JP3733127B2

JP3733127B2 - 細胞の培養方法、細胞の培養装置、細胞組織の培養に使用される立体フレームの形成方法、細胞組織の培養に使用される立体フレームの形成装置、及び細胞組織の培養に使用される立体フレーム

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Publication number: JP3733127B2
Application number: JP2003119672A
Authority: JP
Inventors: 克昌藤田; 收中村; 聡河田
Original assignee: Nanophoton Corp
Current assignee: Nanophoton Corp
Priority date: 2003-04-24
Filing date: 2003-04-24
Publication date: 2006-01-11
Anticipated expiration: 2023-04-24
Also published as: JP2004321065A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織の培養装置、生体組織、及び生体組織の培養方法に関し、特に、３次元的な生体組織の培養装置、生体組織、及び生体組織の培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の培養法は、医学・生物学分野での研究において、基本的な実験技術として用いられてきた。この細胞の培養技術は生体組織の構築にも応用され、特に再生医学分野では、臓器等の生体組織を形成するために種々の生体組織の培養方法が研究されている。
【０００３】
このような生体組織の培養方法として、種々の培養方法が開発されているが、例えば、表面処理を施された２次元平面上で細胞を培養する方法が知られている。２次元平面上で細胞を培養する方法では、基板表面上の微細構造又は化学的・生物学的に性質が異なる表面パターンを形成して細胞の成長を空間的に抑制する。しかしながら、２次元平面上の細胞培養法では、３次元的な組織を構築すること自体が困難なだけでなく、２次元平面上での細胞技術自体もいまだ確立されたとは言い難く、そこに残された課題も多い。
【０００４】
細胞が生体組織として機能するためには、細胞が３次元的な組織を構築し、その空間の中でお互いにコミュニケーションをとる必要がある。例えば、心臓を構成する主たる細胞は、同種の心筋細胞であるにもかかわらず、ペースメーキングを行う部位、心拍のリズムを作る部位、実際に力強く血流を生み出す部位と、心臓の各部位で異なった機能をもっている。それぞれの部位での実際の相違は細胞の密度や配列であり、その違いによって細胞間コミュニケーションの違いが生まれ、機能の違いをもたらしている。従って、細胞の培養において、生体内での細胞配列に近似した配列で、細胞組織を形成することが望まれる。
【０００５】
３次元的に細胞を培養する技術として、充填層型培養装置において細胞を培養する方法（特許文献１）が知られている。これは、多孔質担体を立体構造物に支持させ、各担体に間隔を持たせることによって充填層を上下に貫通する流路を形成する。流路によって培地が供給され、多孔質担体内の細胞の活性が維持される。あるいは、特定の形状もしくは材料によって多孔質担体を形成し、その担体で細胞の培養を行う方法がある（特許文献２、３）。多孔質担体の間に培養液の流通を維持する空隙が設けられ、多孔質担体内で培養される細胞の活性を維持する。しかし、多孔質担体内の細胞は配列が制御されることなく培養されるに過ぎない。そのため、細胞同士のコミュニケーションが可能な環境を細胞にもたらすことはできない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平６−１８１７４８号公報
【特許文献２】
特開２００１−１７８４４５号公報
【特許文献３】
特開２００２−３００８７２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来の細胞組織の培養方法では、細胞の形状、細胞レベルでの配向あるいは配置を制御して、細胞組織を培養することができないという問題点があった。本発明は、上記従来の技術に鑑みてなされたものであって、細胞の形状、細胞レベルでの配置、あるいは配向を制御し、３次元的な細胞組織の培養する技術を提供することを一つの目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の態様は、３次元細胞組織を形成する細胞の培養方法であって、集光されたレーザ光によって硬化された光硬化性材料で形成された立体フレームを準備するステップと、前記立体フレームに細胞を付着するステップと、前記細胞を前記立体フレーム上で培養し、前記立体フレームに従った３次元細胞組織を形成するステップと、を備える。これにより、細胞培養のコントロールを効果的に行うことができる。
【０００９】
他方、本発明の第１の態様は、３次元細胞組織を形成する、細胞の培養方法であって、集光されたレーザ光によって破壊された樹脂材料で形成された立体フレームを準備するステップと、前記立体フレームに細胞を付着するステップと、前記細胞を前記立体フレーム上で培養し、前記立体フレームに従った３次元細胞組織を形成するステップと、を備える。これにより、細胞培養のコントロールを効果的に行うことができる。
【００１０】
上記第１の態様において、前記立体フレームは、生体材料で形成されていることが好ましい。これにより、細胞組織の培養後の立体フレームの影響を小さくすることができる。さらに、前記立体フレームは、光硬化性ゼラチンもしくは光硬化性生体吸収性ポリマーで形成されていることが好ましい。
【００１１】
上記第１の態様において、前記立体フレームは所定の間隔をおいて配置された複数のワイヤー部を備えることが好ましい。あるいは、上記第１の態様の細胞の培養方法において、前記立体フレームは、前記樹脂材料内で所定の間隔をおいて配置された複数の空洞部を備えることが好ましい。そして、前記細胞組織の各細胞は、前記ワイヤー部若しくは前記空洞部によって配列が制御される。これにより、細胞の成長を効果的に制御することができる。
