CN102143718A - 用于处理包含活细胞的生物材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于处理包含活细胞的生物材料的方法，其中借助等离子体和至少一种活性物种和在等离子体中存在的电流而将试剂至少部分地带入一部分活细胞和/或一部分细胞外基质中。

Description

用于处理包含活细胞的生物材料的方法

技术领域

本发明涉及处理包含活细胞的生物材料的方法。

背景技术

电穿孔是一种用于处理包含活细胞的生物材料的方法，特别是为了使细胞膜可渗透，为了例如和特别是使DNA渗入细胞中(转化)。在分子生物学中经常使用电穿孔，其中在食品工程和生物加工工程领域中，可以采用电穿孔以改善大量运输过程或灭活微生物。

通过通常通过快速放电的电容器所产生的电场，在所处理的细胞膜中产生显微镜可见的小孔，其在毫秒之内又闭合。几十年以来就知道该电穿孔效应。孔诱导以细胞膜半渗透性的丧失和细胞内组成成分的释放为条件。为了进行电穿孔，使用所谓的电穿孔仪，即产生电场的仪器。电穿孔仪通常具有一个用于液槽或其他储存媒介(其中用移液管将例如和特别是细胞悬浮液移入其中)的地方，其中相应的电极处在细胞悬浮液中。然而，在电穿孔中必须注意所施加的电压和电流和因此所消耗的功率不高，使得在细胞膜上造成不可逆的损伤。

DE 10 2007 030 915A1特别公开了一种装置，其用于借助电极在固体电介质上通过被介电阻挡的气体放电产生的等离子体处理表面，其中所述装置具有柔韧的作用表面，其在处理期间直接地与等离子体邻接。

在DE 20 2006 009 481U1中特别请求保护用于用两者均与高电压源连接的电极和反电极处理人体表面，例如指甲

皮肤等的装置，其中在电极和待处理的及与反电极电连接的表面之间产生等离子体，其中该反电极作为用于待处理的身体部分的座套形成和/或是该座套的组成部分。

DE 601 21 356T2特别地公开了用于处理患者皮肤表面的装置，其包括：具有开口的探针，以便能够与皮肤表面接触，该探针此外具有第一输入端口和第二输入端口；提供高频电压的高频发生器；提供真空的真空泵；连接于真空泵和探针之间的进气管，其中进气管通过第一输入端口在探针中提供真空；同轴电缆，其通过第二输入端口在探针中提供高频电压；设置在探针中并与同轴电缆连接的电极，其中电极的构成使得当通过真空和真空泵在探针中提供真空时，接收发生器的高频功率并提供辉光放电，其中辉光放电提供皮肤表面至皮肤表面下至少预定深度的基本上均匀的加热。

在EP 0 523 961A1中公开了美容学应用系统，其中借助静电充电可以将相应可充电的美容学成分特别是施加到身体的组成部分上。

在DE 602 173 93T2中公开了用于处理包含细胞的生物材料的方法，其中借助电穿孔将试剂带入细胞。在此，缺点是比较差的引入效率。

发明内容

因此，本发明的根本问题在于，提供有效的按照类型的方法，其几乎排除了细胞膜对活细胞的不可逆的损害。

根据本发明，通过根据权利要求1的方法以及根据权利要求22的应用解决该问题。

在根据本发明的用于处理包含活细胞的生物材料的方法中，借助介电阻挡的放电产生等离子体，其中借助该等离子体和至少一种活性物种，将试剂至少部分地带入活细胞的一部分和/或细胞外基质的一部分中。

从等离子体的特殊特性得出在医学和美容学领域的应用领域，特别是在皮肤上的应用或者内部应用。在此可用的效应包括：所处理的生物组织/所处理的细胞对物质和作用原料(Wirkstoffe)的吸收能力的促进；在待处理的组织/所处理的细胞中物质和作用原料的存储(存储作用)的促进；原料/物质的微循环和吸收的促进；局部麻醉作用；用细胞修补机制的刺激诱导自发的组织反应。

