CN101624591A - 一种利用等离子体对微生物进行诱变育种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种等离子体诱变微生物的方法，是用以中性活性粒子为作用粒子的等离子体射流辐照待诱变微生物，得到突变的微生物。本发明方法中，起主要诱变作用的是等离子体射流中的中性活性粒子，具有以下优点：得到的正向突变菌株活性更高，生产目标产物的能力更强，遗传稳定性高；诱变周期短、诱变效率高；可诱变微生物种类丰富，如原核微生物、真核微生物、古细菌等，既可以是微生物菌落，也可以是菌悬液或者孢子悬浮液；处理后的微生物不需要避光培养，进一步简化了实验操作；整个操作简单、安全、无污染，设备和实验成本低等特点，将在工业微生物诱变育种领域中发挥更大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物诱变育种的方法，特别涉及一种利用等离子体诱变微生物的方法。
背景技术
微生物菌种是发酵工业的基础和关键，能否提高发酵工业效率、降低产品成本，关键在于能否选育出优质的微生物菌种，因此微生物育种工作变得越来越重要。随着研究的不断进展，目前已有很多不同水平的微生物育种技术出现并逐步成熟。其中，诱变育种已经在改造微生物菌种、解决育种工作某些特殊问题及开发新产品等领域中取得了快速的进展，其不仅可以克服常规育种周期长、进程慢、难以获得高效变异品种的缺点，而且与基因工程相比，诱变育种操作简单，尤其对于改造那些具有复杂代谢网络的菌种来说，更具有效率和成本优势，因此，诱变育种一直是发酵工业中一种很重要的育种手段。
迄今为止，工业微生物诱变育种的方法主要有化学诱变、物理诱变或两者复合诱变。
化学诱变是利用化学诱变剂改变DNA的结构从而引起微生物的遗传变异。目前普遍使用的化学诱变剂包括碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂等。化学诱变的优点在于具有专一性，对基因的某些部位具有毒性，且用量少，操作设备简单。但是此方法的缺点也同样明显，因90％的化学诱变剂都是致癌物质或者极毒药品，对人体及环境均有危害，所以使用时必须非常谨慎；而且此方法的诱变稳定性差，不适合具有复杂代谢网络的微生物的改造。
物理诱变又称为辐射诱变，可以分为电离辐射和非电离辐射，它们都是以量子为单位的、可以发射能量的射线。电离辐射中的X射线和60Co产生的γ射线都是高能电磁波，它们可以在照射过程中把物质分子或原子上的电子击中而产生正离子，而快中子虽不直接产生电离，但在穿过物质时能把原子核中的质子撞击出来而产生电离；电离辐射主要引起基因突变和染色体畸变。非电离辐射中的紫外线在穿过物质时可以使分子或原子中的内层电子能级提高，不产生电离；非电离辐射主要使DNA形成二聚体。其它的辐射还包括激光诱变技术、太空诱变技术等。物理诱变的后代变异率低，效果不够理想，稳定性低，不适合具有复杂代谢网络的微生物的改造，而且有些物理诱变如太空诱变等，其成本非常高，使处理品种类型和数量都受到严重的限制。
近年来等离子体应用于微生物诱变育种的研究也开始起步。等离子体是与物质的固态、液态和气态并存的物质第四态，是一种正离子和电子的密度大致相等的电离气体。等离子体具有特殊的光、热、声、电等物理性质和化学性质，已经在臭氧合成、紫外光源的制备、高功率CO2激光器的制造等很多领域得到了广泛的应用。等离子体作为一种物理灭菌手段，具有快速、低温、操作简便、无毒性以及杀灭效果好等优点。将等离子体用于生物诱变育种还是一个崭新的技术，相关报道甚少。
由于微生物对热的敏感性，能够用于微生物突变的等离子体还限于冷等离子体。当前，在低气压条件下可以产生大面积的非平衡冷等离子体，但由于真空腔的存在，一方面使得设备的制造和维护费用大大增加，另一方面也使得处理微生物的整个过程变得复杂近来。近年兴起的一种离子束注入诱变技术就是一种在低压条件下的非平衡等离子体，其主要通过高电压将气体电离形成离子，然后通过加速电场获得带有高动能的离子，由此作用于目标生物而引起诱变效应，其最早用于农业育种，目前在微生物育种上也取得一定进展。但离子束注入技术对靶室的真空度要求非常严格，整套设备很庞大，样品的拿取非常麻烦，而且离子束温度很高(400℃)，故对微生物杀伤率很大，而且在操作过程细胞中的水分很快失去，造成微生物的死亡，从而降低了诱变效率，以上这些都严重的制约了离子束注入技术在工业微生物育种上的应用。
目前能够产生可以作用于微生物的冷等离子体的发生装置主要有介质阻挡放电等离子体发生器以及采用裸露金属电极结构的等离子体发生器等。
中国发明专利CN 1478892A报道了用等离子体改造微生物的方法，但该专利中使用的是真空高压放电等离子体，处理对象只针对酵母菌，而且处理时间较长，数小时至数百小时。中国专利CN1888063A报道用大气压冷等离子体进行微生物诱变，但该专利中使用的等离子体发生装置为常规的介质阻挡放电等离子体发生器，工作电压很高(1-100kv)，样品需要放置在电极板之间进行处理，主要作用因素为等离子体激发过程中产生的紫外线以及带电粒子，处理后必须避光培养，而且此技术主要作用为紫外线效应，因而诱变效率相对较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种等离子体诱变微生物的方法。