【００１２】
上記第１の態様において、前記立体フレームを準備するステップは、レーザ光を前記光硬化性材料に集光するステップと、前記レーザ光の集光点近傍において前記光硬化性材料の多光子吸収を引き起こし、前記光硬化性材料を硬化させるステップと、前記集光点を３次元的に走査し、前記立体フレームを形成するステップと、を備えることが好ましい。あるいは、上記第１の態様の細胞の培養方法において、前記立体フレームを準備するステップは、レーザ光を前記樹脂材料に集光するステップと、前記レーザ光の集光点近傍において前記樹脂材料の多光子吸収を引き起こし、前記樹脂性材料を破壊させるステップと、前記集光点を３次元的に走査し、前記立体フレームを形成するステップと、を備える。これにより、微細な立体フレームを正確に形成することができる。
【００１３】
本発明の第２の態様は、細胞組織の培養に使用される立体フレームの形成方法であって、レーザ光源からの光を光硬化性材料に集光するステップと、前記集光されたレーザ光によって前記光硬化性材料による多光子吸収を引き起こし、前記光硬化性材料を硬化させるステップと、前記レーザ光の集光点を３次元的に走査し、前記光硬化性材料による立体フレームを形成するステップと、を備える。これにより、微細な立体フレームを正確に形成することができる。
【００１４】
他方、本発明の第２の態様は、細胞組織の培養に使用される立体フレームの形成方法であって、レーザ光源からの光を、樹脂材料に集光するステップと、前記集光されたレーザ光によって前記樹脂材料による多光子吸収を引き起こし、前記樹脂材料を破壊させるステップと、前記レーザ光の集光点を３次元的に走査し、前記樹脂材料による立体フレームを形成するステップと、を備える。これにより、微細な立体フレームを正確に形成することができる。
【００１５】
上記第２の態様において、前記レーザ光源からの光は、フェムト秒パルスレーザ光である、ことが好ましい。これにより、効果的に多光子吸収を引き起こすことができる。
【００１６】
本発明の第３の態様は、３次元細胞組織を形成する、細胞の培養装置であって、培地と、前記培地内に収容され、集光された光によって硬化した光硬化性材料で形成された立体フレームと、を備え、前記立体フレーム上に付着された細胞を、前記立体フレーム上で培養し、前記立体フレームに従った３次元細胞組織を形成する。これにより、細胞培養のコントロールを効果的に行うことができる。
【００１７】
他方、本発明の第３の態様は、３次元細胞組織を形成する、細胞の培養装置であって、培地と、前記培地内に収容され、集光された光によって破壊した樹脂材料で形成された立体フレームと、を備え、前記立体フレーム上に付着された細胞を、前記立体フレーム上で培養し、前記立体フレームに従った３次元細胞組織を形成する。これにより、細胞培養のコントロールを効果的に行うことができる。
【００１８】
上記第３の態様において、前記立体フレームは、所定の間隔をおいて配置された複数のワイヤー部を備え、前記細胞組織の各細胞は、前記ワイヤー部によって配列が制御されることが好ましい。あるいは、上記第３の態様において、前記立体フレームは、前記樹脂材料内で所定の間隔をおいて配置された複数の空洞部を備え、前記細胞組織の各細胞は、前記空洞部によって配列が制御されることが好ましい。これにより、所望の配列で細胞組織の培養を行うことができる。
【００１９】
上記第３の態様において、前記立体フレームは、生体吸収材料で形成されていることが好ましい。これにより、細胞組織の培養後の立体フレームの影響を小さくすることができる。
【００２０】
本発明の第４の態様は、３次元細胞組織を形成するため、細胞を培養する立体フレームであって、所定の間隔をおいて３次元的に配置された複数のワイヤー部を備え、前記細胞組織の各細胞は、前記フレーム上において、前記ワイヤー部によって配列が制御されて培養される、細胞を培養するものである。これにより、これにより、所望の配列で細胞組織の培養を行うことができる。
【００２１】
他方、本発明の第４の態様は、３次元細胞組織を形成するため、細胞を培養する立体フレームであって、樹脂材料内で所定の間隔をおいて３次元的に配置された複数の空洞部を備え、前記細胞組織の各細胞は、前記フレーム上において、前記空洞部によって形状と配列が制御されて培養されるものである。これにより、これにより、所望の配列で細胞組織の培養を行うことができる。
【００２２】
本発明の第５の態様は、細胞組織の培養に使用される立体フレームの形成装置であって、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を、光硬化性材料に集光するレンズと、前記レーザ光の集光点を３次元的に走査する手段と、を備え、前記集光されたレーザ光によって前記光硬化性材料による多光子吸収を引き起こし、前記光硬化性材料を硬化させるものである。これにより、細胞組織の培養に使用される微細な立体フレームを正確に形成することができる。あるいは、他の態様は、細胞組織の培養に使用される立体フレームの形成装置であって、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を、樹脂材料に集光するレンズと、前記レーザ光の集光点を３次元的に走査する手段と、を備え、前記集光されたレーザ光によって前記樹脂材料による多光子吸収を引き起こし、前記樹脂材料の一部を破壊するものである。これにより、細胞組織の培養に使用される微細な立体フレームを正確に形成することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。
【００２４】
発明の実施の形態１．
本形態は、レーザ光学系を使用して、細胞培養のための３次元フレームを形成する。３次元フレームを培養媒質に配置し、細胞をフレーム上で成長させることによって３次元生体組織の構築を行う。以下においては、本形態にかかるレーザ光造形装置について説明した後、細胞の培養に用いる３次元フレーム、この３次元フレームを用いた生体組織の培養について説明する。
【００２５】