被电介地阻挡的放电根据本发明理解为其中在电极上发生放电，其中在电极和待处理的细胞区域之间使用电介质，优选地以一定的固体电介质的形式，因此发挥电容器的作用。

根据本发明，借助等离子体和可以但不是必须地通过等离子体刺激的活性物种，至少部分地将试剂带入活细胞和/或相应的细胞外基质中，其中通过施加等离子体和在至少一种活性物种的存在下，例如和特别是在自由基或离子的情况下，细胞-细胞连接和组织连接的短暂放松成为可能。因此，通常在比较经常发生的存储能力(存储作用)提高的情况下产生通道能力。因此，在任选地存在的细胞刺激的情况下，可以发生单细胞对试剂的吸收能力的短暂的亚致死量的提高，这又导致修补机制的激活。除了局部作用外，还可施加全身(sytemisch)作用的物质，其可通过促进在真皮中渗入和储存物质而从目前储库到达血液循环系统中。

所述试剂选自以下组中：肽、激素、激素类似物、肾上腺皮质激素、免疫抑药物、维生素、抗组胺药物、抗炎剂、止痛药(NSAID，阿片类药物)、局部麻醉剂、肝素药物、抗生素、化妆品、胶体护理液、皮肤自晒黑剂、dsDNA(双链)、ssDNA(单链)、miRNA(微小RNA)、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)。

优选地，活性物种是选自以下组中的至少一种：自由基、离子、通过等离子体刺激的分子、离子、自由基、原子，其中术语“通过等离子体刺激的分子”理解为其振动自由度被刺激或者处于更高的振动水平，由此捕获平移振动、弯曲振动以及旋转振动和扭曲振动和/或将至少一个电子提高到更高的能量水平。

有利地，活性物种选自以下组中：原子氮、原子氧、稀有气体、原子氢、包含OH-的分子、包含CH-的分子、包含CO-的分子、包含NH-的分子、醇、酯、醛、酮、胺、酰胺、氨、氮氧化物、卤素，例如特别是氟、氯、溴和碘。

有利地，在根据本发明的方法中，使用具有柔性的即可逆地变形的作用表面的装置，其在处理期间直接地与等离子体邻接。

根据本发明，术语“作用表面”理解为装置的表面，其在处理期间即在存在的等离子体的情况下直接地与等离子体邻接，并且由于一般的材料特性该材料具有不等于零的介电常数，从而发生气体放电的介电阻挡和因此相应的作用。电介质本身是来自聚集态的固态，并且可以但不是必须地用一种或多种材料涂布，该材料例如在电介质虽然是固态但作为粉末存在并且该粉末被涂布或引入具有粘弹特性并且可相应地成形的类似橡胶的材料中时才实现一定的柔韧性。

因此，在关于介电阻挡的阻挡关于相应的气体放电的同时作用的情况下，与局部情况的机械适配性是可能的。显然，在柔韧的载体上存在/设置颗粒状或粉末形式的固体电介质也是可以想象的。

但也可想象的是，固态的在非柔韧性的意义上存在的固体电介质提供有涂层，其本身是柔韧的或者首先实现或改善柔韧性本身，从而在固体电介质及其布置的作用方面在本发明意义上提供柔韧的作用表面。

该装置的原理是基于，使待处理的物体经受借助于电极和反电极所产生的等离子体，其中有利地在待处理的物体和电极之间设置电介质，从而借助被介电阻挡的气体放电产生等离子体，随后将其施加在待处理的物体上，在此将试剂带入活细胞和/或细胞外基质中。在此，根据本发明，在等离子体作用之前、期间或之后将至少一部分试剂施加在包含活细胞的生物材料上。

通过该刺激原理，在电极和处理区域之间发生冷的气体放电(等离子体)。由此能够对小间隔(0.1至50mm)即接近不接触的和/或毗连的表面和/或空腔在局部狭窄受限的范围内和/或通过更多柔韧的电极或一个组织状结构的相互串联也是大面积地以不同的拓扑学加以处理。从等离子体的特殊特性得出，除了用于处理和消毒相应的表面和/或空腔的应用外，还有在医学领域中的应用领域，特别是在皮肤上的应用或者内部应用。

