CN107201309B - 一种新型等离子体诱变育种装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型等离子体诱变育种装置。该装置包括：样品处理系统，其包括无生物活性的污染物的洁净工作仓、等离子体发生器、以及与等离子体发生器连接的射频电源模块；用于对等离子体发生器进行冷却的冷却系统；检测系统，其包括：用于控制产生等离子体射流的气体流量的气体流量控制器、和检测等离子体发生器发射的射流温度的温度传感器；以及用于控制诱变育种装置操作且包括操作面板和控制器的控制系统，所述控制器分别连接射频电源模块、气体流量控制器、温度传感器、冷却系统以及操作面板，所述等离子体发生器在生物样品处理过程中稳定发射37±3℃的等离子体射流。

Description

一种新型等离子体诱变育种装置
技术领域
本发明属于等离子体技术处理设备领域，特别涉及用于生物育种的一种新型等离子体诱变育种装置。
背景技术
品质优良的微生物菌株始终是生物产业的核心，如何利用高效的生物诱变技术实现菌株的快速优化，是生物产业的重要工作。常规的生物诱变方法普遍存在工作效率低、工作量大、盲目性大等问题，化学诱变还易对操作人员造成身体伤害、对环境造成污染，物理诱变的诱变性能较差且微生物反复使用后产生了一定的耐受性，其它方法均需要专业的复杂设备，有的方法操作成本非常高昂，故常规的生物诱变方法已不能适应工业化菌种开发的需要，亟需开发新型、高效、易操作的诱变育种技术，以提高诱变效率、缩短筛选周期。
发明内容
等离子体技术作为一种诱变育种新技术，不仅克服了常规育种周期长、进程慢、难以获得高效变异品种的缺点，而且比基因工程更具效率和成本优势，尤其对具有复杂代谢网络的生物细胞，非转基因诱变方法更有其独特的优势。等离子体是与物质的固态、液态和气态并存的物质第四态，是以大量自由电子和带电离子为主要成分的物质形态，宏观上呈电中性。研究表明，等离子体中大量存在的活性粒子能够作用于不同的生物样品，并引起多种目标性状的改进，在生物技术领域具有良好的应用前景。
目前现有的等离子体诱变育种装置往往仅能处理一个或数个样品。而目前生物育种领域往往需要对大量生物样品进行处理，因此需要等离子体发生器持续长时间工作。此时在整个处理过程中，由于射频电源一直处于工作状态输出射频能量提供给等离子体发生器，等离子体发生器持续产生等离子体射流，随着操作时间的增长，此时产生的等离子体射流的温度会不断升高，存在无法保持长期稳定喷射给定温度范围的等离子体射流的问题。同时，如果这样的装置在夏天或者热带地区长时间使用，喷射的等离子体射流的温度会升高的更快，更无法长时间保持喷射稳定温度范围的射流。
进一步如上所述，在长时间处理多个样品的装置中，需要射频电源一直以稳定的状态发射射频给等离子体发生器。但通常在诱变育种装置中，射频电源会受到诱变育种装置中其它各部件的干扰，从而导致射频电源无法稳定地发射射频能量，进而影响等离子体发生器发射出稳定的射流。此外，如果诱变育种装置长期使用、或者在炎热的地区或季节使用时，等离子体发生器本身的操作温度会逐渐升高，温度升高会导致等离子体发生器的电容值改变，如果此时不能及时调节射频电源的设置，也会导致产生的射流不稳定。目前现有的等离子体诱变育种装置是采用为射频电源设置一个手动的匹配器来匹配该射频电源，此时当射频电源受到干扰或者等离子体发生器的电容值等发生变化时，手动调节与射频电源和等离子体发生器连接的匹配器来使其两者匹配，从而使射频电源传递给等离子发生器适当的射频并由等离子体发生器发出适当的等离子体射流。因此，存在如果干扰较为严重或者温度的变化较为显著时，需要经常或者随时中止操作重新手动进行匹配，从而严重地影响了育种装置对样品处理的效果和效率。此外，为了屏蔽不必要的等离子体装置内部的干扰，现有技术中的装置往往使用的是接地性质较好的钢材料作为壳体，以实现可以屏蔽装置内部的干扰的问题，但这会导致整个诱变育种装置的重量非常重，体积也较为庞大。
针对多个样品进行处理时，还存在如果样品较多，则待处理样品在工作仓内等待的时间较长，处理前，生物样品染菌的风险大幅升高。进一步，如果待处理的样品是液体样品，则在洁净工作仓内放置较长时间后，生物样品中液体成分，例如培养基部分会干燥蒸发，从而导致在对该样品进行处理时可能会出现已经没有足够进行处理的液体体积。另一方面，如果处理后的样品不能及时进行收集，可能也会影响诱变育种的效果。因此，希望新型的等离子体诱变育种装置可以实现在即将喷射等离子体射流前向洁净工作仓内添加待处理的样品，并且在经等离子体处理之后可以迅速地对该样品进行收集。
