WO2018061846A1 - 細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を製造する製造方法、及び、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造に供する多孔フィルムを提供することを目的とする。
[2] 培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、[1]に記載の細胞組織の製造方法。
[3] 培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、[1]に記載の細胞組織の製造方法。
[4] 培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、[1]に記載の細胞組織の製造方法。
[5] フィーダー能を有する細胞が、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の少なくともいずれかである、[1]~[4]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[6] 複数の開孔が、多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、[1]~[5]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[7] 連通孔が、多孔フィルムの面方向全域に亘って略同一の深さに設けられている、[1]~[6]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[8] 連通孔の孔径が、多孔フィルムに播種される細胞の長径に対して50%~500%の範囲である、[1]~[7]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[9] 連通孔の孔径が5μm~50μmの範囲である、[1]~[8]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[10] 連通孔の孔径の変動係数が30%以下である、[1]~[9]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[11] 開孔の、多孔フィルムの面方向における長径が10μm~100μmの範囲である、[1]~[10]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[12] 開孔の深さが10μm~100μの範囲である、[1]~[11]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[13] 開孔の開口径が5μm~90μmの範囲である、[1]~[12]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[14] 開孔の開口径の変動係数が20%以下である、[1]~[13]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[15] 培養工程の前に、多孔フィルムの複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ細胞を複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含む、[1]~[14]のいずれか1つに記載の細胞組織の製造方法。
[16] 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、開孔の、多孔フィルムの面方向における長径が20μm~100μmの範囲である、多孔フィルム。
[17] 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、開孔の深さが20μm~100μmの範囲である、多孔フィルム。
[18] 開孔の開口径が5μm~90μmの範囲である、[16]又は[17]に記載の多孔フィルム。
[19] 連通孔の孔径が5μm~50μmの範囲である、[16]~[18]のいずれか1つに記載の多孔フィルム。
[20] 複数の開孔が、多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、[16]~[19]のいずれか1つに記載の多孔フィルム。
本実施形態の細胞組織の製造方法は、生体外において細胞組織を製造する方法であり、表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、細胞を培養する培養工程を含む。まず、細胞組織の製造に供する多孔フィルムについて説明する。本実施形態の多孔フィルムは、細胞が生着し組織を形成するための足場として機能する。
疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等)、ポリエステル(例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポリ-3-ヒドロキシブチレート等)、ポリラクトン(例えば、ポリカプロラクトン等)、ポリアミド又はポリイミド(例えば、ナイロン、ポリアミド酸等)、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、セルロースアシレート(例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート)などのポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイとしてよい。これらのポリマーは、1種単独で又は2種以上を混合して使用してよい。生体吸収性の観点からは、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリ-3-ヒドロキシブチレート等が好ましい。
多孔層204を構成する疎水性ポリマーを溶媒に溶解した塗布液を用意し、塗布液を支持体202の上に塗布して、支持体202上に塗膜204aを形成する。
両親媒性化合物は、親水性基と疎水性基を両方有する化合物である。両親媒性化合物を塗布液に配合することにより、塗膜の表面に水滴を形成しやすくなる。また、溶媒に対する疎水性ポリマーの分散状態を両親媒性化合物によって制御することにより、水滴の成長をより容易に制御することができる。両親媒性化合物としては、市販されている多くの界面活性剤、二量体や三量体等のオリゴマー、ポリマー等の高分子化合物が挙げられる。両親媒性化合物としては、具体的には例えば、ポリアクリル骨格を主鎖とし、親油性側鎖として長鎖脂肪族基(例えばドデシル基)及び親水性側鎖としてカルボキシル基を有する化合物;ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコールブロックコポリマー;リン脂質;等が挙げられる。
塗布液において、疎水性ポリマーの濃度は、0. 1質量%~10質量%が好ましく、両親媒性化合物の濃度は、0.01質量%~1質量%が好ましい。
加湿空気を塗膜204aの表面全体に亘って流し、結露現象によって塗膜204a上に水滴210Sを形成する。この際、塗膜204aの近傍を流れる加湿空気の露点Tdと、塗膜204aの表面温度Tsとの差分ΔT(=Td-Ts)が、下記の式(1)を満たすように、Td及びTsの少なくとも一方を制御する。
式(1):3℃≦ΔT≦30℃
加湿空気の供給を継続することにより水滴210Sを成長させる。水滴210Sの各々は、互いに略同一(同一を含む)の大きさに成長する。水滴210Sは、塗膜204aに含まれる溶媒の蒸発に伴って、横毛細管力によりハニカム状に配置されるとともに、塗膜204aの中に入り込む。これと並行して、塗膜204aに含まれる溶媒の蒸発に伴って、疎水性ポリマーが水滴210Sの周囲に析出する。
加湿空気の供給を続け、塗膜204aの中で水滴210Sどうしが、両親媒性化合物の膜220を隔てて密接するまで水滴210Sを成長させる。
溶媒の蒸発に並行して又は溶媒を蒸発させた後に、水滴210Sを蒸発させ、塗膜204aに水滴210Sが入り込んだ部分を開孔210として残し、並行して、密接する水滴210Sどうしを隔てていた両親媒性化合物の膜220を破膜する。こうして、複数の開孔210がハニカム状に配置し且つ内部で連結した多孔層204が形成される。
本実施形態の細胞組織の製造方法は、生体外において細胞組織を製造する製造方法であり、本開示の多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、細胞を培養する培養工程を含む。以下、多孔フィルムの開孔と連通孔とを総称して「孔」という。
本実施形態に用いる培地は、哺乳類細胞の培養に用いられる公知の培地の中から、培養対象となる細胞種に合せて選択される。具体的な培地としては、例えば、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、DMEM:F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)、EMEM(Eagle's minimal essential medium)、MEMα(Minimum Essential Medium Alpha)、BME(Basal Medium Eagle)等の基本培地に細胞増殖因子を添加し、細胞種に合せて最適化した培地が挙げられる。このような培地は市販品として入手可能である。本実施形態に用いる培地は、共培養する細胞種に応じて、複数種の培地を混合した培地でもよい。培地のpHは、例えばpH7.0~8.0であり、好ましくはpH7.3~7.4である。
[多孔フィルム]
ポリ乳酸5質量部、トリクロロメタン94.5質量部、両親媒性化合物としてポリアクリルアミド系の両親媒性ポリマー0.5質量部を混合し、塗布液を調製した。塗布液をPETフィルム(膜厚188μm)の上に塗布してPETフィルム上に塗膜を形成した。加湿空気を塗膜の表面全体に亘って流し、結露現象によって塗膜上に水滴を形成した。加湿空気の供給を継続して水滴を成長させながら、水滴を塗膜の中に入り込ませた。塗膜の中で水滴どうしが両親媒性化合物の膜を隔てて密接するまで水滴を成長させながら、塗膜に含まれる溶媒の蒸発により水滴の周囲にポリ乳酸を析出させた。次いで、加湿空気の供給を停止し、雰囲気温度を上げて水滴を蒸発させ、塗膜に水滴が入り込んだ部分を開孔として残し、複数の開孔がハニカム状に配列し且つ連通構造を有するポリ乳酸からなる多孔層と、PETフィルム層とを備える多孔フィルムを得た。塗膜の膜厚、加湿空気に含まれる水蒸気量、及び水滴を蒸発させるタイミングにより、多孔層における開孔及び連通孔の寸法を調整し、表1に示す各多孔フィルムを得た。
