KR102067311B1 - 개선된 수명 시간 및 항상성을 갖는 다기관 칩 장치 - Google Patents

개선된 수명 시간 및 항상성을 갖는 다기관 칩 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다기관 칩 장치에 관한 것으로서, 다기관 칩 장치는, 기저 층; 상기 기저 층상에 배열된 기관 층; 상기 기관 층상에 배열된 공동 층; 및 액추에이터 층을 포함하며; 이때 상기 기저 층은 다른 층을 위한 단단한 지지대를 제공하도록 구성되고; 상기 기관 층은, 다수의 개별 기관 등가물, 즉 하나 이상의 기관 성장 섹션을 포함하는 각각의 기관 등가물, 기관의 적어도 하나의 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 포함하도록 그리고 기관 성장 섹션의 유기관 공동과 독립된 순환 계통 사이의 유체 연통을 위한 소형 입구 및 소형 출구를 포함하도록 구성된 각각의 기관 성장 섹션을 포함하도록 구성되고, 상기 기관 층은 폐, 소장, 비장, 췌장, 간, 신장 및 골수의 기관을 각각 나타내도록 구성된 적어도 하나의 기관 등가물을 포함하며, 그리고 기관 성장 섹션의 소형 입구 및 출구를 통해 기관 층의 기관 성장 섹션과 직접 유체 연통되도록 구성된 독립된 순환 계통을 포함하도록 구성되며; 상기 공동 층은 공동과 기관 성장 섹션 사이의 유체 교환을 허용하기 위해 선택된 기관 등가물 또는 기관 성장 섹션과 유체 연통되도록 배열된 다수의 공동 및 튜브를 구비하도록 구성되며; 그리고 상기 액추에이터 층은 선택된 기관 등가물, 독립된 순환 계통 및/또는 그 일부에 인가될 수 있는 압력을 조절하도록 배열 및 구성된 다수의 액추에이터를 포함하도록 구성된다.

Description

개선된 수명 시간 및 항상성을 갖는 다기관 칩 장치{MULTI-ORGAN-CHIP WITH IMPROVED LIFE TIME AND HOMOEOSTASIS}
본 발명은 다기관 칩 장치에 관한 것이다.
소형 3차원(3D) 기관 또는 유기관 배양 계통(organoid culture systems)은 학술적 및 경제적 관심이 증가하고 있다. 이러한 3D 배양 계통은 기관들이 일정한 자극하에 어떻게 작동 및 행동하는지 조사할 뿐만 아니라, 특정 기관 또는 그들의 그룹에 대한 화학적 화합물 또는 조성물에 따른 영향을 실험하고, 그러한 화합물 또는 조성물에서 약동학적 행동을 연구하기 위한 것이다. 특히, 화학적 화합물의 안전성 시험에 관해서, 동물 실험을 대체하고, 효율적이고 안정적으로 인체의 안전성을 예측하는 데 더욱 용이하게 사용될 수 있는 데이터를 생성하기 위한 대안이 요구된다. 그와 같은 생체 이외 3D 배양 계통의 품질은 각각의 기관 또는 유기관의 생리학적 기능 및 환경에 가능한 밀접하게 반영하는 그의 능력에 의존할 것이다. 본 목표는, 기관이 별개, 독립된 개체들로서 간주 되지 않지만, 유기적으로 연결된 서로 다른 기관들 사이의 복잡한 상호작용이 가능한 밀접하게 모사되는 경우에만 달성될 수 있다. 정확한 데이터의 생성을 허용하기 위해서는, 배양 계통이 장시간 동안 안정적으로 유지되는 것이 요구된다. 그러나 오늘날 알려진 대부분의 공지된 3D 배양 계통은 하나의 셀 타입만을 반영하거나, 기관 또는 유기관의 한 가지 타입만을 모델링 한다. 다중 기관을 고려하고 이들 다중 기관의 동적인 배양을 허용하는 3차원 배양 계통은 단지 최근에 설명되었다.
WO2009/146911 A2에서는 기관-온-칩 장치가 제공되었다. 이러한 기관-온 칩 장치는 독립적이고 센서 제어되도록 설계되었다. 이러한 장치는 소형 칩 포맷으로 줄기 세포 적소뿐만 아니라 기관 또는 유기관을 구축 또는 유지하는 것을 허용한다. 기관-온 칩 장치는 기관 또는 유기관, 매체 공급 저장조 및 서로 기능상 연결된 매체 폐기물 저장조를 포함하는 다양한 기관 성장 섹션을 포함할 수 있으며, 기관 성장 섹션의 기관 또는 유기관에는 매체 공급 저장조로부터 매체가 공급될 수 있고, 분해 제품 및 폐기물은 매체 폐기물 저장조를 통해 처리될 수 있다. 비록, 이러한 모델이 하나의 칩 상에 둘 이상 기관의 동시 배양을 가능하게 하더라도, 이러한 장치는 칩 상에 있는 서로 다른 기관들 사이의 상호 작용 및 크로스-토크(crosstalk)를 허용하지 않는다. 또한, 이러한 장치는 장기간에 걸쳐 배양 계통의 항상성을 달성하는데 필요한 모든 기능을 반영하지 못한다.
WO 2012/016711 A1에 있어서, 3D 세포 배양 모델은 하나 이상의 기관 성장 섹션, 영양소와 함께 기관 성장 섹션에서 배양된 기관 또는 유기관을 공급하도록 구성된 독립된 순환 계통, 및 기관 성장 섹션으로부터 간질액 및 퇴화물을 수집하는 별도의 모세관 유체 또는 폐기물 수집기를 포함하는 것을 제시한다. 이러한 계통은 둘 이상의 기관의 동시 배양을 허용하고, 서로 다른 기관들을 공급 및 상호 연결하는 혈관 계통을 모사한다. 따라서, 이러한 계통은 계통의 기관들 또는 유기관들 사이의 상호 작용 및 크로스-토크를 허용한다. 그러나, 이러한 장치는 장기간에 걸쳐 배양 계통의 항상성을 달성하기 위해 필요한 모든 기능을 반영하지 않는다.
본 발명은 다기관 칩 장치에 관한 것이며, 이는 기관 및/또는 유기체의 항상성에 필요한 유기체의 기본 기능을 모사한다. 본 발명의 다기관 칩 장치는 다수의 상이한 기관 등가물을 공급하는 고등 유기체의 혈관 계통을 모사하는 독립된 순환 계통을 반영하도록 설계되어 있다. 기관 등가물은 음식 공급의 기본적인 기능, 폐기물 제거, 산소 공급이 장기간에 걸쳐 기관 등가물의 항상성을 유지하는 기능을 충분히 표현하며, 이와 같은 방법으로 기관 등가물은 선택되고 배열된다.
다기관 칩 장치가 제공되며, 본 장치는,
- 기저 층;
- 상기 기저 층상에 배열된 기관 층;
- 상기 기관 층상에 배열된 공동 층; 및
- 액추에이터 층을 포함하며; 이때
- 상기 기저 층은 다른 층을 위한 단단한 지지대를 제공하도록 구성되고;
- 상기 기관 층은,
다수의 개별 기관 등가물, 즉 하나 이상의 기관 성장 섹션을 포함하는 각각의 기관 등가물, 기관의 적어도 하나의 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 포함하도록 그리고 기관 성장 섹션의 유기관 공동과 독립된 순환 계통 사이의 유체 연통을 위한 소형 입구 및 소형 출구를 포함하도록 구성된 각각의 기관 성장 섹션을 포함하도록 구성되고, 상기 기관 층은 폐, 소장, 비장, 췌장, 간, 신장 및 골수의 기관을 각각 나타내도록 구성된 적어도 하나의 기관 등가물을 포함하며, 그리고
기관 성장 섹션의 소형 입구 및 출구를 통해 기관 층의 기관 성장 섹션과 직접 유체 연통되도록 구성된 독립된 순환 계통을 포함하도록 구성되며;
- 상기 공동 층은 공동과 기관 성장 섹션 사이의 유체 교환을 허용하기 위해 선택된 기관 등가물 또는 기관 성장 섹션과 유체 연통되도록 배열된 다수의 공동 및 튜브를 구비하도록 구성되며; 그리고
- 상기 액추에이터 층은 선택된 기관 등가물, 독립된 순환 계통 및/또는 그 일부에 인가될 수 있는 압력을 조절하도록 배열 및 구성된 다수의 액추에이터를 포함하도록 구성된다.
본 발명의 더 상세한 내용 및 바람직한 실시예들은 이하의 명세서 및 특허 청구 범위에 정의되어 있다.
본 발명은 이하에서 보다 상세하게 설명될 것이다. 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적인 용어는 달리 명시하지 않는 한 본 기술 분야에 숙련된 사람에 의해 공통으로 이해할 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 제1 층 또는 객체가 제2 층 또는 객체의 상단에 위치되도록 특정되는 경우, 제1 층 또는 객체는 제2 층 또는 객체의 상단에 직접 위치될 수 있고, 제1 층과 제2 층 또는 객체 사이에 다른 층 또는 객체가 제공될 수 있다.
본 발명의 다기관 칩 장치는 다수의 상이한 기능을 가진 층으로 구성된다. 다기관 칩은 기저 층, 기관 층, 선택적으로 기관-홀더 층, 공동 층 및 액추에이터 층을 포함한다.
기저 층은 다기관 칩 장치가 쉽게 다뤄지고 조작될 수 있도록 추가되는 층을 위한 단단한 지지대를 제공하도록 구성된다. 바람직하게, 상기 기저 층은 투명한 물질로 구성된다. 이는 기관 층이 바닥 측면으로부터 광학적으로 액세스가 가능하고, 이에 따라, 배양 동안, 현미경 예를 들어, 2-광자 현미경으로 기관 성장 섹션에서 유기관의 관찰할 수 있는 장점이 있다. 기저 층이 투명한 물질로 구성되어 있기 때문에, 기관 층은 바닥 측면으로부터 액세스 가능하고, 생리학적 스트레스를 검출하기 위해 일부 조직사이의 pH 측정, 조직 사이의 p02의 인광 쿠엔칭(phosphorescence quenching) 현미경, 및 적외선 분석법을 위한 형광 비율 이미징을 허용한다.
기저 층을 위한 바람직한 물질은 유리와, 광학적으로 투명한 합성 중합체, 예를 들어, 폴리스티롤(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리실록산 및/또는 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 포함한다.
장치의 상태를 모니터링하고, 유기관의 제어된 배양을 허용하기 위하여, 기저 층은 기관 등가물, 기관 성장 섹션 및/또는 독립된 순환 계통 중 하나 이상으로부터 방출 및/또는 그에 전송하는 신호를 측정하도록 구성 및 배열된 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 심지어 소형 샘플 부피에 대한 정확한 측정을 허용하기 위하여 고감도를 나타내는 센서가 사용된다. 바람직하게, 기저 층은 유기관 또는 세포 생존력, 온도, pH, 유체 밸런스, 압력, 유량, 산소 압력 또는 산소 소비, 영양 소비, 유체 흡착, 장액 분비, 알부민 합성, 담즙 합성, 요소 배설, 이온 밸런스, 삼투압, 및 전기 커플링과 같은 인간 유기체의 항상성의 메인 파라미터를 위한 센서를 포함한다. 사용될 수 있는 센서들은 pH 센서, p02 센서, 분석 캡처 센서, 전도성 센서, 플라즈몬 공명 센서, 온도 센서, CO2 센서, NO 센서, 주화성 센서, 사이토킨 센서, 이온 센서, 압력 센서, 전위차 센서, 전류 측정 센서, 유량 센서, 필 센서, 임피던스 센서, 전자장 센서, 표면 탄성파 센서, 및 신진 대사 센서를 포함하지만, 이들에 한정하지 않는다. 바람직하게, 기저 층은 적어도 다음의 센서들의 세트를 포함한다:
- 2개의 pO2 센서는 기관 층의 독립된 순환 계통의 유체에서 pO2를 측정하도록 구성 및 위치되며, 바람직하게 하나의 pO2 센서는 폐 등가물의 원점 근방에서 세동맥 이송 채널 아래 위치되고, 다른 하나의 pO2 센서는 폐 등가물의 그 원점 근방에서 세정맥 이송 채널 아래 위치되며;
- 독립된 순환 계통의 누설을 식별하기 위한 4-트랜스 상피/내피 전기 저항(TEER) 센서(2개의 TEER 센서 사이의 저항이 0인 경우, 누설 가능성 있음), 바람직하게, 두 TEER 센서는 독립된 순환 계통에 위치되고, 예를 들어, 하나의 TEER 센서는 폐 등가물로부터 세동맥 이송 채널의 원점 근방에 위치되고, 하나의 TEER 센서는 폐 등가물로부터 세동맥 이송 채널의 원점으로부터 가장 먼 세동맥 이송 채널의 단부에 위치되며, 2개의 TEER 센서는 간 등가물에 위치되고, 선택적으로, 추가된 2개의 TEER 센서를 제공될 수 있으며, 이들은 기관과 혈류 사이의 상피 또는 내피 장벽과 같은 세포 장벽의 기능을 모니터하기 위해 모두 함께 피부 또는 장 등가물에 위치되도록 구성 및 위치되며, 그리고
- 생물학적 뉴런의 신경절에 연결된 전기 센서, 이는 기관 등가물에서 그와 같은 신경절과 연결되도록 구성 및 위치된다.