本发明针对现有技术存在的问题提供一种新型等离子体诱变育种装置。本发明的技术方案如下：
1.一种等离子体诱变育种装置，其包括：
样品处理系统，其包括无生物活性污染物的洁净工作仓、等离子体发生器、以及与等离子体发生器连接的射频电源模块；
用于对等离子体发生器进行冷却的冷却系统；
检测系统，其包括：用于控制产生等离子体射流的气体的流量的气体流量控制器、和检测等离子体发生器发射的射流的温度的温度传感器；以及
用于控制诱变育种装置操作，且包括操作面板和控制器的控制系统，所述控制器分别连接射频电源模块、气体流量控制器、温度传感器、冷却系统以及操作面板，
所述等离子体发生器在生物样品处理过程中稳定发射37±3℃的等离子体射流。
2.根据项1所述的等离子体诱变育种装置，其中，所述射频电源模块包括射频电源和自动对射频电源进行匹配的匹配器，所述射频电源经由匹配器与等离子体发生器连接。
3.根据权利要求2所述的等离子体诱变育种装置，其中，所述样品处理系统、检测系统和控制器设置在一壳体内，所述冷却系统设置在所述壳体外部，且该壳体为铝型材壳体，所述洁净工作仓具有消毒装置安装位置。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的等离子体诱变育种装置，其中，所述温度传感器将检测的射流温度的结果反馈给控制系统，并根据该结果控制冷却系统工作以使整个样品处理过程中等离子体发生器发射的等离子体射流的温度保持在37±3℃。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的等离子体诱变育种装置，其中，等离子体发生器为同轴型结构，且待处理样品的体积为200μl以下，优选为150μl以下，进一步优选在100μl以下，进一步优选在50μl以下，进一步优选在20μl以下，且在3μl以上，优选在5μl以上。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的等离子体诱变育种装置，其中，等离子体发生器为平板型结构，且待处理样品的体积为0.1mL～10mL，优选为0.5mL～10mL，进一步优选1mL～5mL。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的等离子体诱变育种装置，其中，在所述洁净工作仓内设置有步进电机和载物台，所述控制器通过控制步进电机实现载物台的升降或水平旋转以对多个样品进行自动处理，并控制载物台的旋转速度，使得样品处理后自动替换下一待处理样品的时间间隔在5s以内。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的等离子体诱变育种装置，其中，在所述洁净工作仓内设置有载物传送带、加样器、以及样品回收带。
9.根据权利要求8所述的等离子体诱变育种装置，其中，在通过加样器添加样品之后5秒以内，对由载物传送带传送至喷嘴下方的样品喷射射流，处理后的样品在5秒以内由样品回收带回收。
10.根据权利要求9所述的等离子体诱变育种装置，其中，在所述样品回收带上设置有用于回收样品的容纳有保护剂的容器。
本发明的技术效果如下：
根据本发明的等离子体诱变育种装置，即使在炎热的夏季或者是热带地区长时间使用该装置对多个样品进行连续处理，也能够保持等离子体发生器发出的射流温度在37±3℃的范围，从而能够引起微生物适当的应急修复系统，从而有效地激发突变，实现高效地对多个样品进行诱变育种。
由于本发明的等离子体诱变育种装置可以根据不同的样品来更换适当的等离子体发生器，能够实现处理不同类型、不同体积大小的样品。例如可以处理从细菌、放线菌、霉菌到植物细胞、动物细胞、植物组织、动物组织等各种样品。
根据本发明的等离子体诱变育种装置，由于射频电源模块中的匹配器会根据周围环境、温度变化自动对射频电源和等离子体发生器进行匹配，从而不受外界环境和其它部件的干扰的影响，保证等离子体发生器可以稳定地发出在37±3℃温度范围的等离子体射流。此外，由于将匹配器与射频电源模块化，与现有的等离子体诱变育种射频电源模块相比体积减少1/3。并且由于可以采用较为轻便的铝型材壳体，诱变育种装置的重量也与现有装置相比减少了三分之一。在整个操作的过程中，也不需要经常进行手动匹配，从而减少了操作人员的工作强度。
根据本发明的等离子体诱变育种装置，可以处理大量的生物样品。并且可以在多个样品的处理过程中，可以实现即时加样，即时处理，处理后马上进行收集，从而避免了多个样品处理过程中的其他的样品在等待过程中的变干、染菌等风险，能够及时对处理之后的样品进行收集，以确保诱变育种的效果。
