JP2022103120A - 細胞培養部材及びその表面改質方法 - Google Patents

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Abstract

Figure 2022103120000001
【課題】優れた細胞培養性能、及びその長期安定性を備えた細胞培養部材及びその表面改質方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る細胞培養部材は、少なくとも接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材であって、前記保持領域の少なくとも一部は、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域であることを特徴とし、接着性細胞の表面改質領域に対する接着性を向上させ、接着性の経時劣化を抑制し、細胞培養性能とその長期安定性に優れた細胞培養部材を提供することができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞培養部材及びその表面改質方法に関し、より詳細には、優れた細胞培養性能、及びその長期安定性を有する細胞培養部材及びその表面改質方法に関する。
細胞培養の技術は、生化学的現象の解明、有用物質の生産、再生医療、及び薬剤評価等、様々な分野での研究等に利用されている。細胞培養の技術のうち、細胞培養容器に於いては、感染・汚染等に対する認識の高まりと、成形性及び製造コストとの観点から、熱可塑性樹脂からなる高分子化合物をその材料に用いるのが一般的である。細胞培養容器の形状や物性は、各種用途での研究等の効率性や分析精度等に大きな影響を及ぼす。
特に、接着性細胞（ガン細胞や造血細胞等の一部の細胞を除いた、哺乳動物に於ける全ての細胞）を用いた研究等では、当該接着性細胞と細胞培養容器との接着性が、細胞増殖効率や生理活性維持にとって重要になる。しかし、前記熱可塑性樹脂を使用した細胞培養容器のほとんどに於いて、その表面が疎水性であるため、接着性細胞の接着性が悪く、接着性細胞の細胞活性が著しく阻害されるという問題がある。
この様な問題に対し、例えば、特許文献１では、細胞又は生体分子をポリプロピレン基板上に堆積又は固定化させるために、当該ポリプロピレン基板の表面をプラズマ処理により表面改質することが記載されている。特許文献１によれば、プラズマ処理を施すことにより、ポリプロピレン基板の表面改質を行い、ポリプロピレン基板の表面と、細胞又は生体分子との間の相互作用を最適化することが記載されている。
しかしながら、プラズマ処理に代表される放電処理による表面改質を行う場合、被処理物の表面は凹凸のない平滑面であることが好ましい。そのため、近年需要が増加している三次元培養で使用される様な、複雑な形状を有する細胞培養容器への適用は困難であるという問題がある。また、放電処理が施された表面は、当該放電処理の直後では十分な細胞培養性能を発揮するが、時間の経過と共に細胞培養性能が低下するため、その長期安定性に劣るという問題がある。
特表２０１４－５１５６９２号公報
本発明は、前記問題点に鑑みなされたものであり、優れた細胞培養性能、及びその長期安定性を備えた細胞培養部材及びその表面改質方法を提供することを目的とする。
本発明に係る細胞培養部材は、前記の課題を解決するために、少なくとも接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材であって、前記保持領域の少なくとも一部は、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域であることを特徴とする。
前記の構成に於いては、前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが好ましい。
前記の構成に於いて、前記表面改質領域に於ける前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部には、表面修飾基が直接化学結合しており、前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；シアノ基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオール基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであることが好ましい。
前記の構成に於いては、前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体であることが好ましい。
本発明の細胞培養部材の表面改質方法は、前記の課題を解決するために、接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材の表面改質方法であって、前記保持領域の少なくとも一部に、フッ素原子を含むガスと、任意成分としての不活性ガスとを含有する第１処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に前記フッ素原子を直接化学結合させた表面改質領域を形成する工程を含むことを特徴とする。
前記の構成に於いては、前記表面改質領域に於ける前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが好ましい。
前記の構成に於いて、前記工程は、前記第１処理ガスとして、さらに酸素原子を含むガスを含有するものを用いることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させるものであり、前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであってもよい。
前記の構成に於いては、前記第１処理ガスを接触させた前記保持領域の少なくとも一部に、他の酸素原子を含むガスを含有する第２処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させる工程をさらに含み、前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであってもよい。
前記の構成に於いては、前記炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に直接化学結合した前記フッ素原子、及び／又は前記他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に直接化学結合した前記表面修飾基に、前記フッ素原子及び／又は表面修飾基と反応する処理化合物を接触させることにより、前記フッ素原子及び／又は表面修飾基を、前記処理化合物に由来する前記表面修飾基に置換させる工程をさらに含むことが好ましい。
前記の構成に於いては、前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体であることが好ましい。
本発明の細胞培養部材によれば、高分子化合物からなる接着性細胞の保持領域に於いて、高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子を直接化学結合させて表面改質領域を設けることにより、その様な表面改質を行っていない領域と比較して、接着性細胞の表面改質領域に対する接着性を向上させることができる。その結果、細胞培養性能に優れた細胞培養部材を提供することができる。また、フッ素原子は高分子化合物を構成する炭素原子等の一部に直接化学結合し固定化されているので、本発明の細胞培養部材は、例えば、プラズマ処理等の従来の表面改質されたものと比べ、接着性細胞の接着性の経時劣化を抑制することができる。これにより、細胞培養性能の長期安定性に優れた細胞培養部材を提供することができる。
