JPH01120278A

JPH01120278A - 細胞培養方法およびその装置

Info

Publication number: JPH01120278A
Application number: JP62278042A
Authority: JP
Inventors: Katsutoshi Yoshizato; 勝利吉里; Ayako Makino; 綾子牧野; Takeo Katakura; 片倉　健男; Yuichi Mori; 有一森
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1987-11-02
Publication date: 1989-05-12
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: JP2619885B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は細胞培養装置および細胞培養方法に関する。よ
り具体的には、繊維芽細胞、平滑筋細胞あるいは脳細胞
等の間質系細胞や、肝細胞、肝細胞、神経細胞、内皮細
胞、上皮細胞等の付着依存性細胞、及びリンパ球、顆粒
球、胆球等の血液細胞を効率良く培養するための高密度
培養に係る。

〔従来の技術〕

細胞の大量培養法として従来量も一般的に行なわれてい
るのは、浮遊培養法である。この方法では、培養細胞を
培地溶液中に浮遊させて攪拌しながら培養する。しかし
、既述の高機能細胞は付着依存性が強いため、浮遊培養
法を適用しても細胞は培養容器の内面に付着して浮遊せ
ず、所期の培養効率が得られない。そこで、これら高機
能細胞に対する浮遊培養法の適用に際して適当なビーズ
を担体に用い、該ビーズ表面に細胞を付着させた状態で
培地中に浮遊させる手段が用いられている。

ところが、上記浮遊培養法では攪拌や暴気操作を必要と
し、生活環境が乱されるため細胞の活性低下を生じる欠
点がある。また、培地を回収して再利用したり、その中
に含まれる有用成分を単離するためには、細胞と培地を
分離するために遠心分離等の複雑な操作を必要とする欠
点がある。

上記の浮遊培養法の他、動物細胞の大量培養法としては
分離膜表面での培養法が行なわれている。

例えば、中空型物質交換装置における中空糸外面での細
胞培養が報告されている（Ｋｎａｚｅｋ　Ｒ，Ａ、　ｅ
ｔａｌ　；　Ｃｅ１ｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｎ　ａｒｔ
ｉｆ’１ｃｉａｌ　ｃａｐｌｌｌａｒｉｅｓ。

Ａｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏ
ｗｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、；５ＣＩＥＮＣＥ、ｖｏｌ
、１７ｇ、６５．１９７２　　）　、しかし、この方法
では分離膜表面を細胞の付着場所としているため、分離
膜の表面積がそのまま培養可能な有効面積となる。この
ため、大量培養のためには大きな膜面積が（例えば中空
糸の本数増加）が必要となり、装置が大がかりなものに
なってしまう欠点がある。

また、細胞活性を高く維持したままで高密度の。

培養が可能な方法として、コラーゲンゲル内での培養が
知られている。コラーゲンは生体内に豊富に存在する細
胞間物質で、その細胞生着に対する適性については既に
種々の確認がなされており、細胞培養基質として市販さ
れるに至っている。更に、コラーゲンのゲル内に細胞を
封入して培養を行なうと三次元的な立体培養が行なわれ
、且つ細胞の機能亢進が認められることが報告されてい
る（例えば、榎並淳平「マウス乳癌上皮細胞、乳癌細部
のコラーゲン・ゲル培養」、組織培養研究ｖｏ１．４．
　ｎｏ、１．　ｐ７８．１９８５）　ｏ従って、この方
法によれば活性を高く維持したまま細胞密度を高めるこ
とが可能となる。

しかし、このゲル内培養においては、細胞への栄養補給
並びに細胞から分泌された代謝産物の排出が何れもゲル
内の物質拡散により行なわれるため、物質代謝の効率が
悪い問題がある。また、ゲルの厚さが増大すると、栄養
補給および代謝産物の速度が低下して培養効率が悪くな
る問題がある。

このため、長期に亙る安定な大量培養には適さない問題
がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記事情に鑑み本発明が達成しようとする課題は、付着
依存性の強い高機能細胞を、細胞活性を低下することな
く、長期に亙って安定かつ高密度で大量培養できる高効
率の培養装置および培養方法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の課題を達成するために本発明が提供する培養装置
は、物質交換膜により隔てられた第一室および第二室と
、前記第一室に封入された培養すべき細胞、コラーゲン
ゲル及び培地と、前記第二室に満たされた潅流液と、該
潅流液を交換するために前記第二室に設けられた潅流液
交換口とを具備したことを特徴とするものである。