附图说明
图1为本发明等离子体诱变育种装置的一实施方式的整体结构示意图。
图2为本发明等离子体诱变育种装置的一实施方式的内部结构示意图。
图3为本发明等离子体诱变育种装置的另一实施方式的内部结构示意图。
图4为本发明的等离子体诱变育种装置的一实施方式中的加样系统的示意图。
图5为本发明的等离子体诱变育种装置的一实施方式中的同轴型结构的等离子体发生器。
图6为本发明的等离子体诱变育种装置的一实施方式中的平板型结构的等离子体发生器。
符号说明：
1 壳体；
2 洁净工作仓；
3 散热孔；
4 操作面板；
5 电源控制按钮；
6 控制器；
7 等离子体发生器；
8 射频电源模块；
10 载物台；
12 喷嘴；
13 温度传感器；
16 气体流量控制器；
20 步进电机；
32 载物传送带；
33 加样器
34 样品回收带
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行说明。
本发明的等离子体诱变育种装置，其用于在常压室温条件下通过等离子体技术对生物育种样品进行诱变育种，其包括样品处理系统、冷却系统、检测系统、以及控制系统。其中样品处理系统，其包括无生物活性污染物的洁净工作仓2、等离子体发生器7、以及与等离子体发生器7连接的射频电源模块8；冷却系统是用于对等离子体发生器7进行冷却的系统；检测系统包括：用于控制产生等离子体射流的气体的流量的气体流量控制器16、和检测等离子体发生器发射的射流的温度的温度传感器13；以及控制系统用于控制诱变育种装置操作且包括操作面板4和控制器6，控制器6分别连接射频电源模块8、气体流量控制器16、温度传感器13、冷却系统以及操作面板4。其中本发明的等离子体诱变育种装置的等离子体发生器7在处理全部样品的过程中稳定发射37±3℃的射流。利用本发明的等离子体诱变育种装置，由于可以保持用于处理生物样品的发射的等离子体射流的温度在37±3℃，能够引起微生物适当的应急修复系统，可以有效地对待处理的生物样品进行育种。
在本发明一个具体的实施方式中，射频电源模块8包括射频电源8’和自动对射频电源进行匹配的匹配器8”。射频电源8’通过匹配器8”与等离子体发生器7连接，射频电源8’将射频源传递给匹配器8”，经匹配器8”匹配后将该射频源的射频能量传递给等离子体发生器7，从而将例如氦气等气体转化为等离子体状态的能量(即等离子体射流)。在射频电源8’和匹配器8”之间存在发送和收集反馈信号的信号线，匹配器8”和等离子体发生器7之间通过射频线连接，通过该射频线匹配器8”可以收集关于等离子体发生器7物理性质(例如，电容值)的信息，且匹配器8”可以通过信号线反馈给射频电源8’该物理性质的信息。当等离子体发生器7的温度随环境变化较为明显或由于长期工作而等离子体发生器7自身温度升高时，等离子体发生器7的物理性质(例如，电容值)会发生改变，此时通过匹配器8”检测出该变化并自动改变其匹配的数值，并将该信号反馈给射频电源8’，从而射频电源8’会根据反馈的信号进行调整发射的射频。由于在本实施方式中，能够自动匹配等离子体发生器的温度变化、以及外界环境的温度变化，可以保持等离子体发生器稳定地接收来自射频电源的射频源，并稳定地发射出温度在37±3℃范围的等离子体射流。此外，通过将射频电源8’和匹配器8”模块化处理，可以大大地减少整个射频电源模块8的体积，与现有的等离子体诱变育种射频电源模块相比体积减少1/3。
在本发明的等离子体诱变育种装置的一实施方式中，等离子体发生器7是同轴型结构的等离子体发生器(以下，有时也称为同轴电极)，同轴型结构的等离子体发生器采用的是同轴型裸露金属用来产生等离子体射流。作为同轴电极的一个实例，如图5所示。同轴电极的出口端形成喷嘴12，喷嘴12的截面积可以是为直径8～20mm的圆形截面。由于同轴电极用于喷射等离子体射流的喷嘴截面积较小，但其可以实现集中稳定地喷射，因此通常通过同轴电极产生的等离子体射流适用于处理面积、体积较小的样品，例如可以用于处理细菌、放线菌、霉菌等的培养悬浮菌液或孢子的悬浮液。在利用同轴电极产生等离子体射流时，待处理样品的体积通常为200μl以下，优选为150μl以下，进一步优选在100μl以下，进一步优选在50μl以下，进一步优选在20μl以下，且在3μl以上，优选在5μl以上。
