BR112015006859B1 - dispositivo de múltiplos órgãos em chip - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP A presente invenção refere-se a um dispositivo de múltiplos órgãos em chip que compreende uma camada de base; uma camada de órgão disposta sobre a camada de base; uma camada de antros disposta sobre a camada de órgão; e uma camada de atuador; em que a camada de base é configurada para fornecer um suporte sólido para as camadas adicionais; a camada de órgão é configurada para compreender uma multiplicidade de equivalentes de órgãos individuais, em que cada equivalente de órgão compreende uma ou mais seções de crescimento de órgãos, sendo que cada uma das seções de crescimento de órgãos é configurada para compreender uma cavidade de organoide para alojar pelo menos um organoide de um órgão e para compreender uma microentrada e uma microssaída para comunicação fluida entre a cavidade de organoide da seção de crescimento de órgãos e um sistema de circulação independente, em que a camada de órgão compreende pelo menos um equivalente de órgão configurado para representar os órgãos pulmão, intestino delgado, baço, pâncreas, fígado, rim e medula óssea, respectivamente, e um sistema de circulação independente configurado para ficar em comunicação fluida direta com as seções de crescimento de (...).

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] Os sistemas de cultura de órgãos ou organoides tridimensionais miniaturizados (3D) são de crescente interesse acadêmico e econômico. Esses sistemas de cultura 3D visam permitir a investigação sobre como os órgãos funcionam e se comportam sob determinados estimulos, assim como, testar os efeitos de compostos ou composições quimicas em órgãos particulares ou grupos dos mesmos e estudar o comportamento farmacocinético de tais compostos ou composições. Em particular, em relação a testes de segurança de compostos quimicos, alternativas são exigidas para substituir experimentos em animais e gerar dados que possam ser mais facilmente usados para prever de maneira eficiente e confiável a segurança em humanos. A qualidade de tal sistema de cultura 3D in vitro irá depender de sua capacidade para refletir o máximo possivel a função fisiológica e o ambiente do respectivo órgão ou organoide. Esse objetivo pode ser atingido apenas se os órgãos não forem considerados como objetos independentes separados, mas se a complexidade de interação entre órgãos diferentes em um organismo for imitada o mais próximo possivel. A fim de permitir a geração de dados significativos, é necessário que o sistema de cultura permaneça estável por um periodo de tempo prolongado. Entretanto, a maioria dos sistemas de cultura 3D conhecidos reflete hoje apenas um tipo de célula ou modela apenas um tipo de órgão ou organoide. Os sistemas de cultura 3D que levam em consideração múltiplos órgãos e que permitem a cultura dinâmica desses múltiplos órgãos apenas recentemente foram descritos.

[002] No documento n° W02009/146911 A2, um dispositivo de órgão em um chip foi apresentado. Esse dispositivo de órgão em um chip é projetado para ser independente e controlado por sensor. O dispositivo permite o estabelecimento ou manutenção de órgãos ou organoides, assim como, nichos de células-tronco em um formato de chip miniaturizado. O dispositivo de órgão em um chip pode compreender uma multiplicidade de seções de crescimento de órgãos que compreende um órgão ou organoide, um reservatório de alimentação de meio e um reservatório de descarte de meio funcionalmente conectados uns aos outros, de modo que os órgãos ou organoides da seção de crescimento de órgãos possam ser alimentados com o meio a partir do reservatório de alimentação de meio e que os produtos de degradação e residues possam ser descartados através do reservatório de descarte de meio. Embora esse modelo permita a cultura simultânea de mais de um órgão em um chip, esse dispositivo não permite a interação e relação cruzada entre diferentes órgãos no chip. Além disso, esse dispositivo não reflete todas as funções necessárias para atingir a homeostase do sistema de cultura ao longo de um periodo de tempo prolongado.

[003] No documento n° WO 2012/016711 Al, apresenta-se um modelo de cultura de células 3D que compreende uma ou mais seções de crescimento de órgãos, um sistema de circulação independente configurado para abastecer os órgãos ou organoides cultivados nas seções de crescimento de órgãos com nutrientes e um coletor de fluidos ou residuos extracapilar para coletar fluido intersticial e produtos de degradação a partir das seções de crescimento de órgãos. Esse sistema permite a cultura simultânea de mais de um órgão e imita um sistema vascular que serve e interconecta os órgãos diferentes. Desse modo, esse sistema permite a interação e relação cruzada entre os órgãos ou organoides do sistema. Outro dispositivo de cultura de células com uma composição comparável é revelado em US 2012/0214189 Al. Entretanto, esse dispositivo não reflete todas as funções necessárias para atingir a homeostase do sistema de cultura ao longo de um periodo de tempo prolongado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] A presente invenção refere-se a um dispositivo de múltiplos órgãos em chip que imita as funções básicas de um organismo necessárias para a homeostase de órgãos e/ou organismo. O dispositivo de múltiplos órgãos em chip da presente invenção é projetado para refletir um sistema de circulação independente que imita o sistema sanguineo de um organismo superior que serve inúmeros equivalentes de órgãos diferentes. Os equivalentes de órgãos são selecionados e dispostos de tal modo que as funções básicas de fornecimento de alimentos, remoção de residues e fornecimento de oxigênio sejam representadas totalmente funcionais para manter a homeostase dos equivalentes de órgãos ao longo

[005] de um periodo de tempo Um dispositivo de prolongado. múltiplos órgãos em chip é fornecido

[006]

[007] camada de base;

[008] , em que o dispositivo uma camada de uma camada de uma camada de compreende base; órgão disposta sobre a antros disposta sobre a camada de órgão; e

[009] - uma camada de atuador;

[010] em que

[011] - a camada de base é configurada para fornecer um suporte sólido para as camadas adicionais;

[012] - a camada de órgão é configurada para compreender

[013] uma multiplicidade de equivalentes de órgãos individuais, em que cada equivalente de órgão compreende uma ou mais seções de crescimento de órgãos, sendo que cada uma das seções de crescimento de órgãos é configurada para compreender uma cavidade de organoide para alojar pelo menos um organoide de um órgão e compreender uma microentrada e uma microssaida para comunicação fluida entre a cavidade de organoide da seção de crescimento de órgãos e um sistema de circulação independente, em que a camada de órgão compreende pelo menos um equivalente de órgão configurado para representar os órgãos pulmão, intestino delgado, baço, pâncreas, figado, rim e medula óssea, respectivamente, e

[014] um sistema de circulação independente configurado para ficar em comunicação fluida direta com as seções de crescimento de órgãos da camada de órgão através das microentradas e microssaidas das seções de crescimento de órgãos;

[015] - a camada de antros é configurada para compreender uma multiplicidade de cavidades e tubos disposta para ficar em comunicação fluida com equivalentes de órgãos selecionados ou seções de crescimento de órgãos a fim de permitir a troca de fluidos entre as cavidades e as seções de crescimento de órgãos; e

[016] - a camada de atuador é configurada para compreender uma multiplicidade de atuadores disposta e configurada para regular uma força de pressão aplicada sobre um equivalente de órgão selecionado, o sistema de circulação independente e/ou parte do mesmo.

[017] Os detalhes adicionais e modalidades preferidas da invenção são definidos no relatório descritivo abaixo e nas reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[018] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes. Exceto onde especificado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido pelo versado na técnica pertinente. Se uma primeira camada ou objeto for especificada para ser localizada em cima de uma segunda camada ou objeto, a primeira camada ou objeto pode ser diretamente localizada em cima da segunda camada ou objeto ou pode estar presente outra camada ou objeto entre a primeira e a segunda camada ou objeto.

[019] O dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção é composto por inúmeras camadas com funcionalidades diferentes. O dispositivo de múltiplos órgãos em chip compreende uma camada de base, uma camada de órgão, opcionalmente, uma camada de suporte de órgão, uma camada de antros e uma camada de atuador.

[020] A camada de base é configurada para fornecer um suporte sólido para as camadas adicionais, de modo que o dispositivo de múltiplos órgãos em chip possa ser facilmente manuseado e manipulado. De preferência, a dita camada de base é feita de um material transparente. Isso tem a vantagem de que a camada de órgão é opticamente acessivel a partir do lado inferior e, desse modo, permite a observação de organoides na seção de crescimento de órgãos durante a cultura por microscopia, por exemplo, por microscopia de dois fótons. Uma vez que a camada de base é feita de material transparente, a camada de órgão é acessivel a partir do lado inferior e permite o imageamento de razão de fluorescência para medição de pH intersticial local, microscopia de extinção de fosforescência de p02 intersticial e espectroscopia de infravermelho para detectar estresse fisiológico.

[021] Os materiais preferidos para a camada de base compreendem vidro e polimeros sintéticos opticamente transparentes como, por exemplo, poliestireno (PS), policarbonato (PC), polissiloxano e/ou polidimetilsiloxano (PDMS).

[022] A fim de monitorar a situação do dispositivo e permitir a cultura controlada dos organoides, a camada de base pode compreender um ou mais sensores configurados e dispostos para medir sinais emitidos a partir de e/ou transmitir sinais para um ou mais dos equivalentes de órgãos, seções de crescimento de órgãos e/ou sistema de circulação independente. Os sensores que são exibem alta sensibilidade a fim de permitir a medição exata mesmo em pequenos volumes de amostra. De preferência, a camada de base compreende sensores para os parâmetros principais de homeostase do organismo humano, tais como, viabilidade organoide ou celular, temperatura, pH, equilíbrio de fluidos, pressão, volume de fluxo, pressão de oxigênio ou consumo de oxigênio, consumo de nutrientes, adsorção de fluidos, secreção de suco intestinal, sintese de albumina, sintese de bile, excreção de ureia, equilíbrio iônico, osmolaridade e acoplamento elétrico. Os sensores que podem ser usados incluem, porém, não se limitam a sensores de pH, sensores de PO2, sensores de captura de analitos, sensores de condutividade, sensores de ressonância de plasmon, sensores de temperatura, sensores de CO2, sensores de NO, sensores de quimiotaxia, sensores de citocina, sensores de ions, sensores de pressão, sensores potenciométricos, sensores amperométricos, sensores de fluxo passante, sensores de carga, sensores de impedância, sensores de campo eletromagnético, sensores de ondas acústicas de superfície e sensores metabólicos. De preferência, a camada de base compreende pelo menos o seguinte conjunto de sensores:

[023] - 2 sensores de pÜ2 configurados e localizados para medir pθ2 no fluido do sistema de circulação independente da camada de órgão, de preferência, um sensor de PO2 é localizado sob o canal de transporte arteriolar nas proximidades de sua origem a partir do equivalente de pulmão e um sensor de pÜ2 é localizado sob o canal de transporte venular nas proximidades de sua origem a partir do equivalente de pulmão;

[024] - 4 sensores de resistência elétrica transepitelial/endotelial (TEER) para identificar vazamento no sistema de circulação independente (se a resistência entre dois dos sensores TEER for 0 o vazamento é provável) , de preferência, dois sensores TEER são localizados no sistema de circulação independente, por exemplo, um sensor TEER é localizado nas proximidades da origem do canal de transporte arteriolar a partir do equivalente de pulmão e um sensor TEER é localizado na extremidade do canal de transporte arteriolar mais distante da origem do canal de transporte arteriolar a partir do equivalente de pulmão, dois sensores TEER são configurados e localizados no equivalente de figado, opcionalmente, podem existir dois sensores TEER adicionais presentes configurados e localizados no equivalente à pele ou intestino conjuntamente para monitorar a funcionalidade de barreiras celulares, tais como, barreiras epiteliais ou endoteliais entre os órgãos e a corrente sanguinea;

[025] - sensores elétricos, que se acoplam a gânglios neuronais biológicos, configurados e localizados para ficar em contato com tais gânglios nos equivalentes de órgãos.