본 발명의 다기관 칩 장치는 기저 층의 상부에 위치된 기관 층을 포함한다. 기관 층은 다수의 개별 기관 등가물을 포함하도록 구성되며, 각각의 기관 등가물은 하나 이상의 기관 성장 섹션을 포함한다. 기관 층의 각각의 기관 성장 섹션은 특정 기관 유형의 하나의 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 포함하도록 구성된다. 각각의 기관 성장 섹션은 유기관 성장 섹션의 유기관 공동과 기관 층의 독립된 순환 계통 사이의 유체 연통을 위해 소형 입구와 소형 출구를 포함하도록 구성된다. 기관 층은 기관들, 즉, 폐, 소장, 비장, 췌장, 간, 신장, 및 골수를 각각 나타내도록 구성된 적어도 하나의 기관 등가물을 포함한다. 기관 층은, 예를 들어, 피부, 고환, 뇌 및/또는 지방 조직의 기관 등가물과 같은 추가적인 기관 등가물을 포함할 수 있다. 또한, 기관 층은 기관 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 입구 및 출구를 통해 기관 층의 기관 성장 섹션과 직접적으로 유체 연통될 수 있도록 구성된 독립된 순환 계통을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “기관 등가물”은 유기관 또는 특정 기관 유형을 포함하는 모든 기관 성장 섹션을 지칭한다. 유기체, 예를 들어, 인간 유기체의 모든 기관들 및 계통은 여러, 동일한, 기능적으로 독립된, 구조 단위, 유기관 단위에 의해 내장되어 있다. 이러한 유기관 단위는 여러 세포층에서 수 mm까지의 극히 소형 크기를 가진다. 간 소엽, 신장의 네프론, 피부의 외피와 진피, 장 점막, 췌장의 랑게르한스의 섬, 뇌 피질과 소뇌의 회색 및 흰색 물질, 성인 정지-촉진 줄기 세포 니치는 모두 중요한 기능과 고도의 가변 기하학적 변수를 가진 그와 같은 인간 유기관 구조의 예의 소형 선택이다. 각각의 기관 내의 그와 같은 소형 유기관의 현저한 기능, 독립 및 다양성의 높은 등급으로 인하여, 임의의 물질에 대한 각각의 패턴은 전체의 기관을 나타내는 것으로 보인다. 본질은 매우 작지만, 기관 및 계통의 가장 중요한 기능을 실현하기 위한 정교한 생물학적 구조를 갖는다. 주어진 기관 내의 이들 유기관 구조의 증식은 일부 기관의 손상 시에 기능의 전체의 손실을 방지하기 위한 본질의 위험 관리 툴(nature's risk management tool)이다. 한편, 이러한 개념은 단일 기능의 유기관 단위를 구축하기 위해 확립된 마스터플랜을 여전히 사용하는 주어진 종, 예를 들어 쥐와 사람의 간의 필요에 따라 기관의 크기와 모양의 조절이 용이하다. 인체 노출에 대한 물질 테스트를 예상하기 위한 유일하고 중요한 기회는 시험관에서 인간의 소형-유기관의 등가물을 구축하는 데 있다. 본 발명에 있어서, “유기관”은, 적어도 하나의 기관 또는 조직 기능을 나타내는 시험관에서 세포들의 상이한 유형의 가공되고, 새롭게 생성된 기능 세포 집합체를 의미하며, 바람직하게는 대부분 또는 기본적인 모든 기관이나 조직 기능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 다기관-칩 장치에 있어서, 기관 등가물은 각각의 기관 성장 섹션이 각각의 기관 유형중 하나의 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 포함하는 하나 이상의 기관 성장 섹션에 의해 표현된다. 따라서, 기관 등가물의 크기는 각각의 유형의 기관 성장 섹션 또는 유기관의 적당한 수를 선택함으로써 용이하게 조정될 수 있다.
당업자는 주어진 유기관의 구조를 잘 알고, 상기 유기관을 생성하는 방법을 알고 있다. 특정 기관을 가진 유기관의 다음과 같이 몇 가지의 예들, 즉 폐의 폐포 형태의 유기관, 췌장의 랑게르한스섬 형태의 유기관, 비장의 백비수와 적비수 형태의 유기관, 소장의 융모 형태의 유기관, 간의 소엽 형태의 유기관, 신장의 네프론 형태의 유기관, 골수단위, 골수의 뼈와 연골 형태의 유기관, 피부의 맹장 형태의 단위, 지방 조직의 덩어리 형태의 유기관, 고환의 여포 형태의 유기관, 뇌의 소뇌 외피 형태의 유기관이 제공된다.
간 유기관은 1.2 내지 2.2mm3의 부피를 갖는 육각형의 간 소엽일 수 있다.
폐 유기관은 0.15 내지 0.25mm2의 곡면을 갖는 타원형 폐포일 수 있다.
췌장 유기관은 0.2 내지 0.5mm3의 부피를 갖는 회전 타원형 조직으로 구성된 외분비 조직에 둘러싸인 랑게르한스섬일 수 있다.
비장 유기관은 0.3 내지 0.6mm3의 부피를 갖는 회전 타원형의 백비수 및 적비수 조직일 수 있다.
소장 유기관은 0.2 내지 0.4mm2의 곡면을 갖는 기둥형의 융모일 수 있다.
신장 유기관은 회전 타원형 피막 및 원통형 세관과 6 내지 7.5mm2의 여과된 표면을 갖는 신장 네프론일 수 있다.
골수 유기관은 0.006 내지 0.008mm3의 부피를 갖는 골수, 뼈 및 연골로 형성된 다공성 형태의 단위일 수 있다.
피부 유기관은 1.2 내지 2mm2의 곡면을 갖는 맹장을 포함하는 육각형의 한 부분일 수 있다.
지방 조직 유기관은 0.0004 내지 0.0006mm3의 부피를 갖는 회전 타원형의 지방 덩어리일 수 있다.
고환 유기관은 0.006 내지 0.008mm3의 부피를 갖는 회전 타원형의 고환 여포일 수 있다.
뇌 유기관은 0.02 내지 0.03mm2의 곡면을 갖는 원통형의 대뇌 피질 칼럼이 일 수 있다.
기관 층은 다음과 같이 설계될 수 있다:
- 간 등가물의 기관 성장 섹션은 5개 내지 15개의 간 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 간 유기관은 간 소엽이고, 바람직하게 유기관 공동은 10개의 간 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 폐 등가물의 기관 성장 섹션은 2000개 내지 4000개의 폐 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 유기관은 폐포이고, 바람직하게 유기관 공동은 3000개의 폐 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 췌장 등가물의 기관 성장 섹션은 5개 내지 15개의 췌장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 췌장 유기관은 랑게르한스섬이고, 바람직하게 유기관 공동은 10개의 췌장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 비장 등가물의 기관 성장 섹션은 5개 내지 15개의 비장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 비장 유기관은 백비수 및 적비수이고, 바람직하게 유기관 공동은 10개의 비장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 소장 등가물의 기관 성장 섹션은 40개 내지 80개의 소장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 소장 유기관은 융모이고, 바람직하게 유기관 공동은 60개의 소장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 신장 등가물의 기관 성장 섹션은 10개 내지 30개의 신장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 신장 유기관은 네프론이고, 바람직하게 유기관 공동은 20개의 신장 유기관을 하우징하도록 구성되며; 그리고
- 골수 등가물의 기관 성장 섹션은 1000개 내지 2000개의 골수 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 골수 유기관은 골수, 뼈, 연골로 형성된 단위이고, 바람직하게 유기관 공동은 1400개의 골수 유기관을 하우징하도록 구성된다.
또한, 기관 층은 다음과 같이 설계될 수 있다:
- 피부 등가물의 기관 성장 섹션은 10개 내지 20개의 피부 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 피부 유기관은 피부 부속기이고, 바람직하게 유기관 공동은 15개의 피부 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 지방 조직 등가물의 기관 성장 섹션은 200,000개 내지 300,000개의 지방 조직 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 지방 조직 유기관은 지방질의 클러스터이고, 바람직하게 유기관 공동은 240,000개의 지방 조직 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 고환 등가물의 기관 성장 섹션은 10개 내지 20개의 고환 유기관을 하우징하기위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 고환 유기관은 고환 여포이고, 바람직하게 유기관 공동은 15개의 고환 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 뇌 등가물의 기관 성장 섹션은 100개 내지 300개의 뇌 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 뇌 유기관은 대뇌 피질 칼럼이고, 바람직하게 유기관 공동은 200개의 뇌 유기관을 하우징하도록 구성된다.
각각의 기관 등가물은 포유 동물 유기체, 바람직하게는 인간의 각 기관에 평균적으로 존재하는 유기관의 개수에 비례하는 다수의 유기관을 하우징하도록 구성될 수 있다. 유기체를 표현하기 위하여, 유기체의 생리적 조건하에서 기관 크기에 상대적인 비례를 반영하도록, 본 발명의 다기관-칩 장치의 모든 기관 등가물의 크기를 선택하는 것이 유리하다. 바람직하게, 다기관 칩 장치의 모든 기관 등가물은 동일한 소정의 비례 계수에 의해 크기가 감소된다. 이러한 비례 계수는 다기관 칩 장치의 의도하는 크기에 따라 변할 수 있고, 바람직한 비례 계수는 0.00001(1/100,000)이다. 인간 유기체가 표현되어야 하는 경우, 다기관 칩 장치는 다음과 같이 구성되는 것이 바람직하다:
1개의 간 유기관,
300개의 폐 유기관,
1개의 췌장 유기관,
1개의 비장 유기관,
6개의 소장 유기관,
2개의 신장 유기관,
140개의 골수 유기관, 및 선택적으로,
1개 또는 2개의 피부 유기관 ,
2400개의 지방질 유기관,
1개 또는 2개의 고환 유기관,
20개의 뇌 유기관,
또는 이들의 복수 개.
특정 바람직한 실시예에 있어서, 다기관 칩 장치는 다음을 포함하도록 구성되는 것이 바람직하다:
10개의 간 유기관,
3000개의 폐 유기관,
10개의 췌장 유기관,
10개의 비장 유기관,
60개의 소장 유기관,
20개의 신장 유기관,
1400개의 골수 유기관, 및 선택적으로,
15개의 피부 유기관,
240,000개의 지방 유기관,
15개의 고환 유기관,
200개의 뇌 유기관,
또는 이들의 복수 개.
바람직하게, 기관 성장 섹션은 하나 이상의 줄기 세포 니치를 더 포함한다. 오랜 기간 동안 항상성 조건 하에서 작동될 수 있는 계통을 제공하기 위하여, 유기관 내에 세포 전환이 용이할 수 있는 세포의 공급원을 제공하는 것이 유리하다. 각각의 기관은 특정 전환 시간을 갖는데, 이 전환 시간 동안 기관의 세포가 새로운 세포로 대체된다. 기관의 이러한 세포의 전환은 기관의 세포들이 필수적이면서 완전히 기능을 하도록 보장한다. 상기 전환은 다기관 칩 장치의 하나, 일부 또는 전부의 기관 등가물에 대해 줄기 세포 니치를 도입함으로써 모사될 수 있다. 상기 줄기 세포 니치는 기관 등가물의 하나, 일부 또는 전부의 기관 성장 섹션의 일부가 될 수 있다.
기관 공동 및 줄기 세포 니치를 포함하는 그러한 기관 성장 섹션의 구조 및 제조 방법은 WO 2012/016711 Al 및 WO 2009/146911 A2에서 이미 설명되고, 이러한 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기관 층은 적절한 물질로 만들어질 수 있다. 바람직하게, 물질은 Si02, 유리 및 합성 중합체를 포함한다. 바람직하게, 합성 중합체는 폴리스티롤(PS), 폴리 카보네이트(PC), 폴리아미드(PA), 폴리이미드(PI), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리페닐렌설파이드(PPSE), 에폭시드수지(EP), 불포화 폴리에스테르(UP), 5-페놀 수지(PF), 폴리실록산, 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS), 멜라민 수지(MF), 시아네이트 에스테르(CA), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 특히, 바람직한 합성 중합체는, 광학적으로 투명하고, 예를 들어, 폴리스티롤(PS), 폴리카보네이트(PC), 및 폴리실록산, 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS)을 포함한다. 특히, 바람직한 물질은 PDMS를 포함한다.
기관 층은 독립된 순환 계통을 포함한다. 독립된 순환 계통은 유기체의 혈관 계통을 모사하도록 설계되고, 이에 따라 영양소, O2를 본 발명의 다기관 칩 장치의 모든 기관 등가물에 공급하고, 기관 등가물들 사이에서 상호 작용과 크로스-토크를 허용한다. 상기 독립된 순환 계통의 존재는 모든 다기관 칩 장치의 항상성을 위해 필수적이다. 용어 “독립된(self-contained)”은 순환 계통 내에서 유체가 순환 가능하다는 사실과, 바람직하게, 매체, 혈액, 혈액 등가물과 같은 유체가 연속적으로 외부 저장조로부터 순환 계통으로 제공하기 위한 유체 연결이 없다는 사실을 지칭한다. 이러한 문장에서 “외부”는, 저장조가 순환 계통 또는 다기관 칩 장치의 일체로 되지 않는다는 것, 예를 들어, 관을 통해 순환 계통에 연결되지 않는다는 것을 의미한다. 물질, 예를 들어 영양소 및/또는 유체가 배양 과정에서 보충되어야 하는 경우, 이러한 영양소나 유체는 순환 계통의 세정맥 또는 세정맥 이송 채널에 바람직하게 위치되거나, 공동 층에 위치되는 주입 포트를 통해 불연속적으로 공급되는 것이 바람직하다.
