń. Ponadto, wykorzystanie materiałów hydrożelowych umożliwia spontaniczne, samoistne formowanie nowych naczyń włosowatych w obrębie hodowanych tkanek w obecności czynników proangiogennych, przez co lepiej naśladuje warunki wzrostu komórek in vivo. Dzięki wykorzystaniu materiałów przepuszczalnych dla światła widzialnego oraz promieniowania ultrafioletowego (UV) metoda umożliwia fabrykację mikroukładów przeznaczonych do prowadzenia obserwacji i detekcji z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej - klasycznej techniki powszechnie wykorzystywanej w badaniach materiałów biologicznych.
Inżynieria sztucznych tkanek jest przyszłościową dziedziną dającą nadzieję na rozwiązanie problemów pacjentów cierpiących z powodu nieodwracalnych uszkodzeń narządów będących następstwem chorób, urazów oraz ich degeneracji (Robert Langer, Joseph P. Vacanti, (1993) Tissue Engineering, Science, New Series, Vol. 260, No. 5110: 920-926). Obecnie trójwymiarowe struktury tkankowe wytwarzane są na bazie porowatych rusztowań, w których wnętrzu zamykane są komórki. Rusztowania te pełnią rolę syntetycznej macierzy zewnątrzkomórkowej i umożliwiają przestrzenną organizację komórek oraz odpowiadają za dostarczanie bodźców fizykochemicznych stymulujących podziały i wzrost komórek w ich obrębie. (Gaharwar AK, Peppas NA Khademhosseini A (2014) Nanocomposite hydrogels for biomedical applications. Biotechnol Bioeng 111:441-453). Technika ta wykorzystana została do wytworzenia wąskiej grupy syntetycznych tkanek, które nie wymagają złożonej struktury naczyniowej: tkanki chrzęstnej i skóry. Wytwarzanie tkanek o złożonej strukturze naczyniowej np. serca czy wątroby napotyka na duże trudności z uwagi na niemożliwość uformowania funkcjonalnej sieci naczyń krwionośnych w ich obrębie, zdolnej do prawidłowego ich odżywiania i natlenienia. Z tego względu obecnie głównym wyzwaniem inżynierii tkankowej jest opracowanie metody formowania naczyń krwionośnych wewnątrz porowatej struktury hydrożelowej, zdolnych do podtrzymania prawidłowej aktywności zamkniętych we wnętrzu macierzy komórek. Można wyróżnić dwa podejścia w tej dziedzinie. Pierwsze polega na dostarczeniu do macierzy hydrożelowej proangiogennych czynników wzrostu, komórek macierzystych oraz komórek śródbłonka i w ten sposób wymuszenie samoistnego formowania sieci naczyniowej wewnątrz sztucznej tkanki (Naito Y, Shinoka T, Duncan D, Hibino N, Solomon D, Cleary M et al (2011) Vascular tissue engineering: towards the next generation vascular grafts. AdvDrug Deliv Rev 63:312-323). Drugie podejście polega na wykorzystaniu technik mikrofabrykacji do uformowania struktury mikrokanałów w hydrożelu przed przeprowadzeniem hodowli komórek w jej wnętrzu. (Zorlutuna P, Annabi N, Camci-Unal G, Nikkhah M, Cha JM, Nichol JW et al (2012) Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater 24:1782-1804). Pierwsza z wymienionych metod jest nieefektywna przy wytwarzaniu stabilnych rozgałęzionych struktur naczyniowych wysokiego poziomu, druga stwarza problemy przy fabrykacji drobnych naczyń włosowatych w obrębie tkanek.
Chociaż konwencjonalne makroskalowe metody hodowli komórkowych znane już od ponad 100 lat pozostają podstawowymi metodami badań w biologii, medycynie i biotechnologii, wysokie wymagania stawiane przez nowo rozwijające się dziedziny medycyny, w tym inżynierię tkankową, wymagają stosowania nowych, precyzyjnych technik do prowadzenia hodowli komórkowych. Hodowle w mikroskali zapewniają lepszą, precyzyjną kontrolę warunków rozwoju komórek i wzajemnej ich interakcji, a przede wszystkim prowadzenie hodowli w warunkach przepływowych, w układzie dynamicznym - wiernie naśladującym zjawiska in vivo. Mikrofluidalne układy do hodowli tkankowych dają możliwość ograniczenia
PL 238 703 B1 wykorzystania modeli zwierzęcych w badaniach nowych leków oraz przyspieszenia badań przedklinicznych z uwagi na wysoką powtarzalność wyników i zgodność sztucznych tkanek z materiałem genetycznym człowieka. Mikrosystemy te nie tylko w lepszy sposób naśladują trójwymiarową mikroarchitekturę tkanek niż hodowle klasyczne, ale oddają specyficzne dla danej tkanki warunki fizyczne. Najbardziej złożone układy mikrofluidalne są w stanie w ograniczonym zakresie odwzorować specyficzne właściwości tkanek płuc, wątroby, nerek oraz układu pokarmowego, a nawet kilku organów jednocześnie dając możliwość prowadzenia badań farmakokinetyczno-farmakodynamicznych nowych leków in silico. (F. Sonntag, et al., (2010), Design and prototyping of a chip-based multi-micro-organoid culture system for substance testing, predictive to human (substance) exposure, J. Biotechnol. 148 (1), 70-75).
W amerykańskim opisie patentowym nr US7960166 (B2) opisano przepływowe mikrourządzenie oraz sposób jego wytwarzania, złożone z dwóch równoległych, prostych kanałów oddzielonych porowatą membraną, przeznaczone do prowadzenia kohodowli komórkowych. Urządzenie umożliwia równoległe prowadzenie hodowli dwóch różnych typów komórek w warunkach przepływowych, a transport substancji odżywczych oraz metabolitów odbywa się przez porowatą membranę pomiędzy kanałami, przez co jedna z komór pełni rolę naczynia krwionośnego, a druga komory hodowlanej. Podobnie z niemieckiego opisu patentowego nr DE102011112638 (B4) znane jest mikrourządzenie złożone z co najmniej jednego przepływowego kanału i jednej komory hodowlanej oddzielonych porowatą membraną do symulacji zjawisk biologicznych zachodzących w naczyniach krwionośnych. Sposób wytwarzania obu mikrosystemów wymaga integracji porowatej membrany wewnątrz urządzenia, co jest technicznie trudne do realizacji i nie daje możliwości formowania złożonych struktur naczyniowych o dowolnej konfiguracji. Amerykański opis patentowy nr US8647861 (B2) dotyczy mikrosystemu do prowadzenia hodowli tkankowych, sposobu jego działania oraz metody wytwarzania mikrourządzenia. Urządzenie złożone jest z centralnego mikrokanału podzielonego za pomocą porowatych membran na wiele równoległych przedziałów wewnątrz których mogą przepływać płyny. Powierzchnia membran została zmodyfikowana za pomocą substancji ułatwiających adhezję komórek do ich powierzchni, co umożliwia formowanie tkanek na zewnętrznych powierzchniach naczyń (kanałów przepływowych), wewnątrz nieprzepływowych komór hodowlanych. Mikrosystem został połączony z układem zbiorników zasilających oraz pomp, a sterowanie układu odbywa się za pomocą komputera.