[026] O dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção compreende uma camada de órgão localizada em cima da camada de base. A camada de órgão é configurada para compreender uma multiplicidade de equivalentes de órgãos individuais, em que cada equivalente de órgão compreende uma ou mais seções de crescimento de órgãos. Cada uma das seções de crescimento de órgãos da camada de órgão é configurada para compreender uma cavidade de organoide para alojar um organoide de um tipo de órgão especifico. Cada seção de crescimento de órgãos é configurada para compreender uma microentrada e uma microssaida para comunicação fluida entre a cavidade de organoide da seção de crescimento de órgãos e o sistema de circulação independente da camada de órgão. A camada de órgão compreende pelo menos um equivalente de órgão configurado para representar os órgãos: pulmão, intestino delgado, baço, pâncreas, figado, rim e medula óssea, respectivamente. A camada de órgão pode compreender equivalentes de órgãos adicionais como, por exemplo, equivalentes de órgãos de pele, testiculos, cérebro e/ou tecido adiposo. Além disso, a camada de órgão compreende um sistema de circulação independente configurado para ficar em comunicação fluida direta com as seções de crescimento de órgãos da camada de órgão através das microentradas e microssaidas das seções de crescimento de órgãos dos equivalentes de órgãos.

[027] Conforme usado no presente documento, o termo "equivalente de órgão" se refere a todas as seções de crescimento de órgãos que compreendem organoides ou um tipo de órgão particular. Todos os órgãos e sistemas de um organismo, por exemplo, de um organismo humano, são construídos por múltiplas unidades estruturais autossuficientes funcionalmente idênticas, as unidades organoides. Essas unidades organoides são de dimensões muito pequenas, a partir de diversas camadas celulares até alguns milímetros. Os lóbulos do fígado, néfrons do rim, derme e epiderme da pele, mucosa intestinal, ilhotas de Langerhans do pâncreas, substância cinzenta e branca do córtex cerebral e cerebelo e nichos de células-tronco promotores de repouso de adultos são uma pequena seleção de exemplos de tais estruturas organoides humanas, todos com uma funcionalidade proeminente e geometria de conglomerado altamente variável. Devido à funcionalidade distinta, um alto grau de independência e multiplicidade de tais micro-organoides dentro do respectivo órgão, seu padrão de reatividade a quaisquer substâncias parece ser representativo de todo o órgão. A natureza criou estruturas biológicas muito pequenas, porém, sofisticadas para realizar as funções mais proeminentes de órgãos e sistemas. A multiplicação dessas estruturas organoides dentro de um determinado órgão é a ferramenta de gerenciamento de riscos da natureza para impedir a perda total de funcionalidade durante danos de órgãos parciais. Por outro lado, esse conceito permitiu o ajuste fácil do tamanho e formato de órgão às necessidades de uma determinada espécie - por exemplo, figado em camundongos e homens - ainda com o uso de um plano principal estabelecido para construir a única unidade organoide funcional. Uma chance exclusiva e excelente para testes de substância preditivos para a exposição humana consiste no estabelecimento de equivalentes de micro-organoides humanos in vitro. Na presente invenção, "organoides" significam artificiais, gerados de novo, agregados de células funcionais de diferentes tipos de células in vitro que mostram pelo menos uma função de órgão ou tecido mostram, de preferência, a maioria ou essencialmente todas as funções de órgão ou tecido. Desse modo, no dispositivo de múltiplos órgãos em chip da presente invenção, um equivalente de órgão é representado por uma ou mais seções de crescimento de órgãos, sendo que cada seção de crescimento de órgãos compreende uma cavidade de organoide para alojar um organoide do respectivo tipo de órgão. Desse modo, o tamanho de um equivalente de órgão pode ser facilmente ajustado escolhendo-se o número apropriado de seções de crescimento de órgãos ou organoides do respectivo tipo de órgão.

[028] O indivíduo versado na técnica está bem ciente da estrutura de um organoide de um determinado órgão e sabe como produzir o dito organoide. A seguir, alguns exemplos de organoides de órgãos específicos são fornecidos: organoides de forma alveolar do pulmão, organoides em forma de ilhotas de Langerhans do pâncreas, organoides em forma de polpa branca e vermelha do baço, organoides em forma de vilosidades do intestino delgado, organoides em forma de lóbulo do fígado, organoides em forma de néfrons do rim, unidades de medula óssea, organoides em forma de osso e cartilagem da medula óssea, unidades em forma de apêndices da pele, organoides em forma de agrupamentos de tecido adiposo, organoides em forma de folículo dos testículos e organoides em forma de córtex cerebelar do cérebro.

[029] O organoide de fígado pode ser um lóbulo do fígado em formato hexagonal com um volume de 1,2 a 2,2 mm3.

[030] O organoide de pulmão pode ser um alvéolo pulmonar em formato esferoide e com uma superfície de 0,15 a 0,25 mm2.

[031] O organoide de pâncreas pode ser uma ilhota de Langerhans circundada por tecido exócrino, todos organizados em formato esferoide e com um volume de 0,2 a 0,5 mm3.

[032] O organoide de baço pode ser tecido de polpa branca e vermelha em formato esferoide com um volume de 0,3 a 0,6 mm3.

[033] O organoide de intestino delgado pode ser uma vilosidade em formato de pilar com uma superfície de 0,2 a 0,4 mm2.

[034] 0 organoide de rim pode ser um néfron renal com uma capsula esferoide e um túbulo cilíndrico, e uma superfície de filtração de 6 a 7,5 mm2.

[035] O organoide de medula óssea pode ser uma unidade em formato de macroporos formada por medula óssea, osso e cartilagem com um volume de 0,006 a 0,008 mm3.

[036] O organoide de pele pode ser um segmento em formato hexagonal contendo apêndices, que tem uma superfície de 1,2 a 2 mm2.

[037] O organoide de tecido adiposo pode ser um agrupamento adiposo em formato esferoide com um volume de 0,0004 a 0,0006 mm3.

[038] O organoide de testículos pode ser um folículo de testículos em formato esferoide com um volume de 0,006 a 0,008 mm3.

[039] O organoide de cérebro pode ser uma coluna do córtex cerebral em formato cilíndrico e uma superfície de 0,02 a 0,03 mm2.

[040] A camada de órgão pode ser projetada de modo que:

[041] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de fígado seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de fígado, em que cada organoide de fígado é um lóbulo do fígado, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 10 organoides de fígado;

[042] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 2.000 a 4.000 organoides de pulmão, em que cada organoide de pulmão é um alvéolo pulmonar, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 3.000 organoides de pulmão;

[043] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de pâncreas é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de pâncreas, em que cada organoide de pâncreas é uma ilhota de Langerhans, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 10 organoides de pâncreas;

[044] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de baço é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de baço, em que cada organoide de baço é uma polpa branca e vermelha, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 10 organoides de baço;

[045] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de intestino delgado é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 40 a 80 organoides de intestino delgado, em que cada organoide de intestino delgado é uma vilosidade, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 60 organoides de intestino delgado;

[046] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de rim é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 30 organoides de rim, em que cada organoide de rim é um néfron, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 20 organoides de rim; e

[047] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de medula óssea é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 1.000 a 2.000 organoides de medula óssea, em que cada organoide de medula óssea é uma unidade formada por medula óssea, osso e cartilagem, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 1.400 organoides de medula óssea.

[048] Além disso, a camada de órgão pode ser projetada, de modo que:

[049] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de pele é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 20 organoides de pele, em que cada organoide de pele é um apêndice de pele, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 15 organoides de pele;

[050] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de tecido adiposo é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 200.000 a 300.000 organoides de tecido adiposo, em que cada organoide de tecido adiposo é um agrupamento adiposo, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 240.000 organoides de tecido adiposo;

[051] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de testículos é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 20 organoides de testículos, em que cada organoide de testículos é um folículo de testículos, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 15 organoides de testículos; e

[052] - uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de cérebro é configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 100 a 300 organoides de cérebro, em que cada organoide de cérebro é uma coluna do córtex cerebral, de preferência, a cavidade de organoide é configurada para alojar 200 organoides de cérebro.

[053] Cada um dos equivalentes de órgãos pode ser configurado para alojar um número de organoides que seja proporcional ao número de organoides presentes, em média, no respectivo órgão de um organismo mamifero, de preferência, de um ser humano. A fim de representar um organismo, é vantajoso selecionar o tamanho de todos os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção para refletir a proporcionalidade relativa no tamanho de órgão sob condição fisiológica no organismo. De preferência, todos os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip são reduzidos em tamanho pelo mesmo fator de proporcionalidade predeterminado. Esse fator de proporcionalidade pode variar dependendo do tamanho pretendido do dispositivo de múltiplos órgãos em chip, um fator de proporcionalidade preferido é 0,00001 (1/100.000). Se um organismo humano deve ser representado, o dispositivo de múltiplos órgãos em chip é preferencialmente configurado para compreender:

[054] 1 organoide de figado,

[055] 300 organoides de pulmão,

[056] 1 organoide de pâncreas,

[057] 1 organoide de baço,

[058] 6 organoides de intestino delgado,

[059] 2 organoides de rim,

[060] 140 organoides de medula óssea e, opcionalmente,

[061] 1 ou 2 organoides de pele,

[062] 24.000 organoides adiposos,

[063] 1 ou 2 organoides de testiculos,

[064] 20 organoides de cérebro,

[065] ou um múltiplo dos mesmos.

[066] Em uma modalidade preferida particular, o dispositivo de múltiplos órgãos em chip é preferencialmente configurado para compreender:

[067] 10 organoides de figado,

[068] 3. 000 organoides de pulmão,

[069] 10 organoides de pâncreas,

[070] 10 organoides de baço,

[071] 60 organoides de intestino delgado,

[072] 20 organoides de rim,

[073] 1. 400 organoides de medula óssea, opcionalmente

[074] 15 organoides de pele,

[075] 240.000 organoides adiposos,

[076] 15 organoides de testículos,

[077] 200 organoides de cérebro,

[078] ou um múltiplo dos mesmos.

[079] De preferência, uma seção de crescimento de órgãos compreende adicionalmente um ou mais nichos de células-tronco. A fim de fornecer um sistema que possa ser operado sob condição homeostática por um periodo de tempo prolongado, é vantajoso fornecer uma fonte de células que possa facilitar a renovação celular dentro de um organoide. Cada órgão tem um determinado tempo de renovação durante o qual as células do órgão são substituídas por novas células. Essa renovação celular de um órgão assegura que as células de um órgão sejam vitais e totalmente funcionais. A dita renovação pode ser imitada introduzindo-se um nicho de célula-tronco em um, alguns ou todos os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip. Os ditos nichos de células-tronco podem fazer parte de uma, algumas ou todas as seções de crescimento de órgãos de um equivalente de órgão.

[080] A estrutura e o modo de fabricação de tais seções de crescimento de órgãos que incluem cavidades de órgão e nichos de células-tronco já foram descritos no documento n° WO 2012/016711 Al e n° WO 2009/146911 A2, a revelação dos quais é incorporada no presente documento a titulo de referência.

[081] A camada de órgão pode ser feita de um material adequado. Os materiais preferidos compreendem SÍO2, vidro, e polimeros sintéticos. Os polimeros sintéticos preferidos compreendem poliestireno (PS), policarbonato (PC) , poliamida (PA), poliimida (PI), polieteretercetona (PEEK), polifenilenossulfeto (PPSE), resina de epóxido (EP), poliéster insaturado (UP), resina de fenol (PE) , polissiloxano, por exemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), resina de melamina (ME), éster cianato (CA) , politetrafluoroetileno (PTFE) e misturas dos mesmos. Os polimeros sintéticos particularmente preferidos são opticamente transparentes e incluem, por exemplo, poliestireno (PS), policarbonato (PC), e polissiloxano, por exemplo, polidimetilsiloxano (PDMS). Um material particularmente preferido compreende PDMS.

