DE60005854T2

DE60005854T2 - Verfahren zur beurteilung der genotoxizität einer verbindung

Info

Publication number: DE60005854T2
Application number: DE60005854T
Authority: DE
Inventors: Marc Pallardy; Daniel Marzin; Sophie Meintieres; Armelle Biola
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2020-11-18
Also published as: US6713261B1; ATE251751T1; EP1230546B1; DE60005854D1; JP2003514540A; FR2801320B1; CA2391998A1; EP1230546A1; WO2001036970A1; FR2801320A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung der Genotoxizität einer Verbindung, die ein Risiko für Mensch oder Tier darstellen kann.
In einer Zeit, in der sich die kombinatorische Chemie entwickelt, welche die Synthese zahlloser neuer Verbindungen ermöglicht, kommt den toxikologischen Kurzzeitstudien ein zunehmender Stellenwert im Rahmen der Entwicklung dieser Verbindungen zu, die in Industrien wie der pharmazeutischen, Argar-, Lebensmittel-, Kosmetikindustrie usw. von Nutzen sein können.
Denn bei der Entwicklung einer neuen Verbindung finden vor jeder ersten Humanexposition unabdingbare Studien statt, welche die vorgegebenen "Voraussetzungen" beinhalten. Dabei handelt es sich zumindest um Toxizitätsstudien durch einmalige und subakute Verabreichung sowie die basale Beurteilung des mutagenen und genotoxischen Potentials.
reichung sowie die basale Beurteilung des mutagenen und genotoxischen Potentials.
Insoweit die meisten kanzerogenen Substanzen mutagen wirken und umgekehrt, ist es von wesentlicher Bedeutung, daß im Zusammenhang mit der Genotoxizität zuverlässige Tests zum Einsatz kommen, die absolut sichere Schlußfolgerungen hinsichtlich der potentiell mutagenen Auswirkungen einer Verbindung über Gen-, Chromosomen- oder auch Genommutationen im Bereich der Körper- oder Keimzellen ermöglichen.
Im Hinblick auf eine Beurteilung der Genotoxizität der in Frage kommenden Verbindungen setzt die Industrie Tests ein, die den Nachweis einer klastogenen (Chromosomenbruch) oder aneugenen Wirkung (Kernspindelanomalie) ermöglichen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben jedoch dargelegt, daß der Nachweis einer klastogenen Wirkung durch Verbindungen beeinträchtigt werden kann, die zwar nicht klastogen sind, aber zu einer Apoptose bei Vorhandensein von Kernereignissen führen können. Diese getesteten Verbindungen erweisen sich daher als "falsch positiv" bzw. als "übertrieben positiv" und sind von jeder weiteren Anwendung auszuschließen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben ein Verfahren zur Beurteilung der Genotoxizität einer Verbindung entwickelt, das die Lösung dieses Problems der "falsch positiven" oder "übertrieben positiven" Befunde ermöglicht.
Die Erfindung hat insbesondere ein verfahren zur in vitro-Beurteilung der Genotoxizität einer Verbindung zum Gegenstand, bei dem die besagte Verbindung mit wenigstens einer Zelle oder einem Zelltyp in Kontakt gebracht wird, die bzw. der das Protoonkogen bcl2 und/oder ein verwandtes antiapoptotisches Protein überexprimiert, und die genotoxischen Wirkungen der besagten Verbindung auf die besagte Zelle beobachtet werden.
Die Erfindung hat mit anderen Worten die Verwendung von das Protoonkogen bcl2 und/oder ein verwandtes antiapoptotisches Protein überexprimierenden Zellen zur Beurteilung der Genotoxizität einer Verbindung zum Gegenstand, wobei die mit der Apoptose allein verbundenen Einflüsse ausgeschaltet werden.
Bei der zu testenden Verbindung kann es sich um jede beliebige Verbindung natürlichen oder synthetischen Ursprungs handeln, die unterschiedslos als "Verbindung", "Produkt" oder "Substanz" bezeichnet wird. Es kann sich dabei um eine Mischung mehrerer bestimmter oder unbestimmter Moleküle handeln, wie zum Beispiel um einen Extrakt tierischer oder pflanzlicher Herkunft. Die zu testende Verbindung kann von therapeutischem Interesse oder insbesondere in der chemischen, agrochemischen, Lebensmittel- oder Kosmetikindustrie von Nutzen sein.
Nach einer ersten Ausführungsart der Erfindung können diese positiven genotoxischen Wirkungen durch die Bildung von Mikrokernen beobachtet werden.
Dieser Mikrokern-Test, der insbesondere von Matsuoka und anderen, 1993, sowie von Kirsch-Volders und anderen, 1997, beschrieben wird, beruht auf dem folgenden Prinzip:
Bei der Mitose der Säugetierzellen erreichen die Chromosomenbruchstücke oder ganze Chromosomen, bei denen keine Segregation stattgefunden hat, nicht den Hauptkern während der Telophase, wobei sie unter dem Mikroskop in Form von Mikrokernen, die vom Hauptkern getrennt sind, beobachtet werden können.
Der Ursprung der DNA-Fragmente, die zur Entstehung der Mikrokerne führen, kann entweder in DNA-Schädigungen (klastogene oder aneugene Wirkungen von genotoxischen Verbindungen) oder in der Teilung als Folge der Apoptose (Wirkungen von proapoptotischen Verbindungen) bestehen.
Nach einer zweiten Ausführungsart der Erfindung können positive genotoxische Wirkungen einer Verbindung durch das Vorhandensein von numerischen und/oder strukturellen Anomalien der Chromosomen in der Metaphase beobachtet werden.
Dieser Metaphasenanalyse-Test ist insbesondere von Evans und anderen, 1987, beschrieben worden.
Das Prinzip dieses Tests läßt sich wie folgt zusammenfassen: Die Zellen werden mit der zu testenden Verbindung behandelt, woraufhin durch Spreitung und Färbung der (durch ein Blockiermittel wie Colcemid) in der Metaphase arretierten Zellen die Chromosomen anomalien (Brüche, Rearrangierungen ...) bestimmt werden.
Diese beiden Ausführungsarten (Mikrokern-Test und Metaphasenanalyse-Test) können vorteilhafterweise komplementär durchgeführt werden.
Dadurch werden andere Ausführungsarten des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht ausgeschlossen, bei denen bcl2 und/oder ein verwandtes antiapoptotisches Protein überexprimierende Zellen zum Einsatz kommen.
Da im übrigen bestimmte Verbindungen eine metabolische Aktivierung erfordern, um ihre genotoxischen Wirkungen auszuüben, besteht die Möglichkeit, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu der zu testenden Verbindung einen Aktivator oder ein metabolisches Aktivierungssystem wie etwa "S9 mix" hinzuzufügen, das eine subzelluläre mikrosomale Rattenleber-Fraktion (Kirkland und andere, 1989) enthält.
Gemäß der vorliegenden Verbindung wird die zu testende Verbindung mit das Protoonkogen bcl2 und/oder ein verwandtes antiapoptotisches Protein überexprimierenden Zellen in Kontakt gebracht. Die Überexpression von bcl2, das als Apoptosehemmer bekannt ist, schafft ein Ungleichgewicht zwischen Induktoren und Hemmern der Apoptose der Familie bcl2/bax. Die Überexpression des Proteins bcl2 verhindert daher die Apoptose der Zellen.
Unter "mit bcl2 verwandtem antiapoptotischem Protein" ist jedes Protein der Familie blc2 zu verstehen, das eine antiapoptotische Wirkung aufweist, wobei die Eigenschaften dieser Familie durch Biolo und andere, 1999, beschrieben werden.
