ES2315889T3 - Ensayo de deteccion de p75ntr para identificar moduladores de la apoptosis. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar la capacidad de compuestos de prueba para modular la apoptosis inducida por p75 NTR , dicho método comprendiendo: i. transfectar una suspensión de células eucariotas con un vector que codifica para p75 NTR o un fragmento de este que induce muerte celular, ii. contactar dicha célula con el componente a ser probado; y iii. determinar la respuesta apoptótica en dichas células, donde una alteración en la respuesta apoptótica en la presencia de dicho compuesto de prueba comparado a una respuesta apoptótica en la ausencia del compuesto de prueba es una indicación de la capacidad de este compuesto de prueba para modular la apoptosis inducida por p75 NTR .
Description
Ensayo de detección de p75^{NTR} para
identificar moduladores de la apoptosis.
La presente invención se refiere al campo de los
métodos para la detección de apoptosis y proporciona los ensayos y
kits para la detección de los compuestos de prueba por su capacidad
para prevenir la apoptosis en un sujeto, en particular prevenir la
apoptosis en caso de los trastornos neurodegenerativos. Dichos
ensayos y kits están basados en el hallazgo de que la medición
simultánea de un marcador de de apoptosis y la muerte celular en
las suspensiones celulares transfectadas con el receptor de
neurotrofina p75 o la muerte neuronal que induce el fragmento de
este puede ser aprovechado para predecir el potencial de los
compuestos en la prevención de la muerte neuronal y por
consiguiente la utilidad en el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos. La presente invención encuentra uso
particularmente ventajoso en la detección de alto rendimiento de
bibliotecas de compuestos químicos.
El receptor de neurotrofina p75 (p75^{NTR}),
un miembro de la familia del receptor del factor de necrosis
tumoral (TNRF), es una glicoproteína receptora de la superficie
celular de 75 kDa que se enlaza con similar afinidad a la familia
de la neurotrofina (factor neurotrófico derivado del cerebro,
neurotrofina-3 y neurotrofina-4/5)
de los factores de crecimiento. Fue el primer receptor descrito para
el factor de crecimiento nervioso (NGF) y mostró facilidad para la
transducción de señal del receptor de la Tirosina kinasa (Trk)
mediante la formación de complejos receptores de alta afinidad a la
neurotrofina. A diferencia del p75^{NTR} la familia del receptor
de Trk se enlaza a las neurotrofinas con una especificidad variable
resultante de la sobrevivencia celular y derivados del proceso.
Aún proporcionando una función definitiva para
p75^{NTR} que continua siendo notablemente controversial, existe
la evidencia sustancial que sostiene la hipótesis de que p75^{NTR}
puede iniciar la mediación de la caspasa, por ejemplo la vía
apoptótica mediada por la mitocondria en diversos tipos de células
neurales y no-neurales. Un posible papel como
supresor de tumor o metástasis en células tumorales fue mostrado
recientemente en la capacidad del p75^{NTR} para suprimir el
crecimiento y la metástasis mediada por el factor de crecimiento
nervioso de las células de cáncer de próstata humana y en el efecto
de la expresión del p75^{NTR} sobre la sobrevivencia celular,
proliferación y crecimiento de la línea celular T24 de cáncer
humano. La evidencia para sostener el papel para p75^{NTR} como
factor que induce la muerte neuronal está basado en experimentos
donde el incremento de la muerte celular tras el tratamiento de
diversos tipos de células neurales tales como por ejemplo retinas
de pollito en desarrollo o neuronas simpáticas cultivadas y neuronas
proprioceptivas con el factor neurotrófico derivado de cerebro y/o
NGF, puede prevenirse por aplicación de anticuerpos de
p75^{NTR}.
El p75^{NTR} tiene una secuencia similar a
otros miembros de la familia TNRF tanto en el ectodomonio rico en
cisteína como en la secuencia citoplasmática conocida como dominio
de la muerte. A pesar de la presencia del dominio de muerte en
p75^{NTR} existe la evidencia acumulativa de que esta región no
media en la capacidad de p75^{NTR} para promover la muerte
celular. A diferencia del dominio de muerte de TNRF el dominio de
muerte de p75^{NTR} no interactúa con otras proteínas que
contienen el dominio de muerte, no se multimeriza espontáneamente
en solución y no funciona de la misma manera. De hecho,
recientemente fue mostrado que la supresión de la secuencia de
muerte en el dominio no tiene efecto sobre la capacidad de
p75^{NTR} para matar. En lugar del dominio de muerte, la región
de la yuxtamembrana citoplasmática del p75^{NTR} ha sido
encontrada como necesaria y suficiente para iniciar la muerte de la
célula nerviosa. La región fue nombrada "Chopper" y mostró que
induce la muerte celular por apoptosis sólo cuando se enlaza a la
membrana plasmática mediante un ancla lipídica.
La apoptosis o muerte celular programada es un
mecanismo fisiológico para eliminar las células en diferentes
tejidos durante la embriogénesis, morfogénesis y renovación celular.
La apoptosis es un mecanismo genéticamente controlado que
interviene en etapas avanzadas e irreversibles de daño celular. Es
por consiguiente establecido que la apoptosis juega un papel clave
en la muerte neuronal que ocurre en algunos de los trastornos
severos del SNC como el derrame cerebral, enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis
lateral amiotrófica (ALS), epilepsia, Lesión de Médula Espinal
(SCI), Esclerosis Múltiple (MS), Enfermedad Neuromotora (MND) y
otras enfermedades neurodegenerativas (Park y otros 2000; Oh y otros
2000; Lowry y otros 2001; Sedel y otros 1999; Dowling y otros
1999).
Además de lo anterior, numerosos estudios
muestran una expresión incrementada de p75^{NTR} después de la
isquemia en regiones del cerebro y corazón donde no fue registrada
una apoptosis masiva. Estos resultados sugieren que p75^{NTR}
puede jugar un importante papel en la muerte neuronal por apoptosis
pos-isquémica (Park y otros, J. Neuroscience, 2000,
20, 9096-9103).
El receptor de p75^{NTR} también se describe
como participante de la señalización celular para Prion y péptidos
\beta-amiloides (Della-Bianca y
otros, J. Biol. Chem., 2001, 276, 38929-38933) y es
por consiguiente involucrado en la acción neurotóxica de estos
componentes. Estos resultados sostienen la hipótesis de que
p75^{NTR} podría jugar un importante papel en la muerte neuronal
observada en las enfermedades priónicas, por ejemplo encefalopatías
espongiformes transmisibles (TSE) y enfermedad de Alzheimer.