在本发明的等离子体诱变育种装置的另一实施方式中，等离子体发生器7采用平板型结构的等离子体发生器(以下，有时也称为平板电极)，作为平板型结构的等离子体发生器的具体实例，例如可以参考CN100405879C发明专利中描述的等离子体发生器，采用平板型等离子体发生器可以用于处理体积较大的样品，例如植物种子、植物幼苗、植物愈伤组织等。在利用平板电极产生等离子体射流时，待处理样品的体积通常为0.1mL～10mL，优选为0.5mL～10mL，进一步优选1mL～5mL。作为平板型结构的等离子体发生器的一个实例，如图6所示。
图1示出了本发明的等离子体诱变育种装置一实施方式的整体结构。在该实施方式中，样品处理系统、检测系统和控制器设置在壳体1内，所述冷却系统设置在壳体1外部，如图1中紧靠壳体1设置的小型箱体结构即为冷却系统。
在本发明的等离子体诱变装置的另一实施方式中，该壳体的材料为铝型材。采用铝型材后可以大大减轻装置整体的重量，与现有的装置相比，重量减少约1/3。在现有技术中，往往认为铝型材的接地性能不好，不能有效地屏蔽壳体内各部件之间的干扰，因此在现有技术的装置中通常采用接地更好的钢材料作为壳体。而由于本发明的等离子体诱变育种装置采用了上述射频电源模块8，因此干扰的影响被大大减少，从而可以采用更为轻便、美观的铝型材作为壳体。
在本发明的一实施方式中，所述冷却系统为风冷系统，包括依次连接的外置的水泵、水箱、换热器，等离子体发生器7的两端分别与水泵和散热器相连，形成循环。
在本发明的另一实施方式中，所述冷却系统为水冷系统，包括与等离子体发生器7连接的外置冷却水循环机。此时，外置冷却水循环机通过如下方式与壳体1连接：壳体1上有进水、出水2个接口，外置冷却水循环机的出水口连接在壳体1的进水口上，然后进入到壳体1内部连接到等离子体发生器7的进水口，然后从等离子体发生器7出水口连接到壳体1的出水口上，最后进入到冷却机的进水口形成循环。
在本发明的实施方式中，优选使用水冷系统作为冷却系统。
在本发明的一实施方式中，温度传感器13将检测的射流温度的结果反馈给控制系统，并根据该结果控制冷却系统工作以使整个样品处理过程中等离子体发生器7发射的等离子体射流的温度保持在37±3℃。通过采用这样的方式，保证了等离子体发射器7可以稳定地发射温度在37±3℃范围的等离子体射流。从而确保了本发明的装置可以在炎热季节、炎热的区域长时间稳定的使用。
在本发明的一实施方式中，温度传感器13将检测的射流温度的结果反馈给控制系统，如果射流温度低于37±3℃范围时，控制器6会根据温度传感器13反馈的温度的结果发出“预热中”的信号，此时该结果会显示在操作面板上，以提醒操作者此时不要添加样品，当射频电源模块8持续放出射频，等离子体发生器7发出的等离子体射流的温度会逐渐升高，当升高至37±3℃范围时，温度传感器13将检测到射流温度的结果反馈给控制系统，此时操作面板上会显示“可以进行处理”的信号，提醒操作者可以继续进行添加样品的处理。
在本发明的一实施方式中，洁净工作仓2具有消毒装置安装位置，该消毒装置安装位置为洁净工作仓的壁上所预设的紫外灯灯座以及所述紫外灯灯座的电源线通孔，所述消毒装置为紫外灯，所述紫外灯与控制器相连。在另一实施方式中，该消毒装置安装位置为洁净工作仓的壁上所开的通孔，消毒装置为化学消毒气体补给管，化学消毒气体补给管外连化学消毒气体容器，化学消毒气体补给管通过所述通孔伸入所述洁净工作仓内。
在本发明的一实施方式中，在所述洁净工作仓2内设置有步进电机20和载物台10，所述控制器6通过控制步进电机20实现载物台10的升降或水平旋转以对多个样品进行自动处理，并控制载物台的旋转速度，使得样品处理后自动替换下一待处理样品的时间间隔在5s以内。图2示出了本发明等离子体诱变育种装置的一实施方式的内部结构示意图。
当控制器6通过控制步进电机20实现载物台10的水平旋转时，所述载物台10沿圆周设置有多个用于储存样品的凹陷部，通过载物台10的水平旋转使得所述凹陷部依次与喷嘴对应。在各凹陷部中设置待处理样品，尤其适用于体积比较小的样品，操作面板4通过控制器6控制步进电机20实现载物台10的水平旋转，放置待处理样品的凹陷部依次与同轴电极的喷嘴12或平板电极对应，由等离子体发生器7产生的等离子体射流开始处理样品，在样品处理完成后，载物台10再次水平旋转一个角度，使得下一个待处理样品的凹陷部转到与同轴电极的喷嘴12或平板电极对应的位置进行处理，以此类推，通过简单易行的结构实现大批量尤其是小体积的样品的自动化和连续化诱变处理。