まず、図１を用いて、本形態におけるレーザ光造形装置について説明する。図１は、本形態におけるレーザ光造形装置１００の構成を示す模式図である。図１において、１０１はレーザ光源である。レーザ光源１０１としては、例えば、チタンサファイアレーザを使用することができる。１０２はシャッターを備えるアッテネータ、１０３はビームエキスパンダである。ビームエキスパンダ１０３は、２枚のレンズ１０４、１０５を備えている。１０６はピンホールであって、レンズ１０４、１０５の間に配置されている。１０７はミラー、１０８はガルバノスキャナーである。
【００２６】
ガルバノスキャナー１０８は、２つのガルバノメータミラー１０９と１１０を有している。１１１、１１２はミラー、１１３はビームエキスパンダである。ビームエキスパンダ１１３は、２枚のレンズ１１４、１１５を備えている。１１６はλ／２板、１１７は偏光ビームスプリッタ、１１８はミラー、１１９は対物レンズである。１２０はピエゾ作動ステージ、１２１はステージ１２０上の光硬化性樹脂である。１２２はファイバー光源、１２３はカラーフィルター、１２４はイメージングレンズ４３、１２５はＣＣＤである。
【００２７】
図１に示すように、レーザ光源１０１から出射されたレーザ光は、シャッターを有するアッテネータ２２を通過して、ビームエキスパンダ１０３に入射する。ビームエキスパンダ１０３は入射したレーザの径を拡大する。本形態のビームエキスパンダ１０３は、レンズ１０４と１０５の間の集光部位に、空間フィルターとしてのピンホールを備えている。これにより良好な解像度を得ることができる。ピンホールの直径は、例えば、およそ５０μｍとすることができる。
【００２８】
ビームエキスパンダ１０３によって広げられたレーザ光は、ミラー１０７によって反射され、光路方向が変更された後、ガルバノスキャナー１０８に入射する。ガルバノスキャナー１０８は、２つのガルバノメータミラー１０９と１１０を備えており、Ｘ-Ｙ平面内でレーザ・スポットが樹脂試料を走査することを可能とする。ガルバノメータミラー１０９と１１０は、それぞれ異なる回転軸と回転方向とを備えている。例えば、一方のミラーの回転により露光ビームの集光部位のＸ方向への移動を実現し、他方のミラーの回転によりＹ方向への露光ビームの集光部位の移動を実現する構成とすることができる。また、ガルバノスキャナー１０８のミラー１０９、１１０でビームパスを遮ることによって、レーザ光のＯＮ／ＯＦＦを行うことができる。
【００２９】
ガルバノスキャナー１０８を通過したレーザ光は、ミラー１１１、１１２によって反射され、光路方向が変更された後、ビームエキスパンダ１１３に入射する。ビームエキスパンダ１１３は２つのレンズ１１４、１１５を備えており、入射レーザ光の径を拡大する。ビームエキスパンダ１１３からの射出光は、１／２λ板１１６を通過した後、偏光ビームスプリッタ１１７入射する。偏光ビームスプリッタ１１７からの射出光はミラー１１８を介して、対物レンズ１１９に入射する。対物レンズ１１９は入射光を試料内の所定位置に集光する。
【００３０】
図１に示すように、光硬化性樹脂１２１が、ピエゾ作動ステージ１２０のカバーガラス上に滴下され、ピエゾ作動ステージ１２０上に配置されている。対物レンズ１１９によって集光された光は、光硬化性樹脂１２１に下方よりカバーガラスを介して入射され、光硬化性樹脂１２１を硬化させる。このとき、露光ビームの集光部位は、ガルバノスキャナー２７により焦平面内でＸＹ軸方向に走査され、ピエゾ作動ステージ１２０によって光軸方向（Ｚ軸方向）に走査される。
【００３１】
カバーガラス上の光硬化性樹脂１２１は、上方からファイバー光源１２２を用いて光を照明される。照射光は対物レンズ１１９、ミラー１１８を介して偏光ビームスプリッタ１１７に入射する。偏光ビームスプリッタ１１７で反射された照明光は、イメージングレンズ１２４を介してＣＣＤ４４に結像している。また、ファイバー光源１２２からの照明光によって光硬化性樹脂１２１が硬化するのを防ぐために、例えば波長５６０ｎｍ以下というように一定の波長をカットするカラーフィルター１２３を設けることができる。ＣＣＤ４４によって３次元フレームの形成状況を視認することができる。
【００３２】
上記のようなレーザ光造形装置１００は、例えば、ＧＰ−ＩＢ、ＤＡボードを介して、コンピュータ・システム（不図示）に接続され、コンピュータ・システムから自動的にコントロールすることができる。また、このコンピュータ・システム上のＣＡＤソフトにより、造形する光硬化性樹脂１２１の形状を設計することができる。設計されたＣＡＤデータは、制御ソフトにより読み込まれ、この形状データに沿ってレーザ光造形装置１００は３次元フレームの造形を行うことができる。
【００３３】
続いて、図２を用いて、上記のレーザ光造形装置１００により形成される３次元フレームについて説明する。細胞が生体組織として機能するためには、細胞が３次元的な組織を構築し、その空間の中でお互いにコミュニケーションをとる必要がある。細胞の密度あるいは配列などによって、同種の細胞が異なる機能を担う。本形態は、３次元フレーム上で細胞を成長・増殖させることによって、細胞を用いた３次元的な組織を構築する。これにより、生体内の条件に近い細胞組織を構築することができる。３次元フレームは、細胞が実際の生体中でとる３次元配列、例えば配置密度は配向などを人工的に再現する構造が好ましい。
【００３４】
図２は、３次元フレームの一つの構造例を示す斜視図である。図２の３次元フレーム５０は、ワイヤー５１で構成される３次元ワイヤーフレームである。３次元ワイヤーフレーム５０は、ワイヤー５１を立体的に組むことにより形作られた３次元構造体である。３次元ワイヤーフレームは、３次元フレームの好ましい例である。ワイヤーフレームは、細胞の形状や配列をコントロールして成長・増殖させるために好適な構造である。ワイヤーの形状、寸法、ワイヤー間隔、フレーム全体形状などを変化させることによって、様々な細胞の培養のそれぞれに適した細胞組織形成のための足場を形成することができる。
【００３５】