Estudios recientes proporcionan un papel para el
receptor p75^{NTR} como coreceptor en la vía de señalización de
los componentes inhibitorios de la mielina, por ejemplo gliproteína
asociada a mielina (MAG), Nogo y gliproteína mielina
oligodendrocito (Omgp). Todas estas proteínas están localizadas en
la membrana de los oligodendrocitos inmediatamente adyacente al
axón e inhiben el crecimiento neuronal mediante la unión a un
receptor común, el receptor Nogo66 (NgR). NgR se une a la
superficie celular a través de un ancla de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) pero pierde un dominio de
señalización intracelular y por consiguiente necesita a p75^{NTR}
como participante para la señal. Fue encontrado que la interrupción
del complejo señal NgR previene la acción inhibitoria de MAG. Por
tanto, como un coreceptor de NgR, el p75^{NTR} se revela ahora
como un jugador clave, no sólo para el desarrollo de la regulación
neuronal y la apoptosis, sino también para regular la inhibición de
la regeneración del axón inducida por factores asociados a mielina y
como tal proporciona un blanco terapéutico para promover la
regeneración neuronal.
A pesar de que el papel principal para
p75^{NTR} está relacionado con el CNS, algún trabajo reciente
muestra una expresión incrementada de neutrofinas y p75^{NTR} con
una apoptosis concomitante a lesiones causadas por la
aterosclerosis. Además, para una variante corta de p75^{NTR},
que surge a partir del acoplamiento alternativo del exón III
en el locus de p75^{NTR}, fue mostrado en ratones transgénicos que
la ausencia de p75^{NTR} conduce a un fenotipo severo, que
incluye la letalidad parcial perinatal y defectos en el sistema
vascular. Una participación de las neurotrofinas y de los receptores
Trk en la vasculogenésis ha sido previamente demostrada; todas las
neurotrofinas son detectadas en la formación de medios túnicos de la
aorta desde E13 hacia delante. El TrkB y el TrkC son expresados en
la aorta en desarrollo con patrones de expresión recíprocos para el
p75^{NTR}, y malformaciones severas del corazón han sido
observadas en ratones mutantes de NT3 y de TrkC. Así parece que los
receptores de neurotrofina, que ahora incluyen el p75^{NTR}, son
esenciales en la formación de los vasos sanguíneos. Todos estos
hallazgos sugieren un papel primordial para el p75^{NTR} en las
patologías vasculares como por ejemplo, ateroesclerosis,
enfermedades congénitas y reumáticas cardíacas e inflamación
vascular.
No obstante al reconocimiento de p75^{NTR}
como un importante blanco terapéutico los presentes métodos de
detección se basan en la interacción de p75^{NTR} con su ligando
NGF en cualquier ensayo de unión competitiva usando las
preparaciones de membrana celular de células que expresan el
p75^{NTR} y el NGF radiomarcado como es descrito por Weskamp
(Neuron, 1991, 6, 649-663) o mediante la medida del
efecto de los compuestos a ser probados en la apoptosis inducida
por NGF en las células que expresan el p75^{NTR} como es descrito
por Tabassum (Int.J.Cancer, 2003, 105, 47-52).
Cualquier método proporciona la posibilidad para estudiar los
efectos de los compuestos de prueba en la transducción de la señal
de p75^{NTR} independiente del ligando usado.
Las presentes detecciones in vitro para
identificar los compuestos que modulan la actividad señal de
p75^{NTR} están basados en la transfección transitoria de los
cultivos de células adherentes de neuronas sensoriales, células de
rata PC12, células 293T y células de Schwann tipo salvaje, usando
los constructos de ADN que codifican para p75^{NTR} o las formas
truncadas de p75^{NTR} que retienen la capacidad para inducir la
muerte celular apoptótica bajo la inducción con NGF o el factor
inhibitorio de leucemia (LIF) (vea por ejemplo Coulson y
otros, J. Biol. Chem. 2000, 275,
30537-30545).
Los métodos actuales de descubrimiento de
fármacos involucran la evaluación de la actividad biológica de
decenas o cientos de miles de compuestos para identificar un número
pequeño de estos compuestos que tienen una actividad contra un
blanco particular, es decir Detección de Alto Rendimiento (HTS). En
un formato de detección relacionado a la típica HTS, los ensayos
son realizados en microplacas multi-cavidades, como
96, 384 ó 1536 cavidades por placa, poniendo ciertas limitaciones
para la preparación del ensayo incluyendo la disponibilidad de los
materiales de origen. Las detecciones relacionadas a HTS son
preferiblemente realizadas a temperatura ambiente con una única
medida para cada uno de los compuestos probados en el ensayo, que
requiere ciclos cortos de tiempo, con un rendimiento reproducible y
confiable.
La presente invención describe el desarrollo de
un ensayo de señalización de p75^{NTR} que puede ser realizado en
un formato de detección HTS y este se basa en un particular método
de transfección aplicable a células eucariotas como por ejemplo las
células Hek293T.
La presente invención proporciona un método para
identificar la capacidad de compuestos de prueba para modular la
apoptosis inducida por p75^{NTR} caracterizada porque;
- -
- este método no requiere de inducción con los ligandos de p75^{NTR} como por ejemplo NGF, LIF o neutrofinas, y
- -
- este método es aplicable en un formato de detección HTS debido a que la transfección en las suspensiones celulares permiten un fácil escalado y preparaciones de lotes para obtener una eficiencia reproducible y homogénea en la transfección en todas las microplacas multi-cavidades.
Es por consiguiente un primer aspecto de la
presente invención proporcionar un método para identificar la
capacidad de compuestos de prueba para modular la apoptosis inducida
por p75^{NTR}, dicho método comprende:
- i.
- transfectar una suspensión de células eucariotas con un vector que codifica para p75^{NTR} o un fragmento de este que induce muerte celular,
- ii.
- contactar dicha célula con el componente a ser probado, y
- iii.