本发明所述装置可以确保等离子体高效、快捷的对生物材料进行处理同时不会被其它杂质、微生物等污染，从而在生物领域有良好的应用价值。通过在洁净工作仓内设置步进电机和载物台，控制系统中的操作面板通过控制器控制步进电机实现载物台的升降或水平旋转以对多个样品进行自动处理，该步进电机控制技术配合载物台的结构使得载物台中的待处理样品随之升降或水平旋转，在某样品处理后自动替换下一待处理样品，实现批量样品连续自动化处理，避免了现有技术通过人工进行样品放置和取出的繁琐工作，确保诱变过程不受杂菌污染，降低了人工成本，提高了诱变育种效率。多功能控制的操作面板实现自动消毒、自动化监测和控制功能，能够更高效率地完成在常压室温环境下的等离子体诱变育种。此外，还可以控制载物台的旋转速度，使得样品处理后自动替换下一待处理样品的时间间隔在5s以内。
在本发明的一实施方式中，所述操作面板上设置有温度显示屏、气体流量设定按钮、气体流量显示屏、处理时间设定按钮、消毒装置控制按钮、步进电机控制按钮、以及照明灯按钮，所述控制器为可编程逻辑控制器，所述可编程逻辑控制器通过串行电缆或现场总线与操作面板连接。
在本发明的一实施方式中，在洁净工作仓2内设置有载物传送带32、加样器33、以及样品回收带34。图3示出了本发明等离子体诱变育种装置的一实施方式的内部结构示意图。图4示出了该加样系统的大致结构。
其中载物传送带32和样品回收带34采用履带传送的方式。履带上从右到左有设置多个孔位，可以放置多个载片，在载物传送带32的一端侧为可以加注样品的加样器33，在加样器33的一侧为等离子体发生器7的同轴电极的喷嘴12或平板电极。传送带运行过程中最靠近加样器33孔位先转移到加样器33的正下方，加入样品后再转移到例如，喷嘴12的正下方进行处理，处理完之后继续移动一段距离后到载物传送带32的边缘并掉落在已经准备好的盛有保护剂的容器(例如EP管)中，之后该容器随着样品回收带34自动位移，下一个空的容器替换其原有位置。后续编号的样品处理过程类似。
在本实施方式中，保护剂可以是例如用于培养该生物样品的液体培养基或渗透压稳定剂，如0.8％左右的无菌生理盐水等。
通过采用上述加样系统，在通过加样器33添加样品之后5秒以内，对由载物传送带32传送至例如，喷嘴12下方的样品喷射射流，处理后的样品在5秒以内由样品回收带34回收。根据本发明的等离子体诱变育种装置，可以处理大量的生物样品。并且可以在多个样品的处理过程中，可以实现即时加样，即时处理，处理后马上进行收集，从而避免了多个样品处理过程中的其他的样品在等待过程中的变干、染菌等风险，处理之后的样品能够即时地进行收集，以确保诱变育种的效果。
在本发明的一实施方式中，所述操作面板上设置有温度显示屏、气体流量设定按钮、气体流量显示屏、处理时间设定按钮、消毒装置控制按钮、载物传送带控制按钮、加样器控制按钮、样品回收带控制按钮以及照明灯按钮，所述控制器为可编程逻辑控制器，所述可编程逻辑控制器通过串行电缆或现场总线与操作面板连接。
本发明的检测系统包括气体流量控制器16和温度传感器13。气体流量控制器16与等离子体发生器7相连，温度传感器13位于等离子体发生器7的同轴电极的喷嘴12或平板电极附近即可，以检测同轴电极的喷嘴12或平板电极喷射的等离子体射流的温度。温度传感器13可采用软管温度探头来调节其角度位置，实时显示洁净工作仓2内及等离子体发生器7从同轴电极的喷嘴12或平板电极喷射的等离子体射流的温度。
控制系统包括操作面板4、电源控制按钮5和控制器6，在一个实施方式中，控制器6分别连接步进电机20、射频电源模块8、气体流量控制器16、消毒装置、照明系统、温度传感器13、冷却系统和操作面板4。控制器6优选为可编程逻辑控制器，该可编程逻辑控制器通过串行电缆或现场总线与操作面板4连接。
在另一个实施方式中，控制器6分别连接载物传送带32、加样器33、样品回收带34、射频电源模块8、气体流量控制器16、消毒装置、照明系统、温度传感器13、冷却系统和操作面板4。控制器6优选为可编程逻辑控制器，该可编程逻辑控制器通过串行电缆或现场总线与操作面板4连接。
操作面板4设置于壳体1外表面，即壳体1的外壁上设置有供操作人员调控控制器6的操作面板4，操作面板4上可以设置有温度显示屏、气体流量设定按钮、气体流量显示屏、处理时间设定按钮、照明灯按钮、参数设置显示按钮和设备说明按钮，还设置有消毒装置控制按钮、步进电机控制按钮和/或载物传送带、加样器、以及样品回收带控制按钮等。该操作面板4整体优选为液晶触摸屏，即可以理解为是液晶触摸屏上具有“当前日期时间”显示屏、“气体流量显示及设定”屏、“温度显示”屏、“处理时间”屏、“照明灯”屏、“消毒装置”屏等等。通过气体流量显示及设定屏能够实时监测等离子体发生系统的供气流量，并对其进行控制。当需要设定供气体流量时，用手指点击操作面板4中的气体流量设定按钮，系统自动弹出“数字设置界面”，在数值输入完毕后，点击确定键，确认输入值。随后，控制器6将调节气体流量至新的设定值，并通过气量显示屏显示。如果上述流量设定值超过给定范围，设定值将不能设定，设定输入框一直显示为0。“温度显示”屏用于显示温度探头测温值，主要用于显示等离子体发生器工作时的环境温度。