また、本発明による細胞培養方法は、培養すべき細胞を
培地およびコラーゲンゲルと混合して混合液を調製する
工程と、得られた混合液を物質交換膜で囲まれた培養室
内に封入する工程と、該培養室の外側に潅流液を循環さ
せることにより、培養に必要な物質を前記物質交換膜を
通して前記培養室内に導入すると共に、前記細胞から分
泌された代謝産物を前記物質交換膜を通して潅流液中に
取出す工程とを具備したことを特徴とするものである。

〔作用〕

以下、必要な作用説明を含めて本発明の詳細な説明する
。

本発明において、培養すべき細胞をコラーゲンゲルと共
に細胞室に封入すると、細胞が封入された比較的薄くて
均一なコラーゲンゲル層が形成される。即ち、本発明で
はコラーゲンゲル内で細胞の立体培養が行なわれること
になる。従って、三次元培養による高密度の培養が行な
われ、且つ細胞の機能亢進が誘導される。しかも、本願
発明における培養環境は、物質交換膜を新鮮な潅流液と
接触している。従って、培養環境と潅流液との間には膜
中の細孔を通して活発な物質交換が行なわれ、細胞への
栄養補給および細胞から分泌ぎれる老廃物等の除去が迅
速かつ効率よく行なわれる。

このため、長期間培養しても培養効率は低下せず、安定
な大量培養が可能となる。

本願発明における物質交換膜としては、透析膜、濾過膜
等を用いることができる。物質交換膜の最も重要な要素
は膜を貫通する細孔の孔径である。

その下限は所望の物質が透過し得る大きさであり、また
上限は封入された細胞が漏出しない大きさである。具体
的には、約５Å〜１−程度である。

本発明においては、人工腎臓あるいは人工肺として既に
実用化されている物質交換装置を好適に利用することが
できる。これらの物質交換装置は、中空糸型と平膜型と
に大別されるが、その何れを用いてもよい。

第１図は、中空糸型物質交換装置の外観を示す図である
。同図において、１は円筒状のハウジングである。ハウ
ジング１の両開口端には、下部蓋体２および上部蓋体３
が螺着されている。下部蓋体２には血液導入口４が、上
部蓋対には血液導出口５が夫々設けられている。また、
ハウジング１には透析液または酸素源ガスの入口６およ
び出ロアが設けられている。更に、ハウジング１の内部
には多孔質ポリマーか−らなる中空糸（図示せず）が多
数配設されている。これら中空糸の下端は一つに纏めら
れて血液導入口４に連通され、上端は同様にして血液導
出口５に連通されている。ハウジング１の内部で且つ中
空糸の外側の空隙（ハウジング空間）は、ハイジング１
に設けた入口６および出ロアに連通している。例えば人
工腎臓の場合、中空糸内部を通して患者の血液を循環さ
せると共に、透析液をハウジング空間に循環させる。

これにより、血液中に含まれる尿素等の老廃物が中空糸
を構成する物質交換膜を介して透析される。

人工肺として用いる場合には、透析液の代りに酸素濃度
の高いガスをハウジング空間内に循環させ、血液中の炭
酸ガスとの間でガス交換を行なわせる。

上記の中空糸型物質交換装置を用いて本発明を実施する
場合には、培養すべき細胞を適当な培地およびコラーゲ
ンゲルと混合し、これを血液導入口４から中空糸内部に
圧入して封入する。次いで、潅流液を入口６および出ロ
アからハウジング空間内に循環させる。第１図（Ｂ）は
、このときの中空糸の状態を拡大して示している。同図
において、８は中空糸を構成する多孔質膜である。実用
されている中空糸の孔径は約２００ｐ前後で、膜を貫通
する細孔の孔径は２０Å〜０．６趨程度である。中空糸
の内部にはコラーゲンゲル９が充填され、その中に培養
さるべき細胞１０が分散されている。中空糸の外側の矢
印は、ハウジング空間中の潅流液の流れを示している。

この潅流液と中空糸内部の培養環境との間には、図中矢
印で示すように培養に必要な物質交換が行なわれ、培養
効率を高める。

平膜型の人工腎臓等では、中空糸の代りに、第２図（Ａ
）に示すような平膜フィルター１１が用いられる。第２
図（Ｂ）は、平膜フィルター１１の一部断面を拡大して
示している。平膜フィルター１１の平面形状は、中央に
貫通孔１２を有するドーナツ状になっている。この平膜
フィルターは、二枚の多孔質ポリマー膜１３．１４の間
に目の粗い織布１５を挟み込み、内周および外周をヒー
トシール部１６．１７で封着して構成されている。