Die Homologie zwischen den verschiedenen Proteinen dieser Familie ist in drei Regionen mit den Bezeichnungen BH1, BH2 und BH3 konzentriert, die ihre Dimerisierungsfähigkeiten mit anderen Mitgliedern der gleichen Familie sowie ihre Apoptoseregulierungsfunktionen kontrollieren. Alle antiapoptotischen Mitglieder enthalten außerdem einen Bereich BH4, der in der Nähe ihres N-terminalen Endes lokalisiert ist. Diese Proteine besitzen darüber hinaus an ihrem C-terminalen Ende hydrophobe Aminosäuren, die eine wichtige Rolle bei ihrer Verankerung in den intrazellulären Membranen zu spielen scheinen.
Unter den mit bcl2 verwandten antiapoptotischen Proteinen kann vorzugsweise bcl-XL angeführt werden, das eine sehr ausgeprägte Homologie mit bcl2 aufweist (Biolo und andere, 1999; Chao und andere, 1995).
Bei den verwendeten Zellen handelt es sich um eukaryotische Zellen, und zwar vorzugsweise um Säugetierzellen. Nach einer bevorzugten Ausführungsart der Erfindung handelt es sich um CTLL-2-Zellen. Die dem Fachmann hinreichend bekannten CTLL-2-Zellen stammen aus einer kontinuierlichen Zellinie von zytotoxischen T-Lymphozyten, bei der es sich um einen von der Maus C57b1/6 abgeleiteten Subklon handelt. Diese Zellinie ist in der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC TIB-214 verfügbar und ist in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben worden (Gillis und andere, 1977; Hu und andere, 1997). Es können auch andere Zelltypen verwendet werden, wie beispielsweise L5178Y, CHO, V79, Fibroblasten oder menschliche bzw. tierische Lymphomzellen oder andere eukaryotische Zellen. Eine CTLL-2-Zellinie kann durch ein bcl2 oder eine verwandte Sequenz enthaltendes Plasmid nach dem Fachmann bekannten Transfektions- und Transformationsmethoden transfektiert werden. Die Präparation von CTLL-2-bcl2-Zellen ist insbesondere in dem Artikel von Deng und anderen, 1993, beschrieben worden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Zellen so transfektiert werden, daß sie ein mit bcl2 verwandtes antiapoptotisches Protein, wie etwa bcl-XL, überexprimieren, was nach Standardmethoden erfolgt, die dem Fachmann bekannt sind, der die entsprechenden Gensequenzen kennt (Bolse und andere, 1993).
Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei der Ermittlung von durch apoptotische Vorgänge bedingten falsch positiven Befunden wirksam. Darüber hinaus ermöglicht es den Nachweis der Substanzen, die ein wirkliches klastogenes oder aneugenes vermögen aufweisen, ohne Apoptose-Induktoren zu sein.
Aufgrund seiner Sensitivität und seiner Reproduzierbarkeit handelt es sich um ein geeignetes großtechnisches Verfahren zur Beurteilung der Genotoxizität von Verbindungen.
Die nachfolgenden Figuren und Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne ihren Geltungsbereich einzuschränken.
LEGENDE DER FIGUREN
In allen Figuren haben die dargestellten Sterne die folgende Bedeutung:
*: p < 0,05 gegenüber der Negativkontrolle
**: p < 0,1 gegenüber der Negativkontrolle
1A stellt eine Metaphasenanalyse von Humanlymphozyten dar, die 44 Stunden lang mit Dexamethason behandelt wurden.
1B stellt die Messung der Apoptose in den mit Dexamethason behandelten Humanlymphozyten nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
2A stellt eine Metaphasenanalyse der mit Dexamethason behandelten CTLL-2-Zellen (durchgezogene Linie) und CTLL-2-bcl2-Zellen (gestrichelte Linie) dar.
2B stellt die Messung der Apoptose in den mit Dexamethason behandelten CTLL-2-Zellen (schraffierte Säulen) und CTLL-2-bcl2-Zellen (weiße Säulen) nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
3A stellt die Anzahl der Mikrokern-Zellen unter den mit Dexamethason behandelten CTLL-2-Zellen (durchgezogene Linie) und CTLL-2-blc2-Zellen (gestrichelte Linie) dar.
3B stellt die Messung der Apoptose in den mit Dexamethason behandelten CTLL-2-Zellen (schraffierte Säulen) und CTLL-2-bcl2-Zellen (weiße Säulen) nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
4A stellt die Anzahl der Mikrokern-Zellen unter den 4 Stunden lang mit Etoposid behandelten Humanlymphozyten dar.
4B stellt die Messung der Apoptose in den mit Etoposid behandelten Mikrokern-Zellen nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
5A stellt eine Metaphasenanalyse von 4 Stunden lang mit Etoposid behandelten Humanlymphozyten dar.
5B stellt die Messung der Apoptose in den mit Etoposid behandelten Humanlymphozyten nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
6A stellt die Anzahl der Mikrokern-Zellen unter den mit Etoposid behandelten CTLL-2-Zellen (durchgezogene Linie) und CTLL-2-blc2-Zellen (gestrichelte Linie) dar.
6B stellt die Messung der Apoptose in den mit Etoposid behandelten CTLL-2-Zellen (schraffierte Säulen) und CTLL-2-bcl2-Zellen (weiße Säulen) nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
7A stellt eine Metaphasenanalyse der mit Etoposid behandelten CTLL-2-Zellen (durchgezogene Linie) und CTLL-2-bcl2-Zellen (gestrichelte Linie) dar.
7B stellt die Messung der Apoptose in den mit Etoposid behandelten CTLL-2-Zellen (schraffierte Säulen) und CTLL-2-bcl2-Zellen (weiße Säulen) nach dem Annexin-V-FITC-Nachweisverfahren dar.
BEISPIELE
Beispiel I: Mikrokern-Tests in den CTLL-2- und CTLL-2-bcl2-Zellen
A – Zellsysteme
1) CTLL-2-Lymphozytenzellen
Die murine Zellinie CTLL-2 ist ein von der Maus C57b1/6 abgeleiteter Subklon von zytotoxischen T-Lymphozyten, deren Proliferation vom humanen rekombinanten Interleukin-2 (IL-2) abhängig ist.
Die Zellen werden in einem Komplettmedium Cl RPMI 1640 (Gibco BRL) kultiviert mit:
10% fetalem Kälber-Serum, dekomplementiert 30 Minuten lang bei 56°C (Gibco BRL)
0,01% Natriumpyruvat zu 20 mg/ml (Sigma)
2 mM L-Glutamin (Gibco BRL)
22 mM HEPES (Sigma)
100 UI/ml Penicillin (Gibco BRL)
0,1 mg/ml Streptomycin (Gibco BRL)
5·10-5 M β-Mercaptoethanol (Merck)
1 ng/ml IL-2
Die Protokolle zum Einfrieren, Auftauen und Aufbewahren der Zellen bei 37°C stellen sich wie folgt dar:
– Einfrieren der CTLL-2- und CTLL-2 Bcl2-Zellen
Die Zellen werden 5 Minuten lang mit 200 g zentrifugiert, und der Rückstand wird auf 3,5·10⁶ Zellen für 0,5 ml dekomplementiertes fetales Kälber-Serum eingestellt, woraufhin 0,5 ml der Zellsuspension in ein Kryoröhrchen umgefüllt werden, das 0,4 ml dekomplementiertes fetales Kälber-Serum und 0,1 ml DMSO (Merck; Charge K2308267-651) in einem Verhältnis von 3,5·10⁶ Zellen/ml enthält.
Die Zellen werden allmählich eingefroren (–1°C) und in Flüssigstickstoff bei –196°C aufbewahrt.
– Auftauen der CTLL2- und CTLL-2 Bcl2-Zellen
Das Kryoröhrchen wird in ein Wasserbad mit 37°C gestellt.
Der Inhalt wird in 49 ml Komplettmedium RPMI 1640 C1 umgefüllt und anschließend im Medium C1 auf 1/10 verdünnt.
Nach 24 Stunden im Trockenschrank bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ und 95% Feuchtigkeit wird die Kultur in einer 50 ml Flasche (Falcon, Becton Dickinson) 5 Minuten lang mit 200 g zentrifugiert, wobei der Rückstand in 50 ml C1 wieder in Suspension versetzt und in eine 10 ml Flasche abgefüllt wird.