Sposób wykonania mikrosystemu, podobnie jak w uprzednio omówionych patentach, wymaga rozmieszczenia porowatych, półprzepuszczalnych membran oddzielających kanały i komory mikrosystemu, co jest technicznie trudne do realizacji i nie daje możliwości formowania złożonych struktur naczyniowych o dowolnej konfiguracji oraz nie umożliwia samoorganizacji naczyń wewnątrz hodowanych tkanek. Przez to nie umożliwia oddania w sposób dokładny wewnętrznej struktury dowolnej tkanki. W kolejnym amerykańskim opisie patentowym nr US7622298 (B2) ujawniono metodę in vitro wytwarzania sieci przepuszczalnych naczyń krwionośnych, które są zintegrowane z urządzeniem mikrofluidalnym. Mikronaczynia wytwarzane były poprzez hodowlę komórek śródbłonka na prostych, cylindrycznych, wydłużonych rdzeniach. Po wytworzeniu ścian naczyniowych zanurzano rdzenie otoczone ścianą komórkową w komorze urządzenia mikrofluidalnego wypełnionej hydrożelem, usuwano rdzeń i prowadzono dalszą hodowlę komórek w warunkach przepływowych, stymulując proces spontanicznego formowania naczyń krwionośnych wewnątrz komory. Opisana metoda jest wieloetapowa i żmudna - wymaga przeprowadzenia wstępnej hodowli komórek na rdzeniach oraz precyzyjnej integracji ścian mikronaczyń krwionośnych z komorą mikrourządzenia, co jest technicznie bardzo trudne do realizacji, a proces usuwania rdzeni ze światła naczyń prowadzi do uszkodzeń ich ścian. Opisana metoda nie umożliwia formowania sieci naczyń krwionośnych o zaprojektowanej, powtarzalnej konfiguracji i nie umożliwia efektywnej produkcji seryjnej mikrosystemów o powtarzalnej geometrii naczyń do prowadzenia hodowli tkankowych. Z kolei, z amerykańskiego opisu patentowego nr US9081003 (B2) znany jest mikrosystem oraz układ do symulacji dynamicznych zjawisk mających miejsce in vivo w obrębie tkanek, narządów i trójwymiarowych struktur komórkowych, a będących efektem przepływu płynu w ich obrębie. Urządzenie znajduje zastosowanie przy testowaniu nowych leków oraz badaniu zjawisk transportu towarzyszących dystrybucji leków w guzach nowotworowych, w szczególności w terapiach celowanych. Mikrosystem składał się z komory hodowlanej zaopatrzonej w przegrody i oddzielonej porowatą membraną od kanału pełniącego rolę naczynia krwionośnego. Półprzepuszczalna membrana stanowiła podporę dla hodowli komórkowych i stanowiła barierę oddzielającą kanał zasilający od komory hodowlanej i kanałów limfatycznych. Sposób wytwarzania wielowarstwowego mikrosystemu obejmował wytworzenie elementów mikrourządzenia wieloetapową metodą fotolitograficzną w poli(dimetylosiloksanie)
PL 238 703 B1 (PDMS) i połączenie ich z porowatą półprzepuszczalną membraną, która stanowiła jedną z warstw mikrosystemu. Opisana metoda wytwarzania mikrosystemu jest wieloetapowa i żmudna.
Konstrukcja i sposób jej wykonania nie daje możliwości formowania złożonych struktur naczyniowych o dowolnej konfiguracji oraz nie umożliwia samoorganizacji naczyń wewnątrz hodowanych tkanek. W amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr WO2015153451 (A1) opisano mikrosystem zdolny do wytwarzania substancji biologicznie aktywnych, umożliwiający prowadzenie hodowli tkankowych w warunkach przepływowych. Układ złożony był z kilku równolegle przebiegających kanałów oddzielonych przegrodą posiadającą otwory umożliwiające transport masy pomiędzy kanałami. Sposób wytwarzania mikrosystemu bazował na wieloetapowej metodzie fotolitografii miękkiej i obejmował przygotowanie matryc replikacji z wykorzystaniem wafli krzemowych, powlekanie fotorezystem, przygotowanie fotomasek, naświetlanie UV, wywoływanie fotorezystu, odlewanie warstw funkcjonalnych w PDMS i łączenie elementów, powlekanie powierzchni za pomocą substancji modyfikujących właściwości powierzchniowe mikrokanałów. Opisana metoda jest wieloetapowa, pracochłonna i czasochłonna. Sposób przygotowania wielowarstwowych kokultur komórkowych oraz prowadzenia badań otrzymanych kultur tkankowych w urządzeniu mikrofluidalnym znany jest z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US20060141617 (A1). Urządzenie wyposażone było w prostoliniowe komory hodowlane, w których wnętrzu usytuowane zostały przegrody wykonane z macierzy hydrożelowej oraz hodowanych komórek. Urządzenie zostało wykonane klasyczną metodą fotolitograficzną w PDMS, a powierzchnia kanałów została zmodyfikowana za pomocą związków krzemoorganicznych. Podobnie w amerykańskim opisie patentowym nr US8119394 (B2) opisano urządzenie do prowadzenia trójwymiarowych hodowli komórkowych na powierzchni porowatych membran.
W polskim opisie patentowym nr PL219444 (B1) ujawniono sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego, a w zgłoszeniach patentowych P409877 (A1) oraz P415009 (A1) sposób wytwarzania urządzenia mikrofluidalnego do enkapsulacji substancji aktywnych i sposób wytwarzania urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli komórek nerwowych. W przywołanych dokumentach do wytworzenia urządzenia mikrofluidalnego wykorzystano metodę bezpośrednią bazującą na laserowym grawerowaniu cienkich warstw PDMS oraz łączeniu ich z warstwami szkła i wiekiem z tworzywa sztucznego. Nie ujawniono jednak sposobu wytwarzania urządzeń mikrofluidalnych do prowadzenia hodowli tkankowych, a w szczególności sposobu wytwarzania warstw hydrożelowych oraz metody wytwarzania kanałów w tych warstwach, co stanowi podstawowy element mikrosystemów do prowadzenia hodowli tkankowych. Nie opisano również metody formowania ścian komórkowych na powierzchniach kanałów warstwy hydrożelowej.
