CN1501974A - 选定分子的导入方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可将多种多样的选定分子高效地导入多种多样的细胞中的方法，以及融合细胞的方法。通过将细胞和/或多核苷酸等选定分子用低温气体等离子体处理，将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内，或通过用低温气体等离子体处理细胞，使细胞融合。本发明进一步提供用于导入选定分子或细胞融合的装置，所述装置具有用于将选定分子导入细胞的低温气体等离子体发生装置。

Description

选定分子的导入方法
技术领域
本发明涉及将基因等多核苷酸、蛋白质、生理活性分子等选定分子导入细胞内的方法和细胞的融合方法或实施这些方法的装置。
背景技术
近年来，在医学、药学等领域进行基因工程和药物开发时，将基因等多核苷酸、蛋白质、生理活性分子、候选药物等选定分子导入细胞内，用细胞测试基因的功能和生理活性分子的生理活性的需要增多。目前，作为导入选定分子的方法，可以采用电穿孔方法、基因枪方法、脂质体方法、细胞融合方法、病毒载体方法等方法，但这些方法未必能充分地将选定分子导入细胞。
电穿孔方法和基因枪方法可应用于多种细胞，但操作繁杂，难以实现HTS；另外，脂质体方法有可应用的细胞有限的问题。并且，这些方法费用都很高，因而，即使可以实现HTS，也是非常昂贵的。况且，很多情况下导入效率也未尽人意。
目前已完成人和小鼠基因序列的解读，对功能尚未知晓的基因进行功能分析已成当务之急，其中，开发可实现HTS的基因导入方法是必不可少的。在实现HTS的过程中，也急需开发出不是向特定的细胞导入基因，而是向各种细胞中均可高效地导入基因的方法，以便可以高效率地对各种基因的功能进行分析。
本发明的目的在于：解决上述问题，提供高效率地向多种细胞中导入选定分子的方法和细胞的融合方法。
发明的公开
本发明人发现，用低温气体等离子体处理细胞和/或选定分子，可将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内，从而完成了本发明。并进一步发现用低温气体等离子体处理细胞，细胞发生了融合。
即，本发明的内容如下所示。
[1]一种将选定分子导入细胞的方法，所述方法包括通过用低温气体等离子体处理细胞和/或选定分子，将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内。
[2][1]的选定分子的导入方法，所述方法包括是预先将选定分子置于细胞附近，然后进行细胞的低温等离子体处理。
[3][1]或[2]的选定分子的导入方法，其中所述选定分子是多核苷酸。
[4]通过用等离子体处理细胞，使细胞融合的方法。
[5]一种装置，所述装置以细胞和/或选定分子为靶，通过用低温气体等离子体处理，可以将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内；或通过用等离子体处理细胞，可使细胞融合。
[6][5]的装置，所述装置具有借助开放式放电的低温气体等离子体发生装置。
本发明中的选定分子是指选定供导入目标细胞用的的分子。这样的选定分子包括DNA、RNA等多核苷酸或其衍生物；信号转导蛋白和转录调控因子等蛋白质及其衍生物等高分子化合物；小分子生理活性物质；候选药物。在这些选定分子中，优选多核苷酸及其衍生物。
本发明中的细胞是导入选定分子的目标细胞，并无特别限定。这些细胞有例如大肠杆菌、放线菌、枯草杆菌等原核细胞；酵母、动物细胞、植物细胞等真核细胞。另外，红细胞血影和脂质体等具有脂双层膜结构的也包括在本发明所述的细胞中。
为了提高向这些细胞导入选定分子的效率，可以使用根据导入基因时常用的制备感受态细胞的方法制备的细胞。另外，可以通过与其他的基因导入方法组合，例如与使用脂转染胺试剂(Lipofectamin，GIBCO-BRL公司制造)等阳离子型脂质和脂质体的脂质体方法等组合，来进一步提高选定分子导入细胞的效率。
本发明中，所使用的低温气体等离子体(低温非平衡式等离子体、低温弱电离等离子体)可以通过例如电晕放电而发生，但可根据发生装置的类型和发生条件而改变其性质。可以根据所用细胞和选定分子、操作的环境等，适当选择实施本发明所使用的等离子体的气体的种类、等离子体密度、电子温度、处理时间等。低温气体等离子体中使用的气体种类优选选自氧气、空气、二氧化碳、氮气、氩气中的至少一种。