また、本発明の細胞培養部材の表面改質方法によれば、細胞培養部材の保持領域の少なくとも一部に、フッ素原子を含むガスを少なくとも含有する第１処理ガスを接触させるだけで、保持領域を構成する高分子化合物に於ける炭素原子等の一部にフッ素原子を直接化学結合させることができ、表面改質領域を形成することができる。その結果、極めて簡便な方法で、細胞培養性能に優れ、かつ、その長期安定性に優れた細胞培養部材を製造することができる。
本発明の実施の形態に係る細胞培養部材に於ける表面改質領域を説明するための概念図である。 前記実施の形態に係る細胞培養部材の表面改質方法を説明するための概念図である。 実施例１に係るマイクロプレートのＸＰＳの測定結果を表すグラフである。 実施例１のマイクロプレートを用いて、マウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡による明視野観察像を示す図である。 比較例１のマイクロプレートを用いて、マウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡による明視野観察像を示す図である。 比較例２のマイクロプレートを用いて、マウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡による明視野観察像を示す図である。
（細胞培養部材）
先ず、本実施の形態の細胞培養部材について、図１に基づき説明する。図１は、本実施の形態に係る細胞培養部材１０に於ける表面改質領域を説明するための概念図である。
本実施の形態の細胞培養部材１０は、接着性細胞を保持することが可能な保持領域（細胞培養面）を少なくとも備える。本実施の形態の細胞培養部材１０は、この保持領域に接着性細胞を接着させ、当該保持領域での接着性細胞の培養を可能にするものである。
本明細書に於いて「細胞培養部材」とは、接着性細胞が増殖、分化及び生存等をするにあたって、接着性細胞の足場となり得る固体表面を少なくとも有するものを意味する。従って、細胞培養部材１０としては、例えば、フィルム（膜）、シート、マイクロプレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、中空糸膜、又は略球状等が用いられる。尚、細胞培養部材１０がフィルム（膜）やシートである場合の態様には、例えば、細胞培養容器等の完成品の部品である場合を含む。
また、本明細書に於いて「接着性細胞」とは、増殖、分化及び生存等に於いて、固体表面に足場を必要とし、かつ、固体表面に接着する細胞を意味する。接着性細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、シリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ－２１（Ｃ－１３）細胞）及びマウス大脳皮質神経細胞等の上皮細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経／内分泌腺細胞、初代細胞、マウスアストロサイト細胞等のグリア細胞（神経膠細胞）等が挙げられる。但し、接着性細胞は例示したこれらの細胞に限定されない。
細胞培養部材１０は、少なくとも保持領域（細胞培養面）が高分子化合物からなるものであればよい。また、保持領域は、高分子化合物からなるものであって、さらにプラズマ処理等の公知の表面処理により表面が改質された表面改質面であってもよい。
高分子化合物は、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体である。重合体には、熱可塑性樹脂の他、エラストマーも含まれる。これらの高分子化合物のうち、成形性及び製造コスト等の観点からはポリスチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリプロピレンが好ましい。
保持領域の少なくとも一部は、高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子（以下、「炭素原子等」という。）の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域である（図１参照）。これにより、フッ素原子が直接化学結合した表面改質領域では、当該フッ素原子が直接化学結合していない領域と比較して、接着性細胞の接着性を増大させ、細胞培養性能の向上が可能になる。また、フッ素原子は、保持領域を形成する高分子化合物の炭素原子等の一部に直接化学結合しているので、例えば、表面改質領域は、プラズマ処理等の他の表面処理が施された領域と比べ、接着性細胞の接着性の経時劣化を抑制することができる。その結果、細胞培養性能の長期安定性も向上させることができる。
尚、本発明に於いて、表面改質領域は保持領域の少なくとも一部に形成されていればよい。従って、本発明は保持領域の全域が表面改質領域であってもよい。
表面改質領域に於けるフッ素原子のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ：X-ray Photoelectron Spectroscopy）により測定された結合エネルギーのピーク値は、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが好ましく、６８２ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることがより好ましく、６８３ｅＶ～６９０ｅＶの範囲であることが特に好ましい。結合エネルギーのピーク値を６８０ｅＶ以上にすることにより、表面改質領域が親水化し、接着性能を増加させることができる。結合エネルギーのピーク値を６９０ｅＶ以下にすることにより、過度の表面改質による疎水化を防ぎ、表面改質領域と接着性細胞との適切な接着性を保つことができる。尚、フッ素原子の結合エネルギーのピーク値は、例えば、Ｘ線光電子分光装置（型番：ＰＨＩ ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅIII、アルバック・ファイ（株）製）を用いて、照射するＸ線としてモノクロメーターにより単色化されたＡｌＫα線を使用し、Ｘ線の出力を５０Ｗ、加速電圧を１５ｋＶ、１回の測定領域を直径約２００μｍ、結合エネルギーの測定間隔を０．０５ｅＶとして測定することができる。
表面改質領域の高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子（以下、「他の炭素原子等」という。）の一部には、さらに表面修飾基が直接化学結合していてもよい。
前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基（以下、「ヘテロ原子等を有する炭化水素基」という。）；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基（以下、「ヘテロ原子等を有するシリル基」という。）；シアノ基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオール基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
