IT202000007720A1 - Peptidi e loro usi - Google Patents

Description

PEPTIDI E LORO USO

AMBITO TECNICO

La presente invenzione riguarda peptidi interagenti con CD271 e loro derivati e il loro uso come medicamento, in particolare per il trattamento del melanoma.

STATO DELLA TECNICA

Il melanoma rappresenta un grave problema di salute pubblica, con un'incidenza annuale in aumento pi? rapido rispetto a qualsiasi altro tipo di cancro (Ali Z, Yousaf N, Larkin J. Melanoma epidemiology, biology and prognosis. EJC Suppl 11: 81-91, 2013; Lens MB, Dawes M. "Global perspectives of contemporary epidemiological trends of cutaneous malignant melanoma" Br. J. Dermatol., 2004; 150: 179?185) che lo rende una delle forme pi? comuni di cancro nei giovani adulti (Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. "Cancer statistics, 2005" CA, Cancer J Clin, 2005; 55: 10?29). L'incidenza del melanoma maligno cutaneo ? aumentata in media del 3-7% negli ultimi decenni (de Vries E, Bray FI, Eggermont AM, Coebergh JW; "European Network of Cancer Registries. Monitoring stage-specific trends in melanoma incidence across Europe reveals the need for more complete information on diagnostic characteristics" Eur J Cancer Prev, 2004;13: 387-95). Attualmente rappresenta l'1-3% di tutti i tumori maligni, con l'Australia e la Nuova Zelanda con l'incidenza pi? elevata (40 nuovi casi/100.000 abitanti all'anno), seguiti dai paesi del Nord Europa e dagli Stati Uniti; al contrario, Giappone ed Africa centrale condividono l'incidenza pi? bassa (0,4/100.000). In Italia, le tendenze dell'incidenza hanno documentato un aumento annuale del 6,2% nei maschi e del 5,8% nelle femmine dal 1987 al 1997; i tassi di incidenza standardizzati variano tra 3,9 e 12,5/100.000 maschi e tra 3,2 e 13/100.000 femmine. Anche i tassi di mortalit? sono aumentati, con 232.000 nuovi casi di melanoma nel 2012 e 55.000 morti in tutto il mondo (Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D and Bray F. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN2012. Int J Cancer 2015; 136: E359-E386).

Fino a un quinto dei pazienti progredisce verso la malattia metastatica (stadio IV), con una sopravvivenza mediana di 6 mesi e un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 5% (Cummins DL, Cummins JM, Pantle H, Silverman MA, Leonard AL, Chanmugam A. "Cutaneous malignant melanoma" Mayo Clin Proc, 2006; 81: 500?507). Ad oggi, l'unica chemioterapia approvata dalla FDA per il melanoma ? l'agente alchilante dacarbazina (DTIC), che fornisce risposte cliniche della durata di 6-8 mesi nel 5-10% dei pazienti e guarigione in circa l'1% (Serrone L, Zeuli M, Sega F M, Cognetti F. "Dacarbazine-based chemotherapy for metastatic melanoma: thirty-year experience overview" J Exp Clin Res, 2000; 19: 21? 34). Numerose immunoterapie sono ora disponibili per il trattamento del melanoma metastatico; la FDA ha recentemente approvato gli anticorpi monoclonali umanizzati pembrolizumab e nivolumab che hanno come bersaglio il Recettore della Morte Programmata 1 (PD-1), aumentando cos? la capacit? del sistema immunitario di attaccare le cellule del melanoma. Un recente studio riporta un tasso oggettivo di risposta del 33% e una sopravvivenza globale mediana di 23 mesi nella popolazione totale e del 45% e 31 mesi nei pazienti trattati. Il 44% di tutti i pazienti che rispondono alla terapia ha avuto una durata di risposta di almeno 1 anno con bassa tossicit? (Kim DW, Zager JS, Eroglu Z. ?improving clinical outcomes with pembrolizumab in patients with advanced melanoma? Chinese Cl Oncology 2017; 6: 1-4; Ribas A, Hamid O, Daud A et al. ?Association of pembrolizumab with tumour response and survival among patients with advanced melanoma?. JAMA 2016; 315:1600-1609). Secondo quanto riferito, l'attivit? del nivolumab era simile a quella del pembrolizumab con un tasso oggettivo di risposta del 40% (Robert C, Long GV, Brady B et al. ?Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation?. N Engl J Med 2015; 372:320-330). Inoltre, l'anticorpo monoclonale umanizzato ipilimumab blocca l'attivit? di CTLA-4, permettendo cos? alle cellule T di attivarsi e attaccare il melanoma. Ipilimumab ha mostrato di prolungare la sopravvivenza nel melanoma avanzato (Eggermont AM, Chiarion-Sileni V, Grob JJ et al. ?Prolonged survival in stage III melanoma with ipilimumab adjuvant therapy. N Engl J Med 2016; 10:1845-1855). Infine, sono diventate disponibili diverse terapie mirate con la funzione di bloccare l'attivit? di alcune forme mutate di BRAF, che sono fondamentali per la crescita del melanoma. In particolare, vemurafenib ? un inibitore della chinasi che blocca il BRAF con mutazione V600E, che ? presente nella met? dei pazienti con melanoma. Vemurafenib da solo o in associazione con altri inibitori del BRAF mutato come trametinib, cobimetinib o dabrafenib migliora la sopravvivenza complessiva nei pazienti con melanoma (Robert C, Karaszewska B, Schachter J et al. ?Improved overall survival in melanoma with combined dabrafenib and trametinib. N Engl J Med 2015; 372:30-39), anche se una percentuale sostanziale di pazienti mostra resistenza intrinseca o acquisita alla terapia (Manzano JL, Layos L, Buges C et al. ?Resistant mechanisms to BRAF inhibitors in melanoma?. Ann Transl Med 2016; 4:237). Il melanoma ? estremamente resistente ai farmaci chemioterapici e gli indici apoptotici sono generalmente bassi nei melanomi, in particolare nelle fasi avanzate (Glinsky GV, Glinsky VV, Ivanova AB and Hueser CJ. "Apoptosis and metastasis: increased apoptosis resistance of metastatic cancer cells is associated with the profound deficiency of apoptosis execution mechanisms" Cancer Lett, 1997; 115: 185-193).