在此可用的效应例如由在有用的UV-A或UV-B波长范围内低剂量的UV辐射及由在气体放电中活性气体物种(等离子体)组成。因此该方法将更多十分有效的效应加以组合，由此产生减少瘙痒、促进微循环、免疫调节效应以及杀细菌和杀真菌效应，这又在至少一部分鞋垫的应用中是非常有用的。同时还可以使用该装置以处理表面和/或空腔，特别是皮肤，因为由此能够治疗伴随强烈瘙痒的皮肤病以及治疗基于微循环障碍的慢性创伤愈合障碍。

在该装置和在本发明方法的情况下，用100至100,000伏特范围内的电压工作。所设置的电压(参见图13)可以是正弦形的(a)、脉冲形的(b1、b2、c1、c2、d1、d2)(单极的或双极的)、高频脉冲形式(e)或直流电压形式(f)。也可采用不同电压形式的组合。电极可以由导电良好的材料组成，其中反电极由同样的材料组成和/或待处理的物体形成反电极。通常，固体电介质由玻璃、陶瓷或塑料组成。

交变电压频率通常为1至100,000,000s^-1。等离子体处理的作用时间取决于应用领域，可以从几毫秒经几分钟直至几小时。

示例性的电学参数取决于电极面积A为：

a)A(陶瓷)＝0.79cm²；U＝10kV；f(P)＝385Hz；E(放电)＝033mJ；

b)A(陶瓷)＝2cm²；U＝10kV；f(P)＝385Hz；E(放电)＝0.55mJ；

A＝电极面积，V＝所设置的电压，f(P)＝产生等离子体的交变频率和E(放电)＝产生等离子体的放电能量。

在一个有利的实施方案中，该装置具有柔韧的作用表面，其在处理期间直接地与等离子体邻接，特别是，设置具有柔韧表面的固体电介质，这例如可以通过作为颗粒和/或作为粉末设置电介质而实现。但也可通过将例如作为精细粉末的电介质设置在例如由玻璃、陶瓷或塑料制成的柔韧空心纤维之上和/或之中，或者电介质本身是柔韧的空心纤维而实现。空心纤维可以具有0.5μm至2000μm的内径。壁厚度在10μm至2000μm的范围内。空心纤维的长度和与此相关的有效活性长度可以从几个毫米直至几米。从端口至电极或反电极的电连接特别地和例如通过在空心纤维末端的金属触点接通来实现。这例如和特别是以如下方式引入空心纤维的，金属触点接通锁住空心纤维，若还需要是气密性的并因此实现导电连接。将空心纤维、触点接通和端口以如下方式安插入支架，实现从电压供应向触点接通的可靠连接。

由于作用表面的柔韧性，该装置还可以如下方式应用在困难的情况下，例如空腔，如在暴露的创伤的情况下，确保等离子体稳定且均匀地作用在待处理的表面上。

在此情况下，有利的是，电极至少部分地直接贴在电介质表面上，从而在电介质中及在设置特定客体/主体的待处理的表面时，例如在皮肤的情况下其位于电极和反电极之间，在电极和反电极之间所设置的电场设置尽可能高的场强度。

在该情况下及作为可选的实施方案，有利的是，将电极至少部分地借助间隔垫片与电介质表面隔开。因为以此方式在间隔垫片作为导体材料和因此不作为电介质的布置情况下，间隔垫片在其导电能力方面的相应设计在电极的导电能力(非常好的传导性)和电介质的导电能力(差的至绝缘作用)之间从而以此方式使电场向量均匀化，这导致等离子体更好且更均匀的面分布范围。

在该情况下优选的是，电极至少部分地作为涂层贴在电介质上，因为以此方式特别是在电介质作为柔韧的波导管(Hohlleiter)的布置情况下实现了高度柔韧的布置。

但也可想象的是，布置实心材料电极，从而在电介质作为柔韧的空心纤维的布置情况下，在柔韧的空心纤维中可靠地设置作为实心材料的电极。

此外，优选的是，电极是作为颗粒和/或作为粉末构成的，从而以此方式方法保证至少一部分装置的柔韧性(例如可弯曲性)。

然而，还可想象的和有利的是，在工作状态中的电极是电离气体，从而在电介质在柔韧空心纤维之上和/或之中或者作为空心纤维本身的相应布置的情况下，给出特别高的纤维柔韧性(特别是可弯曲性)，这是因为不存在作为固体的核芯材料。