Żaden ze znanych sposobów wytwarzania urządzeń mikrofluidalnych do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych nie umożliwia bezpośredniego wytwarzania złożonych, trójwymiarowych, stabilnych i rozgałęzionych struktur naczyniowych wysokiego poziomu o zadanej, powtarzalnej średnicy i przestrzennym rozkładzie w warstwach hydrożelowych i bez potrzeby stosowania półprzepuszczalnych membran, a jednocześnie umożliwia spontaniczne, samoistne formowanie naczyń włosowatych w obrębie hodowanych tkanek w obecności czynników proangiogennych.
W rezultacie wynikła potrzeba opracowania nowego sposobu wytwarzania mikrosystemów do prowadzenia hodowli tkankowych, rozwiązującego powyższe problemy techniczne.
Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych, złożonego z co najmniej sześciu warstw, w tym: dna i wieka, warstwy klejowej, co najmniej jednej pomocniczej warstwy szklanej, co najmniej jednej elastomerowej warstwy funkcjonalnej oraz co najmniej jednej warstwy hydrożelowej, według wynalazku jest pięcioetapowy, przy czym w pierwszym etapie na podstawie uprzednio zaprojektowanych map przygotowanych na podstawie zdjęcia fizycznej struktury układu naczyń krwionośnych w tkance, modelu matematycznego lub zgodnie z założeniami projektowymi w środowisku graficznym CAD każdej z warstw urządzenia, wytwarza się jego elementy - warstwy elastomerowe przygotowuje się poprzez powlekanie nośnika warstwą elastomeru i utrwala, a następnie graweruje i wycina elementy: kanały i mikrokanały naczyniowe i łączące, otwory przelotowe i pozycjonujące oraz komory hodowlane i przegrody poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 μm; pomocnicze warstwy szklane, warstwę klejową oraz dno i wieko mikrourządzenia graweruje się i wycina elementy: otwory rewizyjne, przelotowe i pozycjonujące oraz zbiorniki poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 μm arkuszy materiału; w drugim etapie łączy się bez użycia kleju warstwę elastomerową ze szklaną, po uprzednim naświetleniu powierzchni elastomeru promieniowaniem ultrafioletowym (UV), w zespoły, każdy złożony z jednej warstwy szklanej oraz jednej warstwy elastomerowej na nośniku stanowiącym
PL 238 703 B1 tymczasową postawę zespołu; w trzecim etapie wprowadza się poprzez otwory rewizyjne usytuowane w tymczasowej podstawie zespołu, do wnętrza komór hodowlanych zespołów uprzednio przygotowany ciekły hydrożel i zestala się, a następnie odłącza tymczasową podstawę zespołu i w ten sposób w odsłoniętej warstwie hydrożelowej graweruje mikrokanały naczyniowe, a w przegrodach kanały łączące, poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 ąm; w czwartym etapie łączy się bez użycia kleju warstwę elastomerową ze szklaną, po uprzednim naświetleniu powierzchni elastomeru promieniowaniem ultrafioletowym (UV), jeden lub kilka zespołów wzajemnie lub z dnem, a z wiekiem za pomocą warstwy klejowej; w piątym etapie mikrosystem łączy się z wężami doprowadzającymi i odprowadzającymi płyny z użyciem kleju.
Korzystnie hydrożel przygotowuje się na bazie roztworu kwasu lub bezwodnika akrylowego, alkoholu poliwinylowego, poli(kwasu mlekowego), glikolu polietylenowego, kolagenu, kwasu hialuronowego, alginianu, chitozanu lub ich mieszanin, lub też mieszanin związków wchodzących w skład macierzy zewnątrzkomórkowej, w wodzie lub medium hodowlanym.
Korzystnie hydrożel sterylizuje się poprzez filtrację na hydrofilowym filtrze membranowym o średnicy porów nie większej niż 0,5 mikrometra.
Korzystnie do hydrożelu dodaje się substancje ograniczające wzrost mikroorganizmów, najkorzystniej antybiotyki.
Korzystnie do hydrożelu dodaje się substancje proangiogenne, najkorzystniej czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF.
Korzystnie do hydrożelu dodaje się fibroblasty i komórki macierzyste.
Korzystnie powlekanie nośnika warstwą elastomeru przeprowadza się w powlekaczu obrotowym.
Korzystnie warstwy elastomerowe przygotowuje się poprzez nanoszenie polidimetylosiloksanu (PDMS) na folię poliestrową (PET).
Korzystnie do wykonania wieka i dna urządzenia wykorzystuje się tafle szkła, polimetakrylanu metylu) PMMA lub folii poliestrowej (PET).
Korzystnie do wykonania warstwy klejowej wykorzystuje się komercyjnie dostępne arkusze błony klejowej na bazie kleju akrylowego, dwustronnie osłonięte papierem osłonowym.
Korzystnie utrwalanie warstw PDMS przeprowadza się w suszarce szafkowej lub na płycie grzejnej w temperaturze z zakresu 60-120°C, odpowiednio przez okres od 30 minut do 12 godzin lub w warunkach pokojowych przez okres co najmniej 24 godzin.
Korzystnie parametry wiązki laserowej i przesuwu głowicy laserowej dobiera się tak, by zminimalizować oddziaływanie termiczne wiązki lasera z materiałem poza obszarem cięcia lub grawerowania.
Korzystnie wzajemne pozycjonowanie warstw mikrourządzenia przeprowadza się z wykorzystaniem otworów pozycjonujących rozmieszczonych w tych samych miejscach na każdej z warstw oraz szablonów zaopatrzonych w bolce pozycjonujące, dopasowanych do otworów pozycjonujących.
Korzystnie łączenie warstw elastomerowych ze szklanymi warstwami pomocniczymi w zespoły odbywa się po uprzednim wygrzaniu warstwy szklanej w temperaturze 300°C przez okres co najmniej 30 minut.
Korzystnie warstwy łączy się w sposób hydraulicznie szczelny.
Korzystnie mikrourządzenie łączy się w sposób hydraulicznie szczelny i nierozłączny z wężami doprowadzającymi i odprowadzającymi płyny za pomocą kleju fotoutwardzalnego i naświetla promieniami UV nie krócej niż 30 sekund.
Korzystnie sieć mikrokanałów czyści się i przemywa wodą dejonizowaną, buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) lub wodnym roztworem EDTA i surfaktantu o temperaturze nie wyższej niż 60°C.