本发明所提供的等离子体诱变微生物的方法，是用以中性活性粒子为作用粒子的等离子体射流辐照待诱变微生物，得到突变的微生物。
本发明的以中性活性粒子为作用粒子的等离子体射流可由现有的大气压条件下的气体放电冷等离子体源产生，例如介质阻挡放电等离子体源、电晕放电等离子体源或射频大气压辉光放电等离子体源；产生等离子体射流时所用的放电气体可以是氦气、氩气、氮气、氧气和空气中的一种或其任意混合，所加的电压可为1kHz-100MHz、小于等于1kV的射频电压。
在用所述等离子体射流诱变微生物时，等离子体射流的温度可为10-90℃；可以通过调节外加电源的功率调节射流温度。
所述待诱变微生物距离所述等离子体射流可以小于等于2cm。
所述待诱变微生物的辐照时间可以小于15分钟。
待诱变微生物可为固体培养基上的菌落，或者101-109cfu/ml的菌悬液或者孢子悬浮液。
其中，所述待诱变微生物可以为原核微生物、真核微生物、古细菌等，例如细菌或放线菌。所述放线菌具体可为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)；所述细菌具体可为发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)。
本发明中所述等离子体射流诱变微生物的方法，起主要诱变作用的是等离子体射流中的中性活性粒子。主要作用粒子为中性粒子的等离子体射流具有以下优点：得到的正向突变菌株活性更高，生产目标产物的能力更强，遗传稳定性高；诱变周期短、诱变效率高；可诱变微生物种类丰富，如原核微生物、真核微生物、古细菌等，既可以是微生物菌落，也可以是菌悬液或者孢子悬浮液；处理后的微生物不需要避光培养，进一步简化了实验操作；整个操作简单、安全、无污染，设备和实验成本低等特点，将在工业微生物诱变育种领域中发挥更大的作用。
本发明方法是在大气压、低电压条件下产生的等离子体射流，其温度低，避免了射流温度高而引起大量微生物样品致死的现象；本发明方法中所使用的放电气体种类多，大大丰富了激发态活性粒子的种类，因其具有更为丰富的物理和化学效应，所以可以获得更为丰富的突变株。
附图说明
图1为质粒DNA处理后的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为阿维菌素标准样品HPLC分析曲线。
图3为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)原始出发菌株发酵结果HPLC分析曲线。
图4为阿维链霉菌等离子诱变后所得菌株(Streptomyces avermitilis，LEBTH245 CGMCC No.2154)发酵结果HPLC分析曲线。
图5为发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCC No.2173及发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的生长曲线。
图6为传代培养发孢甲基弯菌(MEtyylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCCNo.2173的对数生长中期的菌体光密度及甲烷单加氧酶活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
使用同轴电极放电装置进行诱变，该装置为中国专利ZL200620023045.1中所示裸露电极的圆型大气压放电冷等离子体发生器系统。诱变条件为：
1、外加电源为射频电源，外加电压为小于等于1kv，一般操作在200v、频率为1kHz-100MHz的射频电压。
2、产生等离子体的放电气体为氦气、氩气、氮气、氧气和空气其中的一种或任意混合。
3、载片的材质为金属(如铜、不锈钢等)、玻璃、塑料、硅片等，所用载片的直径为5-12mm。不同材质的载片的诱变效果无明显差异。
4、射流温度为10-90℃。温度可以通过调节功率的方式进行调节。
5、带有样品的载片距射流出口小于等于2cm。
6、辐照时间为小于等于15min。
7、诱变样品的浓度为101-109cfu/ml，优选为106cfu/ml，向载片上的滴加量为10-1000ul，优选为10-50ul。
利用诱变的具体实验步骤如下：
1、样品载片的制备：
1)菌悬液或孢子悬浮液的制备：
将菌体培养至对数生长期，然后取培养液以5000-10000r/min的速度离心2分钟，收集沉淀并用缓冲液、无菌水或生理盐水洗涤2-3次，将其稀释至101-109cfu/ml的菌悬液，优选为106cfu/ml，制得菌悬液。