[082] A camada de órgão compreende um sistema de circulação independente. O sistema de circulação independente é projetado para imitar o sistema vascular de um organismo e, desse modo, abastecer todos os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção com nutrientes, O2 e permitir a interação e relação cruzada entre os equivalentes de órgãos. A presença do dito sistema de circulação independente é vital para a homeostase de todo o dispositivo de múltiplos órgãos em chip. 0 termo "independente" se refere ao fato de que um fluido é circulável no sistema de circulação e que, de preferência, não existe nenhuma conexão fluidica para fornecer continuamente fluido, por exemplo, meio, sangue ou um equivalente de sangue, a partir de um reservatório externo para o sistema de circulação. Nesse contexto, "externo" significa que o reservatório não é uma parte integral do sistema de circulação ou o dispositivo de múltiplos órgãos em chip, por exemplo, não é conectado através de uma tubulação ao sistema de circulação. Se substâncias, por exemplo, nutrientes e/ou fluidos, tiverem que ser respostas durante o curso de incubação, é preferível que tais nutrientes ou fluidos sejam fornecidos descontinuamente através de uma porta de injeção que, de preferência, é localizada em um canal de transporte arteriolar ou venular do sistema de circulação ou que é localizada na camada de antros.

[083] O sistema de circulação independente é configurado para ficar em comunicação fluida direta com as seções de crescimento de órgãos dos equivalentes de órgãos da camada de órgão através das microentradas e microssaidas das ditas seções de crescimento de órgãos. A estrutura e o modo de fabricação de tal sistema de circulação independente já foram descritos no documento n° WO 2012/016711 Al, a revelação do mesmo é incorporada no presente documento a titulo de referência. A superfície interna do sistema de circulação independente pode ser revestida com células endoteliais e, opcionalmente, células musculares lisas.

[084] O sistema de circulação independente compreende:

[085] um canal de transporte arteriolar, que conecta diretamente as microssaidas das seções de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão às microentradas das seções de crescimento de órgãos da camada de órgão, a fim de permitir o transporte de fluido com alta pÜ2 até as ditas seções de crescimento de órgãos; e

[086] um canal de transporte venular, que conecta diretamente as microssaidas das seções de crescimento de órgãos às microentradas das seções de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão, a fim de permitir o transporte de fluido com baixa pθ2 a partir das seções de crescimento de órgãos até o equivalente de pulmão.

[087] O sistema de circulação independente pode ser preenchido com um fluido com capacidade para transportar nutrientes e O2 até os equivalentes de órgãos. De preferência, o dito fluido é sangue ou um equivalente de sangue.

[088] O fluido no sistema de circulação independente é circulado de um modo direto através da ação associada de atuadores da camada de atuador do dispositivo de múltiplos órgãos em chip. Desse modo, é possivel imitar não apenas uma pressão adequada dentro do sistema de circulação que corresponde à pressão na vasculatura de um organismo, mas, também, permitir a imitação do batimento cardiaco. Desse modo, o sistema de circulação independente do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção é adequado para fornecer forças de cisalhamento e microambientes que correspondem à situação encontrada sob condições fisiológicas.

[089] O sistema de circulação independente pode ser configurado, de modo que as microssaidas das seções de crescimento de órgãos dos equivalentes de intestino delgado, baço e pâncreas sejam conectadas para ficar em comunicação fluida direta umas com as outras e com microentradas adicionais das seções de crescimento de órgãos do equivalente de figado, a fim de permitir a comunicação fluida entre o equivalente de baço, pâncreas, intestino delgado e figado, de tal modo que a comunicação fluida do baço, pâncreas e intestino delgado em direção ao canal de transporte venular do sistema de circulação independente possa ocorrer exclusivamente através da passagem através do equivalente de figado. Essa arquitetura permite imitar as funções básicas do sistema digestivo de um organismo superior como, por exemplo, um ser humano. A vantagem de tal arquitetura consiste no fato de que o dispositivo de múltiplos órgãos em chip pode ser cultivado ao longo de um tempo prolongado abastecendo-se o equivalente de intestino delgado com nutrientes a partir de um reservatório localizado na camada de antros. Os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção serão, então, abastecidos com nutrientes que passaram por um sistema digestivo. Desse modo, os nutrientes são fornecidos de uma forma e modo que são mais comparáveis à condição fisiológica em um organismo. Não há mais nenhuma necessidade de um reservatório de meio externo que seja constantemente alimentado no sistema de circulação para servir os equivalentes de órgãos.

[090] O sistema de circulação independente e os equivalentes de órgãos são configurados, de preferência, de modo que o canal de transporte arteriolar que se origina a partir do equivalente de pulmão exiba, na direção de fluxo, bifurcações nas quais os canais arteriolares se ramificam, servindo os equivalentes de órgãos. 0 fluido que passa através de um determinado equivalente de órgão é canalizado de volta para o canal de transporte venular através de canais venulares que se ramificam a partir do canal de transporte venular nas respectivas bifurcações. De preferência, o sistema de circulação independente e os equivalentes de órgãos são configurados, de modo que o canal de transporte arteriolar que se origina a partir do equivalente de pulmão exiba na direção de fluxo:

[091] - uma primeira bifurcação na qual um primeiro canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de intestino delgado, baço e pâncreas;

[092] - uma segunda bifurcação na qual um segundo canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de figado;

[093] - uma terceira bifurcação na qual um terceiro canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de rim;

[094] - uma quarta bifurcação na qual um quarto canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de rim;

[095] - uma quinta bifurcação na qual um quinto canal arteriolar se ramifica, servindo a medula óssea;

[096] - uma sexta bifurcação opcional na qual um sexto canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de pele;

[097] - uma sétima bifurcação opcional na qual um sétimo canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de tecido adiposo;

[098] - uma oitava bifurcação opcional na qual um oitavo canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de testículos; e

[099] - uma nona bifurcação opcional na qual um nono canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de cérebro.

[0100] O sistema de circulação independente é configurado, de modo que o diâmetro do canal de transporte arteriolar na direção de fluxo seja constantemente reduzido, de modo que a soma das áreas em corte transversal de todos os canais de transporte arteriolares, incluindo todas as bifurcações a uma determinada distância a partir do equivalente de pulmão, permaneça constante e em que no canal de transporte venular a dita redução no diâmetro seja constantemente revertida na direção de fluxo, de modo que a soma das áreas em corte transversal de todos os canais de transporte venulares, incluindo todas as bifurcações a uma determinada distância a partir do equivalente de pulmão permaneça constante.

[0101] A camada de órgão pode ser configurada, de modo que as cavidades de organoide das seções de crescimento de órgãos sejam abertas no lado oposto à camada basal. Isso permite aplicar os organoides ou células precursoras às respectivas cavidades de organoide antes de o dispositivo de múltiplos órgãos em chip ser totalmente montado. Nesse caso, o dispositivo de múltiplos órgãos em chip compreende adicionalmente uma camada de suporte de órgão opcional de outra forma. A camada de suporte de órgão é disposta entre a camada de órgão e a camada de antros. A camada de suporte de órgão é configurada para vedar e/ou estabilizar a camada de órgão, de tal modo que para os equivalentes de órgãos selecionados, a comunicação com a camada de antros seja mantida. A camada de suporte de órgão pode ser fornecida como uma camada de 50 a 500 pm de espessura, de preferência, com uma espessura de 100 a 300 pm, com mais preferência, com uma espessura de 200 pm. A camada de suporte de órgão pode ser feita de um material que compreende ou consiste em um polimero sintético como, por exemplo, poliestireno (PS) , policarbonato (PC), polissiloxano e/ou polidimetilsiloxano (PDMS). De preferência, o material compreende ou consiste em policarbonato. Especificamente nas áreas, em que a camada de suporte de órgão cobre um equivalente de órgão que tem função excretora e/ou produz quantidade considerável de fluido intersticial, como rim, figado, baço e intestino delgado, a camada de suporte de órgão é configurada para permitir a comunicação fluida entre a camada de órgão e a camada de antros. Essa comunicação fluida pode ser atingida, por exemplo, ao fornecer poros dentro da camada de suporte de órgão, de preferência, ao fornecer poros com um diâmetro médio de 5 a 7 pm. De maneira alternativa ou, além disso, a espessura da camada de suporte de órgão em uma área que permite a comunicação fluida entre a camada de órgão e a camada de suporte de órgão pode ser reduzida a uma espessura média de 5 a 15 pm, de preferência, a 10 pm.

[0102] O dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção compreende uma camada de antros disposta em cima da camada de órgão. A camada de antros é configurada para compreender uma multiplicidade de cavidades e tubos disposta para ficar em comunicação fluida com equivalentes de órgãos selecionados ou seções de crescimento de órgãos, a fim de permitir a troca de fluidos entre as cavidades da camada de antros e seções de crescimento de órgãos da camada de órgão. Inúmeros órgãos têm funções excretoras e/ou produzem quantidades consideráveis de fluido intersticial que precisam ser dissipadas se a cultura ou incubação ao longo de um periodo de tempo prolongado for considerada. Especialmente, uma vez que o fluido do sistema de circulação independente é constantemente circulado sem troca e substituição, é vital dissipar os produtos de degradação do sistema. Em particular, a urina formada no equivalente de rim e as fezes fornecidas a partir do equivalente de intestino delgado precisam ser eliminadas do sistema, a fim de permitir a operação do dispositivo de múltiplos órgãos em chip por um periodo de tempo prolongado sob condições homeostáticas. Além disso, uma vez que o meio não é constantemente alimentado no sistema, um reservatório para abastecer o equivalente de intestino delgado com nutrientes é necessário. De preferência, esse reservatório de nutrientes não é disposto dentro da própria camada de órgão, mas, dentro da camada de antros. Isso permite reabastecer o reservatório com nutrientes descontinuamente durante a operação do dispositivo de múltiplos órgãos em chip sem interagir diretamente com a camada de órgão.

[0103] A camada de antros pode ser configurada para compreender:

[0104] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado e fica em comunicação fluida com o equivalente de intestino delgado e um reservatório de nutrição, de modo que o equivalente de intestino delgado possa ser abastecido com nutrientes a partir do reservatório de nutrição;

[0105] uma cavidade que é localizada em cima do intestino delgado e fica em comunicação fluida com o equivalente de intestino delgado e um reservatório de fezes, de modo que o material excretado a partir do equivalente de intestino delgado possa ser transportado para o reservatório de fezes;

[0106] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de figado e fica em comunicação fluida com o equivalente de figado e a cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado, de modo que o material excretado a partir do equivalente de figado possa ser transportado para a cavidade que é localizada em cima do intestino delgado; e

[0107] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de rim e fica em comunicação fluida com o equivalente de rim e um reservatório de urina, de modo que o reservatório de urina receba o material excretado a partir do equivalente de rim.

[0108] O reservatório de nutrição, o reservatório de fezes e o reservatório de urina são partes integrais da camada de antros.

[0109] A camada de antros pode compreender adicionalmente uma porta que permite a introdução de compostos quimicos, como, por exemplo, compostos de teste, no fluido do sistema de circulação independente e a tomada de amostras a partir do fluido do sistema de circulação independente.

[0110] O dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção compreende uma camada de atuador. A camada de atuador é configurada para compreender uma multiplicidade de atuadores disposta e configurada para regular uma força de pressão aplicada sobre um equivalente de órgão selecionado, o sistema de circulação independente e/ou parte do mesmo. A fim de operar um organismo sob condições homeostáticas, é necessário assegurar o movimento e aplicação de força controlada dentro do sistema. Evidentemente, o sangue na vasculatura precisa ser movido, a fim de assegurar o funcionamento adequado. Entretanto, o movimento peristáltico intestinal também é necessário, assim como, a compressão e descompressão do pulmão, a fim de permitir o fluxo de ar. No dispositivo de múltiplos órgãos em chip da presente invenção, o dito movimento ou introdução de força é facilitado através dos atuadores da camada de atuador. A configuração e disposição de elementos de atuador na camada de atuador dependem da arquitetura total do dispositivo de múltiplos órgãos em chip, em particular, da disposição de equivalentes de órgãos dentro da camada de órgão. Os atuadores podem ser entendidos como atuadores à base de pressão de ar que são configurados para aplicar força de pressão em um equivalente de órgão ou no sistema de circulação independente ou uma parte do mesmo. Esses atuadores podem ser controlados por um dispositivo externo que pode ser programável.

