PL188299B1 - Sposób osadzania komórek podłożo-zależnych na powierzchni membran kapilarnych - Google Patents

Abstract

1. Sposób osadzania komórek podlozo-zaleznych na membranach kapilarnych, pole- gajacy na wprowadzeniu medium z zawieszonymi komórkami do kompartmentu komór- kowego bioreaktora i wywolaniu przeplywu tego medium prostopadle do powierzchni membran, znamienny tym, ze medium hodowlane z zawieszonymi komórkami wprowadza sie do kompartmentu komórkowego bioreaktora i powoduje przeplyw tego medium przez sciane membrany kapilarnej w kierunku od kompartmentu komórkowego do centralnego, przy róznicy cisnien od 50 mmHg do 500 mmHg, najkorzystniej okolo 150 mmHg, przy czym przeplyw medium utrzymywany jest przez czas niezbedny dla zwiazania danego typu komórek z powierzchnia membran, korzystnie przez okolo 60 minut. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest metoda szybkiego i skutecznego osadzania komórek na powierzchni membran kapilarnych, poprawiająca ich przeżywalność oraz umożliwiająca prowadzenie długotrwałej hodowli z utrzymaniem pierwotnych funkcji metabolicznych.

Szybkie i skuteczne osadzanie komórek na powierzchni membran stanowi problem w hodowli zróżnicowanych komórek zależnych od podłoża, w szczególności prowadzonej na powierzchni membran w bioreaktorach wyposażonych w membrany kapilarne (typu holów fiber).

W celu zagwarantowania właściwych funkcji biologicznych komórki podłożo-zależne muszą kontaktować się ze stałym podłożem, na którym organizują się strukturalnie. Przy braku kontaktu komórki takie zróżnicowane tracą swoje charakterystyczne funkcje, ulegają rewersji lub zamierają.

W celu wspomagania funkcji uszkodzonej wątroby u pacjentów oczekujących na przeszczep lub leczonych objawowo przy ostrej niewydolności dużej masy narządu, rozważa się możliwość zastosowania bioreaktora wątrobowego włączanego w system krążenia pozaustrojowego pacjenta. W powyższym znaczeniu bioreaktor wątrobowy jest urządzeniem biotechnologicznym, w skład którego wchodzą żywe parenchymalne komórki wątroby (hepatocyty) zdolne przejąć niektóre funkcje naturalnego narządu. Bioreaktor wątrobowy musi zatem zapewniać prawidłową funkcję umieszczonych w nim komórek w zadanym okresie czasu. Prawidłowa funkcja hepatocytów oznacza z kolei, iż komórki wykazują przynajmniej niektóre cechy fizjologiczne hepatocytów znajdujących się w naturalnym narządzie, przy czym o jakości bioreaktora wątrobowego świadczy zarówno stopień podobieństwa pracy komórek umieszczonych w bioreaktorze z funkcjonowaniem komórek w zdrowym narządzie, jak też skuteczność poprawy zdrowia pacjentów.

Praktyczne stosowanie bioreaktora wątrobowego wymaga, aby jego konstrukcja umożliwiała wykorzystanie procesów fizjologicznych zachodzących w hepatocytach, przy czym w przypadku podłączenia bioreaktora w linię krążenia pozaustrojowego wymagana jest izolacja immunologiczna kompartmentu komórkowego bioreaktora i krwi pacjenta. W takim ujęciu istota bioreaktora wątrobowego polega na stworzeniu odpowiednich warunków dla

188 299 funkcjonowania hepatocytów w kompartmencie oddzielonym (immunoizolowanym) od kompartmentu, w którym przepływa krew lub medium odżywcze.

Oprócz wspomagania funkcji uszkodzonej wątroby bioreaktory wątrobowe zbudowane w oparciu o półprzepuszczalne membrany kapilarne uważane są za najlepsze rozwiązania także w zakresie sposobu hodowli hepatocytów. Membrana kapilarna stanowi wówczas barierę półprzepuszczalną rozdzielającą kompartmenty z komórkami od kompartmentu, w którym płynie medium odżywcze (kompartment centralny). Wymianie składników między kompartmentem komórkowym a kompartmentem centralnym, będącej istotą funkcjonowania bioreaktora wątrobowego, sprzyja ścisły kontakt hepatocytów z powierzchnią membrany.