本发明使用的低温气体等离子体发生装置可以采用密闭型、开放型中任一种的发生装置，但从细胞处理的简便性来看，优选为开放型装置。
本发明装置的具体例子有：例如图1所示类型的装置。该装置由电气系统和气体系统构成，可以通过电气系统的信号发生器、线性放大器、匹配电路、升压变压器，将电极间电压、电极间距、频率、脉冲周期、Duty等参数设定成各种条件，并在该条件下在突出部分(head)放电，产生各种等离子体。另一方面，在气体系统中，由气体钢瓶或气泵提供的单一气体或混合气体，通过针阀设定为适当的流量，供给突出部分。突出部分生成的等离子体由气体吹出，来照射设置在前方的试样。为了在适合于细胞、各类生物或选定分子(包括基因、低分子、蛋白等)等每种试样的条件下进行等离子体照射，通过改变上述条件来改变等离子体及其照射条件的设定。
本发明的具体实施方案有：例如将在平板等细胞培养容器中培养的粘附型细胞，或者通过离心或过滤等操作将收集的细胞除去培养液，然后向其细胞表面加入少量含有选定分子的溶液。之后利用等离子体发生器产生的等离子体进行等离子体处理。等离子体处理的时间根据各种条件不同而不同，大致为数秒～数十秒。等离子体处理后，加入培养基进行培养。当选定分子是含有基因等的载体时，可有效地进行基因重组试验；当选定分子是例如定向于细胞内靶分子的候选药物时，可有效地进行候选药物的筛选。
附图简述
图1是本发明的用于导入基因或细胞融合的装置模式图。
图2是显示本发明的用于导入基因或细胞融合的装置的等离子体发生部(电极部)与试样关系的模式图。
图3、图4和图5显示通过光谱法测定本发明的实施例所使用的、用于基因导入或细胞融合的装置在各种条件下发生的等离子体的结果。测定采用大冢电子制造的摄谱仪MCPD-3000，探头设置于距等离子体约3cm处，以获得等离子体的光谱。
实施发明的最佳方式
下面，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不受该
实施例限制。
实施例1
根据图1制作本发明的装置。该装置中等离子体照射仪的条件如下：电极间电压kV～十几kV；电极间距10～15mm；频率20～40kHz；脉冲周期30～90Hz；工作比25～100％；在气体分别为空气、氮气、氧气、二氧化碳、氩气、氦气∶空气＝1∶1等条件下照射约1～5秒。电极至试样的距离在约1～3之间选择适当的条件。
通过该装置可以产生例如具有图3～图5所示光谱的等离子体。通过该等离子体发生装置进行基因导入。
将中国仓鼠肺成纤维细胞CHL细胞接种于直径60mm的细胞培养平板上，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养过夜。每孔接种1×106个培养细胞后开始培养。确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入110μl GFP表达质粒溶液(1μg/μl)，在各种条件下，用本发明的装置进行等离子体照射。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达，计数每个视野内的表达细胞数。另外，用FACS Flow cytometry(荧光激活细胞分类流式细胞仪)计数孔内所有细胞中的GFP蛋白表达细胞。
结果，在每种条件下均观察到GFP的表达。通过显微镜目测，导入效率最高为约60％，通过FACS测定，约为5～25％。
另外，同类型的装置，市场上已有KEYENCE公司的等离子体照射仪ST-7000销售，该装置可以产生具有图5所示光谱的等离子体，因而可用于本发明的目的。
实施例2
2-1)向粘附型动物确立细胞株的导入
将动物确立细胞接种于6孔平板，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养过夜。每孔接种的培养细胞数为：若为中国仓鼠肺成纤维细胞则是1×106个，若为来源于人体子宫癌的Hela细胞则是2.5×105个，然后开始培养。确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入50μl GFP表达质粒(pEGFP-C1)溶液(1μg/μl)，通过等离子体发生装置进行等离子体照射。等离子体照射仪的条件为：放电时电极间电压10～14kV、电极间距13mm、频率23.3kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min，在上述条件下分别照射约3秒。对于电极至试样的距离选择适当的条件。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达，计数每个视野内的表达细胞数。另外，用FACS Flowcytometry计数孔内所有细胞中的GFP蛋白表达细胞。