Korzystnie w celu immobilizacji komórek wewnątrz mikrokanałów, do mikrourządzenia wprowadza się zawiesinę komórek w medium hodowlanym i pozostawia na okres nie krótszy niż 30 minut.
Korzystnie hodowlę komórek w warunkach przepływowych prowadzi się przy natężeniu przepływu medium hodowlanego nie mniejszym niż 1 ml/24h.
Najkorzystniej do medium hodowlanego dodaje się substancje proangiogenne.
Najkorzystniej do medium hodowlanego dodaje się czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF.
Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych według wynalazku jest ośmioetapowy, a przez to prosty, tani i szybki, umożliwia bezpośrednie - nie wymagające przygotowania fotomasek oraz matryc replikacji, wytwarzanie złożonych trójwymiarowych struktur hydrożelowych o zadanej, powtarzalnej geometrii, bez
PL 238 703 B1 potrzeby wykorzystania półprzepuszczalnych membran, co umożliwia wytworzenie podstawowej, rozgałęzionej sieci naczyniowej o stabilnej strukturze, a także wtórne, spontaniczne i samoistne formowanie naczyń włosowatych w obrębie hodowanych tkanek, a ponadto dzięki wykorzystaniu materiałów przepuszczalnych dla światła widzialnego oraz promieniowania ultrafioletowego (UV) metoda umożliwia fabrykację mikroukładów przeznaczonych do prowadzenia obserwacji i detekcji z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach realizacji.
P r z y k ł a d realizacji 1
Sposób wytworzenia sześciowarstwowego, jednokomorowego, przepływowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkanki łącznej z wykorzystaniem struktury hydrożelowej na bazie kolagenu.
a) Przygotowanie hydrożelu
Przed przystąpieniem do fabrykacji mikrourządzenia przygotowano ciekły hydrożel. W tym celu roztworzono komercyjnie dostępny liofilizowany kolagen typu IV w 0.2% v/v wodnym roztworze kwasu octowego, otrzymując roztwór kolagenu o stężeniu 5 mg/ml. Przed przystąpieniem do przygotowania roztworu wszystkie odczynniki i naczynia schłodzono w komorze chłodniczej do temperatury 4°C, a po przygotowaniu roztwór przechowywano w formie ciekłej w komorze chłodniczej lub w łaźni lodowej w temperaturze nie wyższej niż 4°C. Następnie przygotowano medium hodowlane o składzie: 89% wysokoglukozowego medium hodowlanego DMEM z L-glutaminą, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% roztworu 100X pencyliny/streptomycyny i przechowywano w komorze chłodniczej w temperaturze 4°C. Bezpośrednio przed przestąpieniem do fabrykacji warstwy hydrożelowej oba roztwory połączono w proporcjach objętościowych 1:5 (kolagen:medium) i przefiltrowano na zimno na filtrze strzykawkowym o średnicy porów 0,5 mikrometra. Następnie mieszaninę ogrzano do temperatury 37°C i połączono w proporcjach 10:1 (hydrożel:koncentrat komórek) ze skoncentrowaną zawiesiną komórek mysiego śródbłonka linii L929 (1x107 komórek/mL). Wszystkie operacje przeprowadzano w warunkach sterylnych w komorze laminarnej.
b) Projektowanie urządzenia
Projekt mikrourządzenia mikrofluidalnego o wymiarach 24/60/3,6 mm (szerokość/długość/wysokość) został przygotowany w środowisku graficznym oprogramowania do modelowa przestrzennego typu CAD. Elementy składające się na strukturę czipa rozmieszczono na sześciu warstwach. Otwory wlotowe i wylotowe połączono za pomocą kanałów doprowadzających i odprowadzających płyny oraz otworów przelotowych z komorą hodowlaną. Otwory przelotowe zapewniają przepływ płynu w pionie pomiędzy poszczególnymi warstwami, a kanały umożliwiają przepływ planarny płynu w obrębie jednej warstwy. Komorę hodowlaną wraz z kanałami doprowadzającymi i odprowadzającymi płynu do/z komory rozmieszono na warstwie funkcjonalnej wykonanej z PDMS, przy czym każdy z kanałów został oddzielony hydraulicznie od komory za pomocą poprzecznej przegrody, w której wykonane zostaną mikrokanały łączące przestrzenie kanałów doprowadzających i odprowadzających z komorą hodowlaną. Warstwa funkcjonalna ograniczona została od dołu podstawą, a od góry pomocniczą warstwą szklaną zaopatrzoną w otwory przelotowe oraz otwory rewizyjne, która z kolei połączona jest z wiekiem za pomocą warstwy klejowej, w której zaprojektowano otwory przelotowe. W warstwie hydrożelowej, zlokalizowanej w obrębie komory hodowlanej, na podstawie zdjęcia mikroskopowego tkanki nowotworowej, zaprojektowano rozkład mikrokanałów naczyniowych, naśladujący w wierny sposób rozkład drobnych żyłek i tętniczek w tkance. W wieku na bocznych ścianach rozmieszczono porty przyłączeniowe dla mikrowęży doprowadzających i odprowadzających płyny do/z urządzenia. W wieku rozmieszczono zbiorniki połączone portami przyłączeniowymi mikrowęży oraz z kanałami doprowadzającymi i odprowadzającymi płyny do/z komory hodowlanej. Dodatkowo w czterech narożach każdej z warstw z wyłączeniem warstwy hydrożelowej, rozlokowano otwory pozycjonujące. Trójwymiarowy projekt mikrourządzenia przeniesiono na 6 rysunków dwuwymiarowych - map obrazujących każdą z warstw mikrosystemu. Za pomocą różnych kolorów rozróżniono krawędzie o różnych głębokościach i szerokościach cięcia. Rysunki zaprojektowanego mikrourządzenia zostały bezpośrednio wyeksportowany ze środowiska graficznego CAD do środowiska pracy stacji grawerującej w sposób sekwencyjny kolejno dla każdej z warstw, w ten sposób, że warstwy rysunkowe składające się na projekt jednej warstwy mikrourządzenia zostały wyeksportowane jednocześnie, podczas gdy pozostałe warstwy rysunkowe były wyłączone.