[0111] De preferência, a camada de atuador compreende:

[0112] um ou mais atuadores que atuam no sistema de circulação independente para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de imitar o batimento cardiaco;

[0113] um ou mais atuadores que atuam sobre a camada de antros para permitir o movimento direcionado, a fim de imitar o movimento peristáltico intestinal;

[0114] um ou mais atuadores que atuam sobre o equivalente de pulmão para permitir o fluxo de ar, a fim de imitar a respiração;

[0115] um ou mais atuadores que atuam sobre o equivalente de medula óssea para permitir a compressão regulada, a fim de imitar a compressão óssea;

[0116] um ou mais atuadores que atuam sobre o canal de transporte arteriolar do sistema de circulação independente, a fim de imitar a constrição arteriolar;

[0117] um ou mais atuadores que atuam sobre o equivalente de figado para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de dissipar a bile a partir do equivalente de figado; e

[0118] um ou mais atuadores que atuam sobre a camada de antros para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de dissipar a urina a partir do equivalente de rim.

[0119] Em uma modalidade preferida do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção, a camada de órgão compreende ou consiste em polidimetilsiloxano (PDMS), o suporte de órgão compreende ou consiste em policarbonato, a camada de antros compreende ou consiste em PDMS e/ou a camada de atuador compreende ou consiste em policarbonato.

[0120] A presente invenção é voltada ao dispositivo de múltiplos órgãos em chip definido acima e nas reivindicações sem organoides, células e fluido. A presente invenção também é voltada ao dispositivo de múltiplos órgãos em chip definido acima, em que o dispositivo de múltiplos órgãos em chip compreende os respectivos organoides, células e fluidos.

[0121] O dispositivo de múltiplos órgãos em chip da presente invenção é caracterizado por seu potencial na operação prolongada em condição homeostática e sua proximidade com um organismo fisiológico. O dispositivo de múltiplos órgãos em chip pode ser aplicado em diferentes configurações dependendo do conteúdo e arquitetura dos equivalentes de órgãos presentes no dispositivo. Além das aplicações em testes de segurança sistêmicos, modelos imunológicos, infecciosos e/ou oncológicos, os seguintes usos preferidos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção são apresentados: TABELA I: USOS PREFERIDOS DO DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP DA INVENÇÃO

FIGURAS:

[0122] A Figura 1 mostra uma visão geral esquemática de uma modalidade do dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção com toda sua estrutura de camadas.

[0123] A Figura 2 mostra uma vista de cima para baixo esquemática sobre a camada de atuador da modalidade da Figura 1.

[0124] A Figura 3 mostra uma vista de cima para baixo esquemática sobre a camada de antros da modalidade da Figura 1.

[0125] A Figura 4 mostra uma vista de cima para baixo esquemática sobre a camada de suporte de órgão da modalidade da Figura 1.

[0126] A Figura 5 mostra uma vista de cima para baixo esquemática sobre a camada de órgão da modalidade da Figura 1.

[0127] A Figura 6 mostra uma vista de cima para baixo esquemática sobre a camada de base da modalidade da Figura 1.

[0128] A Figura 7 mostra um dispositivo microfluidico de múltiplos órgãos em chip (MOC) de relance, (a) A vista explodida do dispositivo que compreende um policarbonato CP, o chip de PDMS-vidro que acomoda dois circuitos microvasculares (área ocupada: 76 mm x 25 mm; altura: 3 mm) e um suporte de MOC que pode ser aquecido, (b) O corte transversal de uma microbomba peristáltica no chip operada por compressão e descompressão periódica programada de três membranas de PDMS sucessivamente dispostas (espessura: 500 pm) ; a seta indica a direção de fluxo, (c) A vista superior do esboço de MOC que ilustra os dois circuitos microfluídicos separados (altura de canal: 100 pm; largura: 500 pm), cada um, que acomoda duas áreas de inserção (compartimentos) (diâmetro de inserção: 5 mm) . Os pontos A e B de cada circuito designam a posição do fluxo de fluido não invasivo e análise celular.

[0129] A Figura 8 mostra a avaliação da dinâmica dos fluidos no MOC da Figura 7. (a) Os perfis de velocidade exemplificativos ao longo dos quatro estágios de um ciclo de bombeamento total (frequência: 0,476 Hz) medido em dois pontos de análise de fluxo de fluido discretos para sustentar o caráter pulsátil do fluxo de fluido (circulo preto = válvula aberta, circulo branco = válvula fechada), (b) A magnitude de velocidade média (mm/s) e tensão de cisalhamento correspondente (dinas/cm2) plotadas contra as frequências de bombeamento (Hz) em ambos os pontos.

EXEMPLO

[0130] Exemplo 1: Dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção

[0131] Conforme representado na Figura 1, o dispositivo de múltiplos órgãos em chip 1 compreende uma camada de base 3, uma camada de órgão 6, uma camada de suporte de órgão 5, uma camada de antros 4 e uma camada de atuador 2.

[0132] Conforme mostrado na Figura 6, a camada de base 3 é configurada para fornecer um suporte sólido para as camadas adicionais. A camada de base 3 é feita de vidro ou a polimero sintético transparente como, por exemplo, poliestireno (PS), policarbonato (PC), polissiloxano e/ou polidimetilsiloxano (PDMS). A camada de base 3 também compreende inúmeros sensores 32 e 33 que são projetados e dispostos para monitorar e controlar o sistema. Alguns desses sensores 32 são configurados para aplicar estímulos elétricos aos equivalentes de órgãos da camada de órgão, outros sensores 33 são configurados para medir parâmetros do sistema, a fim de assegurar o funcionamento adequado. A camada de base 3 compreende portas a partir das quais os dados adquiridos pelos sensores podem ser extraídos e usados para outros propósitos como, por exemplo, regular o sistema.

[0133] A camada de órgão 6 é mostrada na Figura 5. A camada de órgão 6 é localizada em cima da camada de base 3, é feita de PDMS e é configurada para compreender uma multiplicidade de equivalentes de órgãos individuais, em que cada equivalente de órgão compreende uma ou mais seções de crescimento de órgãos, sendo que cada uma das seções de crescimento de órgão é configurada para compreender uma cavidade de organoide para alojar pelo menos um organoide de um determinado órgão. A camada de órgão 6 compreende um equivalente de pulmão 22, um equivalente de intestino delgado 21, um equivalente de baço 23, um equivalente de pâncreas 24, um equivalente de figado 25, um equivalente de rim 26, um equivalente de medula óssea 27, um equivalente de tecido adiposo 28, um equivalente de cérebro 29, um equivalente de testículos 30 e um equivalente de pele 31. Cada seção de crescimento de órgãos compreende uma microentrada e uma microssaida para comunicação fluida entre a cavidade de organoide da seção de crescimento de órgãos e um sistema de circulação independente 34. O sistema de circulação independente 34 é configurado para ficar em comunicação fluida direta com as seções de crescimento de órgãos da camada de órgão 6 através das microentradas e microssaidas das seções de crescimento de órgãos. O sistema de circulação independente 34 compreende um canal de transporte arteriolar que conecta diretamente as microssaidas das seções de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão 22 às microentradas de todas as outras seções de crescimento de órgãos da camada de órgão 6, a fim de permitir o transporte de fluido com alta pC>2 até as ditas seções de crescimento de órgãos; e um canal de transporte venular que conecta diretamente as microssaidas das seções de crescimento de órgãos às microentradas das seções de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão 22, a fim de permitir o transporte de fluido com baixa pθ2 a partir das seções de crescimento de órgãos até o equivalente de pulmão 22. 0 sistema de circulação independente 34 é configurado, de modo que as microssaidas das seções de crescimento de órgãos de equivalentes de intestino delgado, baço e pâncreas 21, 23, 24 sejam conectadas para ficar em comunicação fluida direta entre si e com as microentradas adicionais das seções de crescimento de órgãos do equivalente de figado 25, a fim de permitir a comunicação fluida entre o equivalente de baço, pâncreas, intestino delgado e figado 23, 24, 21, 25, de tal modo que a comunicação fluida a partir do equivalente de baço, pâncreas e intestino delgado 23, 24, 21 em direção ao canal de transporte venular do sistema de circulação independente 34 possa ocorrer exclusivamente através da passagem através do equivalente de figado 25. Os equivalentes de órgãos e o sistema de circulação independente 34 são configurados, de modo que o canal de transporte arteriolar que se origina a partir do equivalente de pulmão 22 exiba na direção de fluxo:

[0134] - uma primeira bifurcação na qual um primeiro canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de intestino delgado, baço e pâncreas 21, 23, e 24;

[0135] - uma segunda bifurcação na qual um segundo canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de figado 25;

[0136] - uma terceira bifurcação na qual um terceiro canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de rim 26;

[0137] uma quarta bifurcação na qual um quarto canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de medula óssea 27;

[0138] - uma quinta bifurcação opcional na qual um quinto canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de pele 31 ;

[0139] - uma sexta bifurcação na qual um sexto canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de tecido adiposo 28;

[0140] - uma sétima bifurcação na qual um sétimo canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de testículos 30; e

[0141] - uma oitava bifurcação na qual um oitavo canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de cérebro 29.

[0142] O diâmetro do canal de transporte arteriolar na direção de fluxo (a partir do equivalente de pulmão 22 em direção a outros equivalentes de órgãos) é constantemente reduzido, de modo que a soma das áreas em corte transversal de todos os canais de transporte arteriolares, incluindo todas as bifurcações a uma determinada distância a partir do equivalente de pulmão 22 permaneça constante, e em que no canal de transporte venular a dita redução no diâmetro seja constantemente revertida na direção de fluxo (a partir de outros equivalentes de órgãos em direção ao equivalente de pulmão 22) , de modo que a soma das áreas em corte transversal de todos os canais de transporte venulares, incluindo todas as bifurcações a uma determinada distância a partir do equivalente de pulmão permaneça constante.

[0143] Cada um dos equivalentes de órgãos é configurado para alojar um número de organoides que seja proporcional ao número de organoides presentes, em média, no respectivo órgão de um organismo mamifero, de preferência, de um ser humano, em que todos os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip são reduzidos em tamanho pelo mesmo fator de proporcionalidade predeterminado, por exemplo, por um fator de 0,00001 (1/100.000).

[0144] A camada de órgão 6 é projetada, de modo que:

[0145] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de figado 25 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de figado, em que cada organoide de figado é um lóbulo do figado, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 10 organoides de figado;

[0146] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão 22 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 2.000 a 4.000 organoides de pulmão, em que cada organoide de pulmão é um alvéolo pulmonar, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 3.000 organoides de pulmão;

[0147] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de pâncreas 24 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de pâncreas, em que cada organoide de pâncreas é uma ilhota de Langerhans, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 10 organoides de pâncreas;

[0148] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de baço 23 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de baço, em que cada organoide de baço é uma polpa branca e vermelha, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 10 organoides de baço;

[0149] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de intestino delgado 21 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 40 a 80 organoides de intestino delgado, em que cada organoide de intestino delgado é uma vilosidade, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 60 organoides de intestino delgado;

[0150] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de rim 2 6 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 30 organoides de rim, em que cada organoide de rim é um néfron, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 20 organoides de rim;

[0151] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de medula óssea 27 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 1.000 a 2.000 organoides de medula óssea, em que cada organoide de medula óssea é uma unidade formada por medula óssea, osso e cartilagem, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 1.400 organoides de medula óssea;

[0152] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de pele 31 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 15 organoides de pele, em que cada organoide de pele é um apêndice de pele, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 15 organoides de pele;

[0153] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de tecido adiposo 28 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 200.000 a 300.000 organoides de tecido adiposo, em que cada organoide de tecido adiposo é um agrupamento adiposo, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 240.000 organoides de tecido adiposo;

[0154] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de testículos 30 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 20 organoides de testículos, em que cada organoide de testículos é um foliculo de testículos, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 15 organoides de testículos; e

[0155] - a seção de crescimento de órgãos do equivalente de cérebro 29 seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 150 a 250 organoides de cérebro, em que cada organoide de cérebro é uma coluna do córtex cerebral, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 200 organoides de cérebro. Na Tabela 2 a seguir, os parâmetros são fornecidos para uma camada de órgão 6 feita de uma camada de PDMS com uma altura de 3mm. TABELA 2:

[0156] A camada de suporte de órgão 5 é disposta entre a camada de órgão 6 e a camada de antros 4, consulte a Figura 4. A camada de suporte de órgão 5 é configurada para vedar e/ou estabilizar a camada de órgão 6, de tal modo que para os equivalentes de órgãos selecionados, a comunicação fluida com a camada de antros 4 seja mantida. A camada de suporte de órgão 5 é fornecida como uma camada com uma espessura de 200 pm. A camada de suporte de órgão 5 é feita de um material que compreende ou consiste em policarbonato (PC) . Nas áreas, em que a camada de suporte de órgão 5 cobre um dos equivalentes de órgãos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, a camada de suporte de órgão 5 é configurada para permitir a comunicação fluida entre a camada de órgão 6 e a camada de antros 4. Em particular, nas áreas em que a camada de suporte de órgão 5 cobre um equivalente de órgão que tem função excretora e/ou produz quantidade considerável de fluido intersticial, como rim 26, figado 25, baço 23 e intestino delgado 21, essa comunicação fluida pode ser atingida, por exemplo, ao fornecer poros dentro da camada de suporte de órgão 5, de preferência, ao fornecer poros com um diâmetro médio de 5 a 7 pm. De maneira alternativa ou, além disso, em uma área que permite a comunicação fluida entre a camada de órgão 6 e a camada de antros 4, a espessura da camada de suporte de órgão 5 pode ser reduzida a uma espessura média de 5 a 15 pm, de preferência, a 10 pm.