在无菌条件下，将固体平板上的孢子菌落挑入装有0.5-5ml缓冲液、无菌水或生理盐水的试管中，优选为2ml，用玻璃棒搅拌，振荡使孢子分散均匀制得孢子悬浮液；或者在斜面试管中加入0.5-5ml缓冲液、无菌水或生理盐水，优选为2ml，使用接种铲将培养基表面孢子刮下，再用玻璃棒搅拌，并振荡使孢子分散均匀制得孢子悬浮液。将制得的孢子悬浮液稀释至浓度为101-109cfu/ml，优选为106cfu/ml。
2)样品载片的制备：在无菌条件下，将上述1)中制得的菌悬液或孢子悬液，滴加在载片(该载片的直径可为5-12mm，可由金属、玻璃、塑料、硅片等制成)上，滴加量为10-1000ul，优选为10-50ul。
3)样品载片的风干处理：在无菌条件下，将上述2)所制得的液体载片置于冷风下风干。冷风温度为0-50℃，优选为室温；风干时间为小于或等于2h，优选为40min；最终风干至载片表面无明显液滴，样品含水量为60％-99％。
2.诱变操作：
1)将载物台上的载片放置区域用75％酒精擦拭；
2)将步骤1制得的样品载片置于载台上，使载片与射流出口的距离为小于等于5cm；
3)打开工作气体阀门。工作气体即放电气体为纯氦气、纯氩气、纯氮气、纯氧气和空气中的一种或其任意组合。
4)打开外加电源，外加电压为小于等于1kV、频率在1kHz-100MHz的射频电压；
5)通过调节外加电源的功率调节射流温度至10-90℃；
6)对样品进行辐照。辐照时间为小于或等于15min。
3、分离和筛选：
将步骤2中经过诱变处理的载片置于装有0.5-10ml(优选为2ml)灭菌液体的具塞试管中，剧烈振荡，以将载片上的菌体或孢子洗脱。无菌液体为无菌水、缓冲液或液态培养基。
将所得的孢子或菌体悬浮液做5个10倍梯度稀释，取100-1000μl稀释前及稀释后的5个浓度梯度的菌悬液或孢子液分别涂布于筛选平板上，优选为200μl。筛选平板根据目标设计配制。将涂布后的平板置于原始菌株最适培养条件下进行培养。
筛选条件可以是底物耐受型、抗生素耐受型、噬菌体耐受型、产物耐受型、表型突变型、营养缺陷型、温度敏感型、渗漏缺陷型、细胞膜透性突变型等。
在培养后致死率在90％-99.99％的平板上根据所设计筛选条件挑选单菌落；在无菌条件下将其转接入斜面培养基进行扩大培养；将扩大培养后的菌体转入种子培养基进行培养，再在无菌条件下将种子培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养。测量发酵液中目标产物的含量；根据所测得的目标产物的产量或者质量确定目的菌株。
下面结合具体的实施例来进一步说明本诱变方法。
实施例1、利用等离子体对DNA进行处理
该实例中所使用的DNA如下：
pUC119，3162bp，从TaKaRa生物公司购买(货号：D3318或D3319)。该实施例中具体实验步骤如下：
1)样品载片制备：
将pUC119或pUC118质粒用无菌水稀释，取5μL溶液滴加于清洁的载片上，备用。
2)样品处理：
a、将载台上的载片放置区域用75％酒精擦拭，然后封闭；
b、将制得的样品载片置于载台上，使载片与射流出口的距离为2-4mm；
c、打开工作气体阀门。工作气体即放电气体为氦气；
d、打开外加电源，外加电压为200V、13.56MHz的射频电压；
e、此时射流温度至30±3℃；
f、样品进行辐照。辐照时间分别为30s，1min，3min，5min，7min；采用UV透过率为88％的石英片遮挡等离子束，照射时间3、5、10min。
3)处理后样品的检测分析：
按照上述方法每次处理载片一个。处理后的样品用5μL无菌水进行溶解，所得处理后溶液通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果如图1所示，其中泳道1、2分别代表标记物和对比组，泳道3-7分别为氦等离子体射流处理0.5、1、3、5和7分钟的样品，8-10泳道为经UV透过镜片遮挡后的射流等离子束处理3、5和10分钟的样品。
由图1可见，由于等离子体射流中活性粒子的作用，pUC119质粒的双链结构可以在处理很短的时间内(小于3min)被破坏，而等离子体射流中的紫外线却很难起到此作用。微生物产生遗传变异的根本原因在于DNA的改变，本结果揭示出，等离子体诱变主导因素是等离子束中的活性粒子，而非紫外线。
实施例2、利用等离子体诱变阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)
该实施例中所使用的培养基如下：
固体培养基：高氏I培养基。121℃高压灭菌15分钟。
种子培养基：每升培养基中含有马铃薯淀粉30g，麦芽膏(北京莱博生物实验材料研究所20070610)2g，大豆蛋白胨(北京双旋微生物培养基制品厂，02-31)2g，CoCl2·6H2O 5mg，余量为水；所述种子培养基的pH为7.0-7.2。121℃高压灭菌15分钟。