독립된 순환 계통은 상기 기관 성장 섹션의 소형 입구 또는 출구를 통해 기관 층에 있는 기관 등가물의 기관 성장 섹션과 직접 유체 연통하도록 구성된다. 이러한 독립된 순환 계통의 구조 및 제조 방법은 WO 2012/016711 Al에 기술되고, 그 개시 내용은 본원에 참고로 인용된다. 독립된 순환 계통의 내부 표면은 내피 세포와 선택사항으로 평활근 세포가 줄지어 있을 수 있다.
독립된 순환 계통은:
기관 성장 섹션까지 높은 pO2로 유체 이송을 허용하기 위하여 기관 층의 기관 성장 섹션의 소형 입구와 폐 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 출구를 직접적으로 연결하는 세동맥 이송 채널; 및
기관 성장 섹션으로부터 폐 등가물까지 낮은 pO2로 유체 이송을 허용하기 위하여 폐 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 입구와 기관 성장 섹션의 소형 출구를 직접 연결하는 세정맥 이송 채널을 포함한다.
독립된 순환 계통은 기관 등가물에 영양분 및 O2를 이송할 수 있는 유체로 채워질 수 있다. 바람직하게, 상기 유체는 혈액 또는 혈액 등가물이다.
독립된 순환 계통 내의 유체는 다기관 칩 장치의 액추에이터 층의 액추에이터의 일치된 동작에 의해 직접 방식으로 순환된다. 이렇게 함으로써, 유기체의 맥관 구조의 압력에 대응하는 순환 계통 내의 적합한 압력을 모사할 뿐만 아니라 심장 박동수까지도 모사할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다기관 칩 장치의 독립된 순환 계통은 전단력과 생리학적 조건하에서 발견된 상황에 해당하는 미세 환경을 제공하는데 적합하다.
독립된 순환 계통은, 비장, 췌장 및 소장으로부터 독립된 순환 계통의 세정맥 이송 채널로 유체 연통이 간 등가물을 통과시키는 통로를 통해 유일하게 발생할 수 있는 방식으로, 소장, 비장 및 췌장 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 출구가 서로와, 그리고, 비장, 췌장, 소장 및 간 등가물 사이의 유체 연통을 허용하도록 간 등가물의 기관 성장 섹션의 추가적인 소형 입구와 직접 유체 연통되도록 접속된다. 이러한 구조는 예를 들어 사람 같은 고등한 유기체의 소화 계통의 기본 기능을 모사하는 것을 허용한다. 이러한 구조의 장점은 다기관 칩 장치가 공동 층에 위치한 저장조로부터 영양소를 소장 등가물에 공급함으로써 장시간에 걸쳐 배양될 수 있다는 것이다. 이에 따라, 본 발명의 다기관 칩 장치의 기관 등가물에는 소화계를 통과한 영양소가 제공될 것이다. 따라서, 영양소는 유기체의 생리학적 조건과 상당하는 형태와 방식으로 제공된다. 기관 등가물을 공급하기 위해 순환 계통에서 지속적으로 공급되는 외부 매체 저장조는 더이상 필요치 않다.
독립된 순환 계통 및 기관 등가물은 세동맥 채널이 기관 등가물의 공급을 분기하는 흐름 방향 분기에서 폐 등가물로부터 유래하는 세동맥 이송 채널을 나타내도록 구성되는 것이 바람직하다. 주어진 기관 등가물을 통과하는 유체는 각각의 분기에서 세정맥 이송 채널로부터 분기하는 세정맥 채널을 통해 세정맥 이송 채널로 다시 채널링 된다. 바람직하게, 독립된 순환 계통 및 기관 등가물은 폐 등가물로부터 유래하는 세동맥 이송 채널이 흐름 방향으로,
- 제1 세동맥 채널이 소장, 비장 및 췌장 등가물 공급으로 분기되는 제1 분기;
- 제2 세동맥 채널이 간 등가물 공급으로 분기되는 제2 분기;
- 제3 세동맥 채널이 신장 등가물 공급으로 분기되는 제3 분기;
- 제4 세동맥 채널이 신장 등가물 공급으로 분기되는 제4 분기;
- 제5 세동맥 채널이 골수 공급으로 분기되는 제5 분기;
- 제6 세동맥 채널이 피부 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제6 분기;
- 제7 세동맥 채널이 지방 조직 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제7 분기;
- 제8 세동맥 채널이 고환 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제8 분기, 및
- 제9 세동맥 채널이 뇌 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제9 분기를 나타내도록 구성된다.
독립된 순환 계통에서는, 폐 등가물로부터 주어진 거리에서 모든 분기를 포함하는 모든 세동맥 이송 채널의 단면적의 총합이 일정하게 유지되도록, 흐름 방향의 상기 세동맥 이송 채널의 직경은 일정하게 감소되고, 상기 폐 등가물로부터 주어진 거리에서 모든 분기를 포함하는 모든 세정맥 이송 채널의 단면적의 총합이 일정하게 유지되도록, 상기 세동맥 채널에서의 상기 직경의 감소는 흐름 방향으로 일정하게 전환된다.
기관 층은 기관 성장 섹션의 기관 공동이 기저 층에 대향하는 측면에 개방되도록 구성될 수 있다. 이는 다기관 칩 장치가 완전히 조립되기 전에 각각의 유기관 공동에 유기관 또는 전구 세포를 적용할 수 있다. 이 경우, 다기관 칩 장치는 다른 선택적인 기관-홀더 층을 더 포함한다. 기관-홀더 층은 기관 층과 공동 층 사이에 배치된다. 기관-홀더 층은 공동 층과 선택된 기관 등가물의 연통이 유지되는 방식으로 기관 층을 밀봉 및 안정화되도록 구성된다. 기관-홀더 층은 50 내지 500㎛의 두께, 바람직하게 100 내지 300㎛의 두께, 더 바람직하게는 200㎛의 두께로 제공될 수 있다. 기관-홀더 층은 예를 들어 폴리스티롤(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리실록산 및/또는 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 합성 중합체로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게, 물질은 폴리카보네이트로 구성되거나 이를 포함한다. 특히, 기관 홀더 층이 배출 기능을 갖고/갖거나 신장, 간, 비장 및 소장 등과 같은 간질액의 상당한 양을 생산하는 기관 등가물을 커버하는 영역에서, 기관-홀더 층은 기관 층과 공동 층 사이에서 유체 연통을 허용하도록 구성된다. 이러한 유체 연통은, 예를 들어, 기관-홀더 층 내에 기공을 제공함으로써, 바람직하게 5 내지 7㎛의 평균 직경을 갖는 기공을 제공함으로써 성취될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 기관 층과 기관-홀더 층 사이의 유체 연통을 허용하는 영역에서 기관-홀더 층의 두께는 5 내지 15㎛, 바람직하게는 10㎛의 평균 두께로 감소될 수 있다.
본 발명의 다기관-칩 장치는 기관 층의 상단에 배치된 공동 층을 포함한다. 공동 층은 기관 층의 공동 층과 기관 성장 섹션의 공동들 사이의 유체의 교환을 허용하기 위하여 선택된 기관 등가물 또는 기관 성장 섹션과 유체 연통되도록 배열된 공동 및 튜브를 포함하도록 구성된다. 많은 기관은 배출 기능을 갖고/갖거나, 장기간에 걸쳐 배양 또는 인큐베이션이 예상되는 경우 소멸되어야 하는 간질액의 많은 양을 생성한다. 특히, 독립된 순환 계통의 유체가 교환 및 교체 없이 지속적으로 순환되기 때문에, 계통으로부터 분해 산물을 소멸시키는 것이 필수적이다. 특히, 신장 등가물에 있는 소변과 소장 등가물로부터 제공된 대변은 항상성 조건하에서 장시간 동안 다기관 칩 장치의 작동을 허용하기 위한 계통으로부터 제거되어야 한다. 또한, 매체가 계통에 일정하게 제공되지 않기 때문에, 소장 등가물에 영양소를 공급하는 저장조가 요구된다. 바람직하게, 이러한 영양 저장조는 기관 층 자체 내에 배치되지 않고, 공동 층 내에 배치된다. 이는 기관 층의 직접 상호작용 없이 다기관 칩 장치의 작동 중에 불연속적으로 영양 저장조를 재충전할 수 있다.
공동 층은 다음을 포함하도록 구성될 수 있다:
소장 등가물의 상단에 위치하고, 영양 저장조로부터 소장 등가물에 영양소가 공급될 수 있도록 소장 등가물 및 영양 저장조와 유체 연통되는 공동;
소장 등가물의 상단에 위치하고, 소장 등가물로부터 배출된 물질이 대변 저장조로 이송될 수 있도록 소장 등가물 및 대변 저장조와 유체 연통되는 공동;
간 등가물의 상단에 위치하고, 간 등가물로부터 배출된 물질이 소장의 상단에 위치한 공동으로 이송될 수 있도록 소장 등가물의 상단에 위치한 공동 및 간 등가물과 유체 연통되는 공동; 및
신장 등가물의 상단에 위치하고, 소변 저장조가 신장 등가물로부터 배출된 물질을 수용하고 소변 저장조 및 신장 등가물과 유체 연통되는 공동.
상기 영양 저장조, 대변 저장조 및 소변 저장조는 공동 층의 일체형 부분이다.
공동 층은 독립된 순환 계통의 유체에 화학적 화합물, 예를 들어, 테스트 화합물의 도입을 허용하는 포트를 포함할 수 있고, 독립된 순환 계통의 유체로부터 샘플을 채취한다.
본 발명의 다기관 칩 장치는 액추에이터 층을 포함한다. 액추에이터 층은 독립된 순환 계통 및/또는 그 일부인 선택된 기관 등가물에 적용되는 압력을 조절하도록 배열 및 구성된 다수의 액추에이터를 포함하도록 구성된다. 항상성 조건하에 유기체를 작동시키기 위하여, 계통 내에서 제어된 이동 및 힘의 적용을 보장할 필요가 있다. 명백하게, 맥관 구조의 혈액은 적절한 기능을 보장하기 위하여 이동되어야 한다. 그러나 공기 흐름을 허용하기 위하여 폐의 압축 및 해제뿐만 아니라 장의 연동 움직임이 또한 필요하다. 본 발명의 다기관 칩 장치에서, 힘의 상기 이동 또는 도입은 액추에이터 층의 액추에이터를 통해 촉진된다. 액추에이터 층의 액추에이터 요소의 구성 및 배치는 다기관 칩 장치의 전체 구조, 특히 기관 층 내의 기관 등가물의 배열에 의존한다. 액추에이터는 기관 등가물 또는 독립된 순환 계통 또는 그 일부에 압력을 적용하도록 구성되어 공기 압력-기반 발생 장치로서 구현될 수 있다. 이러한 액추에이터는 외부 장치에 의해 제어될 수 있고, 이는 프로그래밍이 가능할 것이다.
바람직하게, 액추에이터 층은:
심장 박동 수를 모사하기 위하여 지향된 유체 운동을 허용하도록 독립된 순환 계통에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
장의 연동 운동을 모사하기 위하여 지향된 이동을 허용하도록 공동 층에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
호흡을 모사하기 위하여 공기-흐름을 허용하도록 폐 등가물에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
뼈-압축을 모사하기 위하여 조절된 압축을 허용하도록 골수 등가물에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
세동맥 수축을 모사하기 위하여 독립된 순환 계통의 세동맥 이송 채널에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
간 등가물로부터 담즙을 방출하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하도록 간 등가물에 작용하는 하나 이상의 액추에이터; 및
신장 등가물로부터 소변을 방출하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하도록 공동 층에 작용하는 하나 이상의 액추에이터를 포함한다.
본 발명의 다기관 칩 장치의 바람직한 실시예에 있어서, 기관 층은 폴리디메틸실록산(PDMS)을 포함하거나 이로 구성되고, 기관 홀더 층은 폴리카보네이트를 포함하거나 이로 구성되며, 공동 층은 PDMS를 포함하거나 이로 구성되고 그리고/또는 액추에이터 층은 폴리카보네이트를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명은 유기관, 세포 및 유체가 없는, 특허 청구 범위 및 위에 정의된 다기관 칩 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 각각 유기관, 세포 및 유체를 포함하는, 위에 정의된 다기관 칩 장치와도 관련이 있다.
본 발명의 다기관 칩은 항상성 상태에서 장시간 작동의 가능함을 특징으로 하고, 이는 생물학적 유기체와 밀접하다. 다기관 칩은 그 장치에 존재하는 기관 등가물의 내용 및 구조에 따라 다른 설정으로 적용될 수 있다. 시스템적인 안전 테스트, 면역, 감염 및/또는 종양 모델에서의 적용과 더불어, 본 발명의 다기관 칩 장치의 다음과 같은 바람직한 용도가 제시된다.