[0157] A camada de antros 4 é representada na Figura 3 e é configurada para compreender uma multiplicidade de cavidades e tubos disposta para ficar em comunicação fluida com equivalentes de órgãos selecionados ou seções de crescimento de órgãos da camada de órgão 6, a fim de permitir a troca de fluidos entre as cavidades e as seções de crescimento de órgãos. A camada de antros 4 compreende ou consiste em PDMS. A camada de antros 4 é configurada para compreender:

[0158] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado 21 e fica em comunicação fluida com o equivalente de intestino delgado 21 e um reservatório de nutrição 18, de modo que o equivalente de intestino delgado 21 possa ser abastecido com nutrientes a partir do reservatório de nutrição 18;

[0159] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado 21 e fica em comunicação fluida com o equivalente de intestino delgado 21 e um reservatório de fezes 19, de modo que o material excretado a partir do equivalente de intestino delgado 21 possa ser transportado até o reservatório de fezes 19;

[0160] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de figado 25 e fica em comunicação fluida com o equivalente de figado 25 e a cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado 21, de modo que o material excretado a partir do equivalente de figado 25 possa ser transportado até a cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado 21; e

[0161] uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de rim 2 6 e fica em comunicação fluida com o equivalente de rim 26 e um reservatório de urina 20, de modo que o reservatório de urina 20 receba o excretado a partir do equivalente de rim 26. O reservatório de nutrição 18, o reservatório de fezes 19 e o reservatório de urina 20 são partes integrais da camada de antros 4 e, de preferência, são configurados para serem externamente acessíveis.

[0162] A camada de atuador 2 é configurada para compreender uma multiplicidade de atuadores disposta e configurada para regular uma força de pressão aplicável em equivalentes de órgãos selecionados, no sistema de circulação independente e/ou parte do mesmo, consulte a Figura 2. A camada de atuador é feita de policarbonato.

[0163] A camada de atuador 2 compreende:

[0164] 3 atuadores à base de pressão 10 que atuam sobre o sistema de circulação independente 34 para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de imitar o batimento cardíaco;

[0165] 3 atuadores de base peristáltica 11 que atuam sobre a camada de antros 4, de tal modo que permitam o movimento direcionado, a fim de imitar o movimento peristáltico intestinal;

[0166] um atuador 12 que atua sobre o equivalente de pulmão 22 para permitir o fluxo de ar, a fim de imitar a respiração de ar;

[0167] um atuador 17 que atua sobre o equivalente de medula óssea 27 para permitir a compressão regulada, a fim de imitar a compressão óssea;

[0168] 8 atuadores 14 que atuam sobre o canal de transporte arteriolar do sistema de circulação independente 34, a fim de imitar a constrição arteriolar;

[0169] 1 atuador 13 que atua sobre o equivalente de fiqado 25 para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de dissipar a bile a partir do equivalente de figado 25;

[0170] 1 atuador 13 que atua sobre o equivalente de rim 26 para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de dissipar a urina a partir do equivalente de rim 2 6 para o reservatório de rim 20; e

[0171] 1 atuador 13 que atua sobre o equivalente de baço 23.

[0172] Além disso, a camada de atuador compreende uma porta 16 para acessar o reservatório de nutrição 18, uma porta 16 para acessar o reservatório de fezes, uma porta 16 para acessar o reservatório de urina 20 e uma porta 16 para acessar o canal de transporte venular do sistema de circulação independente 34.

[0173] Exemplo 2:Integração da vasculatura biológica em um dispositivo de múltiplos órgãos em chip da invenção

[0174] Visa-se emular a parte de transporte da vasculatura humana - coração e vasos - em um chip, a fim de demonstrar a viabilidade do estabelecimento de uma vasculatura funcional equivalente em um dispositivo de múltiplos órgãos em chip ou ser humano em um chip da invenção. Uma microbomba no chip para suportar o fluxo do fluido constante em longo prazo através de um sistema de microcanal totalmente coberto por células endoteliais microvasculares dérmicas humanas primárias (HDMECs) foi estabelecida. Em contraste com a maioria dos microssistemas existentes para investigar os efeitos de tensão de cisalhamento em ECs que aplicam tensão de cisalhamento constante na faixa de 1 a 40 dinas/cm2, visa-se a tensão de cisalhamento pulsátil com padrões de reversão que foram anteriormente usados em configurações experimentais diferentes. O sistema de transporte microvascular apresentado nesse trabalho interconecta dois compartimentos separados que são projetados para a integração de equivalentes de órgãos individuais com uma capacidade de biomassa de até 100 mg cada. Foram fabricadas inserções especiais que suportam a ramificação de vasos e a redução de diâmetro nas áreas de compartimentos de cultura de órgão individuais para suportar a vascularização de órgão posterior. A prototipagem rápida que aplica litografia macia e replica a moldagem de PDMS permite o ajuste flexivel do projeto em relação ao número de órgãos e sua disposição especifica, sempre aderindo ao mesmo formato de base de chip padrão. Além disso, dois recursos importantes foram implantados para superar as restrições de manipulação técnica da maioria dos sistemas microfluidicos existentes: i) a operação independente de incubadora do microssistema foi assegurada por um suporte chip temperado, e ii) o acesso microscópico a toda e qualquer área dos canais de circuito foi garantido, permitindo a microscopia de video em tempo real.

MATERIAIS E MÉTODOS PROJETO E FABRICAÇÃO DE DISPOSITIVO

[0175] Foi projetado e fabricado um dispositivo microfluidico de múltiplos órgãos em chip (MOC) que acomoda dois circuitos microvasculares separados, cada um, operado por uma microbomba peristáltica separada no chip. A Figura 7 ilustra o sistema de relance. A placa de cobertura acomoda seis acessórios de pressão de ar e quatro inserções que formam compartimentos de 300 pl, cada um, para troca de meio e integração posterior de equivalentes de órgãos. O suporte MOC suporta a têmpera controlada constante do MOC a 37 °C (Figura 7a) . Foram instaladas microbombas peristálticas no (Figura 7b) . O controle de software de microbomba facilita tanto o fluxo de fluido no sentido horário como anti-horário. A taxa de fluxo (Q) pode ser variada através do ajuste da frequência de bombeamento. Cada circuito de microcanal (Figura 7c) compreende um volume total de 10 pl, enquanto os dois compartimentos baseados em inserção individuais para cultura equivalente de órgão adicional têm, cada um, uma capacidade volumétrica de até 300 pl. A litografia macia padrão e moldagem de réplica de PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI, EUA) foram aplicadas para a fabricação de MOC. Em resumo, um molde mestre foi fabricado através da ligação de uma lâmina de silicio a uma lâmina de vidro. Resina fotossensivel foi aplicada à lâmina de silicio e padronizada com o uso de uma fotomáscara e luz UV. Subsequentemente, as regiões de silicio desprotegidas foram gravadas e a resina fotossensivel foi removida. Para fabricar o microssistema, a placa de cobertura (CP) foi tratada com um aditivo de borracha de silicio (WACKER® PRIMER G 790; Wacker Chemie, Munich, Alemanha) a 80 °C por 20 min. A placa de cobertura preparada foi conectada ao molde mestre (altura de canal 100 pm, largura 500 pm) e PDMS (razão v/v 10:1 entre PDMS e agente de cura) foi injetado nessa estação de fundição. A preparação foi incubada a 80 °C por pelo menos 60 min. Roscas Teflon foram usadas para gerar os quatro compartimentos de cultura livres de PDMS e as seis membranas de PDMS de 500 pm de espessura que constituem as duas microbombas no chip (três membranas por microbomba). A porção de PDMS fundida se liga de maneira impermeável a fluidos ao CP. Posteriormente, a porção de PDMS fixada ao CP é irreversivelmente ligada por tratamento de oxidação de plasma de baixa pressão (Femto; Diener, Ebhausen, Alemanha) a uma lâmina de microscópio. Meio estéril é imediatamente injetado nos dois circuitos microvasculares para evitar a neutralização de superfície.

CARACTERIZAÇÃO DE DINÂMICA DOS FLUIDOS

[0176] Foi aplicada velocimetria por imagem de microparticulas não invasiva (pPIV) para caracterizar o fluxo de fluido nos pontos A e B (consulte a Figura 7c) do circuito microfluidico. Em resumo, um microscópio invertido Zeiss Primovert (Zeiss, Jena, Alemanha) com uma lâmpada de halogênio padrão como uma fonte de luz contínua acoplada a uma câmera CMOS (Baumer Optronic HXC40, resolução: 2048 x 2048 pixel, interface: CameraLink; Baumer Optronic, Radeberg, Alemanha) foi usado para rastrear o movimento de esferas de poliestireno de 15 pm (4*104 g/ml; Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) em um tempo de exposição de 4 ps por única imagem. Uma baixa ampliação (4x) foi escolhida para limitar o deslocamento entre dois quadros a aproximadamente 50 pixels (1 pixel =3,2 pm). O foco z foi definido no centro do canal fluídico no respectivo ponto (50 pm acima da lâmina de vidro) para detectar a velocidade de pico. Uma janela de interrogação no centro do canal fluídico (1024 pixel x 100 pixel, 3,28 mm x 0,32 mm) foi observada atingindo taxas de quadros de até 3.200 fps. Finalmente, a correlação foi realizada com um programa de software (Fraunhofer IWS, Dresden, Alemanha) que analisa uma pilha de imagens de 15.000 quadros, calculando a correlação máxima para o componente x do deslocamento em uma área especificada. Os valores calculados de cinco quadros seguintes são medidos para minimizar artefatos. A seguinte configuração de bomba foi usada para todos os experimentos: pressão - 0,05 mPa (500 mbar) ; vácuo - 0,052 mPa (520 mbar) ; e fluxo de ar - 1,5 1/min. a 0,035 mPa (350 mbar) . A dependência de tempo foi medida em dois locais diferentes (A+B) no chip, conforme mostrado na Figura 7c.

[0177] À medida que o fluxo laminar tem sua velocidade máxima (vmax) no centro do microcanal, a tensão de cisalhamento média (x) pode ser calculada com o uso da seguinte equação:

[0178] em que Vm,^ é a magnitude da velocidade medida no centro do canal, p é a viscosidade dinâmica (calculada como 1 mPa/s) e h é a altura de canal (100 pm).