前記表面修飾基に於ける前記－ＯＲ１基のＲ１、及び前記－ＣＯＯＲ２基のＲ２は、それぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである。
前記Ｒ１及びＲ２に於ける金属原子としては特に限定されず、例えば、リチウム、ナトリウム及びカリウム等のアルカリ金属；ベリリウム、マグネシウム及びカルシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウム、ガリウム及びインジウム等の周期表第１３族元素；ランタン等のランタノイド等が挙げられる。
前記Ｒ１及びＲ２に於ける炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数が１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０の鎖状炭化水素基；炭素数が３～３０、好ましくは３～２０、より好ましくは３～１２の環状炭化水素基等が挙げられる。前記鎖状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基及びｎ－オクチル基等の直鎖状炭化水素基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基及びイソペンチル基等の分岐鎖状炭化水素基等が挙げられる。また、前記環状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。尚、本明細書に於いて炭素数の範囲を表す場合、その範囲は当該範囲に含まれる全ての整数の炭素数を含むことを意味する。従って、例えば「炭素数１～３」の炭化水素基とは、炭素数が１、２及び３の全ての炭化水素基を意味する。
前記Ｒ１及びＲ２に於けるシリル基としては特に限定されず、例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、及びｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基等が挙げられる。
前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於いて、ヘテロ原子とは、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子等を意味し、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。ヘテロ原子を有する炭化水素基とは、炭化水素基中の水素及び炭素の一部又は全部が、これらのヘテロ原子の何れかで置換されているものを意味する。また、ハロゲン原子を有する炭化水素基とは、炭化水素基中の水素及び炭素の一部又は全部がこれらのハロゲン原子の何れかで置換されているものを意味する。
前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基の炭素数は、１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０である。また、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基は、より具体的には、例えば、２－メトキシエチル基等が挙げられる。
前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於いて、ヘテロ原子及びハロゲン原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子及びハロゲン原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有するシリル基としては特に限定されず、例えば、２－メトキシシリル基等が挙げられる。尚、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
前記表面修飾基に於ける前記－ＣＯＲ３基のＲ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基（以下、「ヘテロ原子等を有する炭化水素基」という。）；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基（以下、ヘテロ原子等を有するシリル基」という。）の何れかである。
前記Ｒ３に於ける炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数が１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０の鎖状炭化水素基；炭素数が３～３０、好ましくは３～２０、より好ましくは３～１２の環状炭化水素基等が挙げられる。前記鎖状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基及びｎ－オクチル基等の直鎖状炭化水素基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基及びイソペンチル基等の分岐鎖状炭化水素基等が挙げられる。また、前記環状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基、及び前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於いて、ヘテロ原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基としては特に限定されず、例えば、２－メトキシエチル基等が挙げられる。尚、前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有するシリル基としては特に限定されず、例えば２－メトキシシリル基等が挙げられる。尚、前記Ｒ３に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
前記表面修飾基に於ける炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数が１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０の鎖状炭化水素基；炭素数が３～３０、好ましくは３～２０、より好ましくは３～１２の環状炭化水素基等が挙げられる。前記鎖状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基及びｎ－オクチル基等の直鎖状炭化水素基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基及びイソペンチル基等の分岐鎖状炭化水素基等が挙げられる。また、前記環状炭化水素基としては、より具体的には、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
前記表面修飾基に於けるシリル基としては特に限定されず、例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、及びｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基等が挙げられる。