发酵培养基：每升培养基中含有马铃薯淀粉50g，酵母粉(北京奥博星生物技术有限责任公司，01-14)12g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，KCl 4g，CaCO32g，CoCl2·6H2O 5mg，余量为水；所述发酵培养基的pH为7.0-7.2。121℃高压灭菌15分钟。
该实施例中具体的实验步骤如下：
1)样品载片制备：
将阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)接种于固体培养基中，28℃培养5-8天，此时固体斜面培养基表面已富含孢子；将2ml灭过菌的生理盐水加入到固体培养基上，用接种铲将表面孢子刮下，然后充分振荡试管，使孢子分散均匀，制得孢子悬浮液；用生理盐水将制得的孢子悬浮液稀释至105-6cfu/ml。
取105-6cfu/ml的孢子悬浮液50ul，将其滴加在灭菌冷却后的载片上，然后将其置于无菌工作台冷风室温风干，整个操作过程在无菌条件下进行。风干约40min后，金属载片表面不见明显液滴，此时样品含水量约为80％。
2)样品诱变：
a、将载台上的载片放置区域用75％酒精擦拭，然后封闭；
b、将制得的样品载片置于载台上，使载片与射流出口的距离为2-4mm；
c、打开工作气体阀门。工作气体即放电气体为氦气；
d、打开外加电源，外加电压为200V、13.56MHz的射频电压；
e、此时射流温度至30±3℃；
f、样品进行辐照。辐照时间为3min。
按照上述方法每次处理载片一个。
3)诱变菌株的筛选：
将处理后的载片置于装有2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈振荡，将载片上的孢子洗脱，并使其分散均匀，制得孢子悬浮液。取上述孢子悬浮液200ul，涂布于用于筛选的固体培养基上，28℃培养5d；在致死率90％以上的平板上挑取表型(菌落颜色，皱褶等)明显变化的菌株，在无菌条件下将其转接入固体斜面培养基进行扩大培养，编号，28℃下培养5-8天；
种子培养：在无菌条件下，将其转接入种子培养基中，28℃培养48h，得到种子培养液。
发酵培养：在无菌条件下，将上述种子培养液以2％(V∶V)的接种量转接入发酵培养基中，28℃发酵培养10d。
阿维菌素的提取：取5mL发酵液，5000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL丙酮，剧烈振荡2min，间隔10min，继续振荡2min，反复4次；再加入3mL乙酸乙酯，剧烈振荡2min，间隔10min继续振荡2min，反复4次；静置10min，提取上清液50μl加入到2mL甲醇中，振荡混匀，作为液相样品。
阿维菌素含量的检测：采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：AgilentTC-C184.6×200mm，流速1.0mL/min，柱温35℃，流动相甲醇∶水(80∶20)，紫外检测波长为245nm。并设未诱变的原始菌株为对照。阿维菌素标准品由河北威远生化有限公司提供，有效成分阿维菌素B1a纯度＞99％。
在以上色谱条件下，阿维菌素B1a标准品的保留时间为11.3分钟(图2)；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)原始出发菌株发酵结果HPLC分析曲线如图3所示，其中，12min处峰为阿维菌素有效成分B1a；阿维链霉菌等离子诱变后所得菌株(Streptomyces avermitilis，LEBTH245 CGMCC No.2154)发酵结果HPLC分析曲线如图4所示，其中，12min处峰为阿维菌素有效成分B1a。
由图3、4对比可以看出，诱变株的发酵产物中B1a的绝对含量和相对含量(B1a在所有阿维菌素8种组分中的量)都较出发菌株高。
结果表明：处理时间3min时，致死率达到90％以上，从其涂布的平板上挑取的10株菌中，其中3株为正向突变，分别记作1#、2#、3#，其生产阿维菌素B1a的能力分别较原种提高了60％，47％，37％。生产阿维菌素B1a的能力提高为60％的菌叫作除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)LEBTH 245(即阿维链霉菌)，已于2007年09月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No.2154。
实施例3、等离子体诱变发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b(ATCC 55314)
一、等离子体诱变发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b(ATCC55314)
本实验中所使用的培养基的组成如下：