- determinar la respuesta apoptótica en dichas células, donde una alteración en la respuesta apoptótica en la presencia de dicho compuesto de prueba comparado a una respuesta apoptótica en la ausencia del compuesto de prueba es una indicación de la capacidad de este compuesto de prueba para modular la apoptosis inducida por p75^{NTR}
En este método de acuerdo con la invención la
suspensión de células eucariotas es seleccionada a partir de un
grupo compuesto por células CHO, células de neuroblastoma humano
SK-N-BE, células de neuroblastoma
humano SH-SY-SY, neuronas
sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal, células de Schwann,
línea celular de melanoma humano A875, células de rata PC12 y
células Hek293T, en particular células Hek293T. Las suspensiones
celulares son usadas a una densidad celular de
0.4-3.0 x 10^{4} células/100 \mul. En particular
en una rango de 0.5-2.0 x 10^{4} células/100
\mul, incluso más particularmente en un rango de
0.4-0.8 x 10^{4} células/100 \mul. En una
realización adicional de la presente invención dichas células son
transfectadas en la presencia de un reactivo de transfección basado
en lípido, en particular a un radio del reactivo de transfección
para ADN de 6-1, incluso más particularmente en un
radio del reactivo de transfección para ADN de 5-3,
más particularmente a un radio de 4. Expresado por 10 ml de mezcla
de transfección final la cantidad de reactivo de transfección es en
un rango de 8.0-12.0 \mul, en particular en un
rango de 6.0-10.0 \mul y la cantidad de ADN es en
un rango de 2.0-3.5 \mug, en particular
2.0-3.0, más particularmente 2.5 \mul.
Los reactivos de transfección basados en lípido
típicamente usados son reactivos comercialmente disponibles como
por ejemplo Lipofectamina, Effectano y DMRIE-C. Como
ejemplificado de aquí en lo adelante, en una realización preferida
la transfección es realizada con una suspensión de Hek293T a una
densidad de 5000 células/ 100 \mul usando lipofectamina como
reactivo de transfección a un radio de reactivo de transfección para
el ADN de 4.
La respuesta apoptótica de las células en el
método de acuerdo con la invención es determinada usando los
procedimientos conocidos en el arte. En particular usando annexina V
o tinción nuclear. En una realización preferida la respuesta
apoptótica es determinada usando
Annexina-V-Alexa Fluor 488 y Hoechst
33342.
El receptor p75^{NTR} como usado sobre este
documento corresponde al receptor p75^{NTR} de rata (SEQ ID No.2)
u ortólogos mamíferos de estos. El fragmento de p75^{NTR} que
induce muerte celular como usado sobre este documento comprende el
dominio Chopper p75 (SEQ ID No 10) y en particular compuesto por
p75_ICD (SEQ ID No.4), p75_CD (SEQ ID No.6) o p75_TNF (SEQ ID
No.8).
Este y aspectos adicionales de la presente
invención serán discutidos en más detalles de aquí en lo
adelante.
Figura 1: Curva dosis respuesta de un compuesto
de prueba sobre la respuesta apoptótica de las células Hek293
transfectadas con el constructo de p75^{NTR} de rata (SEQ ID
No.:1). La toxicidad inducida que es cuantificada por la tinción con
annexina V y expresada como las diferencias relativas entre la
toxicidad inducida por p75^{NTR} y el control (de prueba), que
toma la toxicidad relativa de p75_FL como 100%. El ensayo fue
realizado al formato de placa de 384 cavidades con cuantificación
como porcentaje de células positivas por annexina
V-Alexa-488, contra teñidas por
Hoechst 33342.
Figura 2: Curva dosis respuesta de un compuesto
de prueba sobre la respuesta apoptótica de las células Hek293
transfectadas con el constructo chopper de p75^{NTR} de rata (SEQ
ID No.:5). La toxicidad inducida a ser cuantificada por la tinción
con annexina V y expresada como las diferencias relativas entre la
toxicidad inducida por p75^{NTR} y el control (de prueba), tomando
la toxicidad relativa de p75_CD como 100%. El ensayo fue realizado
al formato de placa de 96 cavidades con cuantificación como promedio
de la intensidad de fluorescencia por annexina
V-Alexa-488, contra teñidas por
Hoechst 33342.
Para los propósitos de descripción de la
presente invención: el receptor p75^{NTR} como es usado aquí se
refiere a una proteína receptor NGFR de rata, también conocido como
receptor de baja afinidad para el factor de crecimiento nervioso,
Gp80-LNGFR, p75 ICD y p75^{NTR}, caracterizados en
Radeke y otros., Nature 1987,325.593-597, y
disponible en Swiss-Prot No. de Acesso P07174, así
como sus ortólogos mamíferos que son al menos el 70% idénticos,
preferiblemente el 80% idénticos, incluso más preferiblemente al
menos el 90% idénticos, preferiblemente el 95% idénticos a, más
preferiblemente al menos el 97% idénticos a, y el más preferible al
menos el 99% idénticos a SEQ ID No.:2, en particular dicho ortólogo
mamífero está compuesto por el receptor humano p75^{NTR}
(Swiss-Prot: PO8138- SEQ ID No.:11), el receptor
p75^{NTR} de ratón (Swiss-Prot: Q920W1- SEQ ID
No.:12) o el receptor p75^{NTR} de pollito
(Swiss-Prot: P18519- SEQ ID No.:13).
En lugar del receptor p75^{NTR} de longitud
completa un fragmento "que induce muerte celular" de dicho
receptor puede ser usado en los ensayos de la invención. Dichos
fragmentos que inducen muerte celular corresponden a los
constructos de supresión de la proteína receptor p75^{NTR} que
retiene la capacidad para inducir apoptosis en una célula, como por
ejemplo las proteínas p75^{NTR} truncadas sptc152 y sptc35
descritas en Coulson y otros (2000, J.Biol.Chem.
275,30537-30545). Los constructos de supresión
adicionales están compuestos por; - un constructo que codifica para
el péptido señal de p75^{NTR} unido a la región de
trans-membrana y el dominio total intracelular de
la proteína p75^{NTR}, en particular que codifica para los
aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 1 a 32 unidos a los
aminoácidos 247 a 425 de la proteína p75^{NTR} de rata (SEQ ID
No.4); - un constructo que codifica para el péptido señal de
p75^{NTR} unido a la región de trans-membrana y la
región yuxtamembrana intra-celular de la proteína
p75^{NTR}, en particular que codifica para los aminoácidos
correspondientes a los aminoácidos 1 a 32 unidos a los aminoácidos
247 a 308 de la proteína p75^{NTR} de rata (SEQ ID No.6); - un
constructo que codifica una proteína compuesta por el péptido señal,
la región de trans-membrana y parte del dominio
intra-celular que carece del dominio "chopper"
pero que incluye el receptor TNF similar al del dominio de la
muerte, en particular que codifica para los aminoácidos
correspondientes a los aminoácidos 1 a 32 unidos a los aminoácidos
247 -273 y los aminoácidos 303 a 425 de la proteína p75^{NTR} de
rata (SEQ ID No.8). En una realización los fragmentos de p75^{NTR}
que inducen muerte celular son seleccionados a partir de
polipéptidos que tienen al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de
identidad en la secuencia con el dominio Chopper (SEQ ID No.:10),
p75_ICD (SEQ ID No.:4), p75_CD (SEQ ID No.:6) o p75_NTF (SEQ ID
No.:8). En una realización preferida de la presente invención el
fragmento p75^{NTR} que induce muerte celular como usado sobre
este documento comprende el dominio Chopper de p75 (SEQ ID No.10) y
en particular está compuesta por p75_ICD (SEQ ID No.4), p75_CD (SEQ
ID No.6) o p75_NTF (SEQ ID No.8).