– Aufbewahren der CTLL-2- und CTLL-2 Bcl2-Zellen
Die CTLL-2-Zellen werden im Medium C1 kultiviert, das zweimal pro Woche erneuert wird. Die in Malassez-Zellen ausgezählten Zellen werden so verdünnt, daß beim folgenden Durchgang die Dichte 300.000 Zellen/ml nicht übersteigt, wobei davon auszugehen ist, daß die Verdoppelungszeit 12 Stunden beträgt.
Diese Kulturen werden in einen Trockenschrank mit 37°C unter einer Atmosphäre mit 5% CO₂ und 95% Feuchtigkeit gestellt.
2) CTLL-2-bcl2-Zellen
Die CTLL-2-bcl2-Zellen stammen aus der Transfektion von CTLL-2-Zellen mittels Elektroporation durch das Plasmid pSFFV-bcl2-neo (Plasmid bereitgestellt durch das Labor von Dr. Korsmeyer, Washington University, Saint Louis, Missouri, Referenznummer des Plasmids: 3088), das ein Eco-RI-Insert mit 1,9 kb kodierend für das humane bcl2-Protein enthält, angeordnet unter der Kontrolle der Region LTR des Virus SV40, sowie ein Resistenzgen gegen Ampicillin und Geniticin (G418), (Renvoize und andere, 1997).
Das Plasmid wird durch das Restriktionsenzym Scal in einem Verhältnis von 1 Einheit pro Schnittstelle und pro μg Plasmid bei 37°C 16 Stunden lang linearisiert. Anschließend wird das Enzym 15 Minuten lang bei 60°C inaktiviert, und das Plasmid wird in Ethanol 100% ausgefällt. Die Transfektion der Zellen mit dem Plasmid (10 μg Plasmid für 10 Millionen Zellen) erfolgt durch Elektroporation (Biorad, 250 V, 960 μF). Danach werden die Zellen wieder 48 Stunden lang im Komplettmedium kultiviert, woraufhin die stabilen Transfektanten in Gegenwart von 800 μg/ml Geniticin (Gibco) mindestens 15 Tage lang und anschließend 48 Stunden lang durch Deprivation in IL-2 selektioniert werden. Die so selektionierten Zellen werden durch Verdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) im Verhältnis von einer Zelle alle zwei Vertiefungen kloniert.
Das Einfrieren, Auftauen und Aufbewahren der CTLL-2 bcl2-Zellen erfolgt nach genau der gleichen Vorgehensweise wie bei den CTLL-2-Zellen.
3) Periphere Lymphozyten
Die Proben von Humanlymphozyten werden durch Isolierung auf Ficoll-Gradient (Hypaque 1077; Sigma; Charge 077H6024) nach Verdünnung des peripheren Bluts auf 1/2 in RPMI 1640 (Gibco BRL; Charge 3001360) mit darin enthaltenem 0,08‰ Heparin (Sanofi) für einen besseren Wirkungsgrad gewonnen.
Das Blut wurde mittels venöser Punktion durch Vacutainer-System mit Lithium-Heparin (Becton Dickinson) unter sterilen Bedingungen bei einem freiwilligen, gesunden, nicht rauchenden Blutspender entnommen. der weder eine rezente medizinische Behandlung noch eine Bestrahlung erhalten hatte und der von keiner rezenten viralen Infektion betroffen war.
Die Zellen werden bei 37°C in einem Komplettmedium RPMI 1640 (Gibco BRL) C2 kultiviert mit:
20% fetalem Kälber-Serum, dekomplementiert 30 Minuten lang bei 56°C (Gibco BRL)
22 mM L-Glutamin (Gibco BRL)
0,1 mg/ml Streptomycin (Gibco BRL)
100 UI Heparin
+2 mL Phytohämagglutinin A (Wellcome) für 100 ml Medium.
B – Untersuchte Substanzen
1) Aneugene
– Griseofulvin
Griseofulvin ist ein Hemmstoff für die Bildung von Mikrotubuli. Es handelt sich um ein Antimitotikum:
Durch seine Wechselwirkung mit Proteinen, die mit den polymerisierten Mikrotubuli assoziiert sind, beeinträchtigt es die mitotische Kernspindel. Das Griseofulvin (Sigma; Charge 85H07391) wird zu 200 mM in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst und bei –20°C aliquotiert aufbewahrt.
– Taxol
Taxol ist ein Antineoplastikum, dessen klinische Wirksamkeit erwiesen ist. Diese Verbindung weist aneugene Wirkungen auf und ist ein Apoptose-Induktor.
Das Taxol (Sigma; Charge 126H1382) wird zu 400 nM in DMSO gelöst und bei –20°C aliquotiert aufbewahrt.
– Nocodazol
Nocodazol greift die Mikrotubuli an und verursacht dadurch eine Aneuploidie. Andererseits bewirkt es ebenso wie Taxol eine Phosphorylierung von bcl2, eine Unterbrechung des Zellzyklus in der M-Phase und die Apoptose.
– Diethylstibestrol
Diethylstibestrol (DES) ist ein Östrogen, dessen pharmakologische Eigenschaften zur Prävention von Spontanaborten genutzt wurden und das beim Mann weiterhin bei der Therapie von Prostatakrebs zum Einsatz kommt. Diese Verbindung vergrößert oder verringert die Transkription der durch Hormone regulierten Gene.
Es wurde berichtet, daß DES kanzerogene Wirkungen beim Menschen hat, insbesondere nach einer Verabreichung während der Schwangerschaft durch Herbeiführung einer Aneuploidie infolge seiner Wirkung auf die Centromere und die Centriolen.
Es hat sich herausgestellt, daß das DES auch eine klastogene Wirkung nach metabolischer Aktivierung aufweist.
– Diazepam
Ebenso wie bei DES handelt sich auch bei Diazepam um ein Aneugen. Diese Verbindung gehört zu den Benzodiazepinen und hat eine anxiolytische und antikonvulsive Wirkung.
2) Klastogene
– Mitomycin C
Bei Mitomycin C handelt es sich um ein Antibiotikum, das Einfachteilungen von DNA-Strängen und Chromosomenbrüche bewirkt. Diese Verbindung ist ein mögliches Kanzerogen beim Menschen.
Mitomycin C (Ametycin; Charge 440) wird zu 500 μg/mL in Wasser für Injektionszwecke (Aqua ad iniectabilia) gelöst und bei –20°C aliquotiert aufbewahrt.
– Methylmethansulfonat
Methylmethansulfonat ist ein monofunktionelles A1kylans, das durch Destabilisierung der DNA wirkt und DNA-Brüche herbeiführt. Es handelt sich um ein mögliches Kanzerogen beim Menschen.
Das MMS (Aldrich; Charge 030177) wird zu 7 mM in RPMI gelöst und bei –20°C aliquotiert aufbewahrt.
– Etoposid
Die von einer Phenylgruppe und einem Zucker flankierte ebene zyklische Zentralregion macht Etoposid zu einem nicht interkalierenden, spezifischen und von der S-Phase abhängigen Hemmer der Topoisomerase II.
Dieses ubiquitäre Enzym kontrolliert die Topologie der DNA durch die Relaxation der superhelikalen DNA, ihre Catenierung und Decatenierung bei der Replikation, der Transkription und der Zellteilung. Dieses Enzym ist von wesentlicher Bedeutung bei der Segregation der Chromosomen, der Rekombination und der Teilung der Chromatiden. Das Etoposid blockiert die katalytische Aktivität der Topoisomerase II, indem es den Komplex DNA-Topoisomerase II stabilisiert. Außerdem bewirkt diese Hemmung DNA-Strangbrüche mit Austausch von Schwesterchromatiden, Chromosomenaberrationen und Anomalien der Chromosomenzahl.