NMS(Higgins’nitrate minimal salt)液体培养基：每升培养基中含有0.85克NaNO3，0.53克KH2PO4，2.17克Na2HPO4，0.17克K2SO4，0.037克MgSO4·7H2O，0.007克CaCl2·2H2O，11.2毫克FeSO4·7H2O，2.5毫克CuSO4·5H2O，2毫升微量元素贮存液，0.5毫升H2SO4溶液，余量为水；所述NMS培养基的pH为7.0。121℃高压灭菌15分钟。
H2SO4溶液的浓度为1mmol/L。
微量元素贮存液的组成为：ZnSO4·7H2O，0.2042克/升；MnSO4·4H2O，0.223克/升；H3BO3，0.062克/升；Na2MoO4·2H2O，0.048克/升；CoCl2·6H2O，0.048克/升；KI，0.083克/升。所述微量元素贮存液的溶剂为水。
NMS固体培养基是在每升上述NMS液体培养基中加入15g琼脂得到的。
具体的实验步骤如下：
1、样品载片的制备
以II型甲烷氧化菌中的发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b(ATCC 55314)为出发菌株。
向装有30mL NMS液体培养基的100mL带挡板的密闭玻璃培养瓶中接入1.2mLOD600为0.312的发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的悬浮液，即接种量为4％(V/V)，加盖橡胶塞，密封；用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气30mL，然后用已灭菌的滤膜孔径为0.2μm的气体过滤器(Sartorius，
2000)向瓶中注入甲烷至瓶内恢复大气压(一个大气压)；在温度为30℃、转速为150rpm、旋转半径为12mm的条件下振荡培养，每24h重新充入混合气体(空气∶甲烷＝1∶1，V/V)至瓶内恢复大气压(一个大气压)，离心收集生长至对数生长期的发孢甲基弯菌(MEthylosinus trichosporium)OB3b，将其重悬于PBS磷酸缓冲溶液中，制得出发菌株发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的悬浮液，其OD600为0.9、细胞干重为1.8g/L。
PBS磷酸缓冲溶液的组成为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4 1.44g/L，KH2PO40.24g/L；所述PBS磷酸缓冲溶液的pH为7.2。
取上述出发菌株发孢甲基弯菌(Methlylosinus trichosporium)OB3b的悬浮液50uL，滴加在灭菌冷却后的不锈钢载片上，载片直径10mm，然后将载片置于无菌工作台，室温自然风干至载片表面无明显液滴。全部操作过程在无菌条件下进行。
2、诱变操作
a、将载台上的载片放置区域用75％酒精擦拭，然后封闭；
b、将制得的样品载片置于载台上，使载片与射流出口的距离为2mm；
c、打开工作气体阀门。工作气体即放电气体为纯氦气；
d、打开外加电源，外加电压为200V、13.56MHz的射频电压；
e、此时的射流温度为30±3℃；
f、将样品进行辐照。辐照时间为3min。
按照上述方法每次处理载片一个
3、诱变菌株的筛选
将步骤2中经等离子体诱变处理后的载片分别置于装有1ml PBS磷酸缓冲溶液的离心管中，剧烈振荡，以将载片上的菌体洗脱。取所得的菌体悬浮液200ul，涂布于用于筛选的NMS固体培养基平板上。涂布后的平板置于30℃、空气和甲烷体积比为1∶1的环境中培养，培养至第6天。挑取平板上的菌落分别接入10ml NMS液体培养基中，加盖橡胶塞，密封；用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气45mL，然后用已灭菌的滤膜孔径为0.2μm的气体过滤器(Sartorius，
2000)向瓶中注入甲烷至瓶内恢复大气压，在温度为30℃、转速为150rpm、旋转半径为12mm的条件下振荡培养，每24h重新充入混合气体(空气∶甲烷＝1∶1，V/V)至瓶内恢复大气压(一个大气压)。
通过测量其对数生长期的菌体浓度及所产生的甲烷单加氧酶的活性来验证是否是目的诱变菌株。结果得到一株对数生长期的菌体浓度为1612-1786mg细胞干重/L发酵液、甲烷单加氧酶的活性为452-1492U/mg细胞干重的菌株，该正向突变菌的编号为LEB-5，已于2007年09月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No.2173。
二、检测发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5的特性
(一)、利用发孢甲基弯菌(MEthylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCC No.2173发酵生产甲烷单加氧酶