结果，在每种细胞中均观察到GFP的表达。在放电时电极间电压10～14kV、电极间距13mm、频率20kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min的条件下，通过显微镜目测，导入效率最高约为70％，通过FACS测定(相对于培养皿内全部细胞数的基因导入效率)约为30％。用现有方法导入Hela细胞的效率低，但根据本发明的方法，某些区域可以得到约70％的高导入效率。
实施例3.向悬浮型动物确立细胞株的导入
将来源于人急性淋巴母细胞性白血病外周血的T细胞株Jurkat细胞配制成磷酸缓冲悬浮液，使其密度为2.25×107细胞/ml，向25μl该悬浮液中混合等量的GFP表达质粒溶液(2μg/μl)，然后将该混合液加入新的6孔板中，每孔加入50μl。溶液薄薄地铺于孔底之后，通过等离子体发生装置进行等离子体照射。装置的条件按照实施例1进行。等离子体照射之后，立即加入培养基，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养过夜，然后用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达，进一步使用FACS Flowcytometry，计数孔内所有细胞中的GFP蛋白表达细胞。
结果，通过用显微镜进行观察，观察到GFP蛋白的表达。使用FACS测定的导入效率约为25％。
实施例4.向大鼠大脑皮质细胞的导入
大鼠大脑皮质如下制备：将妊娠大鼠(Wister，妊娠第17天)麻醉后剪开腹部，将胚胎连同子宫取出，放入L-15中(GIBCO-BRL制造)，从胚胎全脑中切下并分离出大脑皮质部位。向大脑皮质部中加入40ml0.25％胰蛋白酶溶液和80μl 1％DNA酶溶液，在37℃下孵育20分钟后，去掉上清液，加入10ml FBS，用吸管将细胞打散。使其通过细胞滤过器，加入约20ml Neurobasal培养基(GIBCO-BRL制造)，通过离心收集细胞。使收集的细胞悬浮于起始培养用的Neurobasal培养基(含有25μM谷氨酸、500μM谷氨酰胺、30nM NaSeO3、青霉素、链霉素)，使细胞密度为5×105细胞/ml，在37℃、5％二氧化碳的条件下，使用6孔板开始培养。
确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入50μl的GFP表达质粒溶液(1μg/μl)，通过等离子体发生装置进行等离子体照射。等离子体照射仪的条件为：放电时电极间电压10～14kV、电极间距13mm、频率23.3kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min，在上述条件下分别照射约1秒。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达。
结果观察到GFP蛋白表达细胞。导入效率为每一视野最高约70％。对于用现有的基因导入方法几乎不能进行基因导入的动物原代培养细胞，通过本发明的方法可以更安全、简便且有效地导入基因。
实施例5.向大鼠小脑颗粒细胞的导入
用乙醚麻醉出生第9天的Wister大鼠，摘出脑部，切下小脑，并除去脑脊膜。将小脑细细地切碎后，加入10ml木瓜蛋白酶溶液(向溶解了2mg DL-半胱氨酸(Sigma)、50mg清蛋白的10ml磷酸缓冲液中混入90单位木瓜蛋白酶(Worthington-biochem制造)，在37℃下短暂放置活化后，加入50μl DNA酶I(TaKaRa制造)，使用时过滤器过滤除菌)，在37℃下浸泡约30分钟。向其中加入6ml马血清(HS)，离心，将沉淀的组织悬浮于血清培养基(含有5％PFCS、5％HS的DME/F12(1/1)培养基)。将其铺于包被聚乙烯亚胺的6孔板上，在37℃、5％二氧化碳条件下培养过夜，然后更换为含有1μm AraC(Sigma)、含血清的高钾(26mM)培养基(含5％HS、2.1g碳酸氢钾、30nM Na2SeO4的MEM(SIGMA))，在37℃、5％二氧化碳条件下培养5天。