本发明所述装置的操作面板可实现对气体流量、处理时间的设置以及对照明灯、消毒装置的控制，以及对步进电机、载物传送带、加样器和样品回收带的控制，实现样品的连续自动化处理、监测和控制功能。该装置的人机互动界面功能完善、操作方法简易，可以将气体激发，产生等离子体，用于生物样品的诱变处理，在生物技术领域有良好的应用前景。
实施例
以下参考实施例，对本发明的等离子体诱变育种装置进一步进行说明。
实施例1：利用不同温度的等离子体射流进行处理时样品的DNA损伤程度
DNA损伤是产生突变的最直接的原因，在DNA发生损伤时，细菌通过lexA和recA的共同作用，引起体内的SOS响应，可通过测定β-半乳糖苷酶的酶活来反映SOS的诱导水平，从而反映DNA的损伤强度。采用Umu-test方法(umu-test AT试剂盒(Isesaki,Japan))表征基因损伤。Umu-test采用2-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷作为底物，利用分光光度法测定β-半乳糖苷酶活性，从而表征SOS的诱导程度，并最终说明DNA的损伤程度。
1.实验菌株：采用S.typhimurium NM2009；该菌株来源于蛋白精制工业公司(Isesaki,Japan)的umu-test AT试剂盒。
2.实验中采用的药品：SDS(十二烷基硫酸钠)、DTT(二硫苏糖醇)、ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氨苄青霉素、氯霉素、NTG(亚硝基胍)、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、胰蛋白胨、Na2CO3、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，以上这些样品均可以商购。
3.实验中使用的培养基和试剂
TGA培养基：溶解10g胰蛋白胨、5g NaCl、11.9g HEPES于900mL水中，调节pH至7.0±0.2，稀释至970mL，然后高压蒸汽灭菌。溶解2g D(+)葡萄糖于30mL水中，高压蒸汽灭菌。
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，蒸馏水。
B缓冲液：溶解40.6g Na2HPO4·12H2O，6.2g NaH2PO4·2H2O，0.75g KCl，0.25gMgSO4·7H2O于900mL水中。调节pH值至7.0±0.2，加入1.0g SDS稀释至1000ml，加入0.154gDTT，并于4℃密封保存。
磷酸缓冲液(P-Buffer)：溶解2.18g Na2HPO4·12H2O，0.61g NaH2PO4·2H2O于100mL水中，调节pH值至7.0±0.2，高压灭菌(121℃，20min)，于4℃密封保存。
ONPG溶液：溶解18mg ONPG于4mL磷酸缓冲液中，黑暗中(或用锡箔纸包裹)振摇2h至溶解。
反应终止液：溶解106g Na2CO3于900mL水中再稀释至1000mL。常温密封保存。
器材：无菌96孔板，酶标仪，16mm玻璃皿(20个)，1.5ml EP管，排枪等。
4.试验步骤
(1)菌株活化和预培养
针对S.typhimurium NM2009，利用LB培养基加氨苄青霉素钠(25μg·ml-1)和氯霉素(25μg·ml-1)的平板培养基对该菌株进行平板活化。将经平板活化的菌株转接至TGA液体培养基过夜预培养。以10％接种量转接至TGA培养基，37℃预培养至该菌株的对数生长期。
(2)菌株诱变
等离子体诱变：将每100μL预培养菌液加入到直径16mm的玻璃皿中。共准备6组实验，其中每组3个对照。诱变条件：通气量10slpm，功率120w，等离子体发生器的喷嘴12与样品之间的距离保持为2mm，测定等离子体射流的温度，并在将等离子体射流的温度分别控制在28℃、34℃、37℃、40℃、45℃的条件下对样品进行诱变，诱变时间60s。照射后菌液不足100μL的由TGA培养基补满100μL。