Es handelt sich um einen Apoptose-Hemmer: Das Etoposid bewirkt Brüche beim genetischen Material, und das Protein P53 stoppt dann den Zellzyklus in der Phase G21, um die Transkription von DNA-Reparaturgenen zu ermöglichen. In zu großer Zahl vorliegende Brüche übersteigen das Potential der Reparaturkomplexe, um dem genetischen Material zu Hilfe zu kommen. Daraufhin schaltet sich P53 ein, um das Zelltodprogramm auszulösen. Es findet eine P53-abhängige Apoptose statt.
Diese Eigenschaften erklären, daß das Etoposid sowohl ein Klastogen als auch ein Apoptose-Induktor ist.
Das Etoposid (Sigma; Charge 57H1159) wird zu 20 mM im DMSO gelöst und bei –20°C aliquotiert gelagert.
– MNNG und MNU
N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanin (MNNG) und N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU) sind zwei Alkylanzien, die Schädigungen der DNA des Typs 06-Methylguanin herbeiführen, bei denen es sich bekannterweise um mutagene Läsionen handelt. Diese Verbindungen verursachen letale Schädigungen, die durch einen anderen Mechanismus repariert werden als den, bei dem die Alkyltransferase zum Einsatz kommt.
– Genistein
Genistein ist ein in Sojaprodukten reichhaltig vorhandenes Isoflavon. Es verhält sich sowohl als Agonist wie auch als Antagonist der Östrogenrezeptoren. Seine Wirkung besteht außerdem darin, die Protein-Tyrosinkinasen (PTK), die Topoisomerasen II, zu hemmen und die Zelldifferenzierung sowie Oxidationsvorgänge herbeizuführen. Das Genistein stammt von der Firma Sigma und wird bei –20°C in DMSO aufbewahrt.
– Cyclophosphamid
Das Cyclophosphamid (CPA) wird in eine alkylierende Zwischenstufe der DNA metabolisiert, was zur Folge hat, daß es mit der DNA-Synthese und der Zellteilung phasenunabhängig interferiert. Es wurde eindeutig nachgewiesen, daß in den normalen Zellen des Knochenmarks oder des Darmepithels eine Blockierung in der Phase G1/S stattfindet, um die Schädigungen zu reparieren oder die Apoptose einzuleiten.
3) Apoptose-Induktoren
– Dexamethason
Dexamethason ist ein Glucocorticoid, das die Apoptose nach zwei Modellen herbeiführt. Das Transkriptionsmodell erfordert eine Aktivierung von Zelltodgenen durch den Glucocorticoid-Rezeptor. Es findet daher keine Wirkung des Moleküls auf der Ebene der DNA statt. Die Apoptose könnte nach einem Transpressionsmodell erfolgen, bei dem eine Repression von für das Überleben der Zellen notwendigen Faktoren stattfindet.
Das Dexamethason (Sigma; Charge 116H0427) wird zu 150 mM in DMSO gelöst und bei –20°C aliquotiert aufbewahrt.
– Gliotoxin
Gliotoxin ist ein Pilzmetabolit, der die Apoptose durch Herbeiführung einer von der Protein Kinase A abhängigen Hyperphosphorylierung an den Serin-Resten der Histone H3 induziert, wodurch die Zellen für die Wirkungen der Nuklease sensitiv werden. Das Gliotoxin stammt von der Firma Sigma und wird bei –20°C in DMSO aufbewahrt.
– Methional
Methional, bei dem es sich um einen Methionin-Metaboliten handelt, wirkt als Apoptose-Induktor.
C1 – Protokoll des Mikrokern-Tests ohne metabolische Aktivierung
Bei den getesteten Verbindungen handelt es sich um die folgenden Substanzen: Griseofluvin, Taxol, Mitomycin C, MMS, Etoposid, Dexamethason, Genistein, Gliotoxin, Methional, Nocodazol und DES.
– Durchführung des Tests bei den CTLL-2 CTLL-2 Bcl2 Zellen
In 15 ml Röhrchen, die jeweils 5 ml Komplettmedium RPMI 1640 unter Zusatz von 25 pg/ml IL-2 enthalten, werden 2.10⁶ Zellen hineingegeben. Anschließend wird die zu untersuchende Substanz in verschiedenen Konzentrationen in einem Verhältnis von 2 hinzugefügt. Parallel dazu wird ein Röhrchen mit dem Lösungsmittel der zu untersuchenden Substanz (wobei im Falle von DMSO 0.2% bezogen auf die Endkonzentration nicht überschritten werden) und ein anderes durch eine positive Referenzsubstanz (Mitomycin C zu 75 ng/ml; Boehringer; Charge 1397592137) in wäßriger Lösung behandelt. Die Röhrchen werden mittels Schraubverschluß verschlossen und schonend verwirbelt, woraufhin sie in geneigter Position ohne Umrühren bei 37°C in den Trockenschrank gestellt werden.
Die aus einer kontinuierlichen Zellinie in permanenter Teilung stammenden CTLL-2-Zellen sind alle Ziele für die untersuchte Substanz, so daß die Behandlung mit dem Cytochalasin B (das eine Blockierung der Cytokinese bewirkt) bei ihnen nicht unbedingt erforderlich ist. Es ist nicht notwendig, die Analyse auf die zweikernigen Zellen zu beschränken. Zudem ist das Cytochalasin B ein Agens, dessen Wirkung mit dem klastogenen Potential der in Frage stehenden Substanzen interferieren könnte, für das die Zellen sehr sensitiv sind.
In der 15 Stunde nach Beginn der Inkubation (1,5 Zellzyklen) erfolgt die Aufnahme der Lymphozyten. Die Zellen werden zweimal mit 5 ml RPMI 1640 unter Zusatz von 2% dekomplementiertem fetalem Kälber-Serum gewaschen. Danach werden die Zellen durch 5 Minuten Zentrifugieren bei 200 g aufgenommen, woraufhin sie 8 Minuten lang einem hypotonis.chen Schock ausgesetzt: (1 Volumeneinheit RPMI 1640: 4 Volumeneinheiten Wasser für Injektionszwecke (Aqua ad iniectabilia + 2% dekomplementiertes fetales Kälber-Serum). Nach dem Zentrifugieren wird das aufschwimmende Material soweit wie möglich eliminiert, und die Zellen werden durch 10 ml Fixiergemisch Carnoy II (3 Volumeneinheiten Ethanol: 1 Volumeneinheit Essigsäure) 10 Minuten lang fixiert.
Nach einem erneuten Zentrifugieren werden die Zellen auf Plättchen gespreitet, woraufhin man sie 24 Stunden lang an der Luft trocknen läßt. Danach werden sie 10 Minuten lang durch das auf 5% in Wasser verdünnte Giemsa-Reagenz eingefärbt.
Anschließend werden die Zellen mit der Vergrößerung 1250 mikroskopisch untersucht, wobei die in den einkernigen Zellen vorhandenen Mikrokerne bestimmt werden.
– Durchführung des Tests an peripheren Lymphozyten
Im Falle der Lymphozyten wird die Teilung durch das Phytohämagglutinin A herbeigeführt. Da sich nur die T-Lymphozyten teilen, muß unbedingt Cytochalasin B hinzugegeben werden, um nur die zweikernigen Zellen mit erfolgter Mitose im Hinblick auf den Nachweis von Mikrokernen zu untersuchen.
Die Zellen werden nach 20 Stunden Vorkultur in Komplettmedium C2 unter Zusatz von Phytohämagglutinin A (Murex Biotech; Charge F067610) in Gegenwart der zu untersuchenden Substanz verbracht.
In der 44. Stunde nach Beginn der Inkubation werden die zirkulierenden Lymphozyten zweimal durch Kulturmedium mit 10% svfd gewaschen, um die Substanz zu eliminieren, woraufhin Komplettmedium mit darin enthaltenem Cytochalasin B (Sigma; Charge 87H4054) in einer Endkonzentration von 6 μg/ml zugesetzt wird.
In der 68. Stunde nach Beginn der Inkubation werden die Lymphozyten aufgenommen, woraufhin sie der gleichen Behandlung wie vorstehend unterzogen werden. Die Mikrokerne werden jedoch nur an den zweikernigen Zellen bestimmt.