前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基の炭素数は、１～１００、好ましくは１～５０、より好ましくは１～２０である。また、前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基の不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基は、より具体的には、例えば、２－メトキシエチル基等が挙げられる。
前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於いて、ヘテロ原子及びハロゲン原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子及びハロゲン原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於いて、ヘテロ原子及びハロゲン原子は、前記Ｒ１及びＲ２に於けるヘテロ原子等を有する炭化水素基に於けるヘテロ原子及びハロゲン原子と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有するシリル基としては特に限定されず、例えば、２－メトキシシリル基等が挙げられる。尚、前記表面修飾基に於けるヘテロ原子等を有するシリル基に於ける不飽和結合の数は、適宜必要に応じて設定することができる。
前記表面修飾基に於けるスルホニル基としては、特に限定されず、例えばメシル基、トシル基、ノシル基、トリフルオロメタンスルホニル基等が挙げられる。
前記表面修飾基に於けるチオニル基としては、特に限定されず、例えば塩化チオニル基、フッ化チオニル基等が挙げられる。
以上の通り、本実施の形態の細胞培養部材１０は、接着性細胞の保持領域において、フッ素原子や、－ＯＨ基及び－ＣＯＯＨ基等の表面修飾基が直接化学結合した構造を有している。そのため、本実施の形態の細胞培養部材１０は、接着性細胞との接着性を十分に高めることができ、細胞培養性能に優れている。また、本実施の形態の細胞培養部材１０はその優れた培養性能の長期安定性にも優れている。
（細胞培養部材の表面改質方法）
次に、本実施の形態の細胞培養部材の表面改質方法について、図２に基づき説明する。
本実施の形態の細胞培養部材の表面改質方法は、細胞培養部材１０の保持領域の少なくとも一部に、第１処理ガスを接触させて表面改質処理を施し、表面改質領域を形成する工程を少なくとも含む。
第１処理ガスは、フッ素原子を含むガスと、任意成分としての不活性ガスとを含有する。第１処理ガスを保持領域の少なくとも一部に接触させることで、保持領域に於ける高分子化合物を構成する炭素原子等の一部にフッ素原子を直接化学結合させ、フッ素化処理を施すことができる。これにより、保持領域に於ける第１処理ガスが接触した領域では、フッ素化された表面改質領域を形成することができる。本実施の形態の表面改質処理は、高分子化合物を構成する炭素原子等の一部にフッ素原子を直接化学結合させるものであるので、例えば、プラズマを用いて表面を活性化し親水性を付与するプラズマ処理とは異なり、長期安定性に優れた表面処理を可能にする。
第１処理ガスを保持領域に接触させる方法としては、例えば、気相中で行う方法が挙げられる。
前記第１処理ガスに於けるフッ素原子を含むガスの濃度は、第１処理ガスの全体積に対し、０．０１～６０ｖｏｌ％の範囲が好ましく、０．０５～３０ｖｏｌ％の範囲がより好ましく、０．１～２０ｖｏｌ％の範囲が特に好ましい。フッ素原子を含むガスの濃度を０．０１ｖｏｌ％以上にすることにより、保持領域のフッ素化が不十分となるのを防止することができる。また、フッ素原子を含むガスの濃度を６０ｖｏｌ％以下にすることにより、処理時に保持領域の高分子化合物とフッ素原子とが激しく反応し、燃焼するのを防止することができる。
フッ素原子を含む気体は、フッ素原子を含む気体であれば特に限定されない。その様なフッ素原子を含むガスとしては、例えば、フッ化水素（ＨＦ）、フッ素（Ｆ２）、三フッ化塩素（ＣｌＦ３）、四フッ化硫黄（ＳＦ４）、三フッ化ホウ素（ＢＦ３）、三フッ化窒素（ＮＦ３）、フッ化カルボニル（ＣＯＦ２）、五フッ化リン（ＰＦ５）等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いてもよい。
前記第１処理ガスには、不活性ガスが含まれていてもよい。不活性ガスとしては特に限定されないが、フッ素原子を含むガスと反応して保持領域の表面改質処理に悪影響を与えるもの、高分子化合物と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。不活性ガスとしては、具体的には、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。また、不活性ガスの純度としては特に限定されないが、当該悪影響を与える不純物については１００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。
また、前記第１処理ガスには、酸素原子を含むガスが含まれていてもよい。これにより、本実施の形態の表面改質処理に於いては、フッ素化処理に加えて、表面修飾基の導入も可能となる。すなわち、第１処理ガスに酸素原子を含むガスを含有させることで、保持領域の高分子化合物を構成する他の炭素原子等の一部に、さらに前記表面修飾基を直接化学結合させることができる。
酸素原子を含むガスとしては特に限定されないが、酸素原子を含むガスと反応して細胞培養部材１０の表面改質処理（フッ素化処理）に悪影響を与えるもの、細胞培養部材１０を構成する材料等と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。酸素原子を含むガスとしては、具体的には、例えば、酸素、オゾン、水蒸気、一酸化炭素、二酸化炭素、ホスゲン、二酸化硫黄等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
表面改質処理を行う際の処理温度は、細胞培養部材１０を構成する高分子化合物のガラス転移点以下であれば特に限定されないが、好ましくは－２０℃～１５０℃、より好ましくは－１０℃～１２０℃、さらに好ましくは０℃～１００℃である。処理温度を－２０℃以上にすることにより、表面改質処理、特にフッ素化処理を促進させることができる。その一方、処理温度を１５０℃以下にすることにより、細胞培養部材１０表面へのフッ素原子（フッ素基）の導入に伴って発生する炭素骨格及び／又はケイ素骨格の欠陥が過度に増大するのを抑制し、炭素骨格及び／又はケイ素骨格の過度の破壊及び細胞培養部材１０の機械的強度が減少するのを防止することができる。さらに、細胞培養部材１０に熱変形が生じるのを防止し、歩留まりの低下を抑制することができる。
表面改質処理の処理時間（反応時間）は１秒～２４時間の範囲内が好ましく、１分～１２時間の範囲内がより好ましく、３分～１時間の範囲内が特に好ましい。処理時間を１秒以上にすることにより、細胞培養部材１０表面の表面改質、特にフッ素化を十分なものにすることができる。その一方、処理時間を２４時間以下にすることにより、処理時間の長期化による処理効率の低下を防止することができる。
表面改質処理を行う際の圧力条件としては特に限定されず、常圧下、加圧下又は減圧下で行うことができる。経済上・安全上の観点からは、常圧下で行うのが好ましい。尚、「常圧」とは、標準大気圧（１０１．３ｋＰａ）を意味するが、本発明に於いては標準大気圧に対し±１０％の圧力条件下である場合も含み得る。
表面改質処理を行うための反応容器としては特に限定されず、固定床、流動床等の従来公知のものを採用することができる。