Los métodos para comparar la identidad y
similaridad de dos o más secuencias son bien conocidos en el arte.
Así por ejemplo, los programas disponibles en el Paquete de Análisis
de Secuencia de Winconsin, versión 9.1 (Devreux J. y otros, Nucleic
Acid Res, 12, 387-395, 1984), por ejemplo los
programas BESTFIT y GAP, pueden ser usados para determinar el % de
identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de
similaridad entre dos secuencias de péptidos o de polipéptidos.
BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y
Watcrman (J.Mol.Biol., 147, 195-197, 1981) y
encuentra la única mejor región de similaridad entre dos secuencias.
BESTFIT es más apropiado para comparar dos polinucleótidos o dos
secuencias de péptidos o de polipéptidos que son diferentes en
longitud, el programa que asume que la secuencia más corta
representa una porción de la más larga. En comparación, GAP alinea
dos secuencias, encontrando una "similaridad máxima", de
acuerdo con el algoritmo de Needdlman y Wunsch (J.Mol.Biol., 48,
443-453, 1970). GAP es más apropiado para comparar
secuencias que son aproximadamente de igual longitud y es esperado
un alineamiento por encima de longitud completa. Preferiblemente,
los parámetros "Peso del intervalo" y "Peso de Longitud"
usado en cada programa son 50 y 3, para secuencias de
polinucleótidos y 12 y 4 para secuencias de polipéptidos,
respectivamente. Preferiblemente, los % de identidad y similaridad
son determinados cuando las dos secuencias que se comparan son
óptimamente alineadas. Otros programas para determinar la identidad
y/o similaridad entre las secuencias son bien conocidos en el arte,
por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul S F y otros,
Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997).
El término "compuesto", "compuesto de
prueba", "agente" o "agente candidato" como usado aquí
puede ser cualquier tipo de molécula, que incluye por ejemplo, un
péptido, un polinucleótido, o una molécula pequeña que uno desee
examinar por su capacidad para modular la apoptosis inducida por
p75^{NTR}, y donde dicho agente puede proporcionar una ventaja
terapéutica para el sujeto que la reciba. Los agentes candidatos
pueden ser administrados a un individuo por diferentes vías, que
incluyen, por ejemplo, oral o parenteral, como intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intraorbital, intracapsular,
intraperitoneal, intrarectal, intracisternal o por absorción pasiva
o facilitada a través de la piel, usando por ejemplo un parche
dérmico o iontoforesis transdermal, respectivamente. Además el
compuesto puede ser administrado mediante inyección, intubación o
tópicamente, este último puede ser pasivo, por ejemplo mediante
aplicación directa de un ungüento, o activa, por ejemplo, usando un
atomizador o inhalador nasal, en este caso un componente de la
composición es un propelente apropiado. La vía de administración
del compuesto dependerá, en parte, de la estructura química del
compuesto. Los péptidos y polinucleótidos, por ejemplo, no son
particularmente útiles cuando administrados oralmente debido a que
ellos pueden ser degradados en el tracto digestivo. Sin embargo,
los métodos para los péptidos que se modifican químicamente, por
ejemplo versión de ellos menos susceptibles a la degradación son
bien conocidos e incluyen por ejemplo, el uso de
D-aminoácidos, el uso de dominios basados en
péptidos mimetizadotes, o el uso de un peptoide como el peptoide
vinilogos.
El agente usado en el método de detección puede
ser usado en un portador farmacéuticamente aceptable. Vea, por
ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición,
por E.W. Martin Mack Pub. Co., Easton, PA, que divulga portadores
típicos y métodos convencionales de preparación de composiciones
farmacéuticas que pueden ser usadas en conjunción con la preparación
de las formulaciones de agentes y que es incorporada como referencia
aquí.
Como se esbozó anteriormente, la presente
invención proporciona una suspensión de células temporalmente
transfectadas con un vector que codifica para p75^{NTR} o un
fragmento de este que induce la muerte. En particular las células
HEK 293T (ATCC número de acceso CRL-1573) son
derivadas de células embrionarias de riñón humano transformadas y
conocidas por tener propiedades adherentes en el crecimiento (Graham
F.L., y otros 1977, J.Gen.Virol. 36:59-72). Las
células HEK 293 tienen una tendencia normal para formar agregados
que afectan la viabilidad celular cuando se mantienen en suspensión
(David A.E. y otros, 1999 Focus 21(1):22-24).
Como una consecuencia la transfección de las células HEK293 es
típicamente realizada en las células adheridas. En un formato de
detección de multi-cavidades esto implica que las
células se recubren en cada una de las cavidades individuales al
menos un día antes de la transfección. Usando el protocolo de
transfección de la presente invención, una mezcla homogénea de
transfección es adicionada a una suspensión de células HEK293 y así
la mezcla celular obtenida se recubre de las células individuales.
Comparado al anterior, esto no sólo reduce el tiempo del ciclo, sino
también el número de pasos a pipetear y como tal proporciona un
formato de ensayo más homogéneo, reproducible. Además, dado el
método particular de transfección de la presente invención, sólo
pequeños números de células, ADN y reactivo de transfección son
requeridos reduciendo adicionalmente el costo por cavidad.
Los vectores usados en los métodos de acuerdo
con la invención son automáticamente construidos en el arte de la
biología molecular y pueden involucrar el uso de ADN plasmidial e
iniciadores, promotores, aceleradores y otros elementos apropiados,
que pueden ser necesarios, y que son posicionados en la orientación
correcta, para permitir la expresión proteica. Generalmente,
cualquier sistema o vector apropiado que mantiene, propaga o
expresa polinucleótidos puede ser usado para producir un polipéptido
en un huésped. La secuencia de nucleótidos apropiada, por ejemplo
las secuencias que codifican tanto la proteína p75^{NTR} como un
fragmento de este que induce la muerte como es definido aquí en lo
adelante, pueden ser insertadas en un sistema de expresión por
cualquier una de la variedad de técnicas bien conocidas y de rutina
como por ejemplo aquellos expuestos en Current Protocols in
Molecular Biology, Ausbel y otros., eds., John Wiley & Sons,
1997.