하기 표 1은 본 발명의 다기관 칩 장치의 바람직한 용도를 보여준다.
기관 계통 (제한되지 않은) 모델링을 위한 다기관 칩 장치의 사용
혈액 순환: - 체내에서 진행되는 맥관 구조, 조혈 작용, 골수의 구조 및 혈류역학의 미세 환경을 복제 가능한 혈관 계통
- 혈액 순환 계통과 면역 계통을 나타내는 림프 계통
- AV 및 SV 노드에서 심근 세포의 부정맥, 심박수 및 뚜렷한 성질의 모델
- 심장조직에서 관상동맥의 맥관 구조와 산소 그라디언트를 포함하는 통합 계통
- 긴 QT 증후군, 심근증과 같은 질병의 병리를 모델링 할 수 있는 미세 계통
내분비: - 시상 하부 - 뇌하수체 - 내분비 기관 축 (예. 부신, 갑상선, 부갑상선, 성선, 지방 세포) 모사
- 췌장섬-및/또는 그 구성 요소 (베타세포, 알파세포)
- 조절장애 호르몬 방출 또는 내분비 질환과 관련된 질병
- 개별 및 상호 연결된 발병, 치료 및 제 1형 및 제 2형 당뇨병의 합병증
위장: - 침샘
- 미생물과의 상호 작용을 포함한 내장
- 지방간, 간 독성, 염증성 장 질환, 식도 및 소화 운동장애, 췌장염 질환
면역: - 선천성 및 후천성 면역 계통, 유아 및 성인의 면역 체계, 성별-특정 면역 반응, 비장
- 염증, 보충 활성화, 수상 세포 활성화, 자가 면역, 알레르기, 과민증, 감염성 질환과 같은 질병 병리
피부: - 피부, 장벽의 기능을 모사하는 편평 점막상피와 관련된 면역 기관(예. 알레르기 반응), 온도 조절 규제 기관, 감각 기관(예. 터치, 온도, 통증, 가려움) 및 분비 기관(예. 피지, 항균성 펩타이드), 각질화 및 비-각질화 구강 점막
- 멜라닌 세포, 면역세포, 말초 신경 및 기타 관련 세포 유형으로 표피와 진피 조직을 포함한 조직
- 혈관, 모낭, 땀샘 및 기타 관련 기관 구조를 포한 조직
- 피부 상처 치유, 자극, 알레르기 반응, 백신/아쥬번트 효능의 시험
- 피부 질병 모델 (예. 건선, 섬유증)
근골격: - 관절, 뼈 항상성, 척추, 근육과 신경 근육, 치아 발육 및 재생
- 막성뼈, 혈관신생 뼈, 근육(동적 워크로드, 근육유형 (골격: 심장), 신경근육의 신경분포 묘사), 연골성골, 연골 그리고, 힘줄과 인대 등의 결합 조직
- 근이영양증 또는 질병, 신경 근육 질환, 골관절염, 류마티스 성 관절염, 골다공증 질환
신경: - 신경 교세포 미세환경, 시냅스 연결, 혈액 뇌관문 또는 신경 혈관 단위체, 대뇌 피질의 구조, 눈과 눈의 조직
- 발작 모델링에 대한 비정상적인 회로 작동의 사용 평가, 뇌 조직 염증에 대한 저산소 효과의 평가
- 신경변성, 신경발달장애, 발작, 학습과 기억, 중독
생식: - 자궁경질 등가물, 태반 (투과성, 약물의 이송과 신진대사), 정자, 스테로이드, 유방조직/유선 및 복잡한 호르몬 조절
- 불임
호흡 기관: - 기도 반응성, 비-누출 계통의 가스 교환, 기도와 폐의 미세 계통, 기관지 및 점액섬모의 모사
- 폐 고혈압, 낭포성 섬유증, 기관지 경련, 천식
- 호흡기 병원체, 연기 흡입 또는 독성 물질의 흡입에 대한 노출의 사용 평가
본 발명은 예를 통해 이하에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 모든 층 구조를 갖는 본 발명에 따른 다기관 칩 장치의 일 실시예를 도시한 개략도이다.
도 2는 도 1에 따른 실시예의 액추에이터 층을 위에서 아래로 바라보고 도시한 개략도이다.
도 3은 도 1에 따른 실시예의 공동 층(antra layer)을 위에서 아래로 바라보고 도시한 개략도이다.
도 4는 도 1에 따른 실시예의 기관-홀더 층을 위에서 아래로 바라보고 도시한 개략도이다.
도 5는 도 1에 따른 실시예의 기관 층을 위에서 아래로 바라보고 도시한 개략도이다.
도 6은 도 1에 따른 실시예의 기저 층을 위에서 아래로 바라보고 도시한 개략도이다.
도 7은 개략적으로 미세 유체 다기관 칩(MOC) 장치를 도시한 도면으로서, (a)는, 폴리카보네이트(CP)를 포함하고 PDMS-유리 칩이 2개의 미세혈관 회로(면적: 76mm x 25mm, 높이: 3mm) 및 가열 가능한 MOC-보유를 수용하는, 장치의 분해도이고, (b)는, 연속적으로 배열된 3개의 PDMS 막(두께: 500㎛)의 프로그램된 주기적인 압축 및 압축 해제에 의해 작동되는 연동-온-칩 미세 펌프의 단면도로서, 화살표가 흐름의 방향을 나타내는 단면도이며, (c)는, 각각 수용하는 2개의 삽입 영역(구분)(삽입 직경: 5mm)을 수용하는 2개의 분리된 미세 유체 회로(채널 높이: 100㎛, 폭: 500㎛)를 예시한 MOC 레이아웃의 평면도이다. 각 회로의 스폿 A 및 B는 비침임성 유체 및 세폭 분석을 지정한다.
도 8은 도 7의 MOC에서 유체역학의 결과를 도시한 도면으로서, (a)는 예시적인 속도가 유체 흐름의 박동 특성을 뒷받침하기 위해 2개로 분리된 유체 흐름 분석 스폿에서 측정된 전체 펌핑 사이클(주파수: 0.476 Hz)의 4단계에 걸쳐 작성(검은색 원 = 열림 밸브, 흰색 원 = 닫힘 밸브)되며, (b)는 두 스폿에서 펌핑 주파수(Hz)에 대해 평균 속도 크기(mm/s) 및 대응하는 전단 응력(dyn/cm2)을 나타낸 도면이다.
실시예 :
실시예 1: 본 발명에 따른 다기관 칩 장치
도 1에 도시된 것처럼, 다기관 칩 장치(1)는 기저 층(3), 기관 층(6), 기관 홀더 층(5), 공동 층(4) 및 액추에이터 층(2)을 포함한다.
도 6에 도시된 바와 같이, 기저 층(3)은 다른 층들을 위한 견고한 지지대를 제공하도록 구성된다. 기저 층(3)은 유리 또는, 예를 들어, 폴리스티롤(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리실록산 및/또는 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 투명한 합성 중합체로 구성된다. 또한, 기저 층(3)은 계통을 모니터링 및 제어하도록 설계 및 배열된 다수의 센서(32 및 33)를 포함한다. 이들 중 센서(32)는 기관 층의 기관 등가물에 전기 자극을 인가하도록 구성되고, 다른 센서(33)는 적절한 기능을 보장하기 위해 계통의 파라미터를 측정하도록 구성된다. 기저 층(3)은 센서에 의해 취득된 데이터가 예를 들어 계통의 조절과 같은 다른 목적을 위해 추출 및 사용될 수 있는 포트를 포함한다.
기관 층(6)은 도 5에 도시되어 있다. PDMS로 구성된 기관 층(6)은 기저 층(3)의 상부에 위치하고, 다수의 개별 기관 등가물을 포함하도록 구성되며, 각각의 기관 등가물은 하나 이상의 기관 성장 섹션을 포함하고, 기관 성장 섹션의 각각은 지정된 기관에 적어도 하나의 유기관을 수용하기 위한 유기관 공동을 포함하도록 구성된다. 기관 층(6)은 폐 등가물(22), 소장 등가물(21), 비장 등가물(23), 췌장 등가물(24), 간 등가물(25), 신장 등가물(26), 골수 등가물(27), 지방 조직 등가물(28), 뇌 등가물(29), 고환 등가물(30), 및 피부 등가물(31)을 포함한다. 각각의 기관 성장 섹션은 기관 성장 섹션의 유기관 공동과 독립된 순환 계통(34) 사이의 유체 연통을 위한 소형 입구와 소형 출구를 포함한다. 독립된 순환 계통(34)은 기관 성장 섹션의 소형 입구 및 소형 출구를 통해 기관 층(6)의 기관 성장 섹션과 직접적으로 유체 전달되도록 구성된다. 독립된 순환 계통(34)은 기관 성장 섹션까지 높은 pO2로 유체 이송을 허용하기 위해 폐 등가물(22)의 기관 성장 섹션의 소형 출구를 기관 층(6)의 다른 모든 기관 성장 섹션의 소형 입구와 직접적으로 연결하는 세동맥 이송 채널; 및 기관 성장 섹션으로부터 폐 등가물(22)까지 낮은 pO2로 유체 이송을 허용하기 위해 기관 성장 섹션의 소형 출구를 폐 등가물(22)의 기관 성장 섹션의 소형 입구와 직접 연결하는 세정맥 이송 채널을 포함한다. 독립된 순환 계통(34)은, 독립된 순환 계통(34)의 세정맥 이송 채널 쪽으로 비장, 췌장, 소장 등가물(23, 24, 21)로부터의 유체 연통이 간 등가물(25)을 통과시키는 통로를 통해 단독으로 발생할 수 있도록, 비장, 췌장, 소장, 및 간 등가물(23, 24, 21, 25) 사이의 유체 연통을 허용하기 위해서, 소장, 비장과 췌장 등가물(21, 23, 24)의 기관 성장 섹션의 소형 출구가 서로와, 그리고 간 등가물(25)의 기관 성장 섹션의 추가적인 소형 입구와 직접적으로 유체 연통 연결되도록 구성된다. 기관 등가물과 독립된 순환 계통(34)은 폐 등가물(22)로부터 유래하는 세동맥 이송 채널이 흐름 방향으로,
- 제1 세동맥 채널이 소장, 비장 및 췌장 등가물(21, 23 및 24) 공급으로 분기되는 제1 분기;
- 제2 세동맥 채널이 간 등가물(25) 공급으로 분기되는 제2 분기;
- 제3 세동맥 채널이 신장 등가물(26) 공급으로 분기되는 제3 분기;
- 제4 세동맥 채널이 골수 등가물(27) 공급으로 분기되는 제4 분기;
- 제5 세동맥 채널이 피부 등가물(31) 공급으로 분기되는 선택적인 제5 분기;
- 제6 세동맥 채널이 지방 조직 등가물(28) 공급으로 분기되는 제6 분기;
- 제7 세동맥 채널이 고환 등가물(30) 공급으로 분기되는 제7 분기; 및
- 제8 세동맥 채널이 뇌 등가물(29) 공급으로 분기되는 제8 분기를 나타내도록 구성된다.
흐름 방향(폐 등가물(22)로부터 다른 기관 등가물 쪽)으로의 세동맥 이송 채널의 직경은, 폐 등가물(22)로부터 주어진 거리에서 모든 분기를 포함하는 모든 세동맥 이송 채널의 단면적의 총합이 일정하게 유지되도록 일정하게 감소되고, 세정맥 이송 채널에서의 상기 직경의 감소에 의해 폐 등가물로부터 주어진 거리에서 모든 분기를 포함하는 모든 세정맥 이송 채널의 단면적의 총합이 일정하게 유지되도록 흐름 방향(다른 기관 등가물로부터 폐 등가물(22)쪽)으로 전환된다.
유기관의 개수에 비례하는 다수의 유기관을 하우징하도록 구성된 각각의 기관 등가물은 포유 동물 유기체, 바람직하게 인간의 각 기관에 평균적으로 존재하고, 다기관 칩 장치의 모든 기관 등가물은 동일한 미리 결정된 비례 계수, 예를 들어 0.00001(1/100,000)의 계수만큼 크기가 감소된다.
기관 층(6)은 다음과 같이 구성된다:
- 간 등가물(25)의 기관 성장 섹션은 5개 내지 15개의 간 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 간 유기관은 간 소엽이고, 바람직하게 유기관 공동은 10개의 간 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 폐 등가물(22)의 기관 성장 섹션은 2000개 내지 4000개의 폐 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 폐 유기관은 폐포이고, 바람직하게 유기관 공동은 3000개의 폐 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 췌장 등가물(24)의 기관 성장 섹션은 5개 내지 15개의 췌장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 췌장 유기관은 랑게르한스섬이고, 바람직하게 유기관 공동은 10개의 췌장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 비장 등가물(23)의 기관 성장 섹션은 5개 내지 15개의 비장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 비장 유기관은 백비수 및 적비수이고, 바람직하게 유기관 공동은 10개의 비장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 소장 등가물(21)의 기관 성장 섹션은 40개 내지 80개의 소장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 소장 유기관은 융모이고, 바람직하게 유기관 공동은 60개의 소장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 신장 등가물(26)의 기관 성장 섹션은 10개 내지 30개의 신장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 신장 유기관은 네프론이고, 바람직하게 유기관 공동은 20개의 신장 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 골수 등가물(27)의 기관 성장 섹션은 1000개 내지 2000개의 골수 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 골수 유기관은 골수, 뼈 및 연골로 형성된 단위이고, 바람직하게 유기관 공동은 1400개의 골수 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 피부 등가물(31)의 기관 성장 섹션은 10개 내지 15개의 피부 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 피부 유기관은 피부 부속기이고, 바람직하게 유기관 공동은 15개의 피부 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 지방 조직 등가물(28)의 기관 성장 섹션은 200,000개 내지 300,000개의 지방 조직 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 지방 조직 유기관은 지방질의 클러스터이고, 바람직하게 유기관 공동은 240,000개의 지방 조직 유기관을 하우징하도록 구성되며;
- 고환 등가물(30)의 기관 성장 섹션은 10개 내지 20개의 고환 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 고환 유기관은 고환 여포이고, 바람직하게 유기관 공동은 15개의 고환 유기관을 하우징하도록 구성되며; 그리고
- 뇌 등가물(29)의 기관 성장 섹션은 150개 내지 250개의 뇌 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 뇌 유기관은 대뇌 피질 칼럼이고, 바람직하게 유기관 공동은 200개의 뇌 유기관을 하우징하도록 구성된다.