細胞培養部材１０に対する第１処理ガスの接触方法としては特に限定されず、例えば、当該第１処理ガスのフロー下、又は当該第１処理ガスを少なくとも含む雰囲気下に於いて、密閉状態で接触させる方法が挙げられる。また、表面改質処理は複数回行ってもよい。これにより、細胞培養部材１０表面にさらにフッ素原子や表面修飾基を導入することができ、細胞培養部材１０表面の長期安定性を一層向上させることができる。
細胞培養部材１０に対する表面改質処理は、接着性細胞の保持領域の少なくとも任意の一部の領域に施されればよい。従って、表面改質処理は保持領域の全面に行ってもよい。また、保持領域には、表面改質処理を施す前に予め他の公知の表面処理が施されていてもよい。公知の表面処理としては、例えば、プラズマ処理等の放電処理が挙げられる。尚、本発明は、保持領域以外の領域に公知の表面処理が施されている場合も含み得る。
任意の一部の領域に対して表面改質処理を行う場合（部分表面改質処理）、当該表面改質処理を行いたい領域以外の領域をマスキングすることにより行うことができる。マスキングに使用するマスキング材としては、表面改質処理の際の処理温度に対し耐熱性を有していることを除き、特に限定されない。マスキング材としては、具体的には、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロクロルエチレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリジクロルジフルオロエチレン、ポリトリフルオロクロルエチレン等のフッ素樹脂、セラミックス、ポリイミド、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、金属等からなるものが挙げられる。
また、表面改質処理の直後に後処理工程を行ってもよい。後処理工程は、前記第１処理ガスを不活性ガスに置換して不活性雰囲気下にし、かつ、室温まで細胞培養部材１０を冷却させる工程である。室温までの冷却は放冷により行ってもよい。また、不活性ガスに置換するため真空排気した後、不活性ガスで大気圧にしてもよい。これにより、表面改質処理が施された細胞培養部材１０の表面にフッ素ガスが物理吸着して残存するのを防止することができる。その結果、フッ素ガスの加水分解によりフッ化水素が副生するのを防止し、フッ化水素による培養細胞の破壊等の不具合が生じることもない。尚、不活性ガスとしては特に限定されず、例えば、窒素ガス等が挙げられる。
また、表面改質処理の後、表面改質領域に、他の酸素原子を含むガスを含む第２処理ガスを接触させて、前述の表面修飾基の導入を行ってもよい（第１表面修飾基導入処理）。
他の酸素原子を含むガスとしては、具体的には、例えば、酸素、オゾン、水蒸気、一酸化炭素、二酸化炭素、ホスゲン、二酸化硫黄等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
前記第２処理ガスには、不活性ガスが含まれていてもよい。不活性ガスとしては特に限定されないが、酸素原子を含むガスと反応して保持領域の表面改質処理に悪影響を与えるもの、高分子化合物と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。不活性ガスとしては、具体的には、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。また、不活性ガスの純度としては特に限定されないが、当該悪影響を与える不純物については１００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。
第１表面修飾基導入処理を行う際の処理温度は、細胞培養部材１０を構成する高分子化合物のガラス転移点以下であれば特に限定されないが、好ましくは－２０℃～１５０℃、より好ましくは－１０℃～１２０℃、さらに好ましくは０℃～１００℃である。処理温度を－２０℃以上にすることにより、表面修飾基の導入を促進させることができる。その一方、処理温度を１５０℃以下にすることにより、細胞培養部材１０表面への第２処理ガスを用いた処理に伴って発生する炭素骨格及び／又はケイ素骨格への欠陥が過度に増大するのを抑制し、炭素骨格及び／又はケイ素骨格の過度の破壊及び細胞培養部材１０の機械的強度が減少するのを防止することができる。さらに、細胞培養部材１０に熱変形が生じるのを防止し、歩留まりの低下を抑制することができる。
第１表面修飾基導入処理を行う際の処理時間（反応時間）は１秒～２４時間の範囲内が好ましく、１分～１２時間の範囲内がより好ましく、３分～１時間の範囲内が特に好ましい。処理時間を１秒以上にすることにより、表面修飾基の導入を十分なものにすることができる。その一方、処理時間を２４時間以下にすることにより、処理時間の長期化による処理効率の低下を防止することができる。
第１表面修飾基導入処理を行う際の圧力条件としては特に限定されず、常圧下、加圧下又は減圧下で行うことができる。経済上・安全上の観点からは、常圧下で行うのが好ましい。
第１表面修飾基導入処理を行うための反応容器としては特に限定されず、固定床、流動床等の従来公知のものを採用することができる。
細胞培養部材１０に対する第２処理ガスの接触方法としては特に限定されず、例えば、当該第２処理ガスのフロー下、又は当該第２処理ガスを少なくとも含む雰囲気下に於いて、密閉状態で接触させる方法が挙げられる。また、第１表面修飾基導入処理は複数回行ってもよい。これにより、細胞培養部材１０表面にさらに－ＯＨ基や－ＣＯＯＨ基等の親水基を導入することができると共に、細胞培養部材１０表面の長期安定性を一層向上させることができる。
第１表面修飾基導入処理は、接着性細胞の保持領域の少なくとも任意の一部の領域に施されればよい。従って、第１表面修飾基導入処理は保持領域の全面に行ってもよい。任意の一部の領域に対して第１表面修飾基導入処理を行う場合（部分表面修飾基導入処理）、当該第１表面修飾基導入処理を行いたい領域以外の領域をマスキングすることにより行うことができる。マスキングに使用するマスキング材としては、第１表面修飾基導入処理の際の処理温度に対し耐熱性を有していることを除き、特に限定されない。マスキング材としては、具体的には、例えば、部分表面改質処理を行う際に用いられる前述のマスキング材等が挙げられる。
また、第１表面修飾基導入処理の直後に、表面改質領域に対し、他の表面修飾基の導入を行ってもよい（第２表面修飾基導入処理）。第２表面修飾基導入処理は、炭素原子等の一部に直接化学結合したフッ素原子、及び／又は他の炭素原子等の一部に直接化学結合した表面修飾基に反応する処理化合物を接触させて行う。これにより、第２表面修飾基導入処理では、フッ素原子及び／又は表面修飾基を、前記化合物に由来する表面修飾基に置換させることができる。
前記処理化合物に由来する表面修飾基は、第１表面修飾基導入処理に於ける表面修飾基と同様である。従って、その詳細な説明は省略する。
前記処理化合物としては、フッ素原子及び／又は表面修飾基に反応する化合物であれば、気体状、液体状又は固体状のものを特に制限なく使用することができる。
気体状の処理化合物としては特に限定されず、例えば、水蒸気等が挙げられる。また、気体状の処理化合物には、不活性ガスが含まれていてもよい。不活性ガスとしては特に限定されないが、処理化合物と反応して保持領域の表面改質処理に悪影響を与えるもの、高分子化合物と反応して悪影響を与えるもの、及び当該悪影響を与える不純物を含むものは好ましくない。不活性ガスとしては、具体的には、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。また、不活性ガスの純度としては特に限定されないが、当該悪影響を与える不純物については１００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。