确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入50μl的GFP表达质粒溶液(1μg/μl)，通过等离子体发生装置进行等离子体照射。等离子体照射仪的条件为：放电时电极间电压10～14kV、电极间距13mm、频率23.3kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min，在上述条件下分别照射约1秒。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达。
结果观察到GFP蛋白表达细胞。导入效率为每一视野最高约70％。对于用现有的基因导入方法几乎不能进行基因导入的动物原代培养细胞，本发明的方法可以更安全、简便且有效地导入基因。
实施例6.向来源于人脐带静脉的血管内皮细胞(HUVEC)的导入
使用正常人脐带静脉内皮细胞Total Kit(东洋纺制造)进行细胞培养。
将正常人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)接种于6孔板，使每孔接种2.5×105个细胞，在37℃、5％二氧化碳条件下培养过夜。在确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入50μl的GFP表达质粒溶液(1μg/μl)，通过等离子体发生装置进行等离子体照射。等离子体照射仪的条件为：放电时电极间电压10～14kV、电极间距13mm、频率23.3kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min，在上述条件下分别照射约1秒和3秒。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达。
结果观察到GFP基因导入了来源于人脐带静脉的血管内皮细胞。导入效率为每一视野最高约50％。对于用现有的基因导入方法几乎不能进行基因导入的动物原代培养细胞，本发明的方法可以更安全、简便且有效地导入基因。
实施例7.PC12细胞分化诱导为交感神经系统
为了探讨根据本发明的方法导入了基因的细胞是否继续维持着其作为细胞的功能，对PC12细胞是否维持分化为交感神经系统的潜能进行了研究。
向根据实施例1进行的、按照本发明的方法导入GFP基因的PC12细胞的培养液中添加NGF，使其含量为100ng/ml，培养6天后，用荧光显微镜观察有GFP蛋白表达的PC12细胞的形态，探讨分化为交感神经样细胞的潜能。
结果表明：根据本发明的方法导入了GFP基因的PC12细胞在添加NGF 6天后，表达GFP蛋白，且从细胞形态观察可以证实神经突起确实得到伸长。由此可以表明：通过等离子体照射的基因导入方法并未改变PC12细胞固有的、对NGF反应而分化为交感神经细胞潜能的性质。
实施例8.通过向PC12细胞导入基因来激活CREB(报道基因测定)
为了探讨根据本发明的方法导入的基因在细胞内是否可以发挥功能，采用报道基因测定来研究导入PC12细胞的CREB是否可被同样导入的PKA基因激活。
将大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞(ATCC No.CRL-1721)接种于包被胶原IV的6孔板上，使每孔含有1×106个细胞，在37℃、5％二氧化碳条件下培养过夜。确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，将PKA基因(pFC-PKA)(1μg/μl)、荧光素酶基因连接到活化CREB效应序列下游的CREB报道基因(pCRE-Luc)(1μg/μl)以及作为内部标准的肾海鳃属(ウミシイタケ)荧光素酶基因(pRL-SV40)各17μl混合，使用该混合液，探讨按照实施例2进行的、根据本发明的方法共导入的PC12细胞在导入1天后的荧光素酶活性。
结果，与导入对照载体的细胞比较，导入了PKA的细胞的荧光素酶活性显著提高，即表明CREB的转录活性提高。由此证实：根据等离子体照射的基因导入方法，导入的基因在培养的确立细胞PC12细胞中表达了其功能。