例えば、このワイヤー５１により形作られた３次元ワイヤーフレームは、ワイヤー５１の組み方により種々の形状とすることができる。一例として示された３次元ワイヤーフレーム５０は、ワイヤー５１により構成された球状構造を有する。３次元ワイヤーフレーム５０の形状は、後述のように培養される生体組織の構造に従って設計される。３次元ワイヤーフレーム５０の形状は、球体、円筒体、回転楕円体状、立方体状、直方体状、ひょうたん、あるいは尖部をもつ構造体など、様々な形状を選択することができる。３次元ワイヤーフレームは、所定形状の外郭のみを形成し、その内部が空洞である構成とすることができる。あるいいは、所定形状の外郭及びその内部に組み立てられたワイヤーを配置することができる。
【００３６】
また、ワイヤー５１の断面形状は、培養される細胞に従って設計される。図２においては、ワイヤー５１の断面形状は円形であるが、これに限らず、楕円形、楕円形、矩形、多角形とすることができる。また、断面形状が円形のワイヤー５１を用いて３次元ワイヤーフレーム５０全てが形成する他、一部のワイヤー５１の断面形状を変更し、複数の種類のワイヤー５１を用いて３次元ワイヤーフレーム５０を構成しても良い。連続的に変化する断面形状を有することもできる。
【００３７】
ワイヤー５１間のスペースは、培養される生体組織の大きさ、個々の細胞の大きさやなどに従って、好適なものが選択される。ワイヤー５１間のスペースは、最初に細胞が各ワイヤーに付着するための通路となると同時に、付着した細胞が成長するスペースとなる。細胞によるが、ワイヤー５１間のスペースは、例えば１０μｍ〜１００μｍとすることができる。また、ワイヤー５１の長さや径などの寸法も、培養される細胞の大きさや細胞組織の構造に従って適切なものが選択される。例えば１０μｍほどの細胞を密に培養する場合にはワイヤー５１間の幅、ワイヤー５１の寸法を約１０μｍとすることができる。
【００３８】
３次元ワイヤーフレーム５０は、上記の光硬化性樹脂１２１を用いて形成される。この光硬化性樹脂１２１として、培養した生体組織に最終的に吸収される材料が好ましい。３次元ワイヤーフレーム５０上で生体組織を培養するからである。光硬化性樹脂１２１としては、たとえば、光硬化性ゼラチン、光硬化性生体吸収性ポリマー等を用いることが好ましい。
【００３９】
一般に、光硬化性樹脂は、主成分として、樹脂成分、光重合開始剤から構成される。この樹脂成分として、重合度が２〜２０程度の重合体で、末端に多数の反応基を有するオリゴマー、光硬化性樹脂の粘度、硬化性等を調整する反応性希釈剤とを含む。細胞培養において使用可能であるならば、例えば、アクリレート系樹脂、ウレタンアクリレート系樹脂、エポキシ系樹脂を光硬化性樹脂１２１に用いることができる。ワイヤーフレームは、形状、寸法、材料のほか、表面処理など適切な条件において形成される。
【００４０】
次に、上記レーザ光造形装置１００による３次元ワイヤーフレーム５０の造形方法について説明する。本形態のレーザ光造形装置１００による３次元ワイヤーフレーム５０の造形は、多光子吸収を利用して行われる。多光子吸収により、集光点近傍においてのみ樹脂材料を硬化させることができる。これによって、樹脂材料内に所望の３次元フレーム形状を形成することができる。対物レンズ１１９を透過した光は樹脂材料の一部を透過し、集光点近傍において樹脂材料に吸収され、樹脂を硬化する。多光子吸収の典型的な例として、２光子吸収について説明する。２光子吸収とは、非線形光学効果の一種であり、分子が２個の光子を同時に吸収して励起される現象をいう。この２光子吸収においては、１光子あたりのエネルギーが通常の吸収と比べ、およそ半分となる。すなわち、２光子吸収の光は、１光子吸収の光に比べ、その周波数がおよそ半分であり、波長はおよそ倍である。
【００４１】
通常の１光子吸収の発生確率は入射光強度に比例するが、２光子吸収においては、入射光強度の２乗に比例する。そのため、より空間的に小さな領域の分子を励起することができる。２光子吸収においては、波長が倍になることにより、より長い波長で励起が行われる。そのため、光硬化性樹脂に対する透過率が良くなり、より深い位置の分子を励起することができる。さらに、より長い波長で励起が行われるため、光硬化性樹脂１２１中の散乱、屈折の影響を受け難くなる。
【００４２】
２光子吸収は、通常の吸収と異なり、２光子吸収の吸収断面積は非常に小さく非常に起こり難い現象である。２光子吸収が顕著に現れるのは光強度が非常に大きいときに限られるため、好ましくは、瞬間的な光強度が非常に大きいフェムト秒（ｆｓ）パルスレーザが用いられる。例えば、波長７５０〜８５０ｎｍ、パルス幅５０〜１５０ｆｓ、繰り返し周波数７０〜９０ＭＨｚのパルスレーザを用いることができる。好適なレーザ光源は、チタンサファイアレーザである。レーザ光波長、露光時間、強度、スキャン速度などは、装置あるいはフレームによって、適切なものが選択される。
【００４３】
続いて、レーザ光造形装置１００による３次元ワイヤーフレーム５０の造形について説明する。ここで、２光子吸収を発生させるために、例えば、モードロックされた波長７８０ｎｍ、パルス幅８０ｆｓ、繰り返し周波数８２ＭＨｚのチタンサファイアレーザを用いることができる。また、このようなチタンサファイアレーザを用いる場合、波長７８０ｎｍ周辺に吸収を持たず、かつその半分の波長３９０ｎｍ周辺に吸収を持つ光硬化性樹脂１２１が用いられる。
【００４４】
チタンサファイアレーザからの露光ビームを光硬化性樹脂１２１に照射したとき、光硬化性樹脂１２１が波長７８０ｎｍ周辺には吸収を持たないため、光硬化性樹脂１２１では１光子吸収は発生しない。対物レンズ１１９からのレーザ光は、光硬化性樹脂１２１の一部を透過して、光硬化性樹脂１２１内で集光される。これに対して、露光ビームが光硬化性樹脂１２１内において集光されると、光硬化性樹脂１２１が波長７８０ｎｍの半分の３９０ｎｍ周辺に吸収を持つため、集光された位置の光硬化性樹脂１２１で２光子吸収が発生する。２光子吸収は、光強度が非常に大きいときに顕著に発生するので、対物レンズ１１９による露光ビームの集光部位のみで発生し、光硬化性樹脂１２１の内部の集光部位が硬化する。また、２光子吸収の吸収断面積は非常に小さいため、露光ビームにより、光硬化性樹脂１２１の内部の特定の点のみ硬化を行うことができる。
【００４５】