液体状の処理化合物としては特に限定されず、例えば、水等が挙げられる。処理化合物が水である場合、後述の細胞培養部材１０の洗浄処理として行うことも可能である。尚、洗浄処理の詳細については、後段で述べる。
第２表面修飾基導入処理を行う際の処理温度は、細胞培養部材１０を構成する高分子化合物のガラス転移点以下であれば特に限定されないが、好ましくは－２０℃～１５０℃、より好ましくは－１０℃～１２０℃、さらに好ましくは０℃～１００℃である。処理温度を－２０℃以上にすることにより、処理化合物に由来の表面修飾基の導入を促進させることができる。その一方、処理温度を１５０℃以下にすることにより、細胞培養部材１０表面への処理化合物を用いた処理に伴って発生する炭素骨格及び／又はケイ素骨格への欠陥が過度に増大するのを抑制し、炭素骨格及び／又はケイ素骨格の過度の破壊及び細胞培養部材１０の機械的強度が減少するのを防止することができる。さらに、細胞培養部材１０に熱変形が生じるのを防止し、歩留まりの低下を抑制することができる。
第２表面修飾基導入処理を行う際の処理時間（反応時間）は１秒～２４時間の範囲内が好ましく、１分～１２時間の範囲内がより好ましく、３分～１時間の範囲内が特に好ましい。処理時間を１秒以上にすることにより、処理化合物に由来の表面修飾基の導入を十分なものにすることができる。その一方、処理時間を２４時間以下にすることにより、処理時間の長期化による処理効率の低下を防止することができる。
第２表面修飾基導入処理を行う際の圧力条件としては特に限定されず、常圧下、加圧下又は減圧下で行うことができる。経済上・安全上の観点からは、常圧下で行うのが好ましい。
第２表面修飾基導入処理を行うための反応容器としては特に限定されず、固定床、流動床等の従来公知のものを採用することができる。
処理化合物が気体状である場合、細胞培養部材１０に対する処理化合物の接触方法としては特に限定されず、例えば、当該処理化合物のフロー下、又は処理化合物を少なくとも含む雰囲気下に於いて、密閉状態で接触させる方法が挙げられる。また、第２表面修飾基導入処理は複数回行ってもよい。
第２表面修飾基導入処理は、接着性細胞の保持領域の少なくとも任意の一部の領域に施されればよい。従って、第２表面修飾基導入処理は保持領域の全面に行ってもよい。任意の一部の領域に対して第２表面修飾基導入処理を行う場合（部分表面修飾基導入処理）、当該第２表面修飾基導入処理を行いたい領域以外の領域をマスキングすることにより行うことができる。マスキングに使用するマスキング材としては、第２表面修飾基導入処理の際の処理温度に対し耐熱性を有していることを除き、特に限定されない。マスキング材としては、具体的には、第１表面修飾基導入処理を行う際に用いられる前述のマスキング材等が挙げられる。
尚、本実施の形態に於いては、第１表面修飾基導入処理及び第２表面修飾基導入処理の直後に後処理を行ってもよい。後処理は、第２処理ガス又は気体状の処理化合物を不活性ガスに置換して不活性雰囲気下にし、かつ、室温まで細胞培養部材１０を冷却させる工程である。室温までの冷却は放冷により行ってもよい。また、不活性ガスに置換するため真空排気した後、不活性ガスで大気圧にしてもよい。これにより、第１表面修飾基導入処理の直後に後処理工程を行った場合には、第１表面修飾基導入処理が施された細胞培養部材１０の表面に第２処理ガスが吸着して残存するのを防止することができる。また、第２表面修飾基導入処理の直後に後処理工程を行った場合には、第２表面修飾基導入処理が施された細胞培養部材１０の表面に処理化合物が吸着して残存するのを防止することができる。これにより、第２処理ガス又は気体状の処理化合物の分解による副生物の発生を防止し、副生物による培養細胞の破壊等の不具合が生じることもない。前記不活性ガスとしては特に限定されず、窒素ガス等が挙げられる。
また、本実施の形態に於いては、表面改質処理、第１表面修飾基導入処理、第２表面修飾基導入処理及び後処理の後に、洗浄処理を行ってもよい。例えば、洗浄剤が水の場合、洗浄により、炭素原子等の直接化学結合したフッ素原子（フッ素基）の一部を水分子と反応させ、フッ素基に換えて－ＯＨ基、－ＣＯＯＨ基等を直接化学結合させることができる。その結果、細胞培養部材１０表面をさらに親水化することができる。また、細胞培養部材１０の表面に固定化されなかった第１処理ガス、第２処理ガス、処理化合物、及び副生成物を除去することができる。使用する洗浄剤としては特に限定されず、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、水（例えば、超純水）、トルエン、アセトン等が挙げられる。また、洗浄条件は特に限定されないが、通常は洗浄温度（洗浄剤の温度）０℃～１００℃、洗浄時間１秒間～６０分間の範囲内で行われる。
洗浄処理の後に於いては乾燥処理を行うのが好ましい。乾燥方法としては特に限定されず、例えば、自然乾燥や窒素ガス等の吹き付けによる乾燥等が挙げられる。また、乾燥条件は特に限定されないが、通常は乾燥温度（窒素ガス等を吹き付ける場合は、当該窒素ガスの温度）０℃～１００℃、乾燥時間１秒間～２４時間の範囲内で行われる。
以上の通り、本実施の形態に係る細胞培養部材１０の表面改質方法は、接着性細胞の保持領域に、フッ素原子を含むガスを含有する第１処理ガスを接触させるだけで、当該保持領域に於ける接着性細胞との接着性を向上させる表面改質が可能となる。その結果、優れた細胞培養性能を有し、かつその長期安定性に優れた細胞培養部材１０の提供が可能になる。
以下に、この発明の好適な実施例を例示的に詳しく説明する。但し、この実施例に記載されている材料や配合量等は、特に限定的な記載がない限り、この発明の範囲をそれらのみに限定するものではない。
（実施例１）
先ず、ポリスチレン製マイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、商品名：ＩＷＡＫＩ浮遊培養用マイクロプレート ２４ＷＥＬＬ、以下、「マイクロプレート」という。）を用意し、ＳＵＳ３１６Ｌ製チャンバー（容量１８Ｌ）内に、当該マイクロプレートを設置した。
次に、チャンバー内を窒素ガスに真空置換し、窒素ガスの気流（４Ｌ／ｍｉｎ）下、４℃／ｍｉｎでチャンバー内の雰囲気温度が４０℃になるまで昇温させた。その後、マイクロプレートに対し１時間の恒温処理を行った。
続いて、チャンバー内に第１処理ガスを導入してマイクロプレートに対し表面改質処理（フッ素化処理）を行った。第１処理ガスのチャンバー内への導入は、真空置換によりチャンバー内の圧力が大気圧に達するまで行った。第１処理ガスとしては、第１処理ガスの全体積に対し濃度が０．２５ｖｏｌ％のフッ素ガスと、窒素ガスとからなる混合ガスを用いた。また、表面改質処理は、チャンバーを密閉状態にし、チャンバー内の雰囲気温度（処理温度）を４０℃、表面改質処理の処理時間は１７分間とした。その後、チャンバー内を窒素ガスに真空置換し、窒素ガスの気流（４Ｌ／ｍｉｎ）下、室温まで放冷した。
次に、表面改質処理後のマイクロプレートを超純水で十分に洗浄して洗浄処理をした後、２５℃の窒素ガスを吹き付け、乾燥処理を行った。これにより、本実施例に係る細胞培養部材として、表面改質処理を施したマイクロプレートを作製した。尚、洗浄処理に於ける超純水の温度は２５℃とし、洗浄時間は５分間とした。また、乾燥処理に於ける窒素ガスの温度は２５℃とし、乾燥時間は８時間とした。