다음의 표 2에서 파라미터는 3mm의 높이와 PDMS 층으로 이루어진 기관 층(6)을 위해 주어졌다.
유기관 길이×폭×높이 (mm) 부피 ( mm 3 ) 분기하는 순환 계통에서의 단면적의 감소 (%) 채널에서의 단면적 ( mm 2 ) 분기에서의 단면적 ( mm 2 )
폐포 (폐) 15 x 9 x 2 270 100 3.14
랑게르한스섬 (췌장) 1 x 1 x 1 1 17.61

 2.59

 0.55
백비수와 적비수 (비장) 1 x 1 x 1 1


융모 (소장) 9 x 2 x 1.5 27
소엽 (간) 10 x 1.5 x 1.5 22.5 9.47 2.29 0.30
네프론 (신장) 12 x 2 x 2 48 18.13 1.72 0.57
단위 (골수)
(골수: 5mm+뼈+연골: 1.5mm = 6.5mm)		 6.5 x 2 x 1.5 19.5 4.06 1.59 0.13
부속기 (피부) 2 x 9 x 4 72 5.79 1.41 0.18
클러스터 (지방조직) 4 x 17 x 1.5 102 5.53 1.24 0.17
여포 (고환) 1 x 1 x 1.5 1.5 1.87 1.18 0.06
소뇌피질 (뇌) 5 x 2 x 1.5 15 11.46 0.82 0.36
단락에서의 순환 계통: 24.91 0.78
기관-홀더 층(5)은 기관 층(6)과 공동 층(4) 사이에 배열되며, 이와 관련해서는 도 4가 참고된다. 기관-홀더 층(5)은 선택된 기관 등가물에 대해서 공동 층(4)과 유체 연통이 유지되는 방식으로 기관 층(6)을 밀봉 및/또는 안정화시키도록 구성된다. 기관-홀더 층(5)은 200㎛ 두께를 가진 층으로서 제공된다. 기관-홀더 층(5)은 폴리카보네이트(PC)를 포함하거나 구성된 물질로 형성된다. 기관-홀더 층(5)이 기관 등가물(21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31) 중 하나를 커버하는 영역에 있어서, 기관-홀더 층(5)은 기관 층(6)과 공동 층(4) 사이의 유체 연통을 허용하도록 구성된다. 특히, 기관-홀더 층(5)이 배설 기능을 갖거나, 그리고, 신장(26), 간(25), 비장(23) 및 소장(21)과 같은 간질액의 많은 양을 생산하는 기관 등가물을 커버하는 영역에 있어서, 이러한 유체 연통은, 예를 들어, 기관-홀더 층(5) 내에 기공을 제공함으로써, 바람직하게, 5 내지 7㎛의 평균 직경을 갖는 기공을 제공함으로써 성취될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 기관 층(6)과 공동 층(4) 사이의 유체 연통을 허용하는 영역에서, 기관-홀더 층(5)의 두께는 5 내지 15㎛의 평균 두께, 바람직하게, 10㎛로 감소될 수 있다.
공동 층(4)은, 도 3에 도시되어 있고, 공동과 기관 성장 섹션 사이의 유체 교환을 허용하기 위하여 기관 층(6)의 기관 성장 섹션 또는 선택된 기관 등가물과의 유체 연통으로 배열된 다수의 공동 및 튜브를 포함하도록 구성된다. 공동 층(4)은 PDMS를 포함하거나 이로 구성된다. 공동 층(4)은:
소장 등가물(21)의 상단에 위치하고, 소장 등가물(21)에 영양 저장조(18)로부터 영양소가 공급될 수 있도록 소장 등가물(21) 및 영양 저장조(18)와 유체 연통되어 있는 공동;
소장 등가물(21)의 상단에 위치하고, 소장 등가물(21)로부터 배출된 물질이 대변 저장조(19)로 이송될 수 있도록 소장 등가물(21) 및 대변 저장조(19)와 유체 연통되어 있는 공동;
간 등가물(25)의 상단에 위치하고, 간 등가물(25)로부터 배출된 물질이 소장 등가물(21)의 상단에 위치한 공동으로 이송될 수 있도록 간 등가물(25)과 소장 등가물(21)의 상단에 위치한 공동과 유체 연통되어 있는 공동, 및
신장 등가물(26)의 상단에 위치하고, 소변 저장조(20)가 신장 등가물(26)로부터 배출된 물질을 수용하도록 신장 등가물(26) 및 소변 저장조(20)와 유체 연통되어 있는 공동을 포함하도록 구성된다. 영양 저장조(18), 대변 저장조(19) 및 소변 저장조(20)는 공동 층(4)의 일체형 부분이고, 바람직하게는 외부에서 액세스 가능하도록 구성된다.
액추에이터 층(2)은 선택된 기관 등가물, 독립된 순환 계통 및/또는 그 일부에 적용될 수 있는 압력을 조절하도록 배열 및 구성된 다수의 액추에이터를 포함하도록 구성되며, 이와 관련해서는 도 2가 참조된다. 액추에이터 층은 폴리카보네이트로 구성된다.
액추에이터 층(2)은:
심장 박동수를 모사하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하는 독립된 순환 계통(34)에 작용하는 3개의 압력 기반 액추에이터(10);
장의 연동 이동을 모사하기 위하여 지향된 이동을 허용하는 방식으로 공동 층(4)에 작용하는 3개의 연동 기반 액추에이터(11);
공기 호흡을 모사하기 위하여 공기 흐름을 허용하는 폐 등가물(22)에 작용하는 하나의 액추에이터(12);
뼈-압축을 모사하기 위하여 조절된 압축을 허용하는 골수 등가물(27)에 작용하는 하나의 액추에이터(17);
세동맥 수축을 모사하기 위하여 독립된 순환 계통(34)의 세동맥 이송 채널에 작용하는 8개의 액추에이터(14);
간 등가물(25)로부터 담즙을 방출하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하는 간 등가물(25)에 작용하는 1개의 액추에이터(13);
신장 등가물(26)로부터 신장 저장조(20)로 소변을 방출하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하는 신장 등가물(26)에 작용하는 1개의 액추에이터(13); 및
비장 등가물(23)에 작용하는 1개의 액추에이터(13)를 포함한다.
또한, 액추에이터 층은 영양 저장조(18)에 액세스하는 포트(16), 대변 저장조에 액세스하는 포트(16), 소변 저장조(20)에 액세스하는 포트(16), 독립된 순환 계통(34)의 세정맥 이송 채널에 액세스하는 하나의 포트(16)를 포함한다.
실시예 2: 본 발명의 다기관 칩 장치에 생물학적 맥관 구조를 통합
본 발명의 다기관 칩 또는 인간-온-칩 장치에 기능 맥관 구조 등가물의 구축의 가능성을 입증하기 위하여 인간 맥관 구조-심장 및 혈관 온 칩의 이송 부분을 모사하는 것을 목적으로 한다. 1차 인간의 피부 미세 혈관 내피 세포(HDMEC)에 의해 완전히 덮인 마이크로채널 계통을 통해 장시간에 걸쳐서 안정적인 유체의 흐름을 지원하는 온-칩 마이크로펌프가 확립되었다. 기존 대다수의 마이크로시스템과 달리 10 내지 40dyn/cm2의 범위에서 일정한 전단 응력이 적용되는 EC에 전단 응력이 미치는 영향을 조사하기 위해 다른 실험 설정에서 이전에 사용된 패턴과 반대로 박동성 전단 응력을 목적으로 한다. 2개의 분리된 구획을 상호 연결하는 본 연구에서 제시된 미세혈관 이송 계통은 각각 100mg까지의 바이오매스 용량을 갖는 개별 기관 등가물의 통합을 위해 설계되었다. 이후 기관 혈관을 지지하는 개별 기관 배양 구획의 영역에서 혈관 분기 및 직경 감소를 지원하는 특수 인서트가 제작되었다. 소프트 리소그래피 및 PDMS의 복제 몰딩을 적용하는 고속 프로토타이핑은 항상 동일한 표준 칩 기반 포맷에 따르는 기관의 수와 그들 특정 배치에 관한 설계의 유연한 조절을 허용한다. 또한, 두 가지 중요한 특징은 대부분의 기존 미세 유체 계통의 기술적인 취급 제약을 극복하기 위해 구현되었다: i) 마이크로시스템의 인큐베이터 독립된 동작이 강화 칩 지원에 의해 보장되었으며, ii) 회로 채널의 각각 및 모든 영역에 대한 현미경을 이용한 액세스는 실시간으로 비디오 현미경을 가능하게 하여 보장되었다.
물질 및 방법
장치 설계 및 제조
본 발명자는 별도의 연동 온-칩 마이크로펌프에 의해서 각각 작동되는 2개의 분리된 미세 혈관 회로를 수용하는 미세 유체 다기관 칩(MOC) 장치를 설계 및 제조하였다. 도 7은 시스템을 개략적으로 도시하였다. 커버 플레이트는 각각 매체 교환 및 이후에 기관 등가물의 통합을 위한 300㎕의 구획들을 형성하는 6개의 공기 압력 피팅 및 4개의 인서트를 수용한다. MOC-홀더 층은 37℃에서 MOC의 제어된 일정한 템퍼링을 지원한다(도 7a). 연동 온-칩 마이크로 펌프(도 7b)가 설치되었다. 마이크로펌프 소프트웨어 제어는 시계 방향 및 반 시계 바늘 방향의 유체 흐름을 용이하게 한다. 흐름 속도(Q)는 펌핑 주파수의 조절에 의해 변화될 수 있다. 각각의 마이크로채널 회로(도 7c)는 총 10㎕의 부피를 포함하면서, 다른 기관 등가물 배양을 위한 2개의 개별 인서트-기반 구획들은 300㎕까지의 체적 용량을 각각 갖는다. PDMS(실가드 184, 다우코닝, 미드랜드, MI, 미국)의 표준 소프트 리소그래피 및 복제 몰딩은 MOC 제작에 적용되었다. 간단히, 마스터 몰드는 유리 웨이퍼에 실리콘 웨이퍼를 결합함으로써 제조되었다. 포토레지스트는 실리콘 웨이퍼에 도포되었고, 포토 마스크 및 UV 광을 이용하여 패턴화되었다. 이어서, 보호되지 않은 실리콘 영역이 에칭되었고 포토레지스트가 스트립 되었다. 마이크로시스템을 제조하기 위하여, 20분 동안 80℃에서 커버 플레이트(CP)는 실리콘 고무 첨가제(WACKER® PRIMER G 790, 바커 케미, 뮌헨, 독일)로 처리되었다. 제조된 커버-플레이트는 마스터 몰드(채널 높이 100㎛, 폭 500㎛)에 플러깅 되었고, PDMS(경화제에 대한 PDMS의 비율 10:1 v/v)는 캐스팅 스테이션에 주입되었다. 이러한 설정은 적어도 60분 동안 80℃에서 배양되었다. 테플론 스크류는 4개의 PDMS-프리 배양 구획들과 2개의 온-칩 마이크로펌프를 구성하는 500㎛ 두께의 6개의 PDMS 막을 생성하는 데 사용되었다(마이크로펌프당 3개의 막). 캐스팅 PDMS 슬라이스는 CP에 실질적으로 치밀한 결합을 한다. 그 후에, CP에 부착된 PDMS 슬라이스는 저압 플라즈마 산화처리(펨토; 디너, 에프하우젠, 독일)에 의해 현미경 슬라이드에 비가역적으로 결합하였다. 멸균 배지는 표면의 중화를 방지하기 위해 2개의 미세 혈관 회로에 즉시 주입되었다.