本实验中所使用的培养基的组成如下：
NMS(Higgins’nitrate minimal salt)液体培养基：每升培养基中含有0.85克NaNO3，0.53克KH2PO4，2.17克Na2HPO4，0.17克K2SO4，0.037克MgSO4·7H2O，0.007克CaCl2·2H2O，11.2毫克FeSO4·7H2O，2.5毫克CuSO4·5H2O，2毫升微量元素贮存液，0.5毫升H2SO4溶液，余量为水；所述NMS培养基的pH为7.0。121℃高压灭菌15分钟。
H2SO4溶液的浓度为1mmol/L。
微量元素贮存液的组成为：ZnSO4·7H2O，0.2042克/升；MnSO4·4H2O，0.223克/升；H3BO3，0.062克/升；Na2MoO4·2H2O，0.048克/升；CoCl2·6H2O，0.048克/升；KI，0.083克/升；所述微量元素贮存液的溶剂为水。
NMS固体培养基是在每升上述NMS液体培养基中加入15g琼脂得到的。
具体实验步骤如下：
1、菌株活化：将发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5接种于NMS固体培养基上，划线后置于30℃、空气与甲烷的体积比为1∶1的环境中培养6天。
2、种子培养：挑取平板上的菌落接入装有10ml NMS液体培养基的培养瓶中，加盖橡胶塞，密封；用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气45mL，然后用已灭菌的滤膜孔径为0.2μm的气体过滤器(Sartorius，
2000)向瓶中注入甲烷至瓶内恢复大气压(一个大气压)，在温度为30℃、转速为150rpm、旋转半径为12mm的条件下振荡培养，每24h重新充入混合气体(空气∶甲烷＝1∶1，V/V)至瓶内恢复大气压(一个大气压)，制得种子培养液。
3、发酵培养：取1ml步骤2中生长至对数生长期(72h)、OD600为0.2、细胞干重为1.52g/L的种子培养液，在无菌条件下将其接入装有30ml NMS液体培养基的100ml培养瓶中，加盖橡胶塞，密封；用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气30mL，然后用已灭菌的滤膜孔径为0.2μm的气体过滤器(Sartorius，2000)向瓶中注入甲烷至瓶内恢复大气压(一个大气压)，在温度为30℃、转速为150rpm、旋转半径为12mm的条件下振荡培养，每24h重新充入空气和甲烷的混合气体至瓶内恢复大气压(一个大气压)，该混合气体中空气和甲烷的体积比为1∶1。每隔24小时测定一次OD600，并绘制生长曲线。
实验设三次重复，并以原始菌株即未经诱变的发孢甲基弯菌(Methylosinustrichosporium)OB3b为对照。
结果如图4所示，发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCCNo.2173的对数生长期为72-120小时，在144小时达到最高生长量；发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的对数生长期为72-120小时，在96小时达到最高生长量。在各个生长阶段，发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5CGMCC No.2173的生长量均明显高于发孢甲基弯菌(Methylosinustrichosporium)OB3b。
其中，OD600和细胞干重的换算关系为：细胞干重＝1.42+0.48×OD600。换算结果表明：发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCC No.2173培养至72、96、120、144小时的菌体含量分别为1634±12mg细胞干重/L发酵液、1714±17mg细胞干重/L发酵液、1725±23mg细胞干重/L发酵液和1732±24mg细胞干重/L发酵液；发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b培养至72、96、120、144小时的菌体含量分别为1248±15mg细胞干重/L发酵液、1342±11mg细胞干重/L发酵液、1461±14mg细胞干重/L发酵液、1471±8mg细胞干重/L发酵液。
4、酶活测定
根据甲烷单加氧酶催化丙烯生成环氧丙烷的反应来测定酶活，具体按照下述文献中所描述的方法测定：Burrows K.J.，Cornish A.，etal，Substratespecificities of the soluble and particulate methane monooxygenases ofMethylosinus trichosporium OB3b.J.Gen.Microbiol.1984(130)：3327-3333。其中，甲烷单加氧酶的酶活定义为在30℃下，每分钟催化1微摩尔(μmol)丙烯转化为环氧丙烷所需的酶量，即1U＝1μmol环氧丙烷/分；酶的比活单位定义为1mg细胞干重中所含的酶活力单位，即1U/mg细胞干重。