c) Pierwszy etap - fabrykacja elementów mikrourządzenia
Elastomerową warstwę funkcjonalną o grubości 100 mikrometrów wytworzono metodą powlekania obrotowego w powlekaczu obrotowym w ten sposób, że mieszanina prepolimeru PDMS i aktywatora
PL 238 703 B1 polimeryzacji w stosunku wagowym 10:1 została odpowietrzona pod próżną, a następnie zadana w ilości 4 cm3 na wirujący z prędkością 500 obrotów na minutę w komorze roboczej powlekacza dysk o średnicy 80 mm wykonany z przezroczystej folii poliestrowej PET o grubości 150 mikrometrów. Materiał był następnie wirowany przez 1,5 minuty, po czym zmniejszano stopniowo prędkość obrotową dysku przez 1 minutę do zera. W trakcie prowadzenia procesu powlekania w komorze powlekacza wytwarzane było nadciśnienie za pomocą doprowadzonego sprężonego, pozbawionego pyłów suchego powietrza. Następnie folia poliestrowa wraz z naniesioną warstwą elastomeru umieszczona została w szklanej szalce Petriego w suszarce szafkowej, w której zachodził proces polimeryzacji w temperaturze 80°C przez okres 6 godzin. Następnie na powierzchnię polimeru naniesiono arkusz przylegającego papieru osłonowego w celu ochrony przed zabrudzeniem pyłami podczas grawerowania. Gotowe podłoże przechowywano w eksykatorze nad sitami molekularnymi 4A w atmosferze suchego powietrza o wilgotności względnej 1%.
Następnie podłoże z PDMS grawerowano skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 ąm, mocy znamionowej 30 wat, średnicy plamki 25 mikrometrów i maksymalnej prędkości przesuwu głowicy 0,25 m/s, w miejscach w których zgodnie z projektem warstwa elastomeru miała zostać przecięta do powierzchni nośnika. W tym celu dla każdej linii o określonym kolorze przyporządkowano wektorowy tryb pracy stacji grawerującej oraz ustalono moc wiązki laserowej na 0,3% mocy znamionowej, częstotliwość impulsu ustalono na 1000 DPI, prędkość przesuwu głowicy laserowej 0,9% maksymalnej wartości znamionowej, jak również odległość płaszczyzny roboczej od punktu ogniskowania wiązki laserowej na 0,2 mm. Powyższe nastawy umożliwiły przecięcie warstwy PDMS do powierzchni nośnika poliestrowego przy uzyskaniu podstawowej szerokości kanału wynoszącej 45 mikrometrów i przy jednoczesnym ograniczeniu zabrudzenia powierzchni PDMS. Dla uzyskania kanałów o szerokości powyżej 100 mikrometrów w trybie wektorowym przecięto na obrzeżach kanału warstwę elastomeru do powierzchni nośnika, a następnie usunięto mechanicznie PDMS z wnętrza kanału za pomocą ostrego szpikulca pod mikroskopem stereoskopowym. Całkowite przecięcie warstwy PDMS i nośnika poliestrowego, wymagane dla wykonania otworów pozycjonujących, możliwe było dla następujących ustawień urządzenia grawerującego: moc 1,5%, szybkość przesuwu głowicy 1,7%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,2 mm.
Pomocniczą warstwę szklaną wykonano z arkusza szkła borokrzemowego o grubości 150 mikrometrów i wymiarach 24/60 mm. W celu wykonania otworów przelotowych, otworów pozycjonujących oraz otworów rewizyjnych, powierzchnię szkła grawerowano trzykrotnie wodząc po okręgu skupioną wiązką lasera w miejscach, w których zgodnie z projektem warstwa szkła miała zostać przecięta. W tym celu przyporządkowano poszczególnym kolorom linii rysunkowych następujące parametry pracy urządzenia grawerującego: moc 0,4%, szybkość przesuwu głowicy 0,3%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,0 mm.
Warstwę klejową wykonano z komercyjnie dostępnego arkusza błony klejowej z warstwą kleju akrylowego o grubości 100 mikrometrów obustronnie osłoniętej papierem osłonowym. W celu wykonania otworów przelotowych oraz wycięcia geometrii warstwy, powierzchnię arkusza grawerowano wodząc skupioną wiązką lasera w miejscach, w których zgodnie z projektem błona klejowa miała zostać przecięta. W tym celu przyporządkowano poszczególnym kolorom linii rysunkowych następujące parametry pracy urządzenia grawerującego: moc 30%, szybkość przesuwu głowicy 40%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,3 mm. Całkowite przecięcie błony klejowej oraz dwóch warstw papieru osłonowego, wymagane dla wykonania otworów pozycjonujących, możliwe było dla następujących ustawień urządzenia grawerującego: moc 100%, szybkość przesuwu głowicy 40%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,3 mm.
Wieko mikrourządzenia wykonano z PMMA w ten sposób, że arkusz materiału przecięto z wykorzystaniem skupionej wiązki lasera CO2 o mocy 30 wat otrzymując prostokątne arkusze o wymiarach 24/60 mm i grubości 3 mm. W bocznych ścianach podstawy wykonano otwory służące do przyłączenia kapilar doprowadzających i odprowadzających płyny w ten sposób, że wyznaczone miejsca naświetlano wodząc po okręgu skupioną wiązką lasera. Ustawienia lasera były następujące: moc 10%, szybkość przesuwu głowicy 1%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 27 mm, za drugim razem: moc 18%, szybkość przesuwu głowicy 1%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 27 mm. W efekcie otrzymano boczne porty przyłączeniowe dla mikrowęży. Zbiorniki kanałów doprowadzających i odprowadzających płyny do/z zespołu warstw funkcjonalnych czipa wykonano
PL 238 703 B1 w wieku mikrourządzenia w ten sposób, że wyznaczone miejsca naświetlano wodząc po okręgu skupioną wiązką lasera przy zadanych ustawieniach lasera: moc 100%, szybkość przesuwu głowicy 4,5%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 3,0 mm.
Podstawę mikrourządzenia wykonano z folii poliestrowej PET w ten sposób, że arkusz materiału przecinano i wykonywano otwory pozycjonujące z wykorzystaniem skupionej wiązki lasera CO2 o mocy 30 wat, przy nastawach lasera: moc 5%, szybkość przesuwu głowicy 20%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,1 mm.