在等离子体施加在表面上的情况下，特别有利的是，根据本发明的装置具有反电极，这是因为以此方式方法可以更好地控制等离子体的施加和引导，不同于其中待处理的物体似乎发挥反电极作用的实施方案。

此外，有利的是，根据本发明的装置具有特别柔韧的抽气设备和/或特别柔韧的输气设备，以能够以此方式借助气体放电有针对性地控制所产生的等离子体，从而例如在个别情况下尽可能迅速地除去可能非期望的氧自由基或氮氧化物，或者有针对性地输入气体，从而例如冷却处理区域和/或针对性引起在表面上和/或在空腔中的反应和/或稳定等离子体。术语“柔韧的”可理解为在可逆的可变形性的意义上相应设备的可调整性和/或可安放性，以满足不同的拓扑学要求。在此，例如输气设备以及抽气设备基本上可以是可弯曲的软管。

抽气设备或输气设备例如可以也由柔韧的空心纤维形成，因为这特别有利于由此获得和/或改善整个系统的柔韧性。

最后，有利的是，至少空心纤维与其自身或者与至少一种其他的例如纤维形式的支持成分一起形成在纺织物技术意义上的组织状单元，例如是瓷砖的形式，因为以此方式方法可以在不同拓扑学的情况下均匀地处理比较大的待处理的表面。可以将该例如瓷砖形式的组织状单元嵌入组织和/或康复装置，例如绷带或假体中。

组织形式可以按照其目的而构成。可能的形式例如和特别是以圆形或多角形构成的。该组织状单元的表面可以具有10mm²直至1m²和更大的活性面积。

然而，还可想象的和有利的是，以如下方式设置柔韧的电极，特别是柔韧的输气和/或特别是柔韧的抽气，形成自由等离子体火焰。在此可以对柔韧的电极进行单面或双面介电阻挡(屏蔽)。通过该实施方案，对具有与其他所述实施方案(最大几个cm)相比更大间隔的表面和/或空腔施加等离子体。该实施方案与表面的传导性及其表面结构无关地进行工作。

此外，柔韧的电极使得等离子体火焰通过激发器(Aktuatoren)和/或在X和/或Y方向(在任意的笛卡尔系统中选择)上的定位单元可以偏转。这是特别有利的，因为由此可以引导等离子体火焰经过表面。

然而，还可想象的是，柔韧性不是必需的，从而根据本发明的装置也具有固态(刚性)表面，例如是板状，其在处理期间直接地与等离子体邻接，特别是在电介质本身具有固态表面时。

根据本发明的方法可用于使dsDNA、ssDNA、miRNA、siRNA、shRNA或基因的无载体转移成为可能。根据本发明，术语载体DNA分子理解为用于在引入外源DNA后其在宿主细胞中的渗入和扩增。

下面，根据在附图中所示的优选的实施例进一步说明和描述用于实施本发明方法的可能的装置。

附图说明

图1概略地描绘了来自现有技术的实施方案的作用原理；

图2概略地描绘了来自现有技术的另一实施方案的作用原理；

图3概略地描绘了来自现有技术的第三实施方案的作用原理；

图4以截面图概略地描绘了根据本发明的第一实施方案；

图5以截面图概略地描绘了本发明方法的第二实施方案；

图6以截面图概略地描绘了本发明方法的第三实施方案；

图7以截面图概略地描绘了本发明方法的第四实施方案；

图8以截面图概略地描绘了本发明方法的第五实施方案；

图9概略地以截面图描绘了本发明方法的第六实施方案；

图10概略地以截面图描绘了本发明方法的第七实施方案；

图11概略地以截面图描绘了医学应用；

图12作为功能概略图描绘了本发明方法的一般应用；

图13概略地描绘了可施加在电极上的各种不同的电压形式；

图14至17概略地以截面图描绘了第八至第十一实施方案。

具体实施方式

从图1可以看出，本发明方法的装置的作用原理图，如由现有技术已知的，在电极(1)和在具有直至在兆赫范围中的频率的几千伏特的交变电压下发挥反电极7作用的待研究的物体O(传导性)的情况下产生电场，其中空气通过相应的气体放电在电极之间转变成等离子体2，从而用等离子体局部地直接处理作为反电极7的待处理的物体。