C2 – Protokoll des Mikrokern-Tests mit metabolischer Aktivierung
Bestimmte Substanzen erfordern eine metabolische Aktivierung, um ihre genotoxische Wirkungen auszuüben. In vitro erfolgt diese Aktivierung durch die Verwendung von S9 Mix. Bei S9 handelt es sich um eine mit Aroclor induzierte subzelluläre mikrosomale Rattenleber-Fraktion. Die Zusammensetzung des S9 Mix (Kirkland und andere, 1989) stellt sich wie folgt dar:
2 ml S9 (im Labor zubereitet)
1 ml KCl zu 150 g/l
1 ml Glucose-6-phosphat zu 180 g/l
1 ml NADP zu 25 g/l.
Dieser Test dient dazu, herauszufinden, ob es zu einer Reaktion bezogen auf die Genotoxizität oder Apoptose im Anschluß an die metabolische Aktivierung einer Verbindung durch das S9 Mix kommt.
In 15 ml Röhrchen, die jeweils Komplettmedium RPMI 1640 unter Zusatz von abschließend 25 pg/ml Interleukin-2 enthalten, werden 0,5·10⁶ Zellen hineingegeben. Das Endvolumen beträgt 5 ml.
Es werden 0,25 ml S9 Mix und die zu untersuchende Substanz hinzugegeben. In diesem Beispiel handelt es sich um Cyclophosphamid (CPA).
Parallel dazu wird ein Röhrchen mit dem Lösungsmittel der Substanz behandelt.
3 Stunden lang unter Umrühren mit niedriger Drehzahl bei 37°C im Wasserbad inkubieren (B. M. GYROTORY G76: Einstellung auf 2,5 d. h. etwa 80 Zyklen pro Minute).
Nach Ablauf dieser Zeit zentrifugieren und das aufschwimmende Material entnehmen.
Zweimal mit 5 ml RPMI mit 10% dekomplementiertem fetalem Kälber-Serum waschen.
Zentrifugieren und das aufschwimmende Material etwa bis zur Markierung 0,5 ml entnehmen. Danach 4,5 ml Komplettmedium RPMI unter Zusatz von 25 pg/ml Interleukin-2 hinzugeben.
Noch 15 Stunden lang in den Trockenschrank stellen.
Die Entnahme erfolgt nach dem gleichen Verfahren wie beim Mikrokern-Test ohne metabolische Aktivierung.
D – Messung der Apoptose
1) Bestimmung der Apoptose durch Annexin-V-FITC (Euromedex)
Die parallel mit den Mutagenese-Techniken behandelten Zellen werden in Kulturmedium gewaschen, um die Substanz abzusondern, und in einem HEPES/NaOH-Puffer (10 mM HEPES, pH-Wert 7,4; 140 mM NaCl; 5 mM KCl; 5 mM CaCl₂) im Verhältnis von 10⁶ Zellen/ml in Suspension versetzt. Danach werden 10 μl in HEPES-Puffer verdünntes Propidiumiodid mit einer Konzentration von 50 μg/ml hinzugegeben.
Die Flußzytometrie-Analyse erfolgt mit Epics Profile (Coulter Coultronic, Margency): Die durch die mit Annexin-V markierten Zellen abgegebene Fluoreszenz wird nach dem Durchgang durch einen Filter mit 525 ± 10 nm bestimmt und nach logarithmischer Verstärkung angezeigt. Die durch das Propidiumiodid abgegebene Fluoreszenz wird bei 600 nm gemessen.
2) Bestimmung der Apoptose durch YOPRO-1 (Molecular Probes, Eugene, Oregon)
Die parallel mit den Mutagenese-Techniken behandelten Zellen werden in Kulturmedium gewaschen, um die Substanz abzusondern.
Das verdünnte YOPRO-1 (1V Yopro-1 : 100 V EPPI) wird im Verhältnis 1 μl/0,5·10⁶ Zellen in Suspension in 0,5 ml RPMI 1640 zugesetzt.
Die Flußzytometrie-Analyse erfolgt mit Epics Profile (Coulter Coultronic, Margency): Die durch die mit YOPRO-1 markierten Zellen abgegebene Fluoreszenz wird nach dem Durchgang durch einen Filter mit 525 ± 10 nm bestimmt und nach logarithmischer Verstärkung angezeigt.
E – Angabe der Ergebnisse
Die im Anschluß an die Bestimmung der Mikrokerne und die Induktion der Apoptose ermittelten Ergebnisse werden anhand des χ²-Tests durch statistischen Vergleich der Resultate mit den anhand der Lösungsmittel-Referenz ermittelten Ergebnisse ausgewertet, was für die Voruntersuchungen erfolgt.
Im Hinblick auf den Nachweis von Mikrokernen im Triplikat und die Untersuchung der Apoptose im Duplikat haben die Autoren der Erfindung eine Varianzanalyse mit einem Faktor durchgeführt. Bei Signifikanz ist der multiple Vergleichstest nach Dunnett durchgeführt worden.
Durch Regressions-Varianzanalyse haben die Autoren der Erfindung überprüft, ob eine signifikante Korrelation zwischen der Anzahl der festgestellten Mikrokerne oder dem prozentualen Anteil von apoptotischen Zellen und der Produktkonzentration besteht.
F – Ergebnisse
1) Die Überexpression des bcl2-Proteins eliminiert die falsch positiven Befunde durch Apoptose
Die Autoren der Erfindung haben nachgewiesen, daß eine wirkliche Korrelation zwischen den an den murinen Zellinien CTLL2 und CTLL-2-bcl2 ermittelten Ergebnissen hinsichtlich der Induktion von Mikrokernen im Falle von Zellen besteht, die mit einem strikten Aneugen (Griseofulvin) oder mit nicht als Apoptose-Induktoren anerkannten Klastogenen (Mitomycin-C und MMS) behandelt wurden. Unabhängig davon, um welche Zellinie es sich dabei jeweils handelt, wird der apoptotische Vorgang nicht ausgelöst, während sich die Häufigkeiten von Mikrokern-Zellen mit der Dosis signifikant erhöhen. Darüber hinaus ist das Ausmaß der klastogenen und aneugenen Manifestationen bei beiden Zellinien vergleichbar.
Um nachzuweisen, daß die apoptotische Wirkung zu der genotoxischen Wirkung hinzukommt, sind die Zellinien im übrigen mit Aneugenen oder Klastogenen behandelt worden, bei denen es sich ebenfalls um Apoptose-Induktoren handelt: Taxol bzw. Etoposid. So wird effektiv aufgezeigt, daß das CTLL-2-bcl2-Modell die Unterscheidung zwischen den durch Apoptose bedingten Wirkungen von den durch Klastogenese oder durch Aneugenese bedingten Wirkungen ermöglicht. Da die Zellen, die durch das für das bcl2-Protein kodierende Gen transfektiert werden, die Eigenschaft aufweisen, aufgrund des künstlich geschaffenen Ungleichgewichts zwischen den Mitgliedern der bcl2-Familie nicht sensitiv gegenüber den apoptotischen Agenzien zu sein, ist die hohe Proteinkonzentration stets größer als die Konzentration der Apoptose induzierenden Proteine.
Wenngleich sie durch unterschiedliche Mechanismen der Apoptose-Induktion wirken, haben die beiden Agenzien vergleichbare Erscheinungen zur Folge: Beide induzieren die Apoptose sowie die Bildung von Mikrokernen in den CTLL-2-Zellen. Bei den CTLL-2-bcl2-Zellen fällt die Bildung von Mikrokernen hingegen deutlich schwächer aus. Der Unterschied beim Verlauf der Mikrokern-Zellen zwischen der Zellinie CTLL-2 und der Zellinie CTLL-2-bcl2 tritt bereits bei der ersten Taxolkonzentration auf. Außerdem zeigt er sich bei der ersten Etoposidkonzentration (62.5 nM; 6A und 6B).