Hepatocyty należą do klasy komórek podłożo-zależnych, a więc do właściwego funkcjonowania wymagają kontaktu z podłożem stałym. Taki kontakt z podłożem umożliwia polaryzację komórek i odzyskanie istotnych biologicznie funkcji traconych podczas izolacji w wyniku utraty domen receptorowych z powierzchni błony komórkowej. Dlatego w bioreaktorach wątrobowych z membranami kapilarnymi membrana pełni dodatkową funkcję podłoża dla organizowania się hepatocytów.

Hepatocyty mogą być hodowane zarówno na powierzchni zewnętrznej, jak wewnątrz półprzepuszczalnych membran kapilarnych, jednak ze względu na dążenie do uzyskania podobieństwa w architekturze bioreaktora wątrobowego z naturalną wątrobą oraz w celu łatwiejszego rozwiązania problemu przepływu krwi przez bioreaktor, układ w którym hepatocyty znajdują się na zewnątrz membrany a wewnątrz przepływa medium (krew) wydaje się najlepszym rozwiązaniem (Knazec R.A., et al., Celi culture on artificial capillaries: an approach to tissue growth in vitro., Science 178. (1972), 65-67).

Przedstawione powyżej wymagania dotyczące hepatocytów wskazują, iż niezwykle istotnym problemem hodowli hepatocytów w bioreaktorze kapilarnym jest wstępna faza hodowli związana z immobilizacją (osadzaniem) komórek na powierzchni membran. Dowiedziono, iż szybkość osadzania oraz skuteczność tego procesu decyduje o przywróceniu właściwej aktywności biologicznej świeżo izolowanych komórek, poprawia ich przeżywalność oraz umożliwia prowadzenie długotrwałej hodowli z utrzymaniem pierwotnych funkcji metabolicznych.

Szybkość osadzania wyznacza czas między wprowadzeniem komórek do hodowli, a na tyle trwałym ich przylgnięciem do podłoża, iż nie odlepiają się one pod wpływem siły grawitacji. Okres ten powinien być jak najkrótszy. W przypadku hepatocytów szczura swobodnie osiadających na powierzchni sprzyjającej adhezji komórek wymagany jest czas około 60 min., aby zakończyć proces aktywnej organizacji komórek. W przypadku hepatocytów kozy lub świni okres ten wydłuża się do 4 godzin. Z drugiej strony hepatocyty znajdujące się w zawiesinie zachowują swoje pierwotne funkcje w zasadzie tylko przez 60 min inkubacji bez względu na pochodzenie gatunkowe komórek. Jeśli w powyższym okresie nie dojdzie do kontaktu z podłożem, komórki stopniowo zatracają niektóre właściwości metaboliczne a po 6 godzinach istotnie spada ich żywotność.

Powyższe dane jednoznacznie wskazują, iż należy dążyć do tego, aby hepatocyty aktywnie organizowały się na powierzchni membran w okresie do 60 min wstępnej inkubacji.

Problem skuteczności osadzania związany jest z warunkami transportu substancji odżywczych i metabolitów pomiędzy kompartmentem komórkowym a krwią. Adhezje uznaje się za skuteczną, jeśli po jej zakończeniu istnieje odpowiednia wymiana dyfuzyjna poprzez ścianę membrany kapilarnej. Sprzyjające wymianie substancji warunki zapewnia z reguły struktura membrany oraz ścisły kontakt komórek z jej powierzchnią. Wykazano, iż hepatocyty zbyt oddalone od membrany oddzielającej je od medium odżywczego, stają się metabolicznie nieaktywne lub zamierają z braku substancji odżywczych, a w szczególności z braku tlenu.

W celu immobilizacji komórek na membranach kapilarnych, we wczesnej fazie hodowli, oprócz szerokich modyfikacji medium odżywczego, zaopatrywanego w czynniki promujące adhezję komórek, stosowane są inne sposoby postępowania, takie jak:

1. Obracanie biore aktora kapilarnego, zwyklz o 180° co 30 mino ^w celu umożliwienia kontaktu jak największej liczbie komórek z powierzchnią membrany. Heentobyty opadają tutaj biernie na powierzchnię membrany, a następnie przyczepiają się dzięki okresowi

188 299 spoczynku w rotacji bioreaktora (Gerlach J.C,, Development of hybrid artificial liver support system: a review, Int. Artif. Organs, 77. (1994), 301). Metoda ta pozwala na uruchomienie hodowli, jednak duża liczba hepatocytów nie kontaktuje się z podłożem membran, opada na dno modułu lub pozostaje w zawiesinie tracąc swoją aktywność. Dodatkowo komórki stosunkowo późno organizują się na powierzchni membran, co w efekcie obniża wydajność bioreaktora. Metoda jest niepowtarzalna i utrudnia osiągnięcie niezbędnej masy funkcjonujących komórek dla zastosowań klinicznych.