实施例9.通过向大鼠小脑颗粒细胞导入基因来激活CREB(报道基因 测定)
为了探讨对现有方法难以导入基因的动物原代培养细胞是否可以产生同样的结果，采用大鼠小脑颗粒细胞进行了与实施例8同样的研究。
按照实施例2的方法，用等离子体发生装置，将PKA基因(pFC-PKA)(1μg/μl)、荧光素酶基因连接到活化CREB效应序列下游的CREB报道基因(pCRE-Luc)(1μg/μl)以及作为内部标准的肾海鳃属荧光素酶基因(pRL-SV40)共导入按照实施例5的方法确立的大鼠小脑颗粒细胞中，培养1天后，检查荧光素酶活性。
结果，与导入了对照基因的细胞相比，大鼠原代神经细胞的荧光素酶活性显著提高。因而证实：在大鼠原代神经细胞(大鼠小脑颗粒细胞)中，等离子体导入方法并未使通过PKA的CREB信号转导途径产生异常。
以上表明，通过等离子体照射进行的基因导入方法，也可以向用现有方法难以导入基因的原代神经细胞中导入基因，并表达该基因的功能，另外用该方法还可以简便地进行报道基因测定。
实施例10.通过向大鼠小脑颗粒细胞导入BAD基因来诱导编程性细胞 死亡
按照实施例5制备大鼠小脑颗粒细胞，对于添加了AraC 5天后的细胞，除去培养基，然后向每孔添加50μl诱导编程性细胞死亡的基因BAD基因(pcDNA3.1/GS-BAD)溶液(1μg/50μl)，在实施例2的条件下进行等离子体照射。之后立即加入培养基，在37℃、5％二氧化碳条件下培养过夜，用CaspASE FITC-VAD-FMK原位标记(Promega)测定Caspase活性，由此来探讨是否诱导了编程性细胞死亡。
结果表明，与只导入了载体的模拟细胞相比，在导入BAD基因的细胞中具有显著的Caspase活性，即检出了诱导编程性细胞死亡的细胞。
另外，为了验证根据本发明的方法导入了BAD基因的细胞确实诱导编程性细胞死亡，还使用APO-DIRECT(Pharmingen制造)，结合DNA断裂进行了研究。
结果，在导入BAD基因的细胞中检出了与只导入了载体的模拟细胞相比发生DNA显著断裂的细胞。
这些结果表明，根据本发明的方法导入的BAD基因，对大鼠小脑颗粒细胞显著地诱导了编程性细胞死亡，发挥了其功能。以上表明，根据本发明的方法导入原代培养细胞的基因确实发挥了功能。
实施例11.使用来源于中国仓鼠肺的CHL细胞、来源于人子宫癌的Hela 细胞和大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞进行细胞融合的研究
按照实施例2的方法制备导入GFP基因的CHL细胞和Hela细胞，用荧光显微镜检测融合细胞。另外，使用Dif Quick(国际试药制造)进行核染色，用显微镜观察融合细胞的形态。核染色如下进行：对于经等离子体处理、培养1天后的细胞，吸除细胞培养液，用磷酸缓冲液洗净粘附于培养皿上的细胞，然后每孔加入约5ml甲醇(和光制造)，在室温下固定5分钟。向每孔添加约2ml染色液I后立即吸去，再添加约2ml染色液II后立即吸去。用离子交换水多次洗涤粘附细胞，在显微镜下观察细胞。
在根据本发明的方法导入GFP基因的CHL和Hela细胞中，观察到因细胞融合而变大的细胞。另外，在对经等离子体照射的各个细胞进行核染色时，观察到细胞融合的同时还有核融合的形态，以及细胞融合后变为多核的形态。
另外，在向6孔板每孔接种5×106个的相对多的细胞数的条件下，按照实施例7的方法，向按照实施例1的方法导入GFP基因的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中添加NGF，研究其分化潜能。
证实添加NGF 6天后，GFP蛋白在融合细胞中表达，且神经突起确实得到伸长。由此显示，通过等离子体照射形成的融合细胞也未改变PC12细胞固有的对NGF反应分化为交感神经样细胞潜能的性质。
实施例12.与脂质体方法的组合
研究通过利用本发明的方法，在原本脂质体方法难以导入的条件下，是否可以向细胞导入基因。
脂质体方法是将脂质体试剂与导入质粒混合，制备适当大小的混合粒子，来导入细胞中的方法。因此，需要制备适合导入细胞的尺寸、数量的粒子。使用GFP基因，对于优化条件中的高浓度的质粒和脂质体试剂的条件是否可以改善基因导入细胞的效率的问题进行了如下研究。