多孔フィルムを直径23mmの円形に切り出し、その外周部に、リング(外径22mm、内径16mm、高さ8mm。PMMA製、側面にPDMSコート)を、両面粘着テープ(3M社の品番1510、皮膚貼付用テープ)を用いて貼り付け、リング付き多孔フィルムを作製した。リング付き多孔フィルムを、滅菌を目的に70%(v/v)エタノール水溶液に数分間浸し、次いで滅菌水で洗浄してエタノールを除去した。図4に、多孔フィルム、リング及び培養デバイスの一例を示す。
[細胞]
・間葉系幹細胞:ヒト成人骨髄由来正常細胞、ロンザジャパン社から購入。以下「MSC」という。
・線維芽細胞:ヒト皮膚由来正常細胞NHSF46、理化学研究所バイオリソースセンター(日本国茨城県つくば市高野台3-1-1)から分譲。
・血管内皮細胞:ヒト新生児臍帯静脈由来正常細胞、ロンザジャパン社から購入。以下「HUVEC」という。
・肝臓由来の増殖性細胞:ヒト肝癌由来細胞HepG2、理化学研究所バイオリソースセンター(日本国茨城県つくば市高野台3-1-1)から分譲。
・MSC培地:ヒト間葉系幹細胞培地キットMSCGM BulletKit、ロンザジャパン社
・NHSF46培地:MEMα+10%FBS
・HUVEC培地:ヒト内皮細胞培地キットEGM-2 BulletKit、ロンザジャパン社
・HepG2培地:DMEM+10%FBS
培養デバイスとしてTCP、Flat、PLA3、PLA10、PLA30を用いて、下記の培養条件でMSCを単独培養した。
・播種後の遠心処理:多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径120mm、回転数1100rpm、回転時間3分間の遠心処理を施した。
・骨分化誘導培地:hMSC differentiation BulletKit-osteogenic(商品番号:PT-3002、ロンザジャパン社)
・脂肪分化誘導培地:hMSC differentiation BulletKit-adipogenic(商品番号:PT-3004、ロンザジャパン社)
・培養液量:1.0ml/disk
・インキュベーター:37℃、5%CO2
・多孔フィルムの開孔の大きさに応じて細胞の形態が変化した。PLA10及びPLA30において、細胞は多孔フィルムの孔内で細長い形態を示した。TCP、Flat及びPLA3において、細胞は多孔フィルムの表面において伸展した形態を示した。
・PLA3及びPLA10における細胞の増殖性は、Flatと同程度であったが、PLA30における細胞の増殖性は、Flatに比べ低かった。このことから、細胞が多孔フィルムの孔内に侵入すると増殖が抑制されることが示唆された。
・リアルタイムPCRの解析結果は、いずれの培養デバイスにおいても、骨細胞への分化と脂肪細胞への分化とが起こることを示していた。
培養デバイスとしてTCPとPLA40を用いて、下記の培養条件で、HUVECを単独培養、又は、MSCとHUVECを共培養した。
・共培養:MSCとHUVECを混合したのち播種した。MSCの播種密度0.5×105cells/disk、HUVECの播種密度1×105cells/disk、合計播種密度1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2)。MSC培地とHUVEC培地の混合培地(MSC培地:HUVEC培地=体積比1:2)で培養。
・播種後の遠心処理:多孔フィルムを備えた培養デバイスの半数に対して、回転半径120mm、回転数1100rpm、回転時間3分間の遠心処理を施した。
・培養液量:1.0ml/disk
・インキュベーター:37℃、5%CO2
・培養期間:7日間培養。2日毎に培地を交換した。
・図7B:培養3日目のCD31の蛍光免疫染色像(高倍率)。
・図7C:培養7日目のCD31の蛍光免疫染色像(高倍率)。
・図7D、表2:共培養におけるネットワークの全長及び総面積。
・HUVECは血管内膜を形成する細胞であるところ、HUVECのみでは毛細血管網様のネットワークの形成は難しいが、MSCとHUVECの共培養により毛細血管網様のネットワークが形成された。内皮細胞が管腔構造を形成するには内皮細胞を支持する細胞が必要であると考えられるところ、MSCは内皮細胞に作用するサイトカインを分泌すること及び壁細胞への分化が可能であることから、HUVECの毛細血管網様のネットワーク形成にMSCが効果的に作用していることが示唆された。
・毛細血管網様のネットワークの形成は経時に伴って進行し、培養7日目では、培養3日目に比べ、より発達したネットワークが形成された。
・PLA40においては、多くの細胞が多孔フィルムの孔内に存在した。PLA40においては、TCPに比べ、発達した毛細血管網様のネットワークが形成された。
・遠心処理を施したPLA40においては、遠心処理を施していないPLA40に比べ、毛細血管網様のネットワークがより長く発達していた。遠心処理を施すことにより、多孔フィルムの孔内に移行する細胞の割合が大きくなることが示唆された。
・通常の播種操作後の培養においては、培養デバイスのリング周辺において細胞密度が高い傾向が見られたが、遠心処理を施した後の培養では、培養面全体において比較的均一なネットワーク形成が見られた。播種された細胞が遠心処理によって多孔フィルムの孔内に移行するので、リング周辺に細胞が移行することが抑制されることが示唆された。