在图2中所示的原理(现有技术)与图1所示实施方案的区别仅在于，将待处理的物体设置在电极1和反电极7之间并因此处于所产生的等离子体中部。

从图3(现有技术)可以看出，电离气体经过管状输入借助于电极1和反电极7通过气体放电产生相应的等离子体射线2，其被直接引导至待处理的物体上。

在图1至2中所示的原理中，在电极和待处理的物体之间原则上存在相应的固体电介质，其中在图2中此外还在反电极7和待处理的物体之间存在相应的固体电介质3。

以下附图示例性地说明了根据本发明的不同的实施方案。

在图4中，介电材料由玻璃、陶瓷或塑料组成并且作为柔韧的空心纤维5构成，其中空心纤维5的内壁用导电材料例如金属、掺杂半导体或传导性金属氧化物层(铟锡氧化物)(ITO)涂覆，其中涂层发挥电极1的作用。在该构成方式的情况下，通常在仅使用空心纤维5的情况下，待处理的物体发挥反电极的作用。

图5中所示的实施方案与图4所示实施方案的区别仅在于，电极1作为实心材料构成并且由传导性材料例如金属和/或金属合金或类似物组成。

图6中所示的实施方案与图4和5所示实施方案的区别仅在于，电极1作为粉末构成，由传导性材料例如金属和/或金属合金或类似物组成。

图7中所示的实施方案与之前的实施方案的区别在于，电极作为电离气体，例如稀有气体或其他惰性气体或其混合物或由其他可电离的气体组成，其中例如通过施加高于气体电离(等离子体)的击穿电压的高电压，从而产生电离气体。现在电离气体是导电的，因此可以作为电极使用。

图8中所示的实施方案与图4、5、6和7所示实施方案的区别在于，两个由电介质材料组成并且分别具有实心材料电极的相应空心纤维5彼此相邻地纵向排列，从而在施加相应的电压的情况下，上方的电极发挥电极1的作用，下方的电极发挥反电极5的作用，从而通过这两个空心纤维的几何排列调节等离子体的特定几何形状，其中此外还可想象的是更多的空心纤维，以产生等离子体的相应的几何形状。

图9所示实施方案与图4、5、6和7所示实施方案的区别在于，与空心纤维5纵向相邻地设置相应的抽气设备6，从而将任选非期望的成分例如所产生的氧自由基迅速地从待处理的物体除去，从而例如不刺激敏感的皮肤微粒。

图14所示实施方案与图4、5、6和7所示实施方案的区别在于，与空心纤维5纵向相邻地设置相应的柔韧的抽气设备6和柔韧的输气设备8，从而将任选非期望的成分例如所产生的氧自由基迅速地从待处理的物体除去，以及针对性地输入气体，从而例如冷却处理区域和/或有针对性地引起反应。

从图10可以看出，更多个空心纤维5由介电材料组成或者具有由玻璃、陶瓷或塑料制成的介电涂层并且配备有电极，例如是内涂层形式(参见图4的实施方案)，与其他纤维形式的支持单元9联合地形成组织状单元10，从而即使在困难的拓扑结构的情况下(参见图11)，能够相应地适宜的和适配的成型并因此加以应用。

最后，在图12中概略地显示了与发挥反电极和物体作用的一部分皮肤区域H(在此情况下皮肤H是待处理的物体O)相关的一般应用。

图15至17显示了不同的实施方案，与之前的实施方案的区别在于，以产生自由等离子体火焰的方式设置电极/电极和/或气体输入设备。从柔韧的装置排出的等离子体2的自由等离子体火焰可以直接用于局部应用。

在图15所示的实施方案中，等离子体对于电极1和反电极7通过相应的固体电介质3以介电阻挡的方式直接接触。

在图16和17的实施方案中，仅给出如下简单的介电阻挡，等离子体与电极1通过固体电介质3直接接触而加以阻挡，然而与反电极7直接接触，这是因为其本身处于等离子体中并且例如作为导电的柔韧的丝线构成。