２光子吸収により露光ビームを吸収した光硬化性樹脂１２１は、重合反応を起こし、液体から固体へと変化する。露光ビームを３次元的にスキャンさせることにより、光硬化性樹脂１２１が点露光されて硬化し、所望の形状を有する３次元ワイヤーフレーム５０が形成される。露光ビームは、ガルバノスキャナー１０８の動作に従って試料のＸＹ面内を走査し、ピエゾ作動ステージ１２０のＺ軸方向の移動によってＺ軸方向に走査する。なお、ガルバノスキャナー１０８の加減速の影響を低減するため、露光はベクトルスキャンではなく、点露光の繰り返しであるラスタースキャンにより行うのが好ましい。
【００４６】
また、チタンサファイアレーザ２１からの露光ビームは、ピエゾ作動ステージ４０のカバーガラス下側から光硬化性樹脂１２１を照射し、これを硬化する。これにより、３次元ワイヤーフレーム５０がカバーガラスに付着することができ、作製中の３次元ワイヤーフレーム５０が光硬化性樹脂１２１中でゆらぐのを軽減することができる。
【００４７】
このように、光硬化性樹脂１２１に露光ビームを照射し、集光部位で２光子吸収を生じさせて光硬化性樹脂１２１を加工する。これにより、３次元ワイヤーフレーム５０を効率良く形成することができる。さらに、２光子吸収を利用して光硬化性樹脂１２１を加工するため、露光ビームの集光部位の光硬化性樹脂１２１のみを硬化させることができ、微細な３次元ワイヤーフレーム５０を精度良く形成することができる。
【００４８】
続いて、図３を用いて、３次元フレームを用いた細胞組織の培養方法について説明する。細胞による３次元構造の構築のため、３次元的な細胞の足場を形成し、その上に単離した細胞を播き培養する。図３は、この生体組織の培養例を示す模式図である。ここで、心筋細胞の培養を例として説明するが、これに限らず、種々の細胞組織を同様に培養することができる。
【００４９】
まず、所定の方法により、心筋細胞が取り出される。この心筋細胞には、心筋細胞を細片化するときに傷害を受けていない心筋細胞、傷害を受けた心筋細胞が含まれている。この取り出された心筋細胞は、シャーレにゲル状の培養媒質を入れた培地に懸濁される。培地内には３次元ワイヤーフレーム５０が配置されており、ＣＯ_２インキュベーター等の中で心筋細胞は培養される。すると、図３（ａ）に示すように、心筋細胞６１が３次元ワイヤーフレーム５０に生着する。このとき、３次元ワイヤーフレーム５０に接着していない心筋細胞は、ほとんどが傷害を受けた心筋細胞である。心筋細胞６１が３次元ワイヤーフレーム５０に生着した状態で培養した後、培地を交換する。これにより、傷害を受けた心筋細胞が除去され、純度の高い心筋細胞６１が得られる。なお、図３においては、傷害を受けた心筋細胞、培地については、図示せずに省略している。
【００５０】
得られた心筋細胞６１は、図３（ｂ）に示すように、シャーレ内で再培養されて成長・増殖する。このとき、各心筋細胞６１はワイヤーに従って成長・増殖し、細胞組織が３次元ワイヤーフレーム５０の形状に従って形成される。より具体的には、図３（ｂ）に示すように、個々の心筋細胞６１は３次元ワイヤーフレーム５０のワイヤー５１に沿うようにして成長し、個々の心筋細胞６１がワイヤー５１上に配列する。すなわち、心筋細胞６１のその長手方向と３次元ワイヤーフレームのワイヤー５１の長手方向とがほぼ同じ方向となるように成長し、配列される。
【００５１】
培養が進むと、心筋細胞組織６２は、３次元ワイヤーフレーム５０の形状とほぼ同じ形状となるように、各細胞が成長し、配列される。成長した個々の心筋細胞６１は、ワイヤー５１に従った形状となり、その配向もワイヤー５１によって制御され、ワイヤー５１上に配置される。また、３次元ワイヤーフレーム５０の材料として、生体組織に吸収される材料を用いた場合、図３（ｃ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０は心筋細胞６１に分解されて無くなる。
【００５２】
以上のように、３次元ワイヤーフレーム５０を用いることにより、細胞の形状、配置（密度を含む）、配向を制御しつつ３次元的な生体組織を培養することが可能となる。細胞レベルで形状及び配列が制御されているため、培養された細胞に生体組織としての機能を持たせることが可能となる。細胞の配列は、細胞の配向及び／または配置を意味する。さらに、３次元ワイヤーフレーム５０の形状を適宜変更することにより、様々な配列を有する生体組織を培養することができる。さらにまた、上記のように３次元ワイヤーフレーム５０を用いて細胞を培養する場合には、３次元ワイヤーフレーム５０のワイヤー５１間の間隙が培養液の流路となっている。これにより、培養する細胞に培養液を確実に供給することができるので、細胞の活性を維持することができ、良質な細胞を得ることが可能となる。
【００５３】
発明の実施の形態２．
実施の形態２において、まず生体組織の培養に用いる３次元ワイヤーフレームの他の構造例について図４を用いて説明し、生体組織の培養について図５を用いて説明する。図４は、３次元ワイヤーフレームの他の構造例を示す斜視図である。図４に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０１は、長手方向に垂直な断面形状が円形となるようにワイヤー５１が巻かれた螺旋状構造を有する。この螺旋状構造の断面形状は、後述のように培養される生体組織の形状に従って設計される。図４においては、螺旋状構造を有する３次元ワイヤーフレーム５０１の断面形状は円形であるが、これに限らず、楕円形、矩形、多角形とすることができる。
【００５４】
また、ワイヤー５１の断面形状、ワイヤー５１間の幅、ワイヤー５１の寸法、３次元ワイヤーフレーム５０１の断面寸法などは、培養される細胞の種類、培養される細胞組織の大きさ、個々の細胞の大きさや数などに従って設計される。３次元ワイヤーフレーム５０１を構成する材料は、光硬化性ゼラチン、光硬化性生体吸収性ポリマー等の光硬化性生体材料を用いることができる。
【００５５】