2. Unieruchomienie komórek na powierzchni membran kapilarnych przy pomocy substancji pomocniczej o właściwościach lepiszcza (kolagen, agar-agar). Taki sposób immobilizacji pozwala na umieszczenie komórek zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz membrany kapilarnej. Wadą tej metody jest to, iż komórki faktycznie pozostają w otoczce substancji wiążącej, nie kontaktują się bezpośrednio z membraną, przy czym warstwa otaczająca komórkę wydłuża jednocześnie niekorzystnie drogę dla dyfuzji substancji odżywczych od komórki do medium (Nyberg S. L.. Bioreactor device with application as a bioartificial liver, US Patent:, 5,605,835; Nyberg S.L, Evaluation of a hepatocyteentrapment hollow fiber bioreactor.a potential bioartificial liver, Biotechnology and Bioengineering, vol41_, (1993), 194-203).

3. Zapewnienie właściwych warunków adhezji komórek przed umieszczeniem ich w module bioreaktora. Immobilizację przeprowadza się na powierzchni nośników (odpowiednio przygotowane polimery w postaci mikrosfer) lub zamykając komórki w formie konglomeratów wewnątrz kapsułek membranowych umożliwiających wymianę dyfuzyjną (żelatynowe, agarowe, polimerowe). Tak przygotowane komórki wprowadza się do kompartmentu komórkowego bioreaktora w momencie, gdy hepatocyty podjęły już funkcje życiowe. W tym rozwiązaniu najwięcej wątpliwości budzi kwestia złożonej drogi transportu substancji odżywczych i metabolitów z kompartmentu centralnego do kompartmentu komórkowego. Rozwiązania te wymagają z reguły wprowadzenia dodatkowego strumienia medium odżywczego przez kompartment komórkowy.

Wszystkie wskazane systemy nie rozwiązują, w pełni opisanego uprzednio problemu szybkiego i skutecznego umieszczenia hepatocytów na powierzchni membrany kapilarnej w bioreaktorze wątrobowym.

Nieoczekiwanie okazało się, że przy zastosowaniu sposobu według wynalazku możliwe jest skuteczne umieszczenie hepatocytów na całej dostępnej powierzchni membran kapilarnych modułu bioreaktora, niezależnie od jego konstrukcji. Uzyskuje się to poprzez wytworzenie niewielkiego strumienia medium z zawieszonymi w nim komórkami w kierunku prostopadłym do powierzchni membrany i utrzymywanie go przez czas niezbędny do aktywnego związania komórek z powierzchnią oraz podjęcia przez nie funkcji życiowych.

Sposób według wynalazku polega na tym, że komórki podłożo-zależne zawieszone w medium odżywczym, wprowadza się grawitacyjnie, do przestrzeni na zewnątrz membran kapilarnych w module bioreaktora, zwanej kompartmentem komórkowym, następnie wywołuje się różnicę ciśnień transmembranowych w ten sposób, iż w kompartmencie komórkowym wytwarza się ciśnienie wyższe, niż w kompartmencie centralnym, przy czym różnica ciśnień wynosi korzystnie od 50 mm Hg do 500 mm Hg, najkorzystniej około 150 mm Hg, a przepływ medium utrzymywany jest przez czas niezbędny dla związania danego typu komórek z powierzchnią membran, korzystnie 60 min.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się medium hodowlane wzbogacone o substancje promujące adhezję komórek.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, stosuje się membrany kapilarne posiadające powierzchnię zawierającą czynniki wspomagające adhezję komórek, wprowadzone do niej zarówno w procesie formowania membrany jak i w procesie przygotowywania bioreaktora do hodowli komórkowej.

Dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku, przez wprowadzenie strumienia medium skierowanego prostopadle do wnętrza kapilar, który porywa komórki i utrzymuje je na całej dostępnej dla wymiany transmembranowej powierzchni membran kapilarnych, przez czas niezbędny do ich aktywnego związania z powierzchnią membrany i podjęcia funkcji

188 299 życiowych, tj. przez okres od 30 do 60 minut, możliwe jest uruchomienie hodowli z największą możliwą liczbą komórek.

Najkorzystniej jest przeprowadzić taką procedurę z wykorzystaniem odpowiedniego medium zawierającego substancje promujące przywieranie komórek do powierzchni, przy czym uruchomienie hodowli hepatocytów przy pomocy proponowanej metody jest szczególnie skuteczne, gdy membrana posiada specyficzne własności powierzchniowe lub strukturę promującą adhezję komórek.

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku, nie ograniczający jego zakresu.

P r z y k ł a d.

W eksperymencie wykorzystano moduł bioreaktora wykonany z obudowy sporządzonej z kopolimeru akrylowo-styrenowego o długości 150 mm, średnicy wewnętrznej 20 mm. Moduł wyposażony jest w 2 porty boczne i 2 centralne. Wewnątrz obudowy znajdują się membrany kapilarne wykonane z polisulfonu, łączące porty centralne. Membrany charakteryzują się następującymi parametrami: grubość ściany 80 μιη, średnica wewnętrzna kapilary 350 pm, punkt odcięcia molekularnego 300 kD, przepuszczalność dyfuzyjna 0,07 cm/min, całkowita powierzchnia wymiany wszystkich membran umieszczonych w module powierzchnia wymiany wszystkich membran umieszczonych w module 0,12 m². Doświadczenie wykonano na świeżo izolowanych hepatocytach pochodzących z wątroby szczepu Wistar. Izolację prowadzono metodą dwustopniowej perfuzji, w wyniku której otrzymywano około 8-10 ⁹ komórek/wątrobę o przeżywalności w granicach 75-90%. Komórki zawieszono w medium William E, a następnie zawiesinę stopniowo wprowadzano do kompartmentu komórkowego modułu bioreaktora wątrobowego w ilości 4-10⁹ komórek w 100 cm³ medium. W celu szybkiego i skutecznego osadzenia hepatocytów na powierzchni membrany kapilarnej prowadzono cyrkulację medium z zawiesiną hepatocytów w układzie zamkniętym w kierunku od kompartmentu komórkowego do centralnego, poprzez ściany membran (przepływ radialny) z szybkością 10 ml/min Hepatocyty poprzez porty boczne gradientowe przedostawały się do przestrzeni pozakapilarnej modułu (kompartmentu komórkowego) i aktywnie były osadzane na powierzchni czynnej membran kapilarnych.

W czasie osadzania badano aktywność metaboliczną komórek. Po 20 minutach cyrkulacji medium z hepatocytami stawało się klarowne, co świadczy o tym, iż komórki znalazły się wewnątrz modułu. Po 60 minutach zakończono cyrkulację radialną, zamykano porty boczne i rozpoczynano perfuzję bioreaktora wątrobowego poprzez światło kapilar. W sześciogodzinnym eksperymencie oznaczano aktywność metaboliczną komórek i ich żywotność.

188 299

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2.00 zł.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób osadzania komórek podłożo-zależnych na membranach kapilarnych, polegający na wprowadzeniu medium z zawieszonymi komórkami do kompartmentu komórkowego bioreaktora i wywołaniu przepływu tego medium prostopadle do powierzchni membran, znamienny tym, że medium hodowlane z zawieszonymi komórkami wprowadza się do kompartmentu komórkowego bioreaktora i powoduje przepływ tego medium przez ścianę membrany kapilarnej w kierunku od kompartmentu komórkowego do centralnego, przy różnicy ciśnień od 50 mmHg do 500 mmHg, najkorzystniej około 150 mmHg, przy czym przepływ medium utrzymywany jest przez czas niezbędny dla związania danego typu komórek z powierzchnią membran, korzystnie przez około 60 minut.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się medium hodowlane wzbogacone o substancje promujące adhezję komórek.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się membrany kapilarne posiadające powierzchnię zawierającą czynniki wspomagające adhezję komórek, wprowadzone do niej zarówno w procesie formowania membrany jak i w procesie przygotowywania bioreaktora do hodowli komórkowej.