图17的实施方案与图16的实施方案的区别主要在于，设置螺旋形的电极1作为围绕固体电介质(在此：空心纤维材料)的外部电极，从而获得或支持一定的机械柔韧性。显然还可想象的是，图15至17所示实施方案可以配备有如图14所示的抽气设备。

附图标记

O-物体

H-皮肤

1-电极

2-等离子体

3-固体电介质

4-作用表面

5-空心纤维

6-抽气设备

7-反电极

8-输气设备

9-支持单元

10-组织状单元

11-支架

12-触点接通

13-电端口

14-气体入口

15-气体出口

16-气体流

Claims (22)

1.用于处理包含活细胞的生物材料的方法，其中借助等离子体和至少一种活性物种和在等离子体中存在的电流而将试剂至少部分地带入一部分活细胞和/或一部分细胞外基质中，其中等离子体是借助被介电阻挡的放电产生的，其中所述试剂选自以下组中：肽、激素、激素类似物、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂、维生素、抗组胺药物、抗炎剂、止痛药、局部麻醉剂、肝素药物、抗生素、化妆品、胶体护理液、皮肤自晒黑剂、dsDNA、ssDNA、miRNA、siRNA、shRNA和基因。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述活性物种选自以下组中：自由基、离子、通过等离子体激发的分子、离子、自由基、原子。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述活性物种选自以下组中：原子氮、原子氧、稀有气体、原子氢、包含OH-的分子、包含CH-的分子、包含CO-的分子、包含NH-的分子、醇、酯、醛、酮、胺、酰胺、氨、氮氧化物、卤素。

4.根据权利要求1至3之一的方法，其特征在于，使用借助电极(1)经过固体电介质(3)通过被介电阻挡的气体放电所产生的等离子体(2)处理表面的装置，其中所述装置具有可逆地可变形的作用表面(4)，其在处理期间直接地与等离子体(2)邻接。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述电介质(3)具有可逆地可变形的表面(4)。

6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于，所述电介质(3)被设置在柔韧的空心纤维(5)之上和/或之中。

7.根据权利要求4至6之一的方法，其特征在于，所述电介质(3)是柔韧的空心纤维(5)。

8.根据权利要求1至3之一的方法，其特征在于，使用借助电极(1)经过固体电介质(3)通过被介电阻挡的气体放电所产生的等离子体(2)处理表面的装置，其中所述装置具有固态作用表面(4)，其在处理期间直接地与等离子体(2)邻接。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述电介质(3)具有固态表面(4)。

10.根据权利要求4至9之一的方法，其特征在于，所述电介质(3)是作为颗粒和/或作为粉末构成的。

11.根据权利要求4至10之一的方法，其特征在于，所述电极(1)至少部分地直接贴在电介质(3)的作用表面上。

12.根据权利要求3至11之一的方法，其特征在于，所述电极(1)至少部分地借助间隔垫片与电介质的作用表面隔开。

13.根据权利要求11至12之一的方法，其特征在于，所述电极(1)至少部分地作为涂层贴在电介质(3)上。

14.根据权利要求11至12之一的方法，其特征在于，所述电极(1)以实心材料构成。

15.根据权利要求11至12之一的方法，其特征在于，所述电极(1)是作为颗粒和/或作为粉末构成的。

16.根据权利要求11至12之一的方法，其特征在于，工作状态中的电极(1)是电离气体。

17.根据权利要求4至16之一的方法，其特征在于具有反电极(7)。

18.根据权利要求4至17之一的方法，其特征在于具有抽气设备(6)和/或输气设备(8)。

19.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述抽气设备(6)和/或所述输气设备(8)是以柔韧的方式构成的。

20.根据权利要求6至18之一的方法，其特征在于，至少空心纤维(5)与其自身或与至少一种其他的支持单元(9)形成组织状单元(10)。

21.根据权利要求4至20之一的方法，其特征在于，以如下方式设置所述电极和/或所述输气设备和/或所述抽气设备，产生自由的等离子体火焰。

22.根据权利要求1至21之一的方法用于无载体转移至少一种选自以下组中的试剂的用途：dsDNA、ssDNA、miRNA、siRNA、shRNA和基因。

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