図５は、この生体組織の他の培養例を示す模式図である。まず、図５（ａ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０１上に単離した細胞６１１が播かれる。細胞６１１は、図５（ｂ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０１の形状に従い、シャーレ内で培養される。細胞６１１は、３次元ワイヤーフレーム５０１のワイヤー５１に沿うようにして成長・増殖し、個々の細胞６１１がワイヤーフレーム５０１上に配列する。細胞６１１は、その長手方向と３次元ワイヤーフレームのワイヤー５１の長手方向とがほぼ同じ方向となるように成長・増殖する。培養が進むと、図５（ｃ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０１の形状とほぼ同じ形状を有する、細胞組織６２１が形成される。成長した個々の細胞６１１は、形状及び配向が制御され、ワイヤー５１上に配置される。
【００５６】
このように、３次元ワイヤーフレーム５０２を螺線状構造とすることにより、螺旋状に細胞が配列された筒状の細胞組織を形成することが可能となる。また、３次元ワイヤーフレーム５０１の螺旋状構造を適宜変更することにより、細胞の配置、方向などを変更することができる。
【００５７】
発明の実施の形態３．
図６は、３次元ワイヤーフレームの他の構造例を示す斜視図である。図６に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０２は、格子上の複数のフレーム要素を備えており、全体として、ワイヤー５１が直方体状に組まれた立体格子状構造を有する。
図７を用いて、上記３次元ワイヤーフレーム５０２を用いた細胞組織の培養方法について説明する。図７は、この細胞組織の他の培養例を示す模式図である。まず、図７（ａ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０２上に単離した細胞６１２が播かれる。細胞６１２は、図７（ｂ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０２の形状に従い、シャーレ内で培養されて成長・増殖する。細胞６１２は、３次元ワイヤーフレーム５０２のワイヤー５１に沿うようにして成長・増殖し、個々の細胞６１２が３次元ワイヤーフレーム５０２上に配列される。細胞６１２は、その長手方向と３次元ワイヤーフレームのワイヤー５１の長手方向とがほぼ同じ方向となるように成長・増殖する。培養が進むと、図７（ｃ）に示すように、３次元ワイヤーフレーム５０２の形状とほぼ同じ形状を有する細胞組織６２２が、形成される。このとき、成長した個々の細胞６１２は、その形状及び配向を制御され、ワイヤー５１上に配置される。
【００５８】
このように、３次元ワイヤーフレーム５０２を立体格子状構造とすることにより、個々の細胞がほぼ同じ方向を向き、平面上に延在した生体組織を形成することが可能となる。また、３次元ワイヤーフレーム５０２は直方体形状の立体格子状構造を有するために平面状に延在した生体組織が形成されたが、これに限らず、３次元ワイヤーフレーム５０２に曲面をつけることによって個々の細胞がほぼ同じ方向を向く曲面状の生体組織を形成することができる。
【００５９】
発明の実施の形態４．
実施の形態４において、まず生体組織の培養に用いる３次元ワイヤーフレームの他の構造例について図８を用いて説明し、生体組織の培養について図９を用いて説明する。ここで、上記実施の形態１乃至実施の形態３においては、光硬化性樹脂１２１をワイヤー状に硬化したワイヤー５１により構成された３次元ワイヤーフレームを用いたが、本実施の形態４においては、樹脂内部に空間が形成された３次元フレームを用いる。図８（ａ）は、３次元フレームの他の構造例を示す斜視図である。図８（ｂ）及び図８（ｃ）は、図８（ａ）に示す３次元フレームのＡ−Ａ‘断面図及びＢ−Ｂ’断面図を示す。
【００６０】
図８に示す３次元フレーム５０３は、硬化された樹脂材料２２１の一部を、レーザ光を使用して削除、もしくは破壊することで加工し、形成することができる。樹脂材料２２１をレーザ光によって加工するための装置は、図１に示された装置に適切な変更を加えて実現することができる。例えば、レーザ加工に適したレーザ光源を使用し、図１に示した光学系と基本的に同様のシステムによって、加工装置を構成することができる。レーザ光源としては、チタンサファイアレーザなどのパルスレーザ光源を使用することができる。レーザ光のパルス幅は、好ましくは１０ナノ秒以下である。レーザ光による樹脂材料２２１の加工は、レーザ光を対物レンズによって樹脂２２１内部で集光させ、この集光部位の樹脂２２１を部分的に破壊することにより、樹脂２２１内部に穴をあけることができる。空間的に小さな領域であるレーザ光の集光部位の樹脂２２１を破壊して形成することができる。集光部における樹脂材料の破壊は、樹脂材料の多光子吸収を利用して行われる。多光子吸収を利用することによって、集光部のみでの樹脂材料の加工を行うことができる。３次元的な樹脂材料の加工は、レーザ光を３次元的に走査することにより、３次元フレーム５０３を形成することができる。３次元フレーム５０３を構成する樹脂材料２２１として、例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリグルコール酸、コポリマー、これらの混合物から構成される生体吸収ポリマーを用いることが好ましい。
【００６１】
図８（ａ）に示すように、３次元フレーム５０３は、樹脂材料２２１が部分的に除去され、複数の空洞である培養穴２２２が形成された構造を有する。すなわち、３次元フレーム５０３は、培養穴２２２が樹脂２２１中に離間した状態で形成されている構造を有する。そして、後述するように、この培養穴２２２の中で細胞が培養される。
【００６２】
図８（ｂ）に示すように、培養穴２２２の断面形状は、培養穴２２２間の樹脂２２１の幅、培養穴２２２の寸法などは、培養される細胞の種類、培養される細胞組織の大きさ、個々の細胞の大きさ、形状、数等に従って設計される。図８に示す培養穴２２２は、長手方向に対して垂直な断面形状が円形状であるが、これに限らず、楕円形状、多角形状等の種々の形状とすることができる。例えば、培養穴２２２の断面形状は、ラットの心筋細胞を培養する場合には、幅４０μｍ、高さ２０μｍの楕円形状となるように形成することができる。
【００６３】