Umgekehrt belegt die Zellinie, die durch das für das Apoptose induzierende bcl2-Protein kodierende Gen transfektiert wird, die genotoxische Wirkung der untersuchten Agenzien durch Aussonderung der apoptotischen Komponente. So zeigt die Beobachtung der Anzahl der Mikrokerne von 6A, die unterschiedliche Steigungen bei den Zellinien CTLL-2 und CTLL-2-bcl2 aufweisen, daß ein Teil der durch Etoposid bedingten Induktion der Mikrokerne durch den apoptotischen Vorgang bedingt ist und daß ein Teil durch die spezifische klastogene Wirkung der Verbindung bedingt ist.
Die Autoren der Erfindung haben die Bildung von Mikrokernen und eine Apoptose nur in den CTLL-2-Zellen mit Dosen zwischen 12,5 nM und 100 nM Dexamethason induziert (3A und 3B).
In diesem Modell hat sich der prozentuale Anteil der Mikrokern-Zellen, der bei der Negativkontrolle 3‰ betrug, bis zu einem Maximum von 60‰ ausgehend von 50 nM Dexamethason erhöht.
Derartige Ergebnisse könnten die Schlußfolgerung nahelegen, daß das Dexamethason mutagene Eigenschaften aufweist; aber die Anzahl der Zellen mit Mikrokernen hat sich in ähnlicher Weise mit der Vergrößerung des prozentualen Anteils der apoptotischen Zellen erhöht. Letzterer hat sich um 6% (in der Negativkontrolle) auf 30,5% nach den Methoden mit Annexin-V-FITC und YOPRO-1 erhöht, wobei außerdem ein Maximum ab 50 nM Dexamethason beobachtet wurde.
Unabhängig von den jeweiligen Dexamethason-Konzentrationen war weder eine Zunahme von apoptotischen Zellen noch eine Zunahme von Mikrokern-Zellen im Stamm CTLL-2-bcl2 zu beobachten, was wiederum darauf hindeutet, daß die Apoptose für die falsch positiven Befunde verantwortlich ist.
Die Arbeiten mit Dexamethason, bei dem es sich um einen anerkannten Apoptose-Induktor in Lymphozytenzellen handelt, ermöglichen daher den Nachweis des Nutzens, den das CTLL-2-bcl2-Modell hinsichtlich der Unterscheidung einer genotoxischen Substanz von einer apoptotischen Substanz aufweist. Es läßt keine Apoptose-Induktion und keine Bildung von Mikrokernen vorkommen, während an der nicht transfektierten Zellinie CTLL-2 der apoptotische Vorgang stattgefunden hat, der mit einer Erhöhung des Anteils der aberrierenden Zellen einhergeht. Dadurch wird der Nachweis erbracht, daß der Ursprung der Mikrokerne in den DNA-Fragmenten zu sehen ist, die durch beim Apoptose-Prozeß aktivierte Endonukleasen gebildet werden. Diese aus der Apoptose hervorgegangenen Fragmente können durch ein charakteristisches "Leiter"-Bild nach Elektrophorese in Agarose-Gel nachgewiesen werden.
2) Das CTLL-2/CTLL-2-bcl2-Modell weist genotoxische Substanzen nach
Bei dem in vitro-Test des Mikrokerns wird eine Substanz als genotoxisch eingestuft, wenn sie im Vergleich zur Negativreferenz eine statistisch signifikante und dosisabhängige Erhöhung der Häufigkeit von Mikrokernen bewirkt.
Nach Abschluß der Behandlungen mit reinen Klastogenen und Aneugenen (Mitomycin-C, MMS, Griseofulvin) konnte bei jeder der beiden Zellinien nicht nur eine statistisch signifikante Erhöhung der Häufigkeit von Aberrationen festgestellt werden, sondern auch eine dosisabhängige Erhöhung: Die Kriterien für die Einstufung einer Substanz in die Kategorie der genotoxischen Stoffe sind damit erfüllt. Darüber hinaus haben die beiden Zellinien die gleiche Sensitivität gegenüber den Substanzen, mit denen sie in Kontakt gebracht wurden, da bei einer gegebenen Konzentration einer getesteten Substanz die Anzahl der Mikrokern-Zellen in beiden Zellinien vergleichbar ausfällt, ohne daß eine erkennbare Apoptose vorliegt.
Die Positivitätskriterien sind bei der Untersuchung der klastogenen oder aneugenen und gleichzeitig Apoptose induzierenden Substanzen (Etoposid und Taxol) in den Zellinien CTLL-2 und CTLL-2-bcl2 ebenfalls erfüllt. Die zuletzt genannte Zellinie hat jedoch darüber hinaus die Eigenschaft, nur die aneugene und klastogene Rolle dieser beiden Substanzen nachzuweisen. Denn sowohl bei Etoposid (klastogen) als auch bei Taxol (aneugen) ist eine Erhöhung der Häufigkeit von Mikrokernen außerhalb jedes apoptotischen Vorgangs festzustellen. Im Falle von Etoposid ist eine Erhöhung der Häufigkeit der Mikrokerne in den CTLL-2-bcl2-Zellen von 12.5 auf 100 nM zu beobachten, die nicht in Apoptose übergehen. Bei Taxol ist eine vergrößerung der Anzahl der Mikrokerne auf 25 nM bei CTLL-2-Zellen und auf 50 nM bei CTLL-2-bcl2-Zellen festzustellen, während diese Dosen keine Apoptose verursachen. Diese Feststellungen zeigen, daß die Zellinie CTLL-2-bcl2 nicht nur ein gutes Modell zur Erfassung der durch die Apoptose bedingten falsch po sitiven Befunde darstellt, sondern daß sie darüber hinaus die Zuordnung ihrer genotoxischen Wirkung zu einer Verbindung ermöglicht.
Außerdem kann bei einer Untersuchung zu einem Apoptose-Induktor wie Dexamethason die Rolle der Apoptose als Ursache für falsch positive Befunde nachgewiesen werden, da ihre Auswirkungen auf die Zellinie CTLL-2 charakteristisch für eine genotoxische Substanz sind; aber auf keinen Fall kann ihr ein derartiges Potential bei der durch das für den Apoptose-Hemmer bcl2 kodierende Gen transfektierten Zellinie zugeordnet werden.
3) Die Zellinien CTLL-2/CTLL-2-bcl2 weisen eine gute Sensitivität gegenüber den untersuchten Substanzen auf
Die Qualität des entwickelten Modells wird im übrigen durch seine gute Sensitivität bestätigt. So ist festzustellen, daß bei jeder der getesteten Substanzen die Reaktionen zwischen den im Triplikat durchgeführten Tests und den im Screening vorgenommenen Tests sowie den mit Humanlymphozyten in Kultur beobachteten Ergebnissen vergleichbar sind (vgl. die 4A und 4B zu den Humanlymphozyten im Vergleich mit den 6A und 6B zu CTLL-2 und CTLL-2-bcl2). Außerdem ist zu beobachten, daß die mit den echten Genotoxica (Mitomycin-C, MMS, Griseofulvin) ermittelten Ergebnisse bei beiden Zellinien gleich ausfallen, was bedeutet, daß die Überexpression von bcl2 die Sensitivität der Zellen gegenüber der aneugenen oder klastogenen Wirkung einer Substanz nicht verändert.
Darüber hinaus ermöglichen die Reproduzierbarkeit zwischen im Screening-Verfahren erzielten Ergebnissen und in den Triplikat-Tests ermittelten Resultaten sowie die Wiederholbarkeit der im Triplikat durchgeführten Versuche mit geringen Standardabweichungen den Rückschluß auf eine gute Qualität hinsichtlich der Auswertung der Ergebnisse.
Durch die Untersuchung von Gliotoxin oder Methional haben die Autoren der Erfindung, ebenso wie im Falle von Dexamethason, nachweisen können, daß das Modell CTLL-2/CTLL-2-bcl2 die Schlußfolgerung ermöglicht, daß die nur Apoptose induzierenden Substanzen für die Bildung von Mikrokernen verantwortlich waren, was Hinblick auf die Genotoxizität zu einer falsch positiven Schlußfolgerung führt.