유체 역학의 특성
본 발명자는 마이크로 유체 회로의 스폿 A와 B(cf. 도 7c)에서의 유체 흐름을 특정하기 위해 비-침습적으로 마이크로 입자 영상 유속계(μPIV)에 적용하였다. 간단히, CMOS 카메라(Baumer Optronic HXC40, 해상도: 2048 x 2048 픽셀, 인터페이스: 카메라 링크; Baumer Optronic, 라데베르크, 독일)에 결합된 연속 광원으로서 표준 할로겐 램프와 자이스 Primovert 반전 현미경(자이스, 예나, 독일)은, 단일 이미지 당 4μs의 노출 시간에서 15㎛ 폴리스티렌 비드(4*104g/ml; 라이프테크놀로지, 다름슈타트, 독일)의 움직임을 추적하는 데 사용된다. 낮은 배율(4배)은 대략 50 픽셀 (1 픽셀 = 3.2㎛)에 두 프레임 사이의 이동을 제한하기 위해 선택되었다. z-포커스 피크 속도를 검출하는 각 스폿에서(50㎛ 유리 슬라이드 위) 유체 채널의 중심부로 설정하였다. 유체 채널 (1024 픽셀 x 100 픽셀, 3.28mm x 0.32mm)의 중심에서 미소 조사 구간은 3200fps까지의 프레임 속도를 달성한 것으로 관찰되었다. 마지막으로, 상관관계는 특정 영역에서의 변위의 x-성분의 최대값에 대한 상관관계를 산출하는 15,000 프레임의 이미지 스택(image stack)을 분석하는 소프트웨어 프로그램(프라운호퍼, IWS, 드레스덴, 독일)으로 수행하였다. 성공한 5개의 프레임의 계산 된 값은 아티팩트를 최소화하기 위해 평균화된다. 다음의 펌프 구성은 모든 실험에 사용하였다. 압력 - 500mbar; 진공 - 520mbar; 및 기류 - 350mbar에서 1.51/분. 도 7c에 도시된 바와 같이, 시간-의존성은 칩상의 2개의 서로 다른 위치(A+B)에서 측정되었다.
층류는 미세 채널의 중심에서 최대 속도(Vmax)를 갖기 때문에, 평균 전단 응력(τ)은 다음과 같은 식을 이용해서 계산될 수 있다:
Figure 112015036812730-pct00001
(1)
상기 식에서, Vmax는 채널의 중심에서 평균 속도의 크기이고, μ는 동점도(1 mPa/s)에서 산출되고, h는 채널 높이(100 ㎛)이다.
세포 분리 및 배양
HDMEC는 청소년 기증자의 일상적인 할례 후, 소아과 수술 동의서 및 윤리승인을 얻은 인간의 포피로부터 분리되었다. 세포분리에 사용된 모든 피부 샘플은 제거 후 하루 만에 처리했다. 분리하기 전, 포피는 30초 동안 80% 에탄올로 세척하고, 인산염 완충 식염수(PBS; PAA, 쾰베, 독일)로 세척하였다. 피부 고리를 열리고 피하조직을 제거하였다. 진피로부터 얇은 표피층을 분리하기 위하여, 준비된 포피는 5㎎/㎖의 디스파제 II 용액(시그마-알드리치, 슈넬도르프, 독일)을 15 내지 18시간 동안 4℃에서 배양하였다. 진피는 소형 조각으로 절단 한 다음, 4㎎/㎖의 콜라게나아제 NB4 용액(Serva, 하이델베르크, 독일)에서 75분 동안 37℃에서 배양하였다. 혼합물은 70㎛ 나일론 필터를 통과하고 5분 동안 300g으로 원심 분리하였다. 생성된 세포 펠릿을 보충 팩 MV2(PromoCell, 하이델베르크, 독일), 1%의 PS 및 0.05%의 훈기존(fungizone)으로 보충된 내피 세포 성장 인자 MV2(ECGM- MV2, PromoCell, 하이델베르크, 독일)에 재부유하였다. 세포를 T-75 플라스크에 식종하고, 5%의 CO2를 37?에서 증식시켰다. 배지는 식종(seeding) 1 일 후에 교체되었다. 초기 식종 2 내지 5일 후, HDMEC는 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의해 정제하였다. 세포는 0.05% (0.5mg/ml) 트립신/EDTA(PAA, 쾰베, 독일)를 사용하여 채취하였고, 제조업체의 지침에 따라 CD31 마이크로 비드 키트(Miltenyi Biotec, 베르기쉬 글라트바흐, 독일)를 사용하여 EC에 대해 양성 선택을 실행하였다. 보충 팩 MV2와 1%의 P-S(완전한 ECGM-MV2)가 보충된 ECGM-MV2는 컬럼으로부터 세포가 빠져나가기 위해 사용되었다. 분리된 세포의 순도 조절은 FACS 분석에 의해 각각 MACS한 후에 직접 실시하였다. 필요한 경우, 세포의 90% 초과 부분이 CD31에 대하여 양성이 될 때까지 분리 사이클이 반복되었다. 정제된 HDMEC는 나중에 사용하기 위해 냉동하거나 증식 후 즉시 사용하는 것 중 하나이다. 3일 동안의 공급체계에서 융합이 70 내지 90% 완료될 때까지 HDMEC는 T-75 플라스크에서 완전한 ECGM-MV2와 함께 증식되었다. 3번째와 8번째 통로 사이의 세포는 내피 세포의 주요 특성을 유지하도록 모든 연구에 사용되었다.
서로 다르게 처리된 PDMS 표면상의 HDMEC 의 배양
HDMEC는 세 가지 유형의 PDMS 표면에서 104cells/cm2의 밀도로 식종되었다: 미처리되었고, 100㎍/ml의 파이브로넥틴(시그마 알드리치, 슈넬도르프, 독일)으로 코팅되었으며, 공기 플라즈마로 처리되었다. 공기 플라즈마 처리를 30초 동안 저압 플라즈마 시스템(50W)에서 13.56 MHz의 주파수로 수행하였다. 배양 48시간 후, 세포의 성장과 형태는 광학 현미경으로 비교하였다.
MOC 에서의 EC 식종과 배양
식종 이전에, 각각 MOC는 배지와 함께 플러싱되고, 37℃, 5%의 C02에서 3일 동안 정적 조건에서 배양한다. HDMEC는 0.05%의 트립신/EDTA(PAA, 쾰베, 독일)를 사용하여 증식 배양으로부터 얻는다. 세포 현탁액은 원심분리 되고, 세포 수는 ViCell 생존 카운터(베크만 쿨터, Fullerto, CA, 미국)를 사용하여 수행하였다. 모든 실험에서 세포의 생존율은 90%를 초과하였다. 원심 분리된 세포는 최종농도가 2 x 107 cells/ml인 완전한 ECGM-MV2로 재부유되었다. 그 후, 세포 현탁액 1ml를 주사기로 옮겼다. 세포는 각각의 회로의 2개 구획 중 하나를 통해 주입하였다. 주사기는 암 루어 x ¼-28 숫 어댑터에 연결된다(IDEX Health & Science, 베르트 하임-몬트펠트, 독일). 공기는 특정 스레드(MOC) 어댑터(MicCell MOC-I 1/4 "- 28 UNF X M10 피팅(PEEK); Gesim, 드레스덴, 독일)에 나사 결합된 피팅 밖으로 밀렸다. 빈 주사기는 제2 구획에 동일하게 연결되었다. 두 회로에 세포 주입 후, 세포가 채널 벽에 부착할 수 있도록 장치는 3시간 동안 정적 조건, 5%의 C02, 37℃에서 배양되었다. 300㎕의 새로운 배지는 각각의 구획에 첨가한 후 각 회로의 온-칩 마이크로 펌프를 이용하여 PDMS 채널을 통해 플러싱 하였다. 0.476Hz의 주파수는 연속적인 동적 작동을 위해 상기 MOCs 미세 혈관의 모든 회로에 적용되었다. 정적 조건하에서 MOC 배양물에 대한, 입구와 출구의 구획 사이의 수압 차를 이용하여, 채널은 5분간 새로운 배지로 플러싱한다.
구획 당 150㎕ 배지의 양은 동적 및 정적 MOC 시스템 모두에 대해 1일 내지 2일마다 교체되었고, 각 순환의 스폿 A와 B에서 세포 성장과 생존은 광학 현미경 검사로 모니터링 하였다(도 7c). 또한, 세포 생존력은 칼세인 AM 분석으로 측정하였다. CellTrace 칼 세인 빨강-주황 AM (라이프테크놀로지, 다름슈타트, 독일) 5㎍/ml의 용액을 100㎕의 부피를 갖는 MOC의 각각의 두 구획에 첨가하였다. MOC을 30분 동안 37℃, 5% C02의 정적 조건에서 2분 동안 펌핑한 다음에 배양하였다. 그 후, 구획 삽입에서 배지를 새로운 배지로 대체함으로써 마이크로채널은 배지를 2회 세척하였다. 이미지는 형광 현미경(BZ9000; Keyence, 노이-이젠부르크, 독일)을 사용하여 얻었다. 정규 MOC 실험은 4일 후에 완료되었다(10 동적 MOC, 12 정적 MOC). 개별 MOC는 미세 혈관 회로의 장기간 성능에 첫 번째 표시를 얻기 위해 7, 14, 32일에 걸쳐 동일한 모드에서 작동되었다. MOC-보유에 의한 MOC 작동을 위해 C02-인큐베이터의 교체 가능성을 평가하려고 도 7a에서 보이는 바와 같이 오로지 홀더만을 사용하여 최대 7일 작동 시간 동안 9 MOC를 실험했다(7 동적 MOC, 2 정적 MOC).
MOC 내에서 EC 대사의 특성
배지의 글루코오스 농도는 제조업체의 지침에 따라 Stanbio 글루코오스 LiquiColor®(옥시다아제) NO.1070(Stanbio 연구소, Boerne의, TX, 미국) 절차를 사용하여 측정했다. 간략하게, 99㎕의 시약을 96 미량 역가판에 첨가하고(Greiner Bio-One, 브릭켄하우젠, 독일), 37℃로 예비 가열하고, 1㎕의 배지 샘플을 첨가한다. 또 다른 37℃에서 5분간 배양 후, 글루코스 농도는 참조에서와 같이 물을 사용하여, 마이크로 플레이트 리더(FLUOstar Omega; BMG Labtech, 오르텐베르크, 독일)에서 500nm로 정량하였다.
배지의 젖산 농도는 LOD-PAP(Diaglobal, 베를린, 독일) 방법을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 간략하게, 99㎕의 시약은 96-웰 포맷 멀티 웰 플레이트에서 1㎕의 배지 샘플과 혼합하고, 흡광도는 마이크로 플레이트 리더에서 520nm으로 측정하였고, 참조에서와 같이 물을 사용하였다.
MOC 내부에서 EC의 면역형광 염색
배양 4일 후, EC를 10분 동안 미세 혈관 회로 내부를 -20℃에서 차가운 아세톤으로 고정하고, 5분 동안 PBS로 두 번 세척하고, 20분 동안 PBS 중 10% 염소 와 함께 혈청 배양한 후 일차 항체인, 마우스 항-인간 CD31 (1:500; 7.1 ㎎/㎖; DRFZ, 베를린, 독일)과 함께 2시간 동안 상온(RT)에서 배양한다. 이어서, PBS로 2회 세척, 그 다음 40분 동안 실온에서 어두운 곳에서 알렉사 Fluor 594 염소 항-마우스 (1:200, 2mg/ml; 라이프테크놀로지, 다름슈타트, 독일)인 이차 항체와 함께 배양하였다. 세척 후, 항체로서 양 항-인간 vWF-FITC(1:50, 10mg/ml; 어빔, 캠브리지, 영국)를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 대조염색으로 핵을 Hoechst 33342로 염색한다. (1:1000, 10mg/ml; 라이프테크놀로지, 독일). 일차 항체 마우스 항-인간 VE-카데린(cadherin)(1:100, 0.2㎎/㎖, 샌터크루즈 생명공학, 하이델베르크, 독일)은 EC를 10분 동안 4% PFA으로 고정하고, 5분 동안 PBS로 두 번 세정 한 후, 5분 동안 0.2% 트리톤 X-100으로 투과하였다. 위에서 설명한 바와 같이 일차 및 이차 항체 염색은 PBS로 두 번 세척한 후 실시하는 것과 같이 수행했다. VE 카데린(cadherin)과 함께 오레건 그린®488 팔로이딘(라이프테크놀로지, 다름슈타트, 독일) 제조업체의 지침에 따라, MOC 배양물을 섬질(filamentous) 액틴 염색하였다.
각 용매는 MOC의 구획 인서트에 추가되고, 1 내지 2분 동안 배분하기 위해 펌프 된다. 이미지는 표준 형광현미경 또는 이광자 현미경 중 하나로 관찰하였다(TriMScope II; LaVision BioTec, 빌레펠트, 독일). 모든 미세 혈관 채널의 이미지는 현미경 슬라이드 벽을 통해 촬영했다. 3D 이미지는 이마리스(Imaris) 소프트웨어를 이용하여 수집된 이미지 스택으로부터 재구성되었다(Bitplane, 취리히, 스위스).
전단 응력의 효과의 특성
면역 형광 염색된 HDMEC 이미지는, 표준 형광현미경을 사용하여 흐름 유도된 형태학적 변화를 모니터링하기 위해 각각의 미세 혈관 회로(도 7c)의 스폿 A와 B를 촬영했다. 이미지의 HDMEC 막은, 자동 EC 인식을 위해 수동적으로 되돌아온다. 접속된 영역의 인식 알고리즘은 EC를 식별하고, 해당 둘레, 세포 크기, 무게 중심과 각각의 EC의 방향(공간 비가중 2차 모멘트의 주축)을 계산하는 데 사용한다.