図８（ｂ）に示すように、個々の培養穴２２２は、樹脂２２１により離間された状態で、ほぼ等間隔に形成されている。また、各培養穴２２２は、他の培養穴２２２により八方から囲まれるようにして密に配置されている。培養穴２２２は、これに限らず、ランダムな間隔で形成してもよいし、また培養穴２２２間の距離を空けて疎に形成してもよい。あるいは、複数の培養穴２２からなるパターンを繰り返して配置してもよい。
【００６４】
図８（ｃ）に示すように、培養穴２２２は、図８（ａ）において紙面表面から紙面裏面に直線状に延在し、それぞれが長手方向に関して平行に形成されている。培養穴２２２は、これに限らず、球状、立体格子状、球状、チューブ状、袋状等の様々な立体構造とすることができ、形成する生体組織の形状に応じて設計される。図８（ｃ）に示すように、３次元フレーム５０３には、複数の流路２２３が形成されている。この流路２２３は、培養穴２２２の長手方向に対して垂直に形成されており、各培養穴２２２を通って樹脂２２１表面の間を貫通している。また、流路２２３の形状、配置分布、寸法等は、培養される細胞の種類、大きさ、数等の培養される細胞によって定められ、細胞間を培養液が確実に流れるように形成される。この流路２２３は、細胞を培養する際、培養液を培養穴２２２内に引き入れ、培養穴２２２内の細胞に培養液を供給する。
【００６５】
図９は、この生体組織の他の培養例を示す模式図である。まず、３次元フレーム５０３上に単離した細胞６１３が播かれると、図９（ａ）及び図９（ｂ）に示すように細胞６１３が培養穴２２２内に入り込み、培養穴２２２内側面に付着する。細胞６１３は、図９（ｃ）及び図９（ｄ）に示すように、３次元フレーム５０３の形状に従い、シャーレ内などで培養される。細胞６１３は、３次元フレーム５０３の培養穴２２２の内側面に沿うようにして成長・増殖し、個々の細胞６１３が培養穴２２２内に配列する。細胞６１３は、その長手方向と３次元フレーム５０３の培養穴２２２の長手方向とがほぼ同じ方向となるように成長・増殖する。培養が進むと、図９（ｅ）及び図９（ｆ）に示すように、培養穴２２２の形状とほぼ同じ形状を有する、細胞組織６２３が形成される。成長した個々の細胞６１３は、形状及び配向が制御され、培養穴２２２内に配置される。また、３次元フレーム５０３の樹脂２２１が生体吸収性を有する場合、細胞６１３の成長後、３次元フレーム５０３が分解される。分解された樹脂２２１は、例えば、細胞６１３自身の作り出す細胞外気質となる。
【００６６】
このように、３次元フレーム５０３を樹脂２２１内部に培養穴２２２が形成された構造とすることにより、個々の細胞がほぼ同じ方向を向き、束となって直線状に延在する生体組織を形成することが可能となる。また、３次元フレーム５０３の培養穴２２２が直方状に延びた構造を有するために直線状に延在する生体組織が形成されたが、これに限らず、３次元フレーム５０３の培養穴２２２に曲面をつけることによって個々の細胞が束となってほぼ同じ方向を向く曲線状の生体組織を形成することができる。
【００６７】
本発明によれば、上記のように、３次元フレームを足場として細胞培養を行うことによって、細胞の形状、配向、配置を制御しつつ、細胞組織の形成を行うことができる。このように培養した細胞や生体組織の機能を、タンパク質の発現の様子を観察することで、生物学的な知見を得ることができる。例えば、細胞間コミュニケーションを担うタンパク質、や細胞接着、細胞骨格を形成するタンパク等、細胞や組織の形状と機能との関連について知見を得ることができる。あるいは、上記方法に従って人工的に構築した生体組織を医療目的に使用することが可能である。特に、生体内への機能する細胞組織の移植や臓器の再生、あるいは生態の機能を有するバイオマイクロマシンの構築に利用することができる。さらに、本発明の方法によって形成された細胞組織は、細胞の形態異常由来した疾患における研究において力を発揮する。形態異常とたんぱく質発現の関係を明らかにすることで、治療法や新薬の開発に利用することができる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、細胞の形状や細胞レベルでの配置・配向を制御して３次元的な細胞組織を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態におけるレーザ光造形装置の構成を示す模式図である。
【図２】本発明の実施の形態における３次元ワイヤーフレームの構造例を示す斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態における生体組織の培養例を示す模式図である。
【図４】本発明の実施の形態における３次元ワイヤーフレームの他の構造例を示す斜視図である。
【図５】本発明の実施の形態における生体組織の他の培養例を示す模式図である。
【図６】本発明の実施の形態における３次元ワイヤーフレームの他の構造例を示す斜視図である。
【図７】本発明の実施の形態における生体組織の他の培養例を示す模式図である。
【図８】本発明の実施の形態における３次元ワイヤーフレームの他の構造例を示す斜視図である。
【図９】本発明の実施の形態における生体組織の他の培養例を示す模式図である。
【符号の説明】
１００レーザ光造形装置、１０１レーザ光源、１０２アッテネータ、１０３ビームエキスパンダ、１０４、１０５レンズ、１０６ピンホール、１０７ミラー、１０８ガルバノスキャナー、１０９、１１０ガルバノメータミラー、１１１、１１２ミラー、１１３ビームエキスパンダ、１１４、１１５レンズ、１１６ λ／２板、１１７偏光ビームスプリッタ、１１８ミラー、１１９対物レンズ、１２０ピエゾ作動ステージ、１２１光硬化性樹脂、１２２ファイバー光源、１２３カラーフィルター、１２４イメージングレンズ、１２５ＣＣＤ、５０、５０１、５０２３次元ワイヤーフレーム、５０３３次元フレーム、２２１樹脂、２２２培養穴、５１ワイヤー、６１、６１１、６１２、６１３細胞、６２、６２１、６２２、６２３細胞組織

Claims

３次元細胞組織を形成する、細胞の培養方法であって、
レーザ光で光硬化性材料を硬化することによって作成された立体フレームを準備するステップと、
前記立体フレームに細胞を付着するステップと、