（比較例１）
本比較例に於いては、実施例１の表面改質処理が施されていないマイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、商品名：ＩＷＡＫＩ浮遊培養用マイクロプレート ２４ＷＥＬＬ）を用いた。
（比較例２）
本比較例に於いては、実施例１の表面改質処理に代えて、放電処理を施したマイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、商品名：ＩＷＡＫＩ付着性培養用マイクロプレート ２４ＷＥＬＬ）を用いた。
（元素分析）
実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれ元素分析を行った。元素分析は、ＰＨＩ５０００ ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ ＩＩＩ（商品名、アルバック・ファイ株式会社製）を用いて、Ｘ線光電子分光法により行った。結果を表１に示す。
（接触角）
実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれ水の接触角を測定した。水の接触角の測定は、接触角計（協和界面科学株式会社製、型番：ＤＭ－３００）を用いて行った。結果を表１に示す。
（フッ素原子の結合エネルギーの測定）
実施例１に係るマイクロプレート表面（フッ素化処理が施された表面）をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ：X-ray Photoelectron Spectroscopy）により分析し、フッ素原子の結合エネルギーを測定した。
ＸＰＳの測定条件は、次の通りとした。すなわち、Ｘ線光電子分光装置（型番：ＰＨＩＶｅｒｓａＰｒｏｂｅIII、アルバック・ファイ（株）製）を用い、照射するＸ線としてモノクロメーターにより単色化されたＡｌＫα線を使用した。Ｘ線の出力を５０Ｗ、加速電圧を１５ｋＶ、１回の測定領域を直径約２００μｍ、結合エネルギーの測定間隔を０．０５ｅＶとし、結合エネルギー６７９～６９９ｅＶの範囲における強度を測定した。測定の結果、図３に示すように、フッ素原子の結合エネルギーが、６８６．５ｅＶにピーク値を有する波形として検出された。図３は、実施例１に係るマイクロプレートのＸＰＳの測定結果を表すグラフである。
（細胞培養評価）
実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、及びシリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ－２１（Ｃ－１３）細胞）を用いて細胞培養評価を実施した。
細胞培養評価は、先ず、細胞数が１×１０４個／ＷＥＬＬとなる様に培養液をマイクロプレートのそれぞれに播種した。培養液中におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）は１０％とした。
次に、この培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４日間、ヒト胎児腎細胞及びシリアンハムスター腎細胞の培養を行った。その後、培地を抜き取り、細胞を剥がし、各細胞の生細胞数をカウントした。結果を表１に示す。
（低栄養培地下に於ける細胞培養評価）
実施例１、比較例１及び比較例２に係る各マイクロプレートについて、それぞれシリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞）を用いて、低栄養培地下における細胞培養評価を実施した。
すなわち、培養液としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）が５％のものを用い、それ以外は、前述の細胞培養評価と同様の方法により、シリアンハムスター腎細胞の培養を行い、その生細胞数をカウントした。結果を表１に示す。
（細胞培養性能の長期安定性評価）
次に、実施例１、比較例１及び２に係る各マイクロプレートについて、それぞれヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を用いて細胞培養性能の長期安定性評価を実施した。
長期安定性評価は、先ず、細胞数が１×１０４個／ＷＥＬＬとなる様に培養液をマイクロプレートのそれぞれに播種した。培養液中におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）は１０％とした。
次に、この培養液を、大気下、２５℃で３０日間保管した。その後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４日間、ヒト胎児腎細胞の培養を行った。培養後、培地を抜き取り、細胞を剥がし、ヒト胎児腎細胞の生細胞数をカウントした。結果を表１に示す。
Figure 2022103120000002
（プライマリ細胞を用いた細胞培養評価）
次に、実施例１、比較例１及び比較例２の各マイクロプレートについて、それぞれマウスアストロサイト細胞を用いて細胞培養評価を実施した。
細胞培養評価は、先ず、マウス（ＩＣＲ系）の胎児から大脳皮質を取り出し、これを酵素で分解し、その後、ラミニン及びポリリジンでコーティングされたマイクロプレートに播種した。その後、１５日間培養しマウスアストロサイト細胞が培養されていることを確認後、これを剥離した。
続いて、各マイクロプレートに細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に再播種した。３日後、各マイクロプレートのマウスアストロサイト細胞をカルセインで蛍光染色し、倒立顕微鏡を用いて当該マウスアストロサイト細胞の様子を確認した。結果を図４～図６に示す。図４～図６はそれぞれ、実施例１、比較例１及び比較例２に於けるマイクロプレートを用いてマウスアストロサイト細胞を培養した後の倒立顕微鏡に於ける明視野観察像を示す図である。
（結果）
ＸＰＳによる元素分析の結果、実施例１のフッ素化処理後のマイクロプレートでは１４．０ａｔ％のフッ素原子が検出された。また、比較例１の未処理のマイクロプレートと比較して、酸素原子の量が増加していることも明らかとなった。また、ＸＰＳのピーク位置から、実施例１のマイクロプレートでは、表面修飾基としての－ＯＨ基及び－ＣＯＯＨ基が生成していることも確認できた。その一方、比較例１及び２のマイクロプレートについてはフッ素原子が検出されなかった。
また、水接触角の測定の結果、実施例１のマイクロプレートについては、未処理のマイクロプレートを用いた比較例１と比較して、接触角が小さくなっていた。これにより、実施例１のマイクロプレートでは、水に対する濡れ性が向上していることが明らかとなった。
また、細胞培養評価の結果、実施例１のマイクロプレートでは生細胞数が３１．７×１０４個であり、比較例１の未処理のマイクロプレートでは１．６×１０４個であった。これにより、表面改質処理を施した実施例１のマイクロプレートは、未処理の比較例１のマイクロプレートと比較して、細胞培養性能が優れていることが確認された。
特に、低栄養培地下における細胞培養評価では、フッ素化処理を施した実施例１のマイクロプレートに於いて生細胞数が３．２×１０４個であり、比較例１及び比較例２のマイクロプレートに対し細胞培養性能が優れていることが確認された。