培養デバイスとしてTCP、Flat、PLA40を用いて、下記の培養条件で、MSCとHUVECを共培養、又は、NHSF46とHUVECを共培養した。
・NHSF46とHUVECの共培養:NHSF46とHUVECを混合したのち播種した。NHSF46の播種密度0.5×105cells/disk、HUVECの播種密度1×105cells/disk、合計播種密度1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2)。NHSF46培地とHUVEC培地の混合培地(NHSF46培地:HUVEC培地=体積比1:2)で培養。
・播種後の遠心処理:多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径120mm、回転数1100rpm、回転時間3分間の遠心処理を施した。
・培養液量:1.0ml/disk
・インキュベーター:37℃、5%CO2
・培養期間:7日間培養。毎日培地を交換した。
・図8B:培養7日目のCD31の蛍光免疫染色像(高倍率)。
・図8C、表3:培養3日目のネットワークの全長及び総面積。
・図8D、表3:培養7日目のネットワークの全長及び総面積。
・NHSF46とHUVECの共培養により、MSCとHUVECの共培養と同様に、毛細血管網様のネットワークが形成された。
・毛細血管網様のネットワークは、経時に伴って発達した。
・PLA40においては、TCP及びFlatに比べ、より発達したネットワークが形成された。
培養デバイスとしてTCP、Flat、PLA3、PLA10、PLA20、PLA40を用いて、下記の培養条件でMSCとHUVECを共培養した。
・播種密度:MSC 0.5×105cells/disk、HUVEC 1×105cells/disk、合計1.5×105cells/disk(7.5×104cells/cm2)。
・培地:MSC培地とHUVEC培地の混合培地、MSC培地:HUVEC培地=体積比1:2。
・播種後の遠心処理:多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径120mm、回転数1100rpm、回転時間3分間の遠心処理を施した。
・培養液量:1.0ml/disk
・インキュベーター:37℃、5%CO2
・培養期間:7日間培養。2日毎に培地を交換した。
・図9B:培養3日目のCD31の蛍光免疫染色像(高倍率)。
・図9C:培養7日目のCD31の蛍光免疫染色像(低倍率)。
・図9D:培養7日目のCD31の蛍光免疫染色像(高倍率)。
・図9E、表4:ネットワークの全長及び総面積。
・PLA3及びPLA10においては、細胞は、多孔フィルムの表面において伸展した形態を示し、ネットワークは形成されなかった。
・PLA20においては、細胞は、多孔フィルムの表面で伸展した形態と、多孔フィルムの孔内でネットワークを形成した形態を示した。
・PLA40においては、毛細血管網様のネットワークが形成された。
・上記のとおり、多孔フィルムの開孔の大きさに応じて細胞の形態が変化した。本実験で使用した細胞の長径が20μm程度であることから、多孔フィルムの開孔の大きさが細胞サイズと同等以上であると、細胞は多孔フィルムの孔内でネットワークを形成しやすいことが示唆された。
培養デバイスとしてTCP、PLA40を用いて、下記の培養条件でMSCとHUVECとHepG2を共培養した。
・播種密度:MSC 0.5×105cells/disk、HUVEC 1×105cells/disk、HepG2 5×105cells/disk。
・培地:MSC培地とHUVEC培地とHepG2培地の混合培地、MSC培地:HUVEC培地:HepG2培地=体積比1:2:3。
・播種後の遠心処理:多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径120mm、回転数1100rpm、回転時間3分間の遠心処理を施した。
・培養液量:1.0ml/disk
・インキュベーター:37℃、5%CO2
・培養期間:3日間培養。毎日培地を交換した。
・図10B:培養3日目におけるCD31の蛍光免疫染色像。
・PLA40においては、細胞はネットワーク構造を形成したが、ネットワーク間の連結状態は乏しかった。
・MSCとHUVECとHepG2の3種共培養は、MSCとHUVECの2種共培養に比べ、播種密度が高く、多孔フィルムの孔内に高密度に細胞が充填されたことにより細胞の遊走性が低下し、ネットワーク形成の低下あるいは遅延が起こっていることが示唆された。播種密度の最適化又は培養時間の延長により、ネットワーク形成が可能と推測された。
培養デバイスとしてTCP、PLA40を用いて、下記の培養条件でMSCとHUVECとHepG2を共培養した。
・播種密度:MSC 0.5×105cells/disk、HUVEC 1×105cells/disk、HepG2 5×105cells/disk。
・播種後の遠心処理:多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径120mm、回転数1100rpm、回転時間3分間の遠心処理を施した。
・培養液量:1.0ml/disk
・インキュベーター:37℃、5%CO2
・培養期間:2種共培養を3日間、3種共培養を3日間行った。
・培地:培養開始から3日間は、MSC培地とHUVEC培地の混合培地(体積比1:2)で培養し、1日目に培地交換を行った。HepG2を播種した後は、MSC培地とHUVEC培地とHepG2培地の混合培地(体積比1:2:3)に交換し、毎日培地を交換しながら培養した。