(3)处理后培养
从上述补充到100μL的处理后的样品中取出各菌液30μL加入到96孔板，同时加入270μLGTA培养基。以不加菌液而且不进行等离子体处理的培养基为空白对照，以加菌液但不进行等离子体处理的培养基为阴性对照。37℃100r·min-1培养2h。培养完成后测定A600。
(4)β-半乳糖苷酶的酶活检测
从处理后培养完成后的菌液中取出30μL转移到新96孔板。同时加入120μL的B缓冲溶液，30μL的ONPG底物溶液溶液。在28℃反应30min。加入上述反应终止液120μL。测定A420，以表征β-半乳糖苷酶的酶活。
(5)结果与计算
对于不同遗传毒性试验中，利用如下mum/sos/检查的试验计算公式计算生长因子G和诱导率Ir的结果：
Figure GDA0001626469030000131
Figure GDA0001626469030000132
G-----------生长因子，其反应了经毒性物质处理后，微生物存活并保持生物活性的能力；
Ir------------诱导率，其反应了经毒性物质处理后，mumC基因被诱导表达的能力；
A600T------待测样品在600nm处的吸光度；
A600B------空白对照在600nm处的吸光度；
A600N-------阴性对照在600nm处的吸光度；
A420T------待测样品在420nm处的吸光度；
A420B------空白对照在420nm处的吸光度；
A420N-------阴性对照在420nm处的吸光度；
表1不同等离子体射流温度处理下的损伤程度对比表
等离子体射流温度/℃ G Ir
28 0.5711 2.8524
34 0.4674 3.6293
37 0.4760 3.8419
40 0.4412 3.3118
45 0.5543 2.7761
结论：由表1可以看出，从28℃起随着等离子体温度的升高，G值不断降低而Ir值不断升高，表明温度升高对S.typhimurium NM2009有致死或抑制其生长的作用，并且增强了DNA的损伤程度，引起微生物的应急修复系统。在等离子体温度高于40℃时，G值出现波动而Ir值明显下降，表明部分菌株在生长方面出现耐受性而且受损伤程度减弱。从表1的结果可以看出，通过将等离子体射流的温度保持在34～40℃的范围时，可以将等离子体射流对于DNA的损伤程度维持较高的范围，能够引起微生物适当的应急修复系统，从而激发有效的突变。
实施例2：利用37±3℃等离子体射流进行诱变时的致死率
1.实验菌种：大肠杆菌ACCC01626。
2.培养基和器材
LB液体培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，蒸馏水。
LB固体培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，蒸馏水。
其他：0.8％生理盐水、10％甘油、枪头、涂布棒、离心管、EP管
灭菌条件：121℃、灭菌20min
3.试验步骤
(1)接种大肠杆菌至LB液体培养基(50mL/250mL)，37℃、200rpm条件下培养12h。
(2)吸取一定量的菌液(3mL左右)，4000rmp离心5min，用生理盐水洗涤菌体2次，最终重悬于一定量的生理盐水中，使菌浓为106-108个/mL(A600在0.6-0.8之间)。
(3)由于大肠杆菌对干燥敏感，在菌液中添加甘油，使甘油的终浓度为5％(菌液与10％甘油1∶1混合)。
(4)吸取10μl菌悬液至载片上，涂布均匀，设置诱变参数：功率120w，气量10SLM，等离子体发生器的喷嘴12与样品之间的距离为2mm，诱变时间30s。开始诱变，利用本发明的装置对8个样品进行连续地诱变，在处理过程中，样品处理后自动替换下一待处理样品的时间间隔被控制在5s以内。在诱变的过程中，温度传感器检测等离子体射流的温度，显示在对8个样品进行诱变的过程中，等离子体射流的温度稳定在37±3℃范围。
(5)诱变后的载片放入EP管中(含1mL生理盐水)。
(6)将装有载片的EP管震荡1min，取100μL涂布在LB培养基平板上，37℃培养16h。
(7)对LB培养基平板上长出的菌落进行计数，计算致死率，绘制致死率曲线，致死率计算公式为：
Figure GDA0001626469030000151
表2八个连续处理的样品的致死率
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
诱变时间 30 30 30 30 30 30 30 30