Así un objeto de la presente invención es
proporcionar vectores que codifican para p75^{NTR} o fragmentos de
este que inducen la muerte, donde dichos vectores comprenden las
secuencias de polinucleótidos seleccionadas a partir de las
secuencias de polinucleótidos que tienen al menos el 70%, 80%, 90%,
95%, 97%, ó 99% de identidad en la secuencia con SEQ ID No.:1
(p75^{NTR} de rata); SEQ ID No.:3 (p75^{NTR}_ICD), SEQ ID No.:5
(p75^{NTR}_CD) o SEQ ID No.:7 (p75^{NTR}_TNF).
En una realización particular las células HEK293
de acuerdo con la invención son transfectadas con vectores de
expresión comercialmente disponibles pcADN3.1, que comprende las
secuencias de polinucleótidos que codifican para p75^{NTR} de rata
(SEQ ID No.:1) o fragmentos de estos que inducen la muerte,
p75^{NTR}_ICD (SEQ ID No.:3), p75^{NTR}_CD (SEQ ID No.:5) y
p75^{NTR}_TNF (SEQ ID No.:7) respectivamente.
Para los detalles adicionales con relación a la
preparación de los constructos de ácidos nucleicos, mutágenesis,
secuenciación, introducción del ADN dentro de las células y
expresión génica, y análisis de las proteínas, vea por ejemplo,
Molecular Cloning: Manual de Laboratorio: 2da edición, Sambrook y
otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
La presente invención también proporciona un
ensayo para identificar la capacidad de un compuesto para modular la
apoptosis inducida por p75^{NTR} en una célula.
Los ensayos de la presente invención pueden ser
diseñados en muchos formatos de detección de compuestos generalmente
conocidos en el arte por su capacidad para modular una respuesta
apoptótica en una célula. La apoptosis es típicamente determinada
en una célula basada en el criterio morfológico y bioquímico. Las
características morfológicas incluyen por ejemplo, contracción
celular, condensación citoplasmática, segregación de la cromatina,
condensación nuclear, fusión de membrana y la formación de cuerpos
apoptóticos unidos-a membrana. Los métodos
tradicionales para determinar estos cambios morfológicos incluyen la
microscopía de luz y electrónica usando entre otros colorantes
vitales y tinciones nucleares tales como por ejemplo DAPI,
DRAQ-5, SYBR14, yoduro de propidio, tinción de
Hoechst. Los cambios bioquímicos están asociados con la activación
de las rutas asociadas a la muerte celular, como por ejemplo la
activación de la quinasa MAP, activación de la calpaína y la
activación de la caspasa-3, que finalmente resulta
en la división del ADN internucleosomal en fragmentos de longitud
de oligonucleosoma. Los métodos bioquímicos comúnmente usados
incluyen el patrón de ADN, unión al Annexina, evaluación de la
pérdida del potencial de transmembrana mitocondrial y medición de
la actividad enzimática en una o más rutas asociadas a la muerte
celular como por ejemplo fosforilación de c-Jun
(JNK), división de PARP y liberación de Citocromo C. (Budd R.C., y
otros 1997, Coron Artery Dis. 8(10): 593-597;
Loo D. T. y Rillema J. R., 1998, Methods Cell Biol. 57:
251-260).
251-260).
Los ensayos de la presente invención aprovechan
ventajosamente el hecho de que la transfección de una suspensión de
células con p75^{NTR} o un fragmento de dicho p75^{NTR} que
induce la muerte celular no requiere más la presencia de un ligando
p75^{NTR} en el medio de cultivo para inducir la apoptosis en
dichas células y por consiguiente simplifica el método para
determinar la capacidad de un compuesto para modular la apoptosis
inducida por p75^{NTR} en una célula.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un ensayo para la detección de los compuestos de prueba, el ensayo
comprende a) transfectar una suspensión de células con p75^{NTR} o
un fragmento de este que induce la muerte; b) incubar dichas células
con los compuestos a ser evaluados; y c) medir la respuesta
apoptótica de dicha células.
En una primera realización de esta invención la
suspensión de células es seleccionada del grupo compuesto por
células CHO, células de neuroblastoma humano
SK-N-BE, células de neuroblastoma
humano SH-SY-5Y, neuronas
sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal, células de Schwann,
línea celular de melanoma humano A875, células de rata PC12 y
células Hek293T. Dichas células son transfectadas con los vectores
de acuerdo a la invención (ver supra) usando los procedimientos de
transfección conocidos en el arte, en particular usando reactivo de
transfección basado en lípido como por ejemplo Lipofectamina,
Effectano y DMRIE-C.
En una realización particular de esta invención
la suspensión de células compuesta por las células HEK293T es
transfectada de acuerdo a la invención con un vector que usa
Lipofectamina como reactivo de transfección.
Los métodos para medir la respuesta apoptótica
en las células son proporcionados de aquí en lo adelante y
típicamente comprende el uso de un marcador precoz de apoptosis como
por ejemplo Annexina V detectablemente marcada en combinación con
tintes nucleares tales como Hoechst 33342, DAPI y
DRAQ-5. La Annexina-V
detectablemente marcada incluye la Annexina V radiomarcada, la
fluorescentemente marcada y la marcada enzimáticamente como por
ejemplo la comercialmente disponible fluorescentemente marcada
Annexina-V-Alexa fluor 350,
Annexina-V-Alexa fluor 488,
Annexina-V-Alexa fluor 568,
Annexina-V-Alexa fluor 594,
Annexina-V-Alexa fluor 647,
Annexina-V-FITC y la enzimáticamente
marcada Annexina-V-Biotina,
Annexina-V-Cy5 y
Annexina-V-Cy5.5.
En otra realización de esta invención la
respuesta apoptótica de las células es determinada usando la
combinación de la tinción con Hoechst, para determinar el número
total de las células, con Annexina unida, para determinar la
fracción de células apoptóticas. En una realización particular la
respuesta apoptótica es determinada usando Hoechst 33342 y
Annexina-V-Alexa fluor 488.
\vskip1.000000\baselineskip
Un uso preferido de los compuestos identificados
usando los métodos de la presente invención es en el tratamiento de
las patologías vasculares como por ejemplo la ateroesclerosis,
enfermedad cardíaca congénita y reumática e inflamación vascular y
en el tratamiento de las patologías asociadas con el desarrollo
neuronal y la apoptosis neuronal. La última incluye las enfermedades
graves en el CNS como accidente cerebro-vascular,
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de
Alzheimer, ALS, SCI, MS MND y enfermedad priónicas, es decir
TSE.
Otro uso preferido de los compuestos
identificados usando los métodos de la presente invención es en la
producción de otros efectos terapéuticos, como efectos analgésicos.
Los compuestos identificados usando los métodos de la presente
invención son preferiblemente usados para producir uno o más de
aquellos efectos en un paciente con la necesidad de tal
tratamiento.