事先将100μg GFP表达质粒和100μl Lipofectin2000(GIBO-BRL制造)混合，在室温下静置15分钟，制备质粒/阳离子脂质体结合物。将前一天在6孔板上培养的CHL细胞的培养上清液除去，添加200μl质粒/阳离子脂质体结合物。用等离子体照射仪在频率23.3kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min的条件下进行等离子体照射，之后立即加入培养基，在37℃、5％二氧化碳条件下培养，培养1天后，用荧光显微镜和FACS检出GFP蛋白表达细胞。
在上述条件下，单独使用脂质体法，可检出少量导入了GFP的细胞。与本发明的方法组合使用的方法与单独的脂质体方法相比，在等离子体照射区域，导入基因的细胞增加。另外在用FACS研究导入基因的细胞相对于各孔中总细胞数的比例时，发现与本发明的方法组合的方法比单独的脂质体方法的导入效率增加1.6倍。因此，通过本发明的方法与其他的基因导入方法组合，另外，与脂质体或其他代替脂质体的促进质粒向细胞转移的载体结合，有望在导入效率差的条件下在导入效率差的细胞中提高导入效率。
实施例13.对使用等离子体照射仪向培养细胞导入GFP表达质粒的研 究
方法：将大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞(ATCC No.CRL-1721)接种于包被胶原IV的6孔板，每孔接种1×106个，培养过夜。确认细胞已很好地粘附在平板上之后，从培养平板上除去培养基，向细胞表面加入50μl的GFP表达质粒溶液(1μg/μl)，通过等离子体照射仪ST-7000(株式会社KEYENCE制造)进行等离子体照射。作为等离子体照射仪ST-7000的条件，在频率为高(High)、低(Low)或金属(Metal)3种条件下分别照射约5秒。等离子体照射之后，立即加入培养基，培养过夜，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达。
结果表明：在每种条件下均有GFP的表达。
在频率高的条件下，导入效率最高，为50％～60％。
实施例14
将裸鼠(8周龄、雌性、Nippon Charles River制造)麻醉，将整个腹部薄薄地涂伊文思蓝(10mg/ml生理盐水溶液)。使用等离子体照射装置，以放电时电极间电压10～14kV、电极间距13mm、频率23.3kHz、脉冲周期60Hz、工作比50％、气体为空气、气体流量38L/min的条件照射2.5秒。电极到腹部远点距离约24mm，近点约18mm。放置3分钟后，先用含水脱脂棉，再用含70％乙醇的脱脂棉将涂了伊文思蓝的部位擦拭干净，观察色素在皮肤的沉着。然后分别与只照射等离子体的裸鼠、涂了伊文思蓝但未照射等离子体的裸鼠比较。
结果，只照射等离子体的裸鼠、涂了伊文思蓝但未照射等离子体的裸鼠均未见皮肤的色素沉着。而涂了伊文思蓝并照射等离子体的裸鼠可在其腹部的等离子体照射区域观察到几个蓝色的斑点。约24小时后，仍观察到该斑点。因此可认为通过等离子体照射，伊文思蓝大小的分子量的物质被导入动物个体。
至今已发表了通过非温热超声波使色素经皮导入动物个体的报告(立花克郎；福冈医大/2001年日本分子生物学会)，本发明显示等离子体方法同样可将物质导入动物个体。
工业应用性
根据本发明，可以将多种多样的选定分子高效率地导入多种多样的细胞中。另外也可以进行细胞融合。并且无需象电穿孔方法那样，对一个一个试样使用电极，施加电场这样繁杂的操作，也无需基因枪那样费用高昂的装置。

Claims (6)

1.一种选定分子的导入方法，所述方法包括将选定分子导入细胞的方法，通过将细胞和/或选定分子用低温气体等离子体处理，将存在于细胞附近的选定分子导入细胞内。
2.权利要求1的选定分子的导入方法，所述方法包括预先将选定分子置于细胞附近，用低温等离子体处理细胞。
3.权利要求1或2的选定分子的导入方法，其中所述选定分子是多核苷酸。
4.一种使细胞融合的方法，所述方法包括用等离子体处理细胞使细胞融合。
5.一种装置，所述装置以细胞和/或选定分子为靶，通过低温气体等离子体处理，可使存在于细胞附近的选定分子导入细胞内；或者通过用等离子体处理细胞，使细胞融合。
6.权利要求5的导入选定分子的装置，所述装置具有通过开放性放电进行的低温气体等离子体发生装置。
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