目の粗い織布１５は、多孔質ポリマー膜１３゜１４の間
に流体通路となる間隙を保持する隙間保持材としての機
能を有している。また、血液をフィルター内部の流体通
路内に循環させるために、二つの貫通孔１８．１９が設
けられている。この平膜フィルター１１を、適当なハウ
ジング内に多数収納することにより、フィルター内部の
流体流路からなる血液循環路が形成され、またフィルタ
ーの外側には透析液等を循環させるハウジング空間が形
成される。この平膜型物質交換装置の場合にも、平膜フ
ィルター１１の内部を培養室として用いることにより、
中空糸型物質交換装置の場合と同様にして本発明を実施
することができる。

本発明において、コラーゲンゲルとしては一般に市販さ
れているものを使用できる。−例としては、アテロコラ
ーゲン（高研株式会社製）が挙げられる。

本発明における潅流液としては、対象となる細胞の培養
に適した培地を用いることができる。

例えば、下記組成のグリーン氏培地（Ｒｈｅｉｎｗａｌ
ｄＪ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｈ，、Ｃｅ１ｌ　ｖ
ｏｌ、８．３８１〜Ｈ４，（１９７５））が挙げられる
。

Ｄ　Ｅ　　　　　　　　　　　　８７．５％Ｈａａ＋　
Ｆ−１２２２，５％Ｐｅｔａｌ　Ｃａ１ｆ’　５ｅｒｕｎ＋　　　　　　１
０　　％ハイドロコーチシン　　　　　０．４ｔｔ’ｊ
／ｖｔｌインスリン　　　　　　　　５　μｇ／ｍＪ！
トランスフェリン　　　　　５　μ’；ｉ／ｍ１Ｔ３　
　　　　　　　　　　２×１０９　Ｍコレラトキシン　
　　　　　１０−”Ｍアデニン　　　　　　　　　　８
Ｘ１０−４　　ＭＥｐｌｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒ　　１０ｎｇ／ｒ！ＩＩ！ペニシリンＧ　
　　　　　　　１００　単位／ｒＩｌｉストリプトマイ
シ＞　　　　　１１００ｎ　／、ｒｔｔ１重ソウ　　　
　　　　　　　　１０　ｍａｌ−Ｈｅｐｅｓ　　　　　
　　　　　　２０　ａＭ但し、ｒＤＥＪはＤｕｌｂｅｃ
ｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆ’ｌｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄ
ｌｕｍ、　　ｒ　Ｈａｍ　Ｐ−１２ＪはＮｕｔｒｉｅｎ
ｔｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ−１２を表わす。

潅流液を循環させて使用する場合には、循環路中にガス
交換装置を設けて潅流液に酸素を補給するのが望ましい
。

本発明によれば、各種臓器等の高機能細胞を活性低下を
伴うことなく高密度で培養できるため、例えば人工肝臓
等のような人工臓器としての応用が期待される。即ち、
上述した方法で肝細胞を物質交換装置内に高密度に培養
した後、潅流液の代りに血液をハウジング空間内に循環
させれば、血液中の有毒物質を肝細胞に代謝分解させて
解毒を行なうことができる。同様に、人工内分泌機腺等
としての応用にも期待がもたれる。

〔実施例〕

以下に、本発明の効果を実証するために行なった実施例
および比較例を説明する。

実施例Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　ｒａｔ　　（雄、５〜
８週令）からＳｅｇｌｅｎの方法に準じて分離した肝細
胞４，４×１０６ｃｅｌｌｓを、４℃に冷却したグリー
ン氏培地およびアテロコラーゲンと混合することにより
、アテロコラーゲン濃度０．２％の混合液５０ｍｊｌ！
を調製した。これを中空糸型物質交換装置の中空糸内に
充填した。中空糸型物質交換装置としては、テルモ株式
会社製の模型人工肺（商品名「キャビオックス■−０８
」）の熱交換部分を取除いたガス交換部分を用いた。こ
の物質交換装置は、約１３．０００本のポリプロピレン
製中空糸（内径２００４．有効長１２．５ｃＩＩ）で構
成されている。

次いで、第３図に示す装置を組みたてて培養を行なった
。同図において、２１は上記のようにしてコラーゲンゲ
ル中に分散した肝細胞を充填した中空糸型物質交換装置
である。この゛物質交換装置のハウジング空間に、ポン
プ２２を用いて液容器２３に満たしたグリーン氏培地を
潅流した。また、潅流液の酸素分圧を高めるために循環
路の途中にガス交換器２４を設け、潅流液に酸素を供給
した。