具体方法如下：
将发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5和发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b培养72、96、120、144小时的发酵液于12000rpm离心，收集菌体，弃去上清液，将菌体重悬于含20mM HCOONa和5mM MgCl2的20mM磷酸缓冲液中至菌液OD600为0.5；然后将菌液装于总体积为70ml的反应瓶中，胶塞密封后用针管抽取20ml空气，再充入20ml丙烯气体，于30℃水浴摇床中反应30min。12000rpm离心3min，测定上清液中环氧丙烷浓度。
测定装置及条件为：气相色谱仪器(岛津GC-2010)，色谱柱(型号AT-5，固定液：5％苯基聚硅氧烷，95％甲基聚硅氧烷；柱长：25m，内径0.32mm，膜厚3.0μm)，进样器200℃，柱箱50℃，检测器200℃，载气N2，流速25cm/sec，H2 30ml/min，空气300ml/min，进样量1μl。实验设三次重复，结果如表1所示。
表1诱变菌及原始菌所生产的甲烷单加氧酶的比活
注：诱变菌为发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5原始菌为发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b
(二)、利用发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCCNo.2173发酵生产甲烷单加氧酶
本实验中所使用的培养基的组成如下：
NMS(Higgins’nitrate minimal salt)液体培养基：每升培养基中含有0.5gNaNO3，0.2g KH2PO4，1.5g Na2HPO4，0.12g K2SO4，0.025g MgSO4·7H2O，0.002gCaCl2·2H2O，10mg FeSO4·7H2O，2.0mg CuSO4·5H2O，1ml微量元素贮存液，0.1mlH2SO4溶液，余量为水；所述NMS培养基的pH为6.8。121℃高压灭菌15分钟。
H2SO4溶液的浓度为0.1mM。
微量元素贮存液的组成为：ZnSO4·7H2O，0.1克/升；MnSO4·4H2O，0.2克/升；H3BO3，0.012克/升；Na2MoO4·2H2O，0.012克/升；CoCl2·6H2O，0.011克/升；KI，0.07克/升；所述微量元素贮存液的溶剂为水。
NMS固体培养基是在每升上述NMS液体培养基中加入15g琼脂得到的。
本实验中培养发孢甲基弯菌(Mryhylosinus trichosporium)LEB-5的过程中，除培养温度、空气与甲烷的体积比、振荡转速及旋转半径不同外，其余均与(一)中的培养过程相同。本实验中的培养温度为27℃，空气与甲烷的体积比为1∶0.5，振荡转速为130转/分，旋转半径为10mm。
本实验中甲烷单加氧酶酶活按照(一)中的方法测定。
实验设三次重复。分别测发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5CGMCC No.2173培养至72、96、120、144小时的OD600，分别为：0.478、0.657、0.733、0.741，将其换算成菌体含量，分别为1649±23mg细胞干重/L发酵液、1735±34mg细胞干重/L发酵液、1771±17mg细胞干重/L发酵液、1775±32mg细胞干重/L发酵液。分别测发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCC No.2173培养至72、96、120、144小时的酶活，结果见表2。
表2发孢甲基弯菌LEB-5产生的甲烷单加氧酶的比活
| 生长时间(小时) | 酶比活(U/mg细胞干重) |
| 72 | 475±23 |
| 96 | 700±12 |
| 120 | 1023±21 |
| 144 | 1112±18 |
(三)、利用发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCCNo.2173发酵生产甲烷单加氧酶
本实验中所使用的培养基的组成如下：
NMS(Higgins’nitrate minimal salt)液体培养基：每升培养基中含有1.5克NaNO3，1.0克KH2PO4，2.9克Na2HPO4，0.25克K2SO4，0.05克MgSO4·7H2O，0.010克CaCl2·2H2O，13毫克FeSO4·7H2O，3.5毫克CuSO4·5H2O，5毫升微量元素贮存液，1毫升H2SO4溶液，余量为水；所述NMS培养基的pH为7.2。121℃高压灭菌15分钟。