前記細胞を前記立体フレーム上で培養し、前記立体フレームによって、前記細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御することによって、前記３次元細胞組織を形成するステップと、を備える細胞の培養方法。
３次元細胞組織を形成する、細胞の培養方法であって、
レーザ光で樹脂材料を破壊することによって作成された立体フレームを準備するステップと、
前記立体フレームに細胞を付着するステップと、
前記細胞を前記立体フレーム上で培養することで、前記立体フレームによって、前記細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御することによって、前記３次元細胞組織を形成するステップと、を備える細胞の培養方法。
前記立体フレームは、生体吸収材料で形成されている、請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
前記立体フレームは、光硬化性ゼラチンもしくは光硬化性生体吸収性ポリマーで形成されている、請求項３に記載の細胞の培養方法。
前記立体フレームは、所定の間隔をおいて配置された複数のワイヤー部を備える、請求項１に記載の細胞の培養方法。
前記立体フレームは、前記樹脂材料内で所定の間隔をおいて配置された複数の空洞部を備える、請求項２に記載の細胞の培養方法。
前記細胞組織の各細胞は、前記ワイヤー部若しくは前記空洞部によって配列が制御される、請求項５又は６に記載の細胞の培養方法。
前記立体フレームを準備するステップは、レーザ光を前記光硬化性材料に集光するステップと、
前記レーザ光の集光点近傍において前記光硬化性材料の多光子吸収を引き起こし、前記光硬化性材料を硬化させるステップと、
前記集光点を３次元的に走査し、前記立体フレームを形成するステップと、を備える、請求項１に記載の細胞の培養方法。
前記立体フレームを準備するステップは、レーザ光を前記樹脂材料に集光するステップと、
前記レーザ光の集光点近傍において前記樹脂材料の多光子吸収を引き起こし、前記樹脂性材料を破壊させるステップと、
前記集光点を３次元的に走査し、前記立体フレームを形成するステップと、を備える、請求項２に記載の細胞の培養方法。
３次元細胞組織を形成するための細胞の培養に使用される立体フレームの形成方法であって、
レーザ光源からの光を光硬化性材料に集光するステップと、
前記レーザ光源からの光を前記光硬化性材料内で集光し、多光子吸収を引き起こすことによって、前記光硬化性材料を前記集光点で硬化するステップと、
前記レーザ光源からの光の前記集光点を、３次元的に前記光硬化性材料上を走査することによって、前記３次元細胞組織の細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御するような前記立体フレームを形成するステップと、を備える立体フレームの形成方法。
３次元細胞組織を形成するための細胞の培養に使用される立体フレームの形成方法であって、
レーザ光源からの光を樹脂材料に集光するステップと、
前記レーザ光源からの光を前記樹脂材料内で集光し、多光子吸収を引き起こすことによって、前記樹脂材料を前記集光点で破壊するステップと、
前記レーザ光源からの光の前記集光点を、３次元的に前記樹脂材料上を走査することによって、前記３次元細胞組織の細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御するような前記立体フレームを形成するステップと、を備える立体フレームの形成方法。
前記レーザ光源からの光は、フェムト秒パルスレーザ光である、請求項１０又は１１に記載の立体フレームの形成方法。
３次元細胞組織を形成するための細胞の培養装置であって、
培地と、
前記培地内に収容され、光硬化性材料上に集光された光を３次元的に走査することによって形成された、前記３次元細胞組織の各々の細胞の大きさを画定し形状と配列を制御することのできる立体フレームと、
を備え、前記立体フレーム上に付着された前記細胞を、前記立体フレーム上で培養し、
前記立体フレームによって、前記細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御することによって、前記３次元細胞組織を形成する、細胞の培養装置。
３次元細胞組織を形成するための細胞の培養装置であって、
培地と、
前記培地内に収容され、樹脂材料上に集光された光を３次元的に走査することによって前記樹脂材料を破壊することによって形成された、前記３次元細胞組織の各々の細胞の大きさを画定し形状と配列を制御することのできる立体フレームと、
を備え、前記立体フレーム上に付着された前記細胞を、前記立体フレーム上で培養し、
前記立体フレームによって、前記細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御することによって、前記３次元細胞組織を形成する、細胞の培養装置。
前記立体フレームは、所定の間隔をおいて配置された複数のワイヤー部を備え、前記細胞組織の各細胞は、前記ワイヤー部によって配列が制御される、請求項１３に記載の細胞の培養装置。
前記立体フレームは、前記樹脂材料内で所定の間隔をおいて配置された複数の空洞部を備え、前記細胞組織の各細胞は、前記空洞部によって配列が制御される、請求項１４に記載の細胞の培養装置。
前記立体フレームは、生体吸収材料で形成されている、請求項１３又は１４に記載の細胞の培養装置。
請求項１３又は１４に記載の培養装置によって形成された細胞組織。
３次元細胞組織を形成するための、細胞を培養する立体フレームであって、
樹脂材料に所定の間隔をおいて３次元的に配置された複数のワイヤー部を備え、
前記複数のワイヤー部によって前記３次元細胞組織の各細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御する、細胞を培養する立体フレーム。
３次元細胞組織を形成するための、細胞を培養する立体フレームであって、
樹脂材料に所定の間隔をおいて３次元的に配置された複数の空洞部を備え、
前記複数の空洞部によって前記３次元細胞組織の各細胞の大きさを画定し、前記細胞の各々の形状と配列を制御する、細胞を培養する立体フレーム。