ISOLAMENTO E CULTURA DE CÉLULA

[0179] As HDMECs foram isoladas do prepúcio humano obtidas com consentimento informado e aprovação ética de uma cirurgia pediátrica após circuncisões de rotina de doadores jovens. Todas as amostras de pele usadas para isolamento de células foram processadas um dia após sua remoção. Antes do isolamento, os prepúcios foram limpos em etanol a 80% por 30 s e lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS; PAA, Coelbe, Alemanha) . O anel de pele foi aberto e tecido subcutâneo foi removido. A fim de separar a camada epidérmica fina da derme, o prepúcio preparado foi incubado em 5 mg/ml de solução dispase II (Sigma- Aldrich, Schnelldorf, Alemanha) a 4 °C por 15 a 18 h. A derme foi cortada em pedaços pequenos e, então, incubada com 4 mg/ml de solução Collagenase NB 4 (Serva, Heidelberg, Alemanha) a 37°C por 75 min. A mistura foi passada através de um filtro de náilon de 70 pm e centrifugada a 300 g por 5 min. O pélete de célula resultante foi ressuspenso em Meio de Crescimento Celular Endotelial -Endothelial Cell Growth Medium MV2 (ECGM- MV2; PromoCell, Heidelberg, Alemanha) suplementado com Supplement-Pack MV2 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha), P-S a 1% e fungizona a 0,05%. As células foram inoculadas em um frasco T-75 e cultivadas em CO2 a 5% a 37°C. O meio foi substituído um dia após inoculação. Dois a cinco dias após a inoculação inicial, as HDMECs foram purificadas por separação celular magnética associada (MACS). As células foram colhidas usando Tripsina/EDTA a 0,05% (0,5 mg/ml) (PAA, Coelbe, Alemanha) e uma seleção positiva para ECs usando o kit CD31 MicroBead (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. O ECGM- MV2 suplementado com Supplement-Pack MV2 e P-S a 1% (ECGM-MV2 completo) foi usado para eluir as células a partir da coluna. Um controle de pureza das células isoladas foi realizado diretamente após cada MACS por análise FACS. Onde necessário, os ciclos de separação foram repetidos até > 90% das células serem positivas para CD31. As HDMECs purificadas foram congeladas para uso posterior ou imediatamente usadas após a expansão. As HDMECs foram expandidas em frascos T-75 com ECGM-MV2 completo até 70 a 90% de confluência em um regime de alimentação de três dias. As células entre a 3^ e 8^ passagem foram usadas em todos os estudos para assegurar que as células mantenham suas características endoteliais primárias.

CULTURA DE HDMEC EM DIFERENTES SUPERFÍCIES DE PDMS TRATADAS

[0180] As HDMECs foram inoculadas a uma densidade de 104 células/cm2 em três tipos de superficies de PDMS: não tratadas, revestidas com 100 pg/ml de fibronectina (Sigma Aldrich, Schnelldorf, Alemanha) e tratadas com plasma de ar. O tratamento de plasma de ar foi realizado em um sistema de plasma de baixa pressão (50W) a uma frequência de 13,56 MHz por 30 s. Após 48 h de cultivo, o comportamento e morfologia de crescimento das células foram comparados por microscopia de luz.

INOCULAÇÃO E CULTURA DE EC NO MOC

[0181] Antes da inoculação, cada MOC foi lavado com meio e estaticamente incubado por 3 dias em CO2 a 5% a 37 °C. As HDMECs foram colhidas a partir de culturas de expansão usando Tripsina/EDTA a 0,05% (PAA, Coelbe, Alemanha). A suspensão de células foi concentrada por centrifugação e as contagens de células foram realizadas usando o contador de viabilidade ViCell (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) . A viabilidade celular foi > 90% para todos os experimentos. As células centrifugadas foram ressuspensas com ECGM-MV2 completo em uma concentração final de 2 x 107 células/ml. Posteriormente, a suspensão de células foi transferida para uma seringa de 1 ml. As células foram injetadas através de um dos dois compartimentos de cada circuito. A seringa foi conectada a um adaptador Luer fêmea x macho ^-28 (IDEX Health & Science, Wertheim-Mondfeld, Alemanha) . 0 ar foi empurrado para fora desse encaixe que foi, então, rosqueado a um adaptador de rosca especial (MOC) (MicCell MOC-I 1/4" - 28 UNF x MIO Fitting (PEEK) ; Gesim, Dresden, Alemanha). Uma seringa vazia foi conectada do mesmo modo ao segundo compartimento. Depois, ainda a infusão de célula em ambos os circuitos do dispositivo foi incubada em CO2 a 5% a 37°C sob condições estáticas por 3 h para permitir que as células se fixem às paredes de canal. Uma quantidade de 300 pl de meio fresco foi adicionada a cada compartimento e, então, purgada através dos canais de PDMS usando a microbomba no chip de cada circuito. Uma frequência de 0,476 Hz foi aplicada a cada circuito microvascular dos MOCs para operação dinâmica continua. Para culturas de MOC sob condições estáticas, os canais foram lavados com meio fresco por 5 min, utilizando uma diferença na pressão hidrostática entre o compartimento de entrada e saida.

[0182] Uma quantidade de 150 pl de meio por compartimento foi substituída a cada 1 a 2 dias tanto em sistemas MOC dinâmicos como estáticos, e o crescimento e viabilidade celular foram monitorados por inspeção por microscopia de luz nos pontos A e B de cada circulação (Figura 7c) . Além disso, a viabilidade celular foi determinada com um ensaio Calcein AM. Uma solução de 5 pg/ml de CellTrace calcein red-orange AM (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) foi adicionada em ambos os compartimentos de cada circuito de um MOC a uma volume de 100 pl. O MOC foi bombeado por 2 min. e, então, incubado sob condições estáticas em CO2 a 5% a 37 °C por 30 min. Posteriormente, os microcanais foram lavados duas vezes com meio substituindo-se o meio nas inserções de compartimento com meio fresco. As imagens foram obtidas usando microscopia de fluorescência (BZ9000; Keyence, Neu-Isenburg, Alemanha). Os experimentos MOC regulares foram finalizados após 4 dias (10 MOCs dinâmicos e 12 MOCs estáticos) . MOCs Individuais foram operados no mesmo modo durante 7, 14 e 32 dias para obter as primeiras indicações sobre o desempenho em longo prazo dos circuitos microvasculares. A fim de avaliar a possibilidade de substituir a incubadora de CO2 para operação MOC pelo suporte de MOC mostrado na Figura 7a, 9 experimentos de MOC (7 MOCs dinâmicos e 2 MOCs estáticos) foram realizados usando o suporte exclusivamente para tempos de operação de até 7 dias.

CARACTERIZAÇÃO DE METABOLISMO DE EC NO MOC

[0183] A Concentração de glicose do meio foi medida, de acordo com as instruções do fabricante, usando o Procedimento Stanbio Glucose LiquiColor® (Oxidase) nt 1070 (Stanbio Laboratory, Boerne, TX, EUA) . Resumidamente, 99 pl do reagente foram adicionados a uma placa de microtitulação 96 poços (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) pré- aquecidos a 37°C e 1 pl de amostra de meio foi adicionada. Após outros 5 min. de incubação a 37 °C, a concentração de glicose foi quantificada em um leitor de microplacas (FLUOstar Omega; BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha) a 500 nm, usando água como uma referência.

[0184] A concentração de lactato do meio foi medida, de acordo com as instruções do fabricante, usando o método LOD-PAP (Diaglobal, Berlin, Alemanha) . Resumidamente, 99 pl do reagente foram misturados com 1 pl da amostra de meio em uma placa de múltiplos poços em formato de 96 poços e a absorbância foi medida a 520 nm em um leitor de microplacas, usando água como uma referência.

COLORAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA DE ECS NO INTERIOR DO MOC

[0185] Após 4 dias em cultura, as ECs foram fixadas no interior do circuito microvascular com acetona fria a -20 °C por 10 min., lavadas duas vezes com PBS por 5 min., incubadas com soro de cabra a 10% em PBS por outros 20 min. e, então, incubadas com o anticorpo primário de camundongo anti-CD31 humano (1:500; 7,1 mg/ml; DRFZ, Berlin, Alemanha), a temperatura ambiente (TA) por 2 h. Subsequentemente, os circuitos foram lavados duas vezes com PBS seguido pela incubação com o anticorpo secundário de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 594 (1:200, 2 mg/ml; Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) , no escuro a TA por 40 min. Após a lavagem, o anticorpo de ovelha anti-humano vWF- FITC (1:50, 10 mg/ml; Abeam, Cambridge, UK) foi adicionado e incubado a TA por 2 h. Os núcleos foram contrastados com Hoechst 33342 (1: 1.000, 10 mg/ml; Life Technologies, Darmstadt, Alemanha). Outra coloração por imunofluorescência com o anticorpo primário de camundongo anti-humano VE- Caderina (1:100, 0,2 mg/ml; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha) foi realizada: ECs foram fixadas com PFA a 4% por 10 min., lavadas duas vezes com PBS por 5 min. e permeabilizadas com Triton a 0,2% X-100 por 5 min. Após a lavagem duas vezes com PBS, a coloração para anticorpos primários e secundários foi realizada, conforme descrito acima. As culturas de MOC foram coloridas para actina filamentosa com faloidina Oregon Green® 488 (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante, em combinação com VE-Caderina.

[0186] Cada solvente foi adicionado às inserções de compartimento do MOC e bombeado por 1 a 2 min. para distribuição uniforme. As imagens foram tomadas tanto por microscopia de fluorescência padrão como por microscopia de dois fótons (TriMScope II; LaVision BioTec, Bielefeld, Alemanha). Todos os canais microvasculares foram imageados através de sua parede de lâmina de microscópio. As imagens 3D foram reconstruídas a partir da pilha de imagens coletadas, usando o software Imaris (Bitplane, Zurique, Suiça).

CARACTERIZAÇÃO DE EFEITOS DE TENSÃO DE CISALHAMENTO

[0187] As imagens de HDMECs coloridas por imunofluorescência foram tomadas nos pontos A e B de cada circuito microvascular (Figura 7c) para monitor alterações morfológicas induzidas por fluxo usando um microscópio de fluorescência padrão. As membranas de HDMEC nas imagens foram manualmente retraídas para reconhecimento de EC automático. Um algoritmo de reconhecimento de área conectado foi usado para identificas as ECs e calcular o perímetro correspondente, tamanho de célula, centro de gravidade e orientação (eixo geométrico principal do segundo momento não ponderado espacial) de cada EC. Um parâmetro de indice de formato não dimensional (SI) foi usado para quantificar o alongamento celular que é definido como:

[0188] em que A é a área da célula e P é o perímetro da célula. O SI varia de 0 a 1, em que 0 é uma linha reta e 1 é um circulo perfeito. Adicionalmente, o ângulo de orientação foi medido para quantificar o alinhamento de HDMECs na direção de fluxo, em que 0o é um eixo geométrico da célula perfeitamente alinhado à direção de fluxo e 90° é uma célula alinhada ortogonal à direção de fluxo. O código-fonte foi implantado no Matlab (Math Works, Ismaning, Alemanha). O SI e o ângulo de orientação celular para pelo menos 200 células por imagem foram usados para análise.

GERAÇÃO DE MICROCANAIS ESTRUTURADOS POR ABLAÇÃO A LASER DE FEMTOSSEGUNDO

[0189] Um laser de femtossegundo guiado por CAM (Tecidosurgeon; Rowiak, Hannover, Alemanha) com um comprimento de onda de 1.030 nm (energia de pulso = 120 nJ) , uma duração de pulso de 400 fs e uma taxa de repetição de 10 MHz foi usado por Rowiak para gerar microcanais tão baixos quanto 40 x 40 pm2 dentro do material de PDMS. O projeto de canal foi escolhido para revelar diâmetros alcançáveis minimos e permitir o fluxo de meio continuo através de cada um dos canais ramificados. As HDMECs foram inoculadas em microcanais pré-estruturados dentro de um molde de PDMS e coloridas com ensaio Calcein AM (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) após 1 dia de cultivo. Posteriormente, o molde de PDMS foi colocado no compartimento de tecido do MOC. As imagens foram adquiridas por microscopia de fluorescência padrão.