・図11B:HepG2を播種した後の培養3日目におけるCD31の蛍光免疫染色像。
・図11C、表5:3種の共培養3日目における、同時共培養(培養実験5)、段階的共培養(培養実験6)それぞれのネットワークの全長及び総面積。
・PLA40においては、TCPに比べ、細く長いネットワークが形成された。
・段階的共培養は、同時共培養に比べ、ネットワークの連結が増していた。MSCとHUVECを共培養してネットワークを予め形成した後にHepG2を播種することが、高次のネットワーク構造の形成に効果的であることが示唆された。
Claims (20)
- 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの前記開孔及び前記連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞を培養する培養工程を含む、細胞組織の製造方法。
- 前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項1に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項1に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項1に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記フィーダー能を有する細胞が、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の少なくともいずれかである、請求項1~請求項4のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記複数の開孔が、前記多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、請求項1~請求項5のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記連通孔が、前記多孔フィルムの面方向全域に亘って略同一の深さに設けられている、請求項1~請求項6のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記連通孔の孔径が、前記多孔フィルムに播種される細胞の長径に対して50%~500%の範囲である、請求項1~請求項7のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記連通孔の孔径が5μm~50μmの範囲である、請求項1~請求項8のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記連通孔の孔径の変動係数が30%以下である、請求項1~請求項9のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記開孔の、前記多孔フィルムの面方向における長径が10μm~100μmの範囲である、請求項1~請求項10のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記開孔の深さが10μm~100μmの範囲である、請求項1~請求項11のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記開孔の開口径が5μm~90μmの範囲である、請求項1~請求項12のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記開孔の開口径の変動係数が20%以下である、請求項1~請求項13のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。
- 前記培養工程の前に、
前記多孔フィルムの前記複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、前記細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ前記細胞を前記複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含む、
請求項1~請求項14のいずれか1項に記載の細胞組織の製造方法。 - 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、
前記開孔の、前記多孔フィルムの面方向における長径が20μm~100μmの範囲である、多孔フィルム。 - 表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、
前記開孔の深さが20μm~100μmの範囲である、多孔フィルム。 - 前記開孔の開口径が5μm~90μmの範囲である、請求項16又は請求項17に記載の多孔フィルム。
- 前記連通孔の孔径が5μm~50μmの範囲である、請求項16~請求項18のいずれか1項に記載の多孔フィルム。
- 前記複数の開孔が、前記多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、請求項16~請求項19のいずれか1項に記載の多孔フィルム。
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