다음과 같이, 무차원 형상지수(SI) 파라미터를 신장된 세포를 정량화하는 데 사용하였다:
Figure 112015036812730-pct00002
(2)
여기서, A는 세포의 면적이고, P는 세포의 파라미터이다. SI는 0에서 1의 범위이고 0은 직선, 1은 정원이다. 또한, 방향의 각도는 흐름 방향에서 HDMEC의 배향을 정량화하기 위해 측정하였고, 여기서 0°는 흐름의 방향에 완벽하게 정렬한 세포의 주축이고, 90°는 흐름의 방향에 수직으로 정렬된 세포이다. 소스 코드(source code)는 매트랩에서 구현되었다(Math Works, 이스마닝, 독일). 이미지당 최소한 200개의 세포에 대한 세포 배향 각도 및 SI를 분석을 위해 사용하였다.
펨토초 레이저 애블레이션에 의해 구성된 마이크로채널의 생성
1030nm (펄스 에너지 = 120nJ)의 파장을 가진 CAM 유도 펨토초 레이저(TissueSurgeon; Rowiak, 하노버, 독일)는 400fs의 펄스 지속 시간 및 10MHz의 반복율을 갖고, PDMS 재료에 40 x 40 ㎛2만큼 낮은 마이크로 채널을 생성하기 위해 Rowiak에 의해 사용되었다. 채널의 설계는 최소한의 성취가능한 직경을 나타내고, 분지 채널들의 각각을 통해 연속한 배지의 흐름을 허용하기 위해 선택되었다. HDMEC는 PDMS 몰드 내에서 사전에 구성된 마이크로채널로 식종되었고(seeded), 배양 1일 후에 칼세인 AM 분석(라이프테크놀로지, 다름슈타트, 독일)으로 염색하였다. 그 후, PDMS 몰드는 MOC의 조직 구획에 배치했다. 이미지는 표준 형광 현미경으로 얻었다.
결과 및 고찰
유체 역학의 평가
본 발명자는 성공적으로 예시된 유체 유동 프로파일을 특성화하는 μPIV를 MOC 회로의 다른 스폿들(spots)에 적용하였다(도 8a). 완벽한 접근 방법은, 현미경을 통해 각각의 모든 영역의 MOC는 MOC의 여러 다른 영역의 면밀한 분석과 미래의 가변적인 MOC 설계를 용이하게 한다. 현미경에 의한 최적의 분석 가능성 및 아래로부터 보는 관점(worm's eye view)에서 인간 적혈구로 채워진 미세 유체 MOC 회로의 연동 마이크로 펌프 막의 가동 모드들을 증명할 수 있다. 견고한 연동 온-칩 마이크로펌프는 무균 조건에서 결점없이 배지를 순환할 수 있는 미세 혈관 회로에 수 주 및 수개월 동안 7㎕/분(저주파수) 내지 70㎕/분(고주파수)분 범위의 유속으로 통합되었다. 박동성의 동작 주파수는 2.4Hz까지 증가시킬 수 있고, 이 주파수는 높지만, 여전히 인간의 생리학적 심장활동에 해당하는 박동수는 분당 144 비트이다. 이 주파수에서, 미세혈관 회로의 스폿 A와 B에서 측정한 전단 응력은 약 25yn/cm2(도 8b)이고, 이는 미세 혈관의 스케일의 상단에서 생리적 전단 응력이다. 평균 속도는 펌핑 주파수에 거의 선형으로 증가한다. 실험에 사용된 펌핑 주파수(0.476Hz)는 표면 범위의 초기 단계 동안 EC 손실을 피하기 위해 분당 30회 미만(휴식하는 성인의 생리적 값의 절반)의 "심장 박동"과 일치한다. 이 단계는 생체 내의 상처치유의 요소와 닮았다. 도 8a에 도시된 바와 같이 진동 전단 응력 - 다른 원하는 생리적 기능 - 은 마이크펌프 설계를 통해 MOC 작동으로 구현될 수 있다. 미세혈관의 특정 로컬 위치에서 이러한 진동의 파형은 펌핑 주파수와 MOC의 특정 설계에 따라 달라진다. 인간의 특정 파형은 특정 질병 감수성과 연관되어 있다. 이는 인체 심혈관계의 병리 과정의 연구에 대한 MOC 플랫폼의 추가적인 평가를 의미한다.
EC 소스, 분리 및 배양
오늘날, 마이크로 유체 시스템에서의 인간 EC 전단 응력 연구의 대부분은 많은 세포 수와 표현형의 높은 유연성에 쉽게 접근하는 인간제대정맥내피세포(HUVEC)상에서 수행한다. HDMEC는 적어도 같은 표현형적 유연성을 보유하고 있지만, 시험관에서 로컬 환경 변화에 신속하게 적응하기 위한 잠재력을 가진다. 캄과 그의 동료들은, 예를 들어, 마이크로 채널의 수직면에 HDMEC 배양에 성공하고 횡 평면에서 콜라겐 겔로 모세관 형태 발생을 모니터링한다. 신체의 다른 기관과 대조적으로, 척추동물의 피부가 즉각적인 혈관 수축 또는 이완에 의한 외부 온도의 변화에 빠르게 적응할 필요가 있다. 또한, 육식 동물의 피부는 공격적인 생활 방식으로 인해 반복되는 상해에 가장 확연한 노출을 가진 기관이다. 매칭되지 않는, 필적할 수 있는 표현형의 유연성과 신생 혈관의 고유한 잠재력을 위해 인간의 장수와 함께 선택되는 두 가지 요인은 HDMEC를 선택할지 모른다. 인간 맥관 구조에 대한 기능적인 체외 증가물의 시험관에서 인간 맥관구조에 기능적인 구축을 위해 두 가지 요인은 가장 중요하다. 혈관 신생의 용량은 MOC 내에 인간 맥관구조 - 기관 등가물의 모세혈관 망 - 의 제2 부분을 구축하는 것은 중요하다. 최근에 등장한 신생혈관형성의 분자 메커니즘은 전단 응력을 포함한 로컬 환경의 중요한 역할을 뒷받침한다. 다양한 기술이 상이한 조직으로부터 인간 EC가 분리되는 것이 설명되었다. CD31(PECAM-1) 마이크로 비드(MicroBeads)의 조직소화(tissue digestion) 시킨 후, 자성비드의 EC 분리가 적용되는데, 사실상 모든 유형의 EC의 표면에 구조적으로 발현되고, 백혈구 집단으로부터 멀리 떨어진 다른 세포 유형에는 존재하지 않기 때문이다. 특히, 피부 섬유아세포 및 평활 근세포에서는 발현되지 않는다. 형태학 및 여러 내피-특정 마커는 내피 세포의 출처를 확인하기 위해 조사하였다. 분리된 HDMEC는 위상차에서 조약돌 같은 형태를 보였고, 내피-특정 마커 CD31, VE-카데린 및 vWF(von Willebrand Factor)에 대해 양성이었다. 5B5, 섬유아세포-특정 마커 및 α-평활근 액틴, 평활근 세포-특정 마커의 염색은, 다른 세포 유형보다 크게 성장하지 않는 것을 나타낸다. 또한, HDMEC의 노출 4시간 후 Alexa594-labeled ac-LDL의 흡수를 보여주었다. 진피 섬유아세포 및 평활근 세포의 혼합은 모든 염색들에 대한 대조군으로 역할을 한다(데이터 미도시). 형태학과 마커표시에서 HDMEC는 큰 변화 없이 최대 8계대까지 배양될 수 있다. 상기 실험 방법은 인간의 포피에서 CD-31 양성 HDMEC을 분리하는 우수하고 재현 가능한 방법임을 우리의 데이터를 통해 나타내었다. MOC의 두 미세 혈관의 회로를 완전히 덮는 HDMEC의 평균 개수는 2*105개 세포의 범위에 있는 것으로 계산되었고, 평균적으로, 1*107개의 1차 HDMEC는 정렬 후 하나의 인간의 포피로부터 제조될 수 있다. 3000개까지의 세포 증폭률은 HDMEC 배양의 7~8계대 및 초기 식종 사이에서 성립하고, 따라서 하나의 포피로부터 3*1010개의 세포를 제공하게 한다. 이론적으로, 로드한 세포 MOC(MOC 1개 당 2개의 회로)는 5000개에 해당한다. 제조 및 증식의 최적화는 HDMEC 수율을 더욱 개선하기 위해 구상될 수 있다.
MOC 에서 안정한 미세혈관 회로 구축
파일럿은 코팅된 피브로넥틴에 부착하는 EC와 공기 플라즈마 처리된 PDMS 표면 사이를 비교 연구하였고, 정적 배양에서 HDMEC가 PDM에 적어도 균일하게 부착되었다. 또한, 플라즈마 처리는 PDMS 마이크로채널의 친수성을 높이는 실행가능한 기술로 오랫동안 인식되어왔다. 따라서, 공기 플라즈마 처리는 마침내 MOCS를 제조하는 동안에 표면 활성화를 위해 선택되었다. 피브로넥틴은 PDMS 기반 미세 유체 장치에서의 EC부착 및 배양을 위한 코팅제로 널리 사용된다. 실험실 연구 규모에서는 취급이 용이하지만, 나중에 대량 제조하는 큰 규모의 산업에서, 피브로넥틴 코팅 절차는 공정 속도 및 멸균을 방해할 수 있다. 수동 공기 플라즈마로의 PDMS 처리는, 효율적인 EC 부착을 위해 PDMS 기반의 마이크로 장치를 준비하기 위한 빠르고 확장 가능하며 재현 가능한 방법이다.
그 후, 연동 마이크로 펌프, 나중에 기관 등가물을 배양하기 위한 두 구획 및 기능성 HDMEC 단일 층으로 완전하게 커버된 연결된 마이크로채널을 포함하는 미세 혈관 회로는, 두 구획이 배양 4 일 이내에 박동성 배지의 흐름에서 구축되었다. 본 발명자는 이전에 다른 곳에서 인간 EC 라인 전체 회로의 범위를 보여주었다. 1차 HDMEC에 근거하여, 소형 인간 심혈관 운반계와 같이 신속한 구축에 초점을 맞추었다. 또한, EC의 대사 활성을 매일 추적하였다. 표면 부착 및 범위의 첫 번째 날에 증가된 대사 활성은, 세포의 증식 및 증가된 운동에 의해 설명될 수 있다. 주로 오염에 의한 실험의 초기 단계에서 시스템 소모율이 50%이고, 지금은 효율적이게도 실험실에서 루틴 MOC를 사용하여 약 20%로 감소되었다. 생체 외 실험 연구소에서 각각의 모든 산업에 설치된 총 품질 관리 시스템은 "연구소" 소모율을 충분히 제거할 수 있다.
EC는 채널 벽에 부착되어 있으며, 칼 세인 AM 빨강 주황 염색으로 볼 때, 생존된 것은 남아 있었다. 또한, 세포는 Alexa594-AC-LDL의 흡수에 대해 시험하였다. 배양 4일 후는 내피 세포의 형태에 더 이상의 변화가 관찰되지 않아서, 분석을 중단하였다. 4일에, 밀도가 높은 EC층의 면밀한 면역 형광법에서 현저한 생존 및 혈관 기능성을 나타냈다. 미세 혈관 회로를 형성하는 HDMEC는 CD31, vWF, VE-카데린에 대해 양성이다. 또한, HDMEC는 치밀한 유체 층을 형성하는 채널의 모든 벽을 커버할 수 있었다. 한편, 안정한 미세 혈관 회로는 최근에 기재된 PDMS 슬라이스 주변으로 분자의 이동을 방지하는 생체막으로써 역할을 할 수 있다. 한편, 그들은 혈액 응고를 방지하는 전체 혈액 순환을 위한 혈액적합성(heamocompatible) 혈관 망의 역할을 할 수 있다.
전단 응력의 영향
층류 전단 응력에 노출될 때, EC는 자신과 자신의 미세 섬유를 흐름 방향에 따라 정렬한다. 서로 다른 위치에서 생체 내 EC는 층류, 박동성, 난류와 같은 다른 유형에 노출되고, 후자는 예를 들어, 회전율을 높이기 위해 기재되었다. 생리적 전단 응력 유도 신도 및 흐름 정렬은 상기 MOC 배양물에서 입증되고, 이는 정적 배양조건에서 생성된 것에 대해 상기 SI 및 박동성 흐름(Q = 40.56μ/min, τ = 5.17dyn/cm2)에서 생성된 미세 혈관 회로 내에서의 HDME의 배향 각도를 플로팅된다. 필라멘트 액틴(F-액틴)의 분포의 변화는 정적 및 동적 배양 사이에 관찰되었다. 정적 상태에서 EC는 다각형이며, F-액틴은 세포의 주변에서 밀도가 높은 밴드로 조직된다; 한편, 약 5dyn/cm2의 전단 응력에서, F-액틴은 응력 섬유의 번들을 만든다. SI와 배향 각도는 MOC에서 EC의 정적 및 동적 배양 사이에서 상당히 다르고, 미세 유체 장치의 HDMEC에 대해서는 이전에 발견한 바 있다.
마지막으로, 본 발명자는 미세혈관 MOC 내의 제한된 수(n=4)의 분석한 스폿에서 14일 배양 동안 장기간 실험해서 최초 단일 미세혈관 MOC는 32일 이상 관찰하였다(데이터 미도시).