d) Drugi etap - łączenie warstw w zespoły
W celu połączenia warstwy elastomeru z pomocniczą warstwą szklaną w zespół, usunięto z powierzchni elastomeru ochronny arkusz papieru osłonowego, a następnie warstwę funkcjonalną na nośniku z folii poliestrowej przemyto roztworem KOH w etanolu o stężeniu 50 g/dm3, po czym trzykrotnie przemyto wodą dejonizowanej i wysuszono w strumieniu czystego sprężonego powietrza. Następnie arkusz szkła (szkiełko mikroskopowe nakrywkowe) wyprażono w temperaturze 300°C w piecu, w atmosferze powierza w czasie 30 minut. Równolegle warstwę funkcjonalną naświetlono w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm przez 30 sekund. Następnie oba elementy spozycjonowano z wykorzystaniem szablonu zaopatrzonego w bolce pozycjonujące, w ten sposób, że bolce szablonu wprowadzano w otwory pozycjonujące kolejnych warstw i dociśnięto elementy. Po usunięciu szablonu, dodatkowo dociskano elementy za pomocą wałka gumowego w celu usunięcia pęcherzy powietrza z przestrzeni pomiędzy warstwami, po czym zespół umieszczano na termostatowanej płycie grzejnej o temperaturze 120°C na okres 30 min. W ten sposób otrzymywano zespół komory hodowlanej złożony z warstwy szklanej i elastomerowej osłoniętej od spodu nośnikiem poliestrowym będącym jego tymczasową podstawą,
e) Trzeci etap - przygotowanie warstwy hydrożelowej
W celu przygotowania warstwy hydrożelowej, uprzednio przygotowany hydrożel wprowadzano za pomocą strzykawki jednorazowej zaopatrzonej w igłę o średnicy dopasowanej do średnicy otworów rewizyjnych, przez otwory rewizyjne zespołu komory hodowlanej do wnętrza komory, wypełniając ją całkowicie. Następnie zespół umieszczano w cieplarce w temperaturze 37°C na okres 1 godziny w celu zestalenia hydrożelu. Po tym okresie usuwano tymczasową podstawę poliestrową zespołu i grawerowano odsłoniętą warstwę hydrożelową skupioną wiązką lasera w celu wytworzenia mikrokanałów naczyniowych o szerokości 50 mikrometrów. Ustawienia lasera były następujące: moc 0,1%, szybkość przesuwu głowicy 10%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,3 mm. Parametry pracy lasera zostały tak dobrane by zminimalizować efekty termiczne w obszarze hydrożelu poza przestrzenią mikrokanałów i nie uszkodzić warstwy szklanej znajdującej się poniżej warstwy hydrożelowej. Dodatkowo w przegrodach oddzielających komorę hodowlaną od kanałów doprowadzających i odprowadzających płyny wykonano mikrokanały łączące w ten sposób, że powierzchnię przegród naświetlano skupioną wiązką lasera w miejscach w których według projektu miały znajdować się mikrokanały łączące. W tym przypadku ustawienia lasera były następujące: moc 1,1%, szybkość przesuwu głowicy 1,6%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,3 mm.
f) Czwarty etap - łączenie zespołu komory hodowlanej z dnem i wiekiem mikrourządzenia.
W celu połączenia zespołu z wiekiem mikrourządzenia zestawia się elementy z wykorzystaniem szablonu zaopatrzonego w bolce pozycjonujące w ten sposób, że bolce szablonu wprowadza się w otwory pozycjonujące kolejnych warstw, tj. zespołu komory hodowlanej, warstwy klejowej oraz wieka i dociska elementy. Przed połączeniem zespołu z dnem, dno naświetlano w komorze UV promieniowaniem o długości fali 185 nm i 253,7 nm przez 30 sekund a następnie połączono z zespołem z wykorzystaniem szablonu i dociśnięto.
g) Piąty etap - łączenie mikrourządzenia z mikrowężami
W celu przyłączenia mikrowęży do urządzenia wprowadzono ich zakończenia do bocznych portów przyłączeniowych po uprzednim naniesieniu na ich końce kleju fotoutwardzalnego i naświetlano w świetle UV przez 30 sekund. Powierzchnia czipu nad komorą hydrożelową została osłonięta nieprzepuszczalną dla światła UV folią w celu zapobieżenia niekorzystnemu oddziaływaniu promieniowania UV na strukturę hydrożelową.
h) Szósty etap - czyszczenie mikrosystemu
W celu usunięcia zanieczyszczeń po procesie grawerowania warstwy hydrożelowej mikroukład przemywa się trzykrotnie buforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS każdorazowo o objętości 1 cm3 i temperaturze 37°C.
PL 238 703 B1
j) Siódmy etap - immobilizacja komórek
W celu immobilizacji komórek śródbłonka mysiej linii B129 na wewnętrznej powierzchni mikrokanałów naczyniowych skoncentrowaną zawiesinę komórek (1x107 komórek/mL) w referencyjnym medium hodowlanym M1168 zawierającą między innymi czynniki wzrostu mysiego śródbłonka: VEGF i EGF wprowadzono do mikrokanałów naczyniowych urządzenia i inkubowano przez okres 4 godzin w temperaturze 37°C w warunkach stacjonarnych w celu ich adhezji do powierzchni mikrokanałów.
k) Ósmy etap - hodowla komórek w warunkach przepływowych
W celu stymulacji samoistnego formowania włosowatych naczyń krwionośny w obrębie sztucznej tkanki, prowadzono hodowlę komórkową w warunkach przepływowych przez okres 5 dni po umieszczeniu mikrosystemu w cieplarce w warunkach: 37°C, 5% CO2 i 95% wilgotności. W tym celu pompę strzykawkową ze strzykawką 50 ml wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym M11168 umieszczono poza obrębem cieplarki i podłączono za pomocą mikrowęży do wlotu mikrosystemu znajdującego się w cieplarce. Wyloty mikrosystemu połączono ze zbiornikiem na odpady. Hodowlę prowadzono przy przepływie medium 5 ml/24h.
P r z y k ł a d realizacji 2
Sposób wytworzenia sześciowarstwowego, jednokomorowego, przepływowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkanki nowotworowej ludzkiego raka piersi z wykorzystaniem struktury hydrożelowej na bazie alginianu. Urządzenie zostało wytworzone w podobny sposób jak przedstawiono w przykładzie 1, z tą różnicą że:
a) Przygotowanie hydrożelu
Przed przystąpieniem do fabrykacji mikrourządzenia przygotowano ciekły hydrożel. W celu otrzymania 10 cm3 roztworu alginianu sodu o stężeniu 5% w/v w PBS, PBS oraz alginian sodu intensywne mieszano na mieszadle magnetycznym w zamkniętym naczyniu w łaźni wodnej o temperaturze 80°C do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór schłodzono i przechowywano w komorze chłodniczej w temperaturze 4°C.