RESULTADOS E DISCUSSÃO AVALIAÇÃO DE DINÂMICA DOS FLUIDOS

[0190] Foi aplicada com êxito a pPIV para caracterizar de forma exemplificativa os perfis de fluxo de fluido em pontos diferentes dos circuitos de MOC (Figura 8a). O acesso microscópico total a toda e qualquer área do MOC facilita as análises detalhadas de várias outras regiões do MOC e desenhos de MOC variáveis no futuro. 0 potencial para análises ideais por microscopia e o modo operacional das membranas de microbomba peristáltica de um circuito de MOC microfluidico preenchido com hemácias humanas a partir de uma vista de ângulo de baixo para cima poderiam ser demonstrados. Uma microbomba peristáltica robusta no chip foi integrada em um circuito microvascular com capacidade para circular meios sem falhas em condições estéreis durante semanas e meses em uma taxa de fluxo que varia de 7 pl/min. (frequência mais baixa) a 70 pl/min. (frequência mais alta). A frequência de operação pulsátil pode ser aumentada para até 2,4 Hz, que corresponde a uma alta, porém, ainda uma atividade cardiaca fisiológica de 144 batimentos por minuto em humanos. Nessa frequência, a tensão de cisalhamento medida em pontos A e B do circuito microvascular alcança aproximadamente 25 dyn/cm2 (Figura 8b) , que é uma tensão de cisalhamento fisiológica na extremidade superior da escala em microvasculatura. A velocidade média aumentou quase linearmente com a frequência de bombeamento. A frequência de bombeamento usada nos presentes experimentos (0,476 Hz) corresponde a menos que 30 "batimentos cardíacos" por minuto (aproximadamente metade do valor fisiológico de um adulto em repouso) para evitar a perda de EC durante as fases iniciais de cobertura de superfície. Essa fase de alguma forma se assemelha a elementos de cicatrização de feridas in vivo. Como ilustrado na Figura 8a, a tensão de cisalhamento oscilatória - outra característica fisiológica desejada - poderia ser implantada em operação de MOC através do desenho de microbomba. A forma de onda de tal oscilação em uma determinada posição local na microvasculatura depende da frequência de bombeamento e do desenho particular de um MOC. Determinadas formas de onda em humanos foram associadas a uma determinada suscetibilidade à doença. Isso implica a avaliação adicional da plataforma de MOC para pesquisa em tais processos patológicos do sistema cardiovascular humano.

ORIGEM, ISOLAMENTO E CULTURA DE EC

[0191] A partir desta data, a maior parte da pesquisa de tensão de cisalhamento de EC humana em sistemas microfluidicos é realizada em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) devido ao fácil acesso a grandes números de células e sua alta elasticidade fenotipica. Considera-se a hipótese que as HDMECs possuem pelo menos a mesma elasticidade de fenótipo, porém com um maior potencial de adaptação in vitro rápida para mudar o ambiente local. Kamm e colaboradores, por exemplo, conseguiram cultivar HDMECs em um plano vertical de microcanais e monitorar a morfogênese capilar em géis de colágeno no plano lateral. Ao contrário de todos os outros órgãos do corpo, a pele em vertebrados precisa se adaptar rapidamente a eventuais mudanças de temperaturas externas por contração e relaxamento imediatos de vasos de sangue. Ademais, a pele de carnívoros é o órgão com a exposição mais evidente a lesões repetidas, devido a seu estilo de vida agressivo. Esses dois fatores adotados em conjunto com a longevidade humana devem ter HDMECs selecionadas para uma elasticidade incomparável de seu fenótipo e um potencial exclusivo para neoangiogênese. Ambos os fatores são de extrema importância para o estabelecimento de um equivalente in vitro funcional à vasculatura humana. A capacidade de neoangiogênese, em particular, é crucial para o estabelecimento da segunda parte de vasculatura humana - a rede capilar de equivalentes de órgãos - em MOCs. As últimas revelações em mecanismos moleculares de angiogênese sustentam a função essencial de ambiente local que inclui tensão de cisalhamento. Várias técnicas foram descritas para isolar as ECs humanas de tecidos diferentes. 0 isolamento de esferas magnéticas de ECs após a digestão de tecido com MicroBead CD31 (PECAM-1) foi aplicado, pois o mesmo é constitutivamente expresso na superfície de virtualmente todos os tipos de ECs e não está presente em qualquer outro tipo de célula com exceção da população de leucócitos. Em particular, esse não é expresso em fibroblastos dérmicos e células musculares lisas. A Morfologia e vários marcadores específicos endoteliais foram examinados para confirmar a origem endotelial. As HDMECs isoladas mostraram uma morfologia semelhante a uma pedra arredondada em contraste de fase e foram positivas para o marcador especifico endotelial CD31, VE-Caderina e Fator de Von Willebrand (vWF) . A coloração para 5B5, um marcador especifico de fibroblastos, e a-actina de músculo liso, um marcador especifico de célula de músculo liso, não mostrou crescimento de outros tipos de células. Além disso, HDMECs mostraram uma absorção de ac-LDL marcado com Alexa594 após 4 h de exposição. Uma mistura de fibroblastos dérmicos e células musculares lisas serviu como o controle para todas as colorações (dados não mostrados). As HDMECs poderiam ser cultivadas para até oito passagens sem mudanças significativas na morfologia e expressão de marcador. Os presentes dados indicam que esse método é uma maneira robusta e reproduzível de isolar HDMECs positivas CD-31 de prepúcio humano. 0 número médio de HDMECs que cobre totalmente dois circuitos microvasculares de um MOC foi calculado para estar na faixa de 2*105 células. Em média, 1 *107 HDMECs primárias após a separação podem ser preparadas a partir de um único prepúcio humano. Um fator de amplificação celular de ~ 3.000 ocorre entre a inoculação inicial e a passagem 7-8 de cultura de HDMEC, desse modo permitindo a provisão de 3*1010 células a partir de um único prepúcio. Teoricamente, isso é equivalente a MOCs carregados com 5000 células (dois circuitos por MOC) . A otimização de preparação e propagação deve ser prevista para aumentar ainda mais o rendimento de HDMEC.

ESTABELECIMENTO DE CIRCUITOS MICROVASCULARES ESTÁVEIS NO MOC

[0192] Um estudo de comparação piloto entre a fixação de EC a superficies de PDMS revestidas com fibronectina e tratadas com plasma de ar revelou uma aderência pelo menos igual de HDMECs a PDMS em culturas estáticas. Além disso, o tratamento com plasma foi reconhecido durante muito tempo como uma técnica viável para aumentar a hidrofilicidade de microcanais de PDMS. Portanto, o tratamento com plasma de ar foi finalmente selecionado para a ativação de superfície durante a fabricação de MOCs. A fibronectina é amplamente usada como um material de revestimento para a fixação e cultivo de EC em dispositivos microfluidicos à base de PDMS. Embora seja fácil de manusear em escala de pesquisa laboratorial, um procedimento de revestimento com fibronectina pode dificultar a velocidade e esterilidade de processo em larga escala industrial posterior em alta eficiência. 0 tratamento à base de PDMS com plasma de ar é um método reproduzível, rápido e escalonável para preparar microdispositivos à base de PDMS para fixação eficiente de EC.

[0193] Posteriormente, um circuito microvascular que compreende uma microbomba peristáltica, dois compartimentos para culturas de equivalentes de órgãos posteriores e microcanais de conexão, totalmente cobertos com uma monocamada de HDMEC funcional, foi estabelecido em um fluxo de meio pulsátil dentro de 4 dias de cultura. Foi anteriormente demonstrado a cobertura de circuito total com uma linha EC humana em outro lugar. Aqui, dirige-se a atenção para o rápido estabelecimento de tal sistema de transporte cardiovascular humano miniaturizado baseado em HDMECs primárias. Além disso, o rastreamento diário da atividade metabólica de ECs foi realizado. A atividade metabólica aumentada dentro dos primeiros dias de fixação e cobertura de superfície pode ser explicada pela motilidade e proliferação aumentadas de células. Uma taxa de atrito de sistema de 50% nos estágios iniciais de experimentos, causada principalmente por contaminações, foi eficientemente reduzida para cerca de 20% durante o uso de MOC rotineiro em laboratório. Os sistemas de gerenciamento de qualidade totais instalados em todo e qualquer laboratório de teste in vitro industrial devem eliminar completamente essa taxa de atrito em "laboratório de pesquisa".

[0194] As ECs mantiveram a aderência às paredes de canal e permaneceram viáveis, como observado por coloração com Calcein AM red orange. Além disso, as células foram testados quanto à absorção de Alexa594-ac-LDL. Visto que nenhuma alteração adicional em morfologia endotelial foi observada após 4 dias de cultivo, os experimentos foram interrompidos para análise. As análises de imunofluorescência detalhadas da camada de EC estanque no 4o dia revelaram viabilidade e funcionalidade vascular notáveis. As HDMECs que formam o circuito microvascular foram positivas para CD31, vWF e VE-Caderina. Além disso, as HDMECs foram capazes de cobrir todas as paredes dos canais formando uma camada estanque a fluido. Tais circuitos microvasculares estáveis, por um lado, podem atuar como membranas biológicas impedindo a transferência de moléculas para as lâminas de PDMS circundantes recentemente descritas. Por outro lado, esses podem servir como redes de vasos hemocompativeis para a circulação de sangue integral, impedindo a coagulação do sangue.

IMPACTO DE TENSÃO DE CISALHAMENTO

[0195] Quando expostas à tensão de cisalhamento laminar, as ECs se alinham e alinham seus microfilamentos na direção do fluxo. As ECs in vivo em locais diferentes são expostas a tipos diferentes de fluxo, como laminar, pulsátil e turbulento; o último, por exemplo, foi descrito para aumentar a renovação. O alongamento e alinhamento de fluxo induzidos por tensão de cisalhamento fisiológica foram evidenciados nas presentes culturas de MOC mediante a plotagem do SI e ângulo de orientação de HDMECs nos circuitos microvasculares gerados em fluxo pulsátil (Q = 40,56 pl/min., T = 5,17 dyn/cm2), contra aqueles gerados sob condições de cultura estáticas. Uma mudança na distribuição de actina filamentosa (F-actina) foi observada entre o cultivo estático e dinâmico. ECs em condições estáticas são poligonais e a F- actina é organizada como uma faixa densa na periferia da célula; entretanto em tensão de cisalhamento de cerca de 5 dyn/cm2, a F-actina cria feixes de fibras de estresse. SI e o ângulo de orientação se diferem significativamente entre o cultivo estático e dinâmico de ECs no MOC, e estão na faixa de descobertas anteriores para HDMECs em dispositivos microfluidicos.

[0196] Por fim, observou-se igualmente uma excelente viabilidade de célula em pontos de análise em um número limitado de experimentos em longo prazo indicativos com MOCs microvasculares durante 14 dias (n = 4) de cultura e em um primeiro MOC microvascular único durante 32 dias (dados não mostrados).