Wie im Falle der Untersuchung mit Dexamethason ist bei den CTLL-2-Zellen, die mit Methional in Dosen von 60,8 μM bis 150 μM behandelt wurden, gleichzeitig die Induktion einer Apoptose und die Bildung von Mikrokernen beobachtet worden. Der Anteil der apoptotischen Zellen erreichte 24% bei der stärksten Dosis gegenüber 6,5% in der Kontrolle, während sich die Anzahl der Mikrokern-Zellen bis auf 98‰ gegenüber 11‰ in der Kontrolle erhöht hat. Bei der Bestimmung von Mikrokern-Zellen wie bei der Apoptose-Induktion waren die Ergebnisse ab der ersten Methionaldosis (60,8 μM) statistisch signifikant (p = 0,01). Unabhängig von der jeweiligen Methionaldosis sind bei den durch bcl2 transfektierten Zellen weder Apoptose noch Mikrokerne aufgetreten. Auch in diesem Fall waren die in den CTLL-2-Zellen induzierten Mikrokerne durch die Apoptose bedingt.
Das Gliotoxin ist ebenfalls in Dosen von 25 nM bis 200 nM im Rahmen des entwickelten Modells untersucht worden. während die Apoptose bei den CTLL-2-bcl2-Zellen ebenso wie die Anzahl der Mikrokern-Zellen bei den nicht transfektierten Zellen auf einem niedrigen Prozentsatz gehalten wurde, hat sich der Apoptose-Anteil von 7,5% auf 45% bei der stärksten Dosis erhöht, und die Anzahl der aberrierenden Zellen ist von 5‰ auf 20‰ angestiegen. Im Mikrokern-Test und im Apoptose-Test unterscheiden sich die Ergebnisse von der Kontrolle (p = 0,01) ab 100 nM.
– Komplementäre Ergebnisse
Nocodazol, Genistein, Camptothecin, Brefeldin A, Anisomycin C, Curcumin, Quinacrin, Thapsigargin induzieren die Apoptose durch unterschiedliche Mechanismen in der Zellinie CTLL-2.
Wie im Falle von Etoposid ist eine Reaktion hinsichtlich einer übersteigerten Mutagenese in der Zellinie CTLL-2 durch das Auftreten der Apoptose bei hohen Substanzkonzentrationen festzustellen, während die Höhe der Zahl der Mikrokern-Zellen in der Zellinie CTLL-2-bcl2 niedriger ausfällt.
Das Modell CTLL-2/CTLL-2 Bcl2 ermöglicht eine Differenzierung des apoptotischen Einflusses der mutagenen Wirkung bei der Auswertung der Ergebnisse des Mikrokern-Tests bei CTLL-2.
MNU, Diazepam und Ethylmethansulfonat (EMS) führen zu einer positiven Reaktion im Mikrokern-Test bei CTLL-2 und CTLL-2-bcl2 mit einem gleichen Ausmaß in jeder der beiden Zellinien, ohne eine Apoptose zu induzieren, wodurch bestätigt wird, daß dieses Modell den Nachweis von Substanzen ermöglicht, die genotoxische Eigenschaften besitzen, unabhängig davon, ob es sich bei den Substanzen um Apoptose-Induktoren handelt oder nicht.
Actinomycin D und Staurosporin führen, wie im Falle von Dexamethason zum Beispiel, zu einer positiven Reaktion hinsichtlich der Klastogenese in den CTLL-2-Zellen, was mit der Apoptose-Induktion korreliert. Bei den CTLL-2-bcl2-Zellen werden weder Apoptose noch Genotoxizität beobachtet, wodurch die Effizienz des Modells bei der Eliminierung der durch die Apoptose bedingten Interferenz beim in vitro durchgeführten Mikrokern-Test erwiesen ist.
– Ergebnisse mit metabolischer Aktivierung:
Nach metabolischer Aktivierung induzieren Cyclophosphamid (CPA), Benzo[a]pyren und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) die Bildung von Mikrokernen bei den CTLL-2-Zellen und den CTLL-2-bcl2-Zellen sowie eine Apoptose nur bei den CTLL-2-Zellen, woraus sich ergibt, daß die Zellen in der Lage sind, eine Reaktion in bezug auf Mutagenese und Apoptose im Anschluß an ihre Behandlung durch ein direktes Mutagen zu entwickeln.
Beispiel II: Metaphasenanalyse-Test bei CTLL-2- und CTLL-2-bcl2-Zellen
A – Material
Es handelt sich um die gleichen Zellsysteme wie im Beispiel II (Mikrokern-Test).
B – Prinzip
Die murinen Zellen werden mit der zu untersuchenden Substanz behandelt, woraufhin mittels Spreitung und Färbung der durch Colcemid in Metaphasen blockierten Zellen die numerischen und/oder strukturellen Chromosomenanomalien bestimmt werden.
Das Annexin-V-FITC-Verfahren ist die ausgewählte Technik zur Bestimmung des prozentualen Anteils der in Apoptose befindlichen Zellen.
Die gewählten Konzentrationen entsprechen den Dosen, die beim in vitro-Mikrokern-Test bei diesen Zellen verwendet werden.
C – Protokoll
In 15 ml Röhrchen, die jeweils Komplettmedium RPMI 1640 enthalten, werden 1·10⁶ Zellen hineingegeben.
Anschließend wird die zu untersuchende Substanz in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben, wobei das Endvolumen 10 ml beträgt.
Parallel dazu wird ein Röhrchen mit dem Lösungsmittel der Substanz behandelt (wobei im Falle von DMSO 0,2 bezogen auf die Endkonzentration nicht überschritten werden), und zwei weitere Röhrchen werden mit einem Referenz-Klastogen (MMS zu 200 μM) sowie mit einem Referenz-Apoptose-Induktor (Dexamethason zu 150 nM)) behandelt.
Die Röhrchen werden mittels Schraubverschluß verschlossen und schonend verwirbelt, woraufhin sie in geneigter Position ohne Umrühren bei 37°C in den Trockenschrank gestellt werden.
In der 13. Behandlungsstunde wird das Colcemid in der Endkonzentration von 100 ng/ml hinzugegeben.
In der 15. Behandlungsstunde werden die Zellen durch zentrifugieren 5 Minuten lang mit 200 g aufgenommen und 5 Minuten lang einem hypotonischen Schock ausgesetzt (KCl 75 mM).
Nach dem Zentrifugieren wird das aufschwimmende Material soweit wie möglich eliminiert, und die Zellen werden durch 10 ml Fixiergemisch Carnoy (3 V Methanol: 1 V Essigsäure) 10 Minuten lang fixiert.
Nach einem erneuten Zentrifugieren werden die Zellen auf Plättchen gespreitet, woraufhin man sie 24 Stunden lang im Freien trocknen läßt. Danach werden sie 10 Minuten lang durch das auf 4% in Wasser verdünnte Giemsa-Reagenz eingefärbt.
Die Plättchen werden unter dem Mikroskop untersucht, und es werden die Chromosomenaberrationen (Brüche, Rearrangierungen ...) bestimmt.
D – Angabe der Ergebnisse
Die nach Abschluß der Metaphasenanalysen ermittelten Ergebnisse werden anhand des Student-t-Tests ausgewertet. Wenngleich die Standardabweichungen keinen Nachweis einer Normalverteilung zulassen, kann der Test aufgrund der Stichprobengröße dennoch angewendet werden. Die Gesamtheit der numerischen Aberrationen und die Gesamtzahl der Zellen mit oder ohne Gaps werden statistisch anhand des χ²-Tests behandelt, ebenso wie die Anzahl der apoptotischen Zellen.
Zunächst wurden die drei anerkannten reinen Apoptose-Induktoren, Dexamethason, Gliotoxin, Methional, im Rahmen des Metaphasenanalyse-Tests bei den CTLL-2- und CTLL-2-bcl2-Zellen getestet, um festzustellen, ob die Fragmentierung, die beim apoptotischen Vorgang stattfindet, zur Beobachtung von Chromosomenbrüchen bei den in der Metaphase arretierten behandelten Zellen führen kann.