ガス交換器２４には既述したのと同じ中空糸型物質交換
装置である。その中空糸内部に潅流液を循環させると共
に、混合ガス（４０％０２＋５５％Ｎ２＋　５％ｃｏ２
）をハウジング空間に循環させることにより酸素供給を
行なった。なお、培養温度は３７℃とした。

７日間培養した後に細胞の状態を観察したところ、ゲル
内のいたる所で細胞の活発な伸展が認められた。

比較例実施例と同様にして肝細胞４．４Ｘ　１．０５ｃｅｌｌ
ｓを含む混合液を調製し、この５ｇを直径３５＋ｕ＋の
プラスチックシャーレに分注した。３７℃のインキュベ
ータ中に収納し、５０％０２＋４５％Ｎ２＋５％ＣＯ２
のガス雰囲気下に培養を行なった。

培養７８目に細胞の状態を観察したところ、ゲルの表面
では細胞の活発な伸展が認められたが、ゲル中央部では
死滅細胞が多数認められた。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明によれば付着依存性の強い
高機能細胞を、細胞活性を低下することなく、長期に亙
って安定かつ高密度で大量培養できる。また、本発明は
培養細胞による人エル・ス器の可能性にも途を拓く等、
顕著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）は本発明の実施に好適に使用できたときの
培養状態を拡大して示す断面図、第２図（Ａ）は本発明
の実施に好適に使用できる平膜型物質交換装置の平膜フ
ィルターを示す平面図であり、第２図（Ｂ）はその一部
を拡大して示す断面図、第３図は本発明の一実施例を示
す説明図である。１・・・ハウジング、２，３・・・蓋体、４・・・血液
導入口、５・・・血液導出口、６・・・ハウジング空間
入口、７・・・ハウジング空間出口、８・・・多孔質ポ
リマーの中空糸、９・・・コラーゲンゲル、１０・・・
細胞、１１・・・平膜フィルター、１２・・・中央孔、
１３．１４・・・多孔質ポリマー膜、１５・・・隙間保
持部材、１６゜１７・・・ヒートシール部、１８．１９
・・・貫通孔、２１・・・細胞培養器、２２・・・ポン
プ、２３・・・潅流液容器、２４・・・ガス交換器出願人代理人　弁理士　鈴江武彦（ａ）　　　　　　　　　　　（ｂ）第１図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）培養すべき細胞を培地およびコラーゲンゲルと混
合して混合液を調製する工程と、得られた混合液を物質
交換膜で囲まれた培養室内に封入する工程と、該培養室
の外側に潅流液を循環させることにより、培養に必要な
物質を前記物質交換膜を通して前記培養室内に導入する
と共に、前記細胞から分泌された代謝産物を前記物質交
換膜を通して潅流液中に取出す工程とを具備したことを
特徴とする細胞培養方法。
（２）前記潅流液を循環させるに際し、潅流液中に酸素
を供給するようにしたことを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の細胞培養方法。
（３）物質交換膜により隔てられた第一室および第二室
と、前記第一室に封入された培養すべき細胞、コラーゲ
ンゲル及び培地と、前記第二室に満たされた潅流液と、
該潅流液を交換するために前記第二室に設けられた潅流
液交換口とを具備したことを特徴とする細胞培養装置。
（４）前記物質交換膜が、孔径５Å〜１μｍの貫通孔を
有する多孔質膜であることを特徴とする特許請求の範囲
第３項に記載の細胞培養装置。
（５）前記第一室が物質交換膜で形成された中空糸の内
部または外部であることを特徴とする特許請求の範囲第
３項に記載の細胞培養装置。
（６）前記第一室が二枚の物質交換膜を重ね合せてその
周縁をシールした平膜フィルターの内部または外部であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の細胞
培養装置。
（７）前記物質交換膜が、孔径２０Å〜０．６μｍの細
孔を有する多孔質ポリマー膜であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項または第６項に記載の細胞培養装置
。
（８）前記第二室には潅流液の入口および出口が設けら
れ、この入口および出口を介して潅流液が第二室の内部
と外部循環路との間を循環するようにしたことを特徴と
する特許請求の範囲第３項〜第７項の何れか１項に記載
の細胞培養装置。
（９）前記潅流液が循環される外部循環路に、酸素を潅
流液中に供給するためのガス交換器を設けたことを特徴
とする特許請求の範囲第８項に記載の細胞培養装置。