Pacientes con la necesidad de tal tratamiento
pueden ser identificados por técnicas médicas estándares. Por
ejemplo, la producción de la actividad analgésica puede ser usada
para tratamiento de pacientes que sufren de las afecciones clínicas
de dolor agudo y crónico que incluyen los siguientes: neuropatías
periféricas como ocurre con la diabetes mellitus y la esclerosis
múltiple; dolor central tal como es visto con las lesiones de la
médula espinal; hiperalgesia; dolor del cáncer y alodinia.
En un método de tratamiento al paciente, una
cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que in
vitro modula la apoptosis inducida por p75^{NTR}, es
administrada al paciente. En particular la administración sistémica
o tópica de una cantidad efectiva de un compuesto de acuerdo a la
invención, a animales de sangre-caliente, esto
incluye los humanos. Típicamente, el compuesto modula la actividad
del receptor p75^{NTR} mediante la acción como un modulador
alostérico o como un agonista o antagonista al sitio de activación
al que se une p75. Preferiblemente, el paciente tiene una enfermedad
neurológica o un trastorno, preferiblemente el compuesto tiene un
efecto sobre la actividad fisiológica. Tal actividad fisiológica
puede ser convulsiones, neuroprotección, muerte neuronal,
desarrollo neuronal, control central de la actividad cardíaca,
despertar, control de movimientos y control del reflejo vestibo
ocular.
Enfermedades o trastornos que pueden ser
tratados mediante la modulación de la apoptosis inducida por
p75^{NTR} incluye uno o mas de los siguientes tipos: (I) aquellos
caracterizados por la expresión anormal de p75^{NTR} (por ejemplo
diferente en tipo (mutantes) o magnitud);(2) aquellos caracterizados
por una cantidad anormal de un mensajero extracelular o
intracelular que activa el receptor p75^{NTR}; (3) aquellos
caracterizados por un efecto anormal (por ejemplo, un efecto
diferente en el tipo o magnitud) de un mensajero intracelular o
extracelular que puede el mismo ser mejorado por la actividad del
receptor p75^{NTR}; y (4) otras enfermedades o trastornos en que
la modulación de la actividad del receptor p75^{NTR} ejercerá un
efecto beneficioso, por ejemplo, en las enfermedades o trastornos
donde la producción de un mensajero intracelular o extracelular
estimulado por la actividad de p75^{NTR} se compensa por una
cantidad anormal de un mensajero diferente.
Los compuestos y métodos pueden también usarse
para producir otros efectos como un efecto analgésico, el efecto de
aceleración del conocimiento, y un efecto relajante muscular.
Un "paciente" se refiere a un mamífero en
el que la modulación de la actividad del receptor de p75^{NTR}
tendrá un efecto beneficioso. Pacientes con necesidad de tratamiento
que involucre la modulación de la actividad del receptor
p75^{NTR} pueden ser identificados usando técnicas estándares
conocidas para aquellos en la profesión médica. Preferiblemente, un
paciente es un humano que tiene una enfermedad o trastorno
caracterizado por uno o más de lo siguiente: caracterizado por la
expresión anormal p75^{NTR} (por ejemplo diferente en tipo
(mutantes) o magnitud); (2) aquellos caracterizados por una cantidad
anormal de un mensajero extracelular o intracelular que activa el
receptor p75^{NTR}; (3) aquellos caracterizados por un efecto
anormal (por ejemplo, un efecto diferente en el tipo o magnitud) de
un mensajero intracelular o extracelular que puede ser propiamente
mejorado por la actividad del receptor p75^{NTR}.
Por "una cantidad terapéuticamente
efectiva" se entiende una cantidad de un agente que alivie a uno
o más síntomas de la enfermedad o trastorno en el paciente; o
retorne parcial o completamente a lo normal a uno o más parámetros
fisiológicos o bioquímicos asociados con o causales de la
enfermedad.
Más generalmente, esta invención proporciona un
método para modular la actividad del receptor del glutamato
metabotrópico proporcionando a una célula que tiene un receptor de
glutamato metabotrópico una cantidad de un receptor glutamato
metabotrópico que modula suficientemente la molécula como
mimetizador de uno o más efectos del glutamato en el receptor
glutamato metabotrópico, o bloquea uno o más efectos del glutamato
en el receptor glutamato metabotrópico. El método puede llevarse a
cabo in vitro o in vivo.
Tales agentes pueden ser formulados en
composiciones que comprenden un agente junto con un portador o
diluente farmacéuticamente aceptable. El agente puede en la forma
de un derivado fisiológicamente funcional, como un éster o una sal,
como una adición de sal ácida, o sal básica de metal, o un óxido de
N o S. Los portadores farmacéuticamente aceptables o diluentes
incluyen aquellos usados en la formulaciones apropiadas para la
administración oral, rectal, nasal, inhalable, tópica (que incluyen
bucal y sublingual), vaginal o parenteral (que incluyen subcutánea,
intramuscular, intravenosa, intradermal, intracatecal y epidural).
La selección del portador o diluente dependerá por supuesto de la
ruta de administración propuesta, que, puede depender del agente y
su propósito terapéutico. Las formulaciones pueden ser presentadas
convenientemente en forma de dosis unitaria y puede ser preparadas
por cualquiera de los métodos bien conocidos en el arte de la
farmacia. Tales métodos incluyen el paso de poner en asociación el
ingrediente activo con el portador que está compuesto por uno o más
ingredientes auxiliares. En general las formulaciones son preparadas
poniendo uniformemente e íntimamente en asociación el ingrediente
activo con los portadores líquidos o portadores sólidos finamente
divididos o ambos, y entonces, si es necesario, formando el
producto.
Para las composiciones sólidas, los portadores
sólidos no-tóxicos convencionales incluyen, por
ejemplo, los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, celulosa,
derivados de celulosa, almidón, esterato de magnesio, sacarina
sódica, talco, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares
puede ser usados. Los compuestos activos como definidos
anteriormente pueden ser formulados como supositorios usando, por
ejemplo, glicoles de poliaquileno, triglicéridos acetilados y
similares, como el portador. Las composiciones líquidas
farmacéuticamente administrables pueden, por ejemplo prepararse
disolviendo, dispersando, etc, un compuesto activo como definido
anteriormente y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador,
como, por ejemplo, agua, dextrosa acuosa salina, glicerol, etanol,
y similares, y de ese modo formar una solución o suspensión. Si es
deseado, la composición farmacéutica a administrarse puede
también contener cantidades menores de sustancias auxiliares
no-tóxicas tales como agentes humectantes o
emulsificantes, agentes tampones de pH y similares, por ejemplo,
acetato de sodio, monolaureato de sorbitano, acetato de
trietanolamina de sodio, monolaureato de sorbitano, oleato de
trietanolamina, etc. Métodos recientes de preparación de tales
formas de dosis son conocidos, o serán demostrados, para aquellos
expertos en el arte; por ejemplo, ver Gennaro y otros, Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton,
Pennsylvania, 18th Edition,
1990.