H2SO4溶液的浓度为5mmol/L。
微量元素贮存液的组成为：ZnSO4·7H2O，0.5克/升；MnSO4·4H2O，0.25克/升；H3BO3，0.092克/升；Na2MoO4·2H2O，0.050克/升；CoCl2·6H2O，0.095克/升；KI，0.09克/升。所述微量元素贮存液的溶剂为水
NMS固体培养基是在每升上述NMS液体培养基中加入15g琼脂得到的。
本实验中培养发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5的过程中，除培养温度、空气与甲烷的体积比、振荡转速及旋转半径不同外，其余均与(一)中的培养过程相同。本实验中的培养温度为33℃，空气与甲烷的体积比为1∶1.5，振荡转速为200转/分，旋转半径为15mm。
本实验中甲烷单加氧酶酶活按照(一)中的方法测定。
实验设三次重复。分别测发孢甲基弯菌(Methyiosinus trichosporium)LEB-5CGMCC No.2173培养至72、96、120、144小时的OD600，分别为：0.428、0.637、0.731、0.737，将其换算成菌体含量，分别为1625±12mg细胞干重/L发酵液、1726±13mg细胞干重/L发酵液、1775±9mg细胞干重/L发酵液、1775±11mg细胞干重/L发酵液。分别测发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5 CGMCC No.2173培养至72、96、120、144小时的酶活，结果见表3。
表3发孢甲基弯菌LEB-5产生的甲烷单加氧酶的比活
| 生长时间(小时) | 酶比活(U/mg细胞干重) |
| 72 | 483±12 |
| 96 | 714±14 |
| 120 | 1123±17 |
| 144 | 1352±15 |
(四)、发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5的遗传稳定性检测
取1ml(一)中生长至对数生长中期即96h的发孢甲基弯菌(Methylosinustrichosporium)LEB-5CGMCC№.2173的种子培养液，在无菌条件下将其接种于装有30mlNMS培养基的培养瓶中，按照(一)中的方法进行培养，培养至对数生长中期96h时(第一代)；从中取1ml菌液，在无菌条件下将其接种于装有30mlNMS培养基的培养瓶中，按照实施例2中的方法进行培养，培养至对数生长中期96h时(第二代)；如此再继续传代培养8代。测定1-10代每代生长至对数生长中期(96h)的菌体光密度及甲烷单加氧酶的活性，测定方法如同(一)中所述，结果如图5所示。
结果表明：在传代培养的1-10代中，每代生长至对数生长中期(96h)的菌体光密度OD600都保持在0.62-0.65的一个很稳定的范围内，发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)LEB-5生产的甲烷单加氧酶的活性也都保持在693-730U/mg细胞干重的一个很稳定的范围内。
Claims (8)
1、一种等离子体诱变微生物的方法，是用以中性活性粒子为作用粒子的等离子体射流辐照待诱变微生物，得到突变的微生物。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述等离子体射流的温度为10-90℃。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待诱变微生物距离所述等离子体射流小于等于2cm。
4、根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述待诱变微生物的辐照时间为小于15分钟。
5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待诱变微生物为原核微生物、真核微生物或古细菌。
6、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待诱变微生物为菌落、孢子悬浮液或者菌悬液。
7、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述待诱变微生物为细菌或放线菌。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述放线菌为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)；所述细菌为发孢甲基弯菌(Methylosinustrichosporium)。
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