さらに、細胞培養性能の長期安定性については、フッ素化処理を施した実施例１のマイクロプレートでは生細胞数が３１．５×１０４個であり、３０日間大気保管前と同等の細胞培養性能が維持されていることが確認された。その一方、プラズマ処理を施した実施例１のマイクロプレートでは生細胞数が２３．４×１０４個であり、３０日間大気保管前の生細胞数３１．２×１０４個から大幅減少しており、細胞培養性能が時間の経過と共に低減していることが確認された。
またプライマリ細胞を用いた細胞培養評価では、図４に示す様に、フッ素化処理を施した実施例１のマイクロプレートに於いてマウスアストロサイト細胞がマイクロプレート表面に接着した状態で、その神経突起が伸長しているのが確認された。その一方、表面改質処理を施していない比較例１のマイクロプレートでは、図５に示す様に、マウスアストロサイト細胞がマイクロプレート表面に接着しておらず、またプラズマ処理を施した比較例２のマイクロプレートでは、図６に示す様に、マウスアストロサイト細胞がマイクロプレート表面に接着しているものの、その神経突起の伸張が実施例１と比較して十分ではなかった。これらの結果から、プライマリ細胞を用いた細胞培養評価でも、実施例１のマイクロプレートは比較例１及び２のマイクロプレートと比較して、細胞培養性能に優れていることが明らかとなった。
以上の結果から、実施例１のフッ素化処理後のマイクロプレートについては、比較例１の未処理のマイクロプレートと比較して、良好な細胞培養性能を有することが明らかとなった。また、実施例１の表面改質処理後のマイクロプレートは、比較例２のプラズマ処理後のマイクロプレートと比較して、３０日間の大気保管後も、優れた細胞培養性能を維持していることが明らかとなった。
１０ 細胞培養部材

Claims (10)

  1. 少なくとも接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材であって、
    前記保持領域の少なくとも一部は、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部にフッ素原子が直接化学結合した表面改質領域である細胞培養部材。
  2. 前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲である請求項１に記載の細胞培養部材。
  3. 前記表面改質領域に於ける前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部には、表面修飾基が直接化学結合しており、
    前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；シアノ基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオール基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、
    前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである請求項１又は２に記載の細胞培養部材。
  4. 前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体である請求項１～３の何れか１項に記載の細胞培養部材。
  5. 接着性細胞の保持領域が高分子化合物からなる細胞培養部材の表面改質方法であって、
    前記保持領域の少なくとも一部に、フッ素原子を含むガスと、任意成分としての不活性ガスとを含有する第１処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に前記フッ素原子を直接化学結合させた表面改質領域を形成する工程を含む細胞培養部材の表面改質方法。
  6. 前記表面改質領域に於ける前記フッ素原子のＸ線光電子分光法により測定された結合エネルギーのピーク値が、６８０ｅＶ～６９０ｅＶの範囲である請求項５に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  7. 前記工程は、前記第１処理ガスとして、さらに酸素原子を含むガスを含有するものを用いることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させるものであり、
    前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、
    前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである請求項５又は６に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  8. 前記第１処理ガスを接触させた前記保持領域の少なくとも一部に、他の酸素原子を含むガスを含有する第２処理ガスを接触させることにより、前記高分子化合物を構成する他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に、表面修飾基を直接化学結合させる工程をさらに含み、
    前記表面修飾基は、－ＯＲ１基；－ＣＯＯＲ２基；－ＣＯＲ３基；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基；ニトロ基；ニトロソ基；リン酸基；スルホニル基；チオニル基；及びフッ素原子を除くハロゲン原子からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    前記Ｒ１及び前記Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子；金属原子；炭化水素基；シリル基；ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子、ハロゲン原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかであり、
    前記Ｒ３は、炭化水素基；ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有する炭化水素基；又は、ヘテロ原子及び不飽和結合の少なくとも何れか１つを有するシリル基の何れかである請求項５又は６に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  9. 前記炭素原子及び／又はケイ素原子の一部に直接化学結合した前記フッ素原子、及び／又は前記他の炭素原子及び／又は他のケイ素原子の一部に直接化学結合した前記表面修飾基に、前記フッ素原子及び／又は表面修飾基と反応する処理化合物を接触させることにより、
    前記フッ素原子及び／又は表面修飾基を、前記処理化合物に由来する前記表面修飾基に置換させる工程をさらに含む請求項７又は８に記載の細胞培養部材の表面改質方法。
  10. 前記高分子化合物が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレンテレフタラート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリオレフィン、及びケイ素含有高分子化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の重合体である請求項５～９の何れか１項に記載の細胞培養部材の表面改質方法。

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