致死率 75.3％ 73.4％ 73.6％ 74.6％ 72.2％ 72.9％ 73.5％ 73.8％
结论：利用本发明的装置，可以始终将等离子体射流的温度控制在37±3℃范围，在其他诱变参数也相同的情况下，不同批次样品的致死率波动范围小，表明本发明的装置可以稳定地、长时间地诱变处理多个样品。
应当指出，以上所述具体实施方式可以使本领域的技术人员更全面地理解本发明创造，但不以任何方式限制本发明创造。因此，尽管本说明书参照附图和实施例对本发明创造已进行了详细的说明，但是，本领域技术人员应当理解，仍然可以对本发明创造进行修改或者等同替换，总之，一切不脱离本发明创造的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明创造专利的保护范围当中。

Claims (15)

1.一种等离子体诱变育种装置，其包括：
样品处理系统，其包括无生物活性污染物的洁净工作仓、等离子体发生器、以及与等离子体发生器连接的射频电源模块；
用于对等离子体发生器进行冷却的冷却系统；
检测系统，其包括：用于控制产生等离子体射流的气体的流量的气体流量控制器、和检测等离子体发生器发射的射流的温度的温度传感器；以及
用于控制诱变育种装置操作且包括操作面板和控制器的控制系统，所述控制器分别连接射频电源模块、气体流量控制器、温度传感器、冷却系统以及操作面板，
所述等离子体发生器在生物样品处理过程中稳定发射37±3℃的等离子体射流；
所述温度传感器将检测的射流温度的结果反馈给控制系统，并根据该结果控制冷却系统工作以使整个样品处理过程中等离子体发生器发射的等离子体射流的温度保持在37±3℃；
所述射频电源模块包括射频电源和自动对射频电源进行匹配的匹配器，所述射频电源经由匹配器与等离子体发生器连接；
所述匹配器检测到所述等离子体发生器的上述温度变化，然后将信号反馈给射频电源，从而所述射频电源根据反馈信号调整发射的射频。
2.根据权利要求1所述的等离子体诱变育种装置，其中，所述样品处理系统、检测系统和控制器设置在一壳体内，所述冷却系统设置在所述壳体外部，且该壳体为铝型材壳体，所述洁净工作仓具有消毒装置安装位置。
3.根据权利要求1或2所述的等离子体诱变育种装置，其中，等离子体发生器为同轴型结构，且待处理样品的体积为200μl以下，且在3μl以上。
4.根据权利要求3所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为150μl以下。
5.根据权利要求3所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为100μl以下。
6.根据权利要求3所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为50μl以下。
7.根据权利要求3所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为20μl以下。
8.根据权利要求3所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为5μl以上。
9.根据权利要求1或2所述的等离子体诱变育种装置，其中，等离子体发生器为平板型结构，且待处理样品的体积为0.1mL～10mL。
10.根据权利要求9所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为0.5mL～10mL。
11.根据权利要求9所述的等离子体诱变育种装置，其中，待处理样品的体积为1mL～5mL。
12.根据权利要求1或2所述的等离子体诱变育种装置，其中，在所述洁净工作仓内设置有步进电机和载物台，所述控制器通过控制步进电机实现载物台的升降或水平旋转以对多个样品进行自动处理，并控制载物台的旋转速度，使得样品处理后自动替换下一待处理样品的时间间隔在5s以内。
13.根据权利要求1或2所述的等离子体诱变育种装置，其中，在所述洁净工作仓内设置有载物传送带、加样器、以及样品回收带。
14.根据权利要求13所述的等离子体诱变育种装置，其中，在通过加样器添加样品之后5秒以内，对由载物传送带传送至喷嘴下方的样品喷射射流，处理后的样品在5秒以内由样品回收带回收。
15.根据权利要求14所述的等离子体诱变育种装置，其中，在所述样品回收带上设置有用于回收样品的容纳有保护剂的容器。
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