Następnie przygotowano medium hodowlane o składzie: 89% wysokoglukozowego medium hodowlanego L-15 z L-glutaminą, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% roztworu 100X pencyliny/streptomycyny i przechowywano w komorze chłodniczej w temperaturze 4°C. Bezpośrednio przed przystąpieniem do fabrykacji warstwy hydrożelowej oba roztwory połączono w proporcjach objętościowych 1:5 (alginian:medium) i przefiltrowano na zimno na filtrze strzykawkowym o średnicy porów 0,2 mikrometra. Następnie mieszaninę ogrzano do temperatury 37°C i połączono w proporcjach 10:1 (hydrożel:koncentrat komórek) ze skoncentrowaną zawiesiną komórek ludzkiego nowotworu piersi linii MB-231 (1x107 komórek/mL). Wszystkie operacje przeprowadzano w warunkach sterylnych w komorze laminarnej.
e) Trzeci etap - przygotowanie warstwy hydrożelowej
W celu przygotowania warstwy hydrożelowej, uprzednio przygotowany ciekły hydrożel wprowadzano za pomocą strzykawki jednorazowej przez otwory rewizyjne zespołu komory hodowlanej o średnicy dopasowanej do średnicy wylotu strzykawki do wnętrza komory, wypełniając ją całkowicie. Następnie z otworów rewizyjnych usuwano hydrożel i wypełniano otwory 5% wodnym roztworem chlorku wapnia, po czym zespół umieszczano w cieplarce w temperaturze 37°C na okres 6 godziny w celu zestalenia hydrożelu. Po tym okresie usuwano tymczasową podstawę poliestrową zespołu i grawerowano odsłoniętą warstwę hydrożelową skupioną wiązką lasera w celu wytworzenia mikrokanałów naczyniowych o szerokości 80 mikrometrów. Ustawienia lasera były następujące: moc 0,2%, szybkość przesuwu głowicy 10%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,5 mm. Parametry pracy lasera zostały tak dobrane by zminimalizować efekty termiczne w obszarze hydrożelu poza przestrzenią mikrokanałów i nie uszkodzić warstwy szklanej znajdującej się poniżej warstwy hydrożelowej. Dodatkowo w przegrodach oddzielających komorę hodowlaną od kanałów doprowadzających i odprowadzających płyny wykonano mikrokanały łączące w ten sposób, że powierzchnię przegród naświetlano skupioną wiązką lasera w miejscach w których według projektu miały znajdować się mikrokanały łączące. W tym przypadku ustawienia lasera były następujące: moc 0,3%, szybkość przesuwu głowicy 0,9%, częstotliwość impulsu 1000 DPI, odległość ogniskowania 0,2 mm.
j) Siódmy etap - immobilizacja komórek
W celu immobilizacji komórek śródbłonka HUVEC na wewnętrznej powierzchni mikrokanałów naczyniowych skoncentrowaną zawiesinę komórek (1x106 komórek/mL) w referencyjnym medium hodowlanym 211-500 suplementowaną 211-GS zawierającą między innymi czynnik wzrostu śródbłonka VEGF, wprowadzono do mikrokanałów naczyniowych urządzenia i inkubowano przez okres 2 godzin w temperaturze 37°C w warunkach stacjonarnych w celu ich adhezji do powierzchni mikrokanałów.
PL 238 703 B1
g) Ósmy etap - hodowla komórek w warunkach przepływowych
W celu stymulacji samoistnego formowania włosowatych naczyń krwionośny w obrębie sztucznej tkanki, prowadzono hodowlę komórkową w warunkach przepływowych przez okres 3 dni po umieszczeniu mikrosystemu w cieplarce w warunkach: 37°C i 95% wilgotności. W tym celu pompę strzykawkową ze strzykawką 50 ml wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym 89% L-15 z L-glutaminą, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% roztworu 100X pencyliny/streptomycyny oraz ludzki czynnik VEGF, umieszczono poza obrębem cieplarki i podłączono za pomocą mikrowęży do wlotu mikrosystemu znajdującego się w cieplarce. Wyloty mikrosystemu połączono ze zbiornikiem na odpady. Hodowlę prowadzono przy przepływie medium 5 ml/24h.
Claims (23)
1. Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych złożonego z co najmniej sześciu warstw, w tym: dna i wieka, warstwy klejowej, co najmniej jednej pomocniczej warstwy szklanej, co najmniej jednej elastomerowej warstwy funkcjonalnej oraz co najmniej jednej warstwy hydrożelowej, znamienny tym, że w pierwszym etapie na podstawie uprzednio zaprojektowanych map przygotowanych na podstawie zdjęcia fizycznej struktury układu naczyń krwionośnych w tkance, modelu matematycznego lub zgodnie z założeniami projektowymi w środowisku graficznym CAD każdej z warstw urządzenia, wytwarza się jego elementy - warstwy elastomerowe przygotowuje się poprzez powlekanie nośnika warstwą elastomeru i utrwala, a następnie graweruje i wycina elementy: kanały i mikrokanały naczyniowe i łączące, otwory przelotowe i pozycjonujące oraz komory hodowlane i przegrody poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 gm; pomocnicze warstwy szklane, warstwę klejową oraz dno i wieko mikrourządzenia graweruje się i wycina elementy: otwory rewizyjne, przelotowe i pozycjonujące oraz zbiorniki poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 gm arkuszy materiału; w drugim etapie łączy się bez użycia kleju warstwę elastomerową ze szklaną, po uprzednim naświetleniu powierzchni elastomeru promieniowaniem ultrafioletowym (UV), w zespoły, każdy złożony z jednej warstwy szklanej oraz jednej warstwy elastomerowej na nośniku stanowiącym tymczasową postawę zespołu; w trzecim etapie wprowadza się poprzez otwory rewizyjne usytuowane w tymczasowej podstawie zespołu do komór hodowlanych zespołów uprzednio przygotowany ciekły hydrożel i zestala się, a następnie odłącza tymczasową podstawę zespołu i w ten sposób w odsłoniętej warstwie hydrożelowej graweruje mikrokanały naczyniowe, a w przegrodach kanały łączące, poprzez naświetlanie skupioną wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 gm; w czwartym etapie łączy się bez użycia kleju warstwę elastomerową ze szklaną, po uprzednim naświetleniu powierzchni elastomeru promieniowaniem ultrafioletowym (UV), jeden lub kilka zespołów wzajemnie lub z dnem, a z wiekiem za pomocą warstwy klejowej; w piątym etapie mikrosystem łączy się z wężami doprowadzającymi i odprowadzającymi płyny z użyciem kleju.
2. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że hydrożel przygotowuje się na bazie roztworu kwasu lub bezwodnika akrylowego, alkoholu poliwinylowego, poli(kwasu mlekowego), glikolu polietylenowego, kolagenu, kwasu hialuronowego, alginianu, chitozanu lub ich mieszanin, lub też mieszanin związków wchodzących w skład macierzy zewnątrzkomórkowej, w wodzie lub medium hodowlanym.