Anschließend wurde ermittelt, ob die Transfektion des Apoptose-Hemmers die Beobachtung einer niedrigeren Häufigkeit von Aberrationen ermöglicht, wenn die Zellen mit einer sowohl klastogenen als auch Apoptose induzierenden Substanz wie Etoposid behandelt werden.
E – Ergebnisse
Bei der Analyse der in vitro-Metaphasen an Humanlymphozyten kann das Dexamethason (1A und 1B) als Klastogen betrachtet werden, während diese Verbindung bekannterweise ein Apoptose-Induktor ist, ohne genotoxisch zu wirken.
Die Lymphozyten wurden 44 Stunden lang mit einer Dosisreihe von 7,5 μM bis 750 μM behandelt, die dosisabhängig Aberrationen induziert hat. Ab 250 μM Dexamethason hat sich die Apoptose, die in der Kontrolle bei etwa 16% lag, bis auf 40% der Zellen erhöht. Es sind 11% aberrierende Zellen gegenüber 2 in der Kontrolle beobachtet worden.
Im Hinblick auf eine Unterscheidung des Anteils der Apoptose bei den Brüchen der Chromosomen und der Chromatiden haben die Autoren die Ergebnisse, die bei den mit dem Apoptose-Hemmer bcl2 transfektierten CTLL-2-Zellen ermittelt wurden, mit den Ergebnissen verglichen, die an nicht transfektierten Zellen ermittelt wurden, was in einer in vitro-Metaphasenanalyse mit einer Dosis zwischen 9,575 nM und 150 nM Dexamethason erfolgte (2A und 2B). Parallel dazu wurde die Apoptose-Induktion gemessen. In den CTLL-2-Zellen unterschied sich die Anzahl der aberrierenden Zellen statistisch (p = 0,05) von der Kontrolle ab 37,5 nM Dexamethason. Dabei wurden 8% aberrierende Zellen gegenüber 2% in der Kontrolle beobachtet.
Wie bei den Humanlymphozyten haben die Autoren der Erfindung Brüche von Chromosomen und Chromatiden, aber keinen Austausch festgestellt, und gleichzeitig hat sich ab 37,5 nM Dexamethason die Apoptose, die in der Kontrolle bei etwa 7% lag, bis auf 18% erhöht, während sie bei 150 nM 30% erreicht hat. Dadurch ist die apoptotische Wirkung bei der DNA-Fragmentierung in der Metaphasenanalyse erwiesen.
Die Behandlung von zwei Zellinien im Rahmen der Metaphasenanalyse mit 9,375 μM bei 150 μM Methional läßt strukturelle Aberrationen wie Brüche oder Löcher ab der zweiten Dosis nur bei den nicht transfektierten Zellen hervortreten. Der Unterschied war statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (p = 0,05) bei 13% Zellen mit Chromosomenaberrationen bei 18,75 μM (gegenüber 3% in der Kontrolle).
Die Metaphasenanalyse der mit 25 bis 100 μM Gliotoxin behandelten Zellen ergab eine positive Reaktion in den CTLL-2-Zellen ab 50 μM Gliotoxin im Hinblick auf die Klastogenese (10% aberrierende Zellen gegenüber 1% bei den Referenzsubstanzen), wobei jedoch gleichzeitig eine starke Erhöhung der Apoptose festzustellen ist (17% gegenüber 5% bei den Referenzsubstanzen). Bei höherer Dosis waren die Metaphasen nicht mehr analysierbar, während die Apoptose ihr Maximum erreichte. Die Ergebnisse und die Unterschiede, die bei den Zellen, die den Apoptose-Hemmer enthielten, im Vergleich zu den nicht transfektierten Zellen festgestellt wurden, zeigen, daß der apoptotische Vorgang zu "falsch positiven" Befunden hinsichtlich der Genotoxizität wie beim Mikrokern-Test führt.
Die in vitro-Metaphasenanalyse der durch Etoposid behandelten Humanlymphozyten ergibt eine statistisch signifikante Erhöhung der Anzahl der aberrierenden Zellen ab 125 nM bis 500 n der Verbindung, bei zahlreichen Chromosomenaustauschvorgängen und komplexen Rearrangierungen, als Beleg für den Versuch einer DNA-Reparatur.
Über diese Konzentration hinaus ist es nicht möglich, die Metaphasen zu interpretieren, da es zu viele Brüche und Rearrangierungen gibt, während die Apoptose ab 2.000 nM Etoposid auftritt, bis sie 47% erreicht (wohingegen es in der Kontrolle etwa 19% waren).
Dieser Test ermöglicht die Einstufung von Etoposid als eine genotoxische Verbindung (5A und 5B). Beim Mikrokern-Test haben die Autoren der Erfindung mit hohen Etoposid-Konzentrationen 4,5‰ (gegenüber 2,5‰ in der Kontrolle) und 29‰ (gegenüber 5‰ in der Kontrolle) Mikrokern-Zellen mit vollständiger Hemmung der Apoptose erzielt. Diese Beobachtung gilt auch bei der Metaphasenanalyse von CTLL-2-Zellen, die mit 31,25 bis 500 nM Etoposid behandelt wurden ( 7A und 7B). Der Versuch ergibt eine statistisch signifikante (p = 0,01) Erhöhung bei der Anzahl der aberrierenden Zellen ab 62,5 nM bis 500 nM der Verbindung, mit Chromosomenaustauschvorgängen und komplexen Rearrangierungen als Beleg für den Versuch einer DNA-Reparatur, während sich die Apoptose ab der ersten Etoposid-Dosis ebenfalls signifikant erhöht hat. Bei den CTLL-2-bcl2-Zellen ergab sich hingegen der Unterschied (p = 0,05) gegenüber der Kontrolle ab 125 nM der Verbindung ohne Apoptose.
F – Schlußfolgerung
Wie beim Mikrokern-Test ermöglichen die zuletzt genannten Ergebnisse den Nachweis, daß die Apoptose zu falsch positiven Befunden auch beim Metaphasenanalyse-Test bei CTLL-2-Zellen führen kann, während die Transfektion durch bcl2 diese Ereignisse eliminiert.
Aufgrund dieser Ergebnisse in Übereinstimmung mit den Resultaten, die beim in vitro-Mikrokern-Test im Rahmen des Modells CTLL-2/CTLL-2-bcl2 festgestellt wurden, steht daher ein neuer Test zur Verfügung: der in vitro-Metaphasenanalyse-Test, der strukturelle Chromosomen- oder Chromatidenaberrationen und numerischen Aberrationen erfaßt.
LITERATURVERZEICHNIS

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– Chao und andere, (1995), J. Exp. Med., Bd. 182, 821–828.
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Claims

Verfahren zur in vitro-Beurteilung der Genotoxizität einer Verbindung, bei dem die besagte Verbindung mit wenigstens einer das Protoonkogen bcl2 und/oder ein verwandtes antiapoptotisches Protein überexprimierender Zelle in Kontakt gebracht wird und die genotoxischen Wirkungen der besagten Verbindung auf die besagte Zelle beobachtet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die positiven genotoxischen Wirkungen der Verbindung durch die Bildung eines Mikrokerns bzw. von Mikrokernen beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die positiven genotoxischen Wirkungen der Verbindung durch das Vorhandensein von zahlenmäßigen und/oder strukturellen Anomalien der Chromosomen in der Metaphase beobachtet werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zelle bcl2 überexprimiert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zelle bcl-XL überexprimiert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zelle eine transfektierte Zelle der Mäusezellinie CTLL-2 ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die besagte zu testende Verbindung in Form einer Mischung von mehreren Molekülen vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem der besagten zu testenden Verbindung ein Stoffwechselaktivator für diese Verbindung zugesetzt wird.
Verwendung von das Protoonkogen bcl2 überexprimierenden Säugetierzellen zur Beurteilung der Genotoxizität einer Verbindung.