1990.
La composición o formulación a administrarse
contendrá, en cualquier circunstancia, una cantidad del
compues-
to(s) activo en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que es tratado.
to(s) activo en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que es tratado.
Las formas o composiciones de las dosis
contienen el ingrediente activo en el rango de 0.25 a 95% con el
balance hecho a partir de portadores no tóxicos que pueden ser
preparados.
Para la administración oral, una composición
no-tóxica farmacéuticamente aceptable se forma por
la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente
empleados, como, por ejemplo grados farmacéuticos de manitol,
lactosa, celulosa, derivados de celulosa, carmelosa cruzada de
sodio, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco,
glucosa, sucrosa, magnesio, carbonato y similares. Tales
composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas,
píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación continua y
similares. Tales composiciones pueden contener 1%-95% de ingrediente
activo, más preferiblemente 2-50%, el más preferible
de 5-8%.
La administración parenteral es generalmente
caracterizada por inyección, tanto subcutánea, intramuscular como
intravenosa. Los inyectables pueden ser preparados en las formas
convencionales, tanto como soluciones líquidas como suspensiones,
formas sólidas apropiadas para solución o suspensión en líquido
previo a la inyección, o como emulsiones. Excipientes apropiados
son, por ejemplo, agua, salina, dextrosa, glicerol, etanol o
similares. Además, si es deseado, las composiciones farmacéuticas a
ser administradas pueden también contener cantidades menores de
sustancias no-tóxicas auxiliares como agentes
humectantes o emulsificadores, agentes tampones de pH y similares,
como por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitano, oleato
de trietanolamina, acetato de trietanolamina de sodio, etc.
El porcentaje de compuesto activo que está
contenido en tales composiciones parentales es altamente dependiente
de la naturaleza específica de este, así como de la actividad del
compuesto y las necesidades del sujeto. Sin embargo, los
porcentajes de ingrediente activo de 0.1% a 19% en solución son
empleados, y serán superiores si la composición es un sólido que
será seguidamente diluido a los porcentajes anteriores.
Preferiblemente, la composición comprenderá 0.2-2%
del agente activo en solución.
En toda esta descripción el término "métodos
estándares", "protocolos estándares" y "procedimientos
estándares", cuando usados en el contexto de las técnicas de
biología molecular, están siendo comprendidos como protocolos y
procedimientos encontrados en un manual de laboratorio ordinario
como: Current Protocols in Molecular Biology, editores Ausbel y
otros., John Wiley & Sons, 1994 o Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2da edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
1989.
Esta invención será mejor comprendida por
referencia a los detalles experimentales que siguen, pero aquellos
expertos en el arte apreciarán fácilmente que estos sólo son
ilustrativas de la invención como descrito mas competo en las
reivindicaciones que siguen posteriormente. Además, en toda la
aplicación, diversas publicaciones son citadas. La divulgación de
estas publicaciones está incorporada en este documento como
referencia en esta aplicación para describir más completamente el
estado del arte para la que esta invención pertenece.
Un constructo pCADN3 (p75_FL), que contiene la
secuencia del ADNc de p75^{(NTR)} de rata tipo salvaje (SEQ ID
No.1), de acuerdo al número de acceso X05137 de EMBL fue gentilmente
proporcionada por Carlos Ibanez. Dos constructos de supresión que
codifican como previamente descrito, de formas truncadas del
receptor p75 (Coulson y otros, 2000) fueron generados por la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Ambos constructos de
supresiones: Dominio Intra-Celular de p75 (p75_ICD)
(SEQ ID NO.3) y Dominio Chopper de p75 (p75_CD) (SEQ ID No.5) fueron
generados clonando los productos del PCR en un sitio de
multi-clonaje del vector pCADN3 usando los sitios
de restricción introducidos por 5'Eco RI y 3' ApaI. La región 5' sin
traducir del ácido nucleico 114 (UTR) y el 3'UTR del ácido nucleico
163 presente en el constructo p75_FL, fueron mantenidos en los
constructos de supresión.
El constructo de ADN de p75_ICD codifica los
aminoácidos 1 al 32 unidos a los aminoácidos 247 al 425 de la
proteína p75^{(NTR)} de rata. Por tanto se incluyen el péptido
señal, la región trans-membrana y el dominio
completo intra-celular.
El constructo de ADN p75_CD codifica los
aminoácidos 1 al 32 unidos a los aminoácidos 247 al 308. Por tanto
se incluyen el péptido señal, la región
trans-membrana y la región
yuxta-membrana intra-celular,
designada dominio de muerte "chopper".
El constructo de ADN p75_NTF codifica un
polipéptido compuesto por los aminoácidos 1 al 32 unidos a los
aminoácidos 247 al 273 y aminoácidos 303 al 425 de la proteína
p75^{(NTR)} de rata. Por tanto se incluyen el péptido señal, la
región trans-membrana y parte del dominio
intra-celular que pierde el dominio Chopper pero
incluye el receptor TNF similar al dominio de muerte. Entre el
péptido señal y la región trans-membrana, fue
insertado el epítope tag de la proteína hemaglutinina (HA) de la
influenza humana.
Todos los cultivos celulares y pasos de
incubación fueron realizados en Medio Eagle Modificado Dulbecco's
(DMEM) (Invitrogen Corporation) suplementado tanto con 10% ó 3% de
Suero Fetal Bovino (FBS) a 37ºC y 5% de CO_{2}, a menos que se
indique de otro modo.
Preparación: El día uno, células HEK293T
fueron sembradas en frascos de cultivo de p175 cm^{2} a una
densidad de 60.000 células/cm^{2} y dejadas crecer toda la noche
(DMEM + 10% FBS) hasta que fue alcanzada la confluencia de
40-70%.
40-70%.
Transfección: El día dos, las células
HEK293T, crecidas toda la noche, fueron transferidas a placas de 96
cavidades, cada cavidad conteniendo 5000 células en 100 \mul de
medio (DMEM +3% de FBS) y transfectadas durante 48 horas, usando
para este ensayo un método desarrollado, Brevemente:
Para asegurar la reproducibilidad, una mezcla de
transfección suficiente fue preparada para al menos 250
cavidades.