CONCLUSÃO

[0197] A presente hipótese é que a circulação de sangue através de microcircuitos de linha de EC que conectam os equivalentes de órgãos uns aos outros em uma ordem fisiológica é a primeira e a exigência fundamental para emular totalmente a homeostase humana do organismo em microescala. Portanto, aplicam-se aqui com êxito a litografia macia, moldagem de réplica e técnicas de ablação a laser com dois fótons para estabelecer um sistema de circulação microvascular independente de incubadora que simula a função de transporte do sistema cardiovascular humano em microescala. Esse é disposto em um chip de vidro-PDMS de duas camadas, a área de uma lâmina microscópica padrão, com alturas de canal de 100 pm e uma altura total de 3 mm. Duas inserções de cultura de tecido cilíndricas separadas, cada área de uma cavidade padrão de uma placa de 96 poços, são posicionadas no circuito microvascular. Um procedimento robusto de 4 dias que aplica tensão de cisalhamento pulsátil foi estabelecido para cobrir todas as superficies de contato com fluido do sistema com uma camada hermeticamente fechada funcional de HDMECs. Ao contrário do crescimento de HDMEC em plano vertical descrito na literatura, a cobertura total do presente sistema microvascular com ECs humanas pela primeira vez torna possivel a hemocompatibilidade biológica de tal sistema microvascular. 0 layout de chip reduz o volume de fluido de circulação no sistema de transporte microvascular para até 10 pl, pelo menos duas magnitudes mais baixas do que o volume de circulação aplicado em qualquer um dos sistemas operados com bombas externas e reservatórios. As inserções de cultura de tecidos mais importantes, cada uma com um volume máximo de 300 pl, irão permitir o ajuste exato de razões de fluido para tecido fisiológico uma vez que equivalentes de órgãos individuais são estabelecidos na próxima etapa de desenvolvimento. A técnica de fabricação é conveniente e versátil, e as alterações de desenho podem ser implantadas em tempos de resposta de desenho para dispositivo de apenas 2 a 3 meses. O alinhamento e alongamento de ECs na direção de fluxo, minuciosamente demonstrados in vitro, foram monitorados em maiores detalhes através de microscopia de video de série temporal. Outros desenhos de microcanal fluidico foram igualmente cobertos de forma eficiente com HDMECs nos laboratórios pela técnica descrita. Foram geradas as primeiras indicações que uma vez que um sistema de circulação microvascular é estabelecido, o mesmo possui eventualmente uma vida útil de pelo menos 32 dias. LISTA DE REFERÊNCIAS NUMÉRICAS: 1 dispositivo de múltiplos órgãos em chip 2 camada de atuador 3 camada de base 4 camada de antros 5 6 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 camada de suporte de órgão camada de órgão atuador baseado em pressão (coração) atuador baseado em peristáltica** atuador de fluxo de ar atuadores constrição arteriolar atuador porta atuador de compressão óssea reservatório de nutrição reservatório de fezes reservatório de urina equivalente de intestino delgado equivalente de pulmão equivalente de baço equivalente de pâncreas equivalente de figado equivalente de rim equivalente de medula óssea equivalente de tecido adiposo equivalente de cérebro equivalente de testiculos equivalente de pele sensor elétrico sensor sistema de circulação independente

Claims (15)

1. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP (1), caracterizado por compreender uma camada de base (3); uma camada de órgão (6) disposta sobre a camada de base; uma camada de antros (4) disposta sobre a camada de órgão; e uma camada de atuador (2) ; em que a camada de base (3) é configurada para fornecer um suporte sólido para as camadas adicionais; a camada de órgão (6) é configurada para compreender uma multiplicidade de equivalentes de órgãos individuais, em que cada equivalente de órgão compreende uma ou mais seções de crescimento de órgãos, sendo que cada uma das seções de crescimento de órgãos é configurada para compreender uma cavidade de organoide para alojar pelo menos um organoide de um órgão e compreender uma microentrada e uma microssaida para comunicação fluida entre a cavidade de organoide da seção de crescimento de órgãos e um sistema de circulação independente (34), em que a camada de órgão (6) compreende pelo menos um equivalente de órgão configurado para representar os órgãos pulmão, intestino delgado, baço, pâncreas, figado, rim e medula óssea, respectivamente, e um sistema de circulação independente (34) configurado para ficar em comunicação fluida direta com as seções de crescimento de órgãos da camada de órgão (6) através das microentradas e microssaidas das seções de crescimento de órgãos; a camada de antros (4) ser configurada para compreender uma multiplicidade de cavidades e tubos disposta para ficar em comunicação fluida com equivalentes de órgãos selecionados ou seções de crescimento de órgãos a fim de permitir a troca de fluidos entre as cavidades e as seções de crescimento de órgãos; e a camada de atuador (2) ser configurada para compreender uma multiplicidade de atuadores disposta e configurada para regular uma força de pressão aplicável em um equivalente de órgão selecionado, no sistema de circulação independente (34) e/ou parte do mesmo.

2. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela camada de base (3) ser feita de um material transparente, de preferência, a camada de base é feita de um material que compreende ou consiste em vidro ou um polimero sintético transparente.

3. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela camada de base (3) compreender um ou mais sensores (33) configurados para medir sinais emitidos a partir de e/ou transmitir sinais para um ou mais dos equivalentes de órgãos, seções de crescimento de órgãos e/ou a partir do sistema de circulação independente (34).

4. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo sistema de circulação independente (34) compreender um canal de transporte arteriolar que conecta diretamente as microssaidas das seções de crescimento de órgãos dos equivalente de pulmão (22) às microentradas de todas as seções de crescimento de órgãos da camada de órgão (6) a fim de permitir o transporte de fluido com alta pθ2 para seções de crescimento de órgãos; e urn canal de transporte venular que conecta diretamente as microssaidas das seções de crescimento de órgãos às microentradas das seções de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão (22) a fim de permitir o transporte de fluido com baixa pCh a partir das seções de crescimento de órgãos para o equivalente de pulmão (22).

5. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo sistema de circulação independente (34) ser configurado, de modo que as microssaidas das seções de crescimento de órgãos de equivalentes a intestino delgado, baço e pâncreas (21, 23, 24) sejam conectadas para ficar em comunicação fluida direta uns com os outros e às microentradas adicionais das seções de crescimento de órgãos do equivalente de figado (25), a fim de permitir a comunicação fluida entre o equivalente de baço, pâncreas, intestino delgado e figado (23, 24, 21, 25), de tal modo que a comunicação fluida a partir do baço, pâncreas e intestino delgado em direção ao canal de transporte venular do sistema de circulação independente (34) possa ocorrer unicamente através da passagem através do equivalente de figado (25).

6. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela camada de órgão (6) compreender adicionalmente equivalentes de órgãos, de preferência, a camada de órgão compreende equivalentes de órgãos de pele, testículos, cérebro e/ou tecido adiposo (31, 30, 29, 28).

7. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender adicionalmente uma camada de suporte de órgão (5) disposta entre a camada de órgão (6) e a camada de antros (4), em que a camada de suporte de órgão (5) é configurada para vedar e/ou estabilizar a camada de órgão (6), de tal modo que para os equivalentes de órgãos selecionados, a comunicação fluida com a camada de antros (4) seja mantida.

8. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela camada de antros (4) ser configurada para compreender: uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado (21) e fica em comunicação fluida com o equivalente de intestino delgado (21) e um reservatório de nutrição (18), de modo que o equivalente de intestino delgado (21) possa ser abastecido de nutrientes a partir do reservatório de nutrição (18); uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado (21) e fica em comunicação fluida com o equivalente de intestino delgado (21) e um reservatório de fezes (19), de modo que o material excretado a partir do equivalente de intestino delgado (21) possa ser transportado para o reservatório de fezes (19); uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de figado (25) e fica em comunicação fluida com o equivalente de fígado (25) e a cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado (21), de modo que o material excretado a partir do equivalente de figado (25) possa ser transportado para a cavidade que é localizada em cima do equivalente de intestino delgado (21) ; e uma cavidade que é localizada em cima do equivalente de rim (26) e fica em comunicação fluida com o equivalente de rim e um reservatório de urina (2 0) , de modo que o reservatório de urina receba o material excretado a partir do equivalente de rim.

9. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela camada de atuador (2) compreender: um ou mais atuadores (10) que atuam sobre o sistema de circulação independente (34) para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de imitar o batimento cardiaco; um ou mais atuadores (11) que atuam sobre a camada de antros (4) para permitir o movimento direcionado, a fim de imitar o movimento peristáltico intestinal; um ou mais atuadores (12) que atuam sobre o equivalente de pulmão (22) para permitir o fluxo de ar, a fim de imitar a respiração; um ou mais atuadores (17) que atuam sobre o equivalente de medula óssea (27) para permitir a compressão regulada, a fim de imitar a compressão óssea; um ou mais atuadores (14) que atuam sobre o canal de transporte arteriolar do sistema de circulação independente (34), a fim de imitar a constrição arteriolar; um ou mais atuadores (13) que atuam sobre o equivalente de figado (25) para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de dissipar a bile a partir do equivalente de figado (25); e um ou mais atuadores (13) que atuam sobre a camada de antros (4) para permitir o movimento de fluido direcionado, a fim de dissipar a urina a partir do equivalente de rim (26).

10. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela camada de órgão (6) ser projetada, de modo que: uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de figado (25) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de figado, em que cada organoide de figado é um lóbulo do figado, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 10 organoides de figado; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de pulmão (22) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 2.000 a 4.000 organoides de pulmão, em que cada organoide de pulmão é um alvéolo pulmonar, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 3.000 organoides de pulmão; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de pâncreas (24) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de pâncreas, em que cada organoide de pâncreas é uma ilhota de Langerhans, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 10 organoides de pâncreas; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de baço (23) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 5 a 15 organoides de baço, em que cada organoide de baço é uma polpa branca e vermelha, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 10 organoides de baço; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de intestino delgado (21) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 40 a 80 organoides de intestino delgado, em que cada organoide de intestino delgado é uma vilosidade, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 60 organoides de intestino delgado; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de rim (26) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 30 organoides de rim, em que cada organoide de rim é um néfron, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 20 organoides de rim; e uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de medula óssea (27) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 1.000 a 2.000 organoides de medula óssea, em que cada organoide de medula óssea é uma unidade formada por medula óssea, osso e cartilagem, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 1.400 organoides de medula óssea.

11. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela camada de órgão (6) ser projetada, de modo que: uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de pele (31) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 15 organoides de pele, em que cada organoide de pele é um apêndice de pele, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 15 organoides de pele; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de tecido adiposo (28) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 200.000 a 300.000 organoides de tecido adiposo, em que cada organoide de tecido adiposo é um agrupamento adiposo, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 240.000 organoides de tecido adiposo; uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de testículos (30) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 10 a 20 organoides de testículos, em que cada organoide de testículos é um foliculo de testículos, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 15 organoides de testículos; e uma seção de crescimento de órgãos do equivalente de cérebro (29) seja configurada para fornecer uma cavidade de organoide para alojar 150 a 250 organoides de cérebro, em que cada organoide de cérebro é uma coluna do córtex cerebral, de preferência, a cavidade de organoide seja configurada para alojar 200 organoides de cérebro.

12. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelos equivalentes de órgãos e o sistema de circulação independente (34) serem configurados, de modo que o canal de transporte arteriolar que se origina a partir do equivalente de pulmão (22) exiba na direção de fluxo: uma primeira bifurcação na qual um primeiro canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de intestino delgado, baço e pâncreas (21, 23, 24); uma segunda bifurcação na qual um segundo canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de figado (25); uma terceira bifurcação na qual um terceiro canal arteriolar se ramifica, servindo o equivalente de rim (26) ; uma quarta bifurcação na qual um quarto canal arteriolar se ramifica, servindo a medula óssea (27); uma quinta bifurcação opcional na qual um quinto canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de pele (31); uma sexta bifurcação opcional na qual um sexto canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de tecido adiposo (28); uma sétima bifurcação opcional na qual um sétimo canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de testículos (30); e uma oitava bifurcação opcional na qual um oitavo canal arteriolar se ramifica, servindo um equivalente de cérebro (29).

13. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado pelo diâmetro do canal de transporte arteriolar na direção de fluxo ser constantemente reduzido, de modo que a soma das áreas em corte transversal de todos os canais de transporte arteriolares, incluindo todas as bifurcações a uma determinada distância a partir do equivalente de pulmão (22) permaneça constante, e em que no canal de transporte venular a dita redução no diâmetro seja constantemente revertida na direção de fluxo, de modo que a soma das áreas em corte transversal de todos os canais de transporte venulares, incluindo todas as bifurcações a uma determinada distância a partir do equivalente de pulmão (22) permaneça constante.

14. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela camada de base (3) compreender ou consistir em vidro, a camada de órgão compreende ou consiste em polidimetilsiloxano (PDMS), a camada de suporte de órgão (5) compreende ou consiste em policarbonato, a camada de antros (4) compreende ou consiste em PDMS e/ou a camada de atuador (2) compreende ou consiste em policarbonato.

15. DISPOSITIVO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS EM CHIP, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por cada um dos equivalentes de órgãos ser configurado para alojar um número de organoides que seja proporcional ao número de organoides presentes, em média, no respectivo órgão de um organismo mamifero, de preferência, de um ser humano, em que todos os equivalentes de órgãos do dispositivo de múltiplos órgãos em chip (1) são reduzidos em tamanho pelo mesmo fator de proporcionalidade predeterminado, por exemplo, por um fator de 0,00001 (1/100.000).

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