결론
생리적 순서에서 기관 등가물을 연결하는 EC-라인 마이크로 회로를 통한 혈액 순환은 마이크로 스케일에 인간 유기체의 항상성을 충분히 모사하기 위해서 가장 중요한 필수 요건이라고 본 발명자는 가정하였다. 따라서, 마이크로스케일의 인간 심장 혈관 계통의 수송 기능을 모사하는 인큐베이터 독립된 미세 혈관 순환 계통을 구축하는 소프트 리소그래피, 레플리카 몰딩, 이광자 레이저 어블 레이션 기술을 여기에서 성공적으로 적용하였다. 이것은 채널의 높이 100㎛, 총 3mm의 높이를 갖는 표준 현미경 슬라이드의 영역은 2층 유리-PDMS 칩 내에 배치된다. 2개의 별도의 원통형 조직 배양 인서트, 즉 각각의 96-웰 플레이트의 표준 공동 영역은 미세 혈관 회로 내에 배치된다. 박동성 전단 응력을 적용하는 왕성한 4일 과정은 HDMEC의 기능성의 치밀한 층을 가진, 시스템의 모든 유동 접촉 표면을 커버하도록 설립되었다. 문헌에서 기재된 수직면 HDMEC 층 성장과 달리, 인간 EC를 갖는 미세 혈관 계통의 전체 범위에 대해 처음에 이러한 미세 혈관 계통에 대한 생물학적 혈액 적합성이 제공될 수 있다. 순환 체적보다 낮은 적어도 2개의 크기에서 칩 레이아웃은 미세 혈관 이송 계통의 순환 유체 부피를 10㎕로 줄인 다음, 이는 외부 펌프와 저장조의 작동 시스템의 일부에 적용된다. 더 중요한 조직 배양 인서트는, 각각 최대 부피 300㎕를 가지며, 우선 개별적인 조직 등가물은 다음 현상 단계에서 수립되면, 생리적 유체-조직 비율의 정확한 조절을 허용한다. 제조 기술은 용이하고 변동가능하며, 설계 변경은 설계에서 장치에 2 내지 3개월의 시간으로 구현될 수 있다. 시험관 내에서 철저하게 입증되는 흐름 방향에 배향되는 EC의 정렬 및 신장은 저속도 비디오 현미경 기술을 통해 상세히 모니터링 된다. 다른 마이크로 유체 채널 설계는 기술 설명에 의해 실험실에서 동일하고 효율적인 HDMEC으로 커버된다. 본 발명자는, 일단 미세 혈관 순환 계통이 확립되면, 적어도 32일의 작동 수명을 갖는 것을 나타낸다.
1: 다기관 칩 장치
2: 액추에이터 층
3: 기저 층
4: 공동 층
5: 기관-홀더 층
6: 기관 층
10: 압력 기반 액추에이터(심장)
11: 연동 기반 액추에이터
12: 공기-유동 액추에이터
13: 액추에이터
14: 세동맥 수축 액추에이터
16: 포트
17: 뼈-압축 액추에이터
18: 영양 저장조
19: 대변 저장조
20: 소변 저장조
21: 소장 등가물
22: 폐 등가물
23: 비장 등가물
24: 췌장 등가물
25: 간 등가물
26: 신장 등가물
27: 골수 등가물
28: 지방 조직 등가물
29: 뇌 등가물
30: 고환 등가물
31: 피부 등가물
32: 전기 센서
33: 센서
34: 독립된 순환 계통

Claims (15)

  1. 다기관 칩 장치로서, 본 장치는,
    - 기저 층;
    - 상기 기저 층상에 배열된 기관 층;
    - 상기 기관 층상에 배열된 공동 층; 및
    - 액추에이터 층을 포함하며; 이때
    - 상기 기저 층은 다른 층을 위한 단단한 지지대를 제공하도록 구성되고;
    - 상기 기관 층은,
    다수의 개별 기관 등가물, 즉 하나 이상의 기관 성장 섹션을 포함하는 각각의 기관 등가물, 기관의 적어도 하나의 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 포함하도록 그리고 기관 성장 섹션의 유기관 공동과 독립된 순환 계통 사이의 유체 연통을 위한 소형 입구 및 소형 출구를 포함하도록 구성된 하나 이상의 기관 성장 섹션을 포함하도록 구성되고, 상기 기관 층은 폐, 소장, 비장, 췌장, 간, 신장 및 골수의 기관을 각각 나타내도록 구성된 적어도 하나의 기관 등가물을 포함하며, 그리고
    기관 성장 섹션의 소형 입구 및 출구를 통해 기관 층의 기관 성장 섹션과 직접 유체 연통되도록 구성된 독립된 순환 계통을 포함하도록 구성되며;
    - 상기 공동 층은 공동과 기관 성장 섹션 사이의 유체 교환을 허용하기 위해 선택된 기관 등가물 또는 기관 성장 섹션과 유체 연통되도록 배열된 다수의 공동 및 튜브를 구비하도록 구성되며; 그리고
    - 상기 액추에이터 층은 선택된 기관 등가물, 독립된 순환 계통 및 그 일부에 인가될 수 있는 압력을 조절하도록 배열 및 구성된 다수의 액추에이터를 포함하도록 구성되는, 다기관 칩 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기저 층은 유리 또는 투명한 합성 중합체를 포함하거나 이로 구성되는 투명한 물질로 제조되는, 다기관 칩 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기저 층은 하나 이상의 기관 등가물, 기관 성장 섹션 또는 독립된 순환 계통으로부터 방출 또는 그에 전송되는 신호를 측정하도록 구성된 하나 이상의 센서를 포함하는, 다기관 칩 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 독립된 순환 계통은,
    기관 성장 섹션까지 pO2로 유체의 이송을 허용하기 위하여 기관 층의 모든 기관 성장 섹션의 소형 입구와 폐 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 출구를 직접적으로 연결하는 세동맥 이송 채널; 및
    기관 성장 섹션으로부터 폐 등가물까지 pO2로 유체의 이송을 허용하기 위하여 폐 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 입구와 기관 성장 섹션의 소형 출구를 직접 연결하는 세정맥 이송 채널을 포함하는, 다기관 칩 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 독립된 순환 계통은, 비장, 췌장 및 소장으로부터 독립된 순환 계통의 세정맥 이송 채널쪽으로의 유체 연통이 간 등가물을 통과하는 통로를 통해서만 발생할 수 있는 방식으로, 소장, 비장 및 췌장 등가물의 기관 성장 섹션의 소형 출구가 서로와 직접 유체 연통되도록, 그리고 비장, 췌장, 소장과 간 등가물 사이의 유체 연통을 허용하도록 간 등가물의 기관 성장 섹션의 추가의 소형 입구와 직접 유체 연통되도록 접속되도록 구성되는, 다기관 칩 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기관 층은 피부, 고환, 뇌 및 지방 조직의 기관 등가물을 각각 나타내도록 구성된 적어도 하나의 기관 등가물을 더 포함하는, 다기관 칩 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기관 층과 상기 공동 층 사이에 배치된 기관-홀더 층을 더 포함하고, 상기 기관-홀더 층은 선택된 기관 등가물을 위해 공동 층과의 유체 연통이 유지되는 방식으로 기관 층을 밀봉 및 안정화되도록 구성된, 다기관 칩 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 공동 층은,
    소장 등가물의 상단에 위치하고, 영양 저장조로부터 소장 등가물에 영양소가 공급될 수 있도록 소장 등가물 및 영양 저장조와 유체 연통되는 공동;
    소장 등가물의 상단에 위치하고, 소장 등가물로부터 배출된 물질이 대변 저장조로 이송될 수 있도록 소장 등가물 및 대변 저장조와 유체 연통되는 공동;
    간 등가물의 상단에 위치하고, 간 등가물로부터 배출된 물질이 소장 등가물의 상단에 위치한 공동으로 이송될 수 있도록 소장 등가물의 상단에 위치한 공동 및 간 등가물과 유체 연통되는 공동; 및
    신장 등가물의 상단에 위치하고, 소변 저장조가 신장 등가물로부터 배출된 물질을 수용하도록 소변 저장조 및 신장 등가물과 유체 연통되는 공동을 포함하도록 구성되는, 다기관 칩 장치.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 액추에이터 층은,
    심장 박동 수를 모사하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하도록 독립된 순환 계통에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
    장의 연동 운동을 모사하기 위하여 지향된 운동을 허용하도록 공동 층에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
    호흡을 모사하기 위하여 공기-흐름을 허용하도록 폐 등가물에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
    뼈-압축을 모사하기 위하여 조절된 압축을 허용하도록 골수 등가물에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
    세동맥 수축을 모사하기 위하여 독립된 순환 계통의 세동맥 이송 채널에 작용하는 하나 이상의 액추에이터;
    간 등가물로부터 담즙을 방출하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하도록 간 등가물에 작용하는 하나 이상의 액추에이터; 및
    신장 등가물로부터 소변을 방출하기 위하여 지향된 유체 이동을 허용하도록 공동 층에 작용하는 하나 이상의 액추에이터를 포함하는, 다기관 칩 장치.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기관 층은,
    - 간 등가물의 기관 성장 섹션이 5개 내지 15개의 간 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 간 유기관은 간 소엽이며;
    - 폐 등가물의 기관 성장 섹션이 2000개 내지 4000개의 폐 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 폐 유기관은 폐포이고;
    - 췌장 등가물의 기관 성장 섹션이 5개 내지 15개의 췌장 유기관을 하우징하기 위해 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 췌장 유기관은 랑게르한스섬이고;
    - 비장 등가물의 기관 성장 섹션이 5개 내지 15개의 비장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 비장 유기관은 백비수 및 적비수이고; - 소장 등가물의 기관 성장 섹션이 40개 내지 80개의 소장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 소장 유기관은 융모이고;
    - 신장 등가물의 기관 성장 섹션이 10개 내지 30개의 신장 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 신장 유기관은 네프론이고; 그리고
    - 골수 등가물의 기관 성장 섹션이 1000개 내지 2000개의 골수 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 골수 유기관은 골수, 뼈 및 연골로 형성된 단위인, 다기관 칩 장치.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기관 층은,
    - 피부 등가물의 기관 성장 섹션이 10개 내지 15개의 피부 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 피부 유기관은 피부 부속기이고;
    - 지방 조직 등가물의 기관 성장 섹션이 200,000개 내지 300,000개의 지방 조직 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 지방 조직 유기관은 지방질의 클러스터이고;
    - 고환 등가물의 기관 성장 섹션이 10개 내지 20개의 고환 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되며, 각각의 고환 유기관은 고환 여포이고; 그리고
    - 뇌 등가물의 기관 성장 섹션이 150개 내지 250개의 뇌 유기관을 하우징하기 위한 유기관 공동을 제공하도록 구성되고, 각각의 뇌 유기관은 대뇌 피질 칼럼인, 다기관 칩 장치.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기관 등가물 및 상기 독립된 순환 계통은, 폐 등가물로부터 유래하는 세동맥 이송 채널이 흐름 방향으로,
    - 제1 세동맥 채널이 소장, 비장 및 췌장 등가물 공급으로 분기되는 제1 분기;
    - 제2 세동맥 채널이 간 등가물 공급으로 분기되는 제2 분기;
    - 제3 세동맥 채널이 신장 등가물 공급으로 분기되는 제3 분기;
    - 제4 세동맥 채널이 골수 등가물 공급으로 분기하는 제4 분기;
    - 제5 세동맥 채널이 피부 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제5 분기;
    - 제6 세동맥 채널이 지방 조직 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제6 분기;
    - 제7 세동맥 채널이 고환 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제7 분기; 및
    - 제8 세동맥 채널이 뇌 등가물 공급으로 분기되는 선택적인 제8 분기를 나타내도록 구성되는, 다기관 칩 장치.
  13. 제4항에 있어서,
    상기 폐 등가물로부터 주어진 거리에서 모든 분기를 포함하는 모든 세동맥 이송 채널의 단면적의 총합이 일정하게 유지되도록, 흐름 방향의 상기 세동맥 이송 채널의 직경은 일정하게 감소되며, 상기 폐 등가물로부터 주어진 거리에서 모든 분기를 포함하는 모든 세정맥 이송 채널의 단면적의 총합이 일정하게 유지되도록, 상기 세동맥 이송 채널에서 상기 직경의 감소에 의해 흐름 방향으로 일정하게 전환되는, 다기관 칩 장치.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 기관 층은 폴리디메틸실록산(PDMS)을 포함하거나 이로 구성되며, 상기 기관-홀더 층은 폴리카보네이트를 포함하거나 이로 구성되고, 상기 공동 층은 PDMS를 포함하거나 이로 구성되며, 및 상기 액추에이터 층은 폴리카보네이트를 포함하거나 이로 구성되는, 다기관 칩 장치.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    유기관의 개수에 비례하는 다수의 유기관을 하우징하도록 구성된 각각의 기관 등가물은 포유 동물 유기체 또는 인간의 각 기관에 평균적으로 존재하며, 다기관 칩 장치의 모든 기관 등가물은 미리 결정된 동일한 비례 계수 또는 0.00001(1/100,000)의 계수만큼 크기가 감소되는, 다기관 칩 장치.
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