Cuando fueron requeridos un número mayor de
cavidades, los volúmenes y cantidades fueron escalados
proporcionalmente.
La mezcla de transfección para 250 cavidades fue
preparada como sigue:
A un tubo que contiene DMEM sin suero, le fue
adicionado 6.25\mug de un constructo de ADN apropiado hasta un
volumen final de 1250 \mul y agitado. A un segundo tubo que
contiene 1225 \mul DMEM sin suero le fue adicionado 25 \mul de
Lipofectamina 2000 (Invitrogen Corporation) y agitado.
Después de un periodo de 5 minutos de incubación a Temperatura
Ambiente (RT), el contenido de los dos tubos fue combinado, mezclado
suavemente e incubado por
20 minutos adicionales a RT.
20 minutos adicionales a RT.
Mientras tanto las células HEK293T fueron
removidas de los frascos de cultivo p175 cm^{2} usando 2 ml de una
solución de Tripsina 0.005%, EDTA 0.04%, seguido por neutralización
de la tripsina con 8 ml de medio (DMEM + 3% FBS). La concentración
celular fue determinada usando un contador Coulter y ajustada a
55.000 células/ml con medio (DMEM + 3% FBS). Al final del periodo de
incubación de 20 minutos, 25 ml de suspensión de la transfección fue
preparada combinando la mezcla de ADN/lipofectamina2000 con 22.5 ml
de la suspensión celular. Después de la mezcla suave pero completa,
100 \mul de la suspensión de la transfección fue transferido
inmediatamente a las cavidades apropiadas de una placa de 96
cavidades cubierta con
poli-L-lisina. Finalmente cada placa
que contenía en cavidades separadas, las células en espera se
transfectaron con vectores vacíos pCADN3 (transfección prueba,
control negativo), constructos de ADN de pCADN3_ICD, pcADN3_TNF
y/o pCADN-CD.
Las placas fueron incubadas durante 48 horas
antes de la medición.
Para determinar la influencia del número de
moléculas pequeñas en la apoptosis inducida por los constructos de
ADN de expresión anteriormente mencionados, las adiciones fueron
hechas a cavidades apropiadas de las placas de 96 cavidades, seis
horas después del inicio de la transfección. Los compuestos fueron
adicionados al medio (DMEM + 3% FBS + 1% DMSO) de una solución madre
de 10 veces, resultando en un volumen final de 110 \mul de medio
por cavidad y una concentración de DMSO de alrededor de 0.1%. Las
cavidades sin la adición de compuestos fueron ajustadas al mismo
volumen y concentración de DMSO.
Una hora antes de la detección, fueron
adicionados a cada cavidad el conjugado de
Annexina-V-Alexa Fluor 488
(Molecular probes) y Hoechst 33342 (Molecular probes)
a una dilución final de 50 veces y una concentración de
6.7 \mug/ml respectivamente. Seguidamente, las placas fueron incubadas durante una hora adicional.
6.7 \mug/ml respectivamente. Seguidamente, las placas fueron incubadas durante una hora adicional.
La cuantificación del número total de células
(Hoeschst positivo), el número de células necróticas más
apoptóticas y la intensidad de fluorescencia (Annexina V
positiva) fue alcanzada analizando las placas de 96 cavidades en
la plataforma de imagen celular MIAS-1
MIAS-2 (Union Biometrica).
Coulson E.J., JBC "Chopper, a
new death domain of p75 neurotrophin receptor that mediates neuronal
cell death", 2000, 275 (9),
30537-30545.
<110> Jassen Pharmaceutica N.V.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ensayo de detección de
p75^{NTR}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PRD 2245
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EPO4103368.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-07-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenteIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1604
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 425
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 930
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<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 211
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 577
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 871
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cmKRWNSCKQNK QGANSRPVNQ TPPPEGEKL
\hskip5cm29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (12)
1. Un método para identificar la capacidad de
compuestos de prueba para modular la apoptosis inducida por
p75^{NTR}, dicho método comprendiendo:
- i.
- transfectar una suspensión de células eucariotas con un vector que codifica para p75^{NTR} o un fragmento de este que induce muerte celular,
- ii.
- contactar dicha célula con el componente a ser probado; y
- iii.
- determinar la respuesta apoptótica en dichas células, donde una alteración en la respuesta apoptótica en la presencia de dicho compuesto de prueba comparado a una respuesta apoptótica en la ausencia del compuesto de prueba es una indicación de la capacidad de este compuesto de prueba para modular la apoptosis inducida por p75^{NTR}.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
donde la suspensión de células eucariotas es seleccionada de un
grupo que consiste de células CHO, células de neuroblastoma humano
SK-N-BE, células de neuroblastoma
humano SH-SY-5Y, neuronas
sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal, células de Schwann,
línea celular de melanoma humano A875, células de rata PC12 y
células Hek293T, en particular células Hek293T.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde el p75^{NTR} es el receptor de rata (SEQ ID No.:2) o los
ortólogos mamíferos de este.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde el fragmento que induce la muerte celular es seleccionado de
los polipéptidos que tienen al menos 70% de identidad en la
secuencia con la SEQ ID No.:10, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6 o SEQ ID
No.:8.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde el fragmento de p75^{NTR} que induce la muerte celular
comprende el dominio Chopper de p75 (SEQ ID No.10) y en particular
está compuesta por p75_ICD (SEQ ID No.4), p75_CD (SEQ ID No.6) o
p75_TNF (SEQ ID No.8).
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde la respuesta apoptótica es determinada usando cambios
morfológicos y/o bioquímicos seleccionados del grupo compuesto por
contracción celular, condensación citoplasmática, segregación de la
cromatina, condensación nuclear, fusión de membrana y la formación
de cuerpos apoptóticos unidos a membrana, el patrón de ADN, unión a
la Annexina, y la pérdida del potencial de membrana
mitocondrial.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde la respuesta apoptótica es determinada usando annexina V o la
tinción nuclear.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 5
donde la respuesta apoptótica es determinada usando annexina V
marcada con fluorescencia, en particular
Annexina-V-Alexa Fluor 488.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 5
donde la respuesta apoptótica es determinada usando annexina V o la
tinción nuclear.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
donde la suspensión de células es transfectada en presencia de un
reactivo de transfección basado en lípido caracterizado
porque el radio del reactivo de transfección para ADN está en el
rango de 6-1.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 8
caracterizado además porque la densidad de la célula está en
el rango de 0.4-3.0 x 10^{4} células/100
\mul.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
10 donde el reactivo de transfección basado en lípido es
seleccionado de Lipofectamina, DMRIE-C o Effectano,
en particular lipofectamina usada al radio de 4 de lipofectamina
para ADN.
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