3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że hydrożel sterylizuje się poprzez filtrację na hydrofilowym filtrze membranowym o średnicy porów nie większej niż 0,5 mikrometra.
4. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że do hydrożelu dodaje się substancje ograniczające wzrost mikroorganizmów.
5. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do hydrożelu dodaje się antybiotyki.
6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że do hydrożelu dodaje się substancje proangiogenne.
7. Sposób według zastrz. 6 znamienny tym, że do hydrożelu dodaje się czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF.
8. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że do hydrożelu dodaje się fibroblasty i komórki macierzyste.
PL 238 703 B1
9. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że powlekanie nośnika warstwą elastomeru przeprowadza się w powlekaczu obrotowym.
10. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że warstwy elastomerowe przygotowuje się poprzez nanoszenie polidimetylosiloksanu (PDMS) na folię poliestrową (PET).
11. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że do wykonania wieka i dna urządzenia wykorzystuje się tafle szkła, poli(metakryklanu metylu) PMMA lub folii poliestrowej (PET).
12. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że do wykonania warstwy klejowej wykorzystuje się komercyjnie dostępne arkusze błony klejowej na bazie kleju akrylowego, dwustronnie osłonięte papierem osłonowym.
13. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że utrwalanie warstw PDMS przeprowadza się w suszarce szafkowej lub na płycie grzejnej w temperaturze z zakresu 60-120°C, odpowiednio przez okres od 30 minut do 12 godzin lub w warunkach pokojowych przez okres co najmniej 24 godzin.
14. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że parametry wiązki laserowej i przesuwu głowicy laserowej dobiera się tak, by zminimalizować oddziaływanie termiczne wiązki lasera z materiałem poza obszarem cięcia lub grawerowania.
15. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że wzajemne pozycjonowanie warstw mikrourządzenia przeprowadza się z wykorzystaniem otworów pozycjonujących rozmieszczonych w tych samych miejscach na każdej z warstw oraz szablonów zaopatrzonych w bolce pozycjonujące, dopasowanych do otworów pozycjonujących.
16. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że łączenie warstw elastomerowych ze szklanymi warstwami pomocniczymi w zespoły odbywa się po uprzednim wygrzaniu warstwy szklanej w temperaturze 300°C przez okres co najmniej 30 minut.
17. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że warstwy łączy się w sposób hydraulicznie szczelny.
18. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że mikrourządzenie łączy się w sposób hydraulicznie szczelny i nierozłączny z wężami doprowadzającymi i odprowadzającymi płyny za pomocą kleju fotoutwardzalnego i naświetla promieniami UV nie krócej niż 30 sekund.
19. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że sieć mikrokanałów czyści się i przemywa wodą dejonizowaną, buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) lub wodnym roztworem EDTA i surfaktantu o temperaturze nie wyższej niż 60°C.
20. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że w celu immobilizacji komórek wewnątrz mikrokanałów, do mikrourządzenia wprowadza się zawiesinę komórek w medium hodowlanym i pozastawia na okres nie krótszy niż 30 minut.
21. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że hodowlę komórek w warunkach przepływowych prowadzi się przy natężeniu przepływu medium hodowlanego nie mniejszym niż 1 ml/24h.
22. Sposób według zastrz. 24 znamienny tym, że do medium hodowlanego dodaje się substancje proangiogenne.
23. Sposób według zastrz. 25 znamienny tym, że do medium hodowlanego dodaje się czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL420395A PL238703B1 (pl) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych |
| PCT/PL2018/000010 WO2018143831A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-01-26 | Method of manufacturing a multilayer microfluidic device for dynamic tissue culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL420395A PL238703B1 (pl) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL420395A1 PL420395A1 (pl) | 2017-12-04 |
| PL238703B1 true PL238703B1 (pl) | 2021-09-27 |
Family
ID=60473203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL420395A PL238703B1 (pl) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238703B1 (pl) |
| WO (1) | WO2018143831A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111718853B (zh) * | 2020-07-03 | 2022-08-02 | 中山大学 | 一种用于药物筛选的2d和3d一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL219444B1 (pl) * | 2013-07-29 | 2015-04-30 | Politechnika Wroclawska | Sposób wytwarzania urządzenia mikronaczyniowego |
-
2017
- 2017-01-31 PL PL420395A patent/PL238703B1/pl unknown
-
2018
- 2018-01-26 WO PCT/PL2018/000010 patent/WO2018143831A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018143831A1 (en) | 2018-08-09 |
| PL420395A1 (pl) | 2017-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Miri et al. | Bioprinters for organs-on-chips | |
| Gu et al. | Development of 3D bioprinting: From printing methods to biomedical applications | |
| Jang et al. | Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics | |
| Tehranirokh et al. | Microfluidic devices for cell cultivation and proliferation | |
| JP5578779B2 (ja) | スフェロイド培養方法及びスフェロイド培養容器 | |
| Vera et al. | Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms | |
| Goodarzi Hosseinabadi et al. | Digital light processing bioprinting advances for microtissue models | |
| CN111218404A (zh) | 一种仿生多器官芯片及其制备方法和应用 | |
| Filippi et al. | Microfluidic tissue engineering and bio‐actuation | |
| Xie et al. | Composable microfluidic spinning platforms for facile production of biomimetic perfusable hydrogel microtubes | |
| JPH06507076A (ja) | 細胞培養のための支持体 | |
| CN112143642B (zh) | 用于体外培养的血管化肿瘤微流控器官芯片及其制备方法 | |
| CN106414703A (zh) | 仿生流体处理的系统和方法 | |
| CN113773959A (zh) | 一种类器官培养芯片和类器官培养方法 | |
| CN103131625A (zh) | 用于构建三维微环境的方法及装置 | |
| Chuchuy et al. | Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip | |
| Zheng et al. | Synthesizing living tissues with microfluidics | |
| Park et al. | Reconstruction of in vivo-like in vitro model: enabling technologies of microfluidic systems for dynamic biochemical/mechanical stimuli | |
| Jiang et al. | Microfluidic-based biomimetic models for life science research | |
| Louit et al. | In vitro 3D modeling of neurodegenerative diseases | |
| CN212316139U (zh) | 一种仿生多器官芯片 | |
| PL238703B1 (pl) | Sposób wytwarzania wielowarstwowego urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli tkankowych w warunkach dynamicznych | |
| Żuchowska et al. | 3D cell models for organ-on-a-chip applications | |
| CN103396946B (zh) | 生物反应装置及其制备方法和应用 | |
| Farshidfar et al. | The feasible application of microfluidic tissue/organ-on-a-chip as an impersonator of oral tissues and organs: a direction for future research |