In generale, il meccanismo apoptotico ? alterato nella maggior parte dei tumori umani e le strategie di trattamento terapeutico spesso includono l'induzione della morte cellulare (Ghobrial IM, Witzig TE, Adjei AA. "Targeting apoptosis pathways in cancer therapy" CA Cancer J Clin, 2005; 55:178-94).

p75NTR (CD271) ? un membro della superfamiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale, con un dominio extracellulare che include un dominio di "morte" simile a quelli presenti in altri membri di questa famiglia (He XL & Garcia KC, 2004) Numerosi studi hanno dimostrato un ruolo pro-apoptotico di CD271 nel sistema nervoso. L'apoptosi tramite CD271 pu? essere innescata da neurotrofine (NT) [fattore di crescita nervosa (NGF), fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) e neurotrofina-4 (NT-4)], proneurotrofine e altri ligandi, tra cui amiloide aggregata e prione neurotossico (Schor NF (2005) The p75 neurotrophin receptor in human development and disease. Prog. Neurobiol. 77: 201? 214). p75NTR pu? rispondere alle NT in modo indipendente o modulando l'affinit? e la specificit? dei recettori Trk per le NT (He X, Garcia KC. ?Structure of Nerve Growth Factor Complexed with shared Neurotrophin Receptor p75? Science, 2004; 304:870-875). Mentre CD271 lega tutte le NT con uguale bassa affinit?, TrkA interagisce preferibilmente con NGF, TrkB con BDNF e NT-4 e TrkC con NT-3 (Chao MV and Bothwell M, Neurotrophins: to cleave or not to cleave. Neuron. 2002; 33: 9-12). L'apoptosi indotta da amiloide in una linea cellulare di neuroblastoma ? mediata esclusivamente da p75NTR (Frago LM, Leon Y, de la Rosa EJ, Gomez-Munoz A and Varela-Nieto I (1998) Nerve growth factor and ceramides modulate cell death in the early developing inner ear. J. Cell Sci. 111:549?556).

Abbiamo dimostrato che le cellule di melanoma esprimono e producono tutto le NT e i loro recettori. Tutte le linee cellulari di melanoma studiate esprimono CD271 (Truzzi F, Marconi A, Lotti R, Dallaglio K, French LE, Hempstead BL, Pincelli C. "Neurotrophins and their receptors stimulate melanoma cell proliferation and migration" J Invest Dermatol, 2008; 128:2031-40). Le linee cellulari di melanoma esprimono anche i recettori ad alta affinit? Trk. Questi recettori tirosina chinasi, che normalmente esercitano effetti opposti al CD271, nel melanoma mediano la migrazione e la proliferazione. Inoltre, l'espressione di CD271 ? inversamente correlata con l'ipossia e l'invasivit? del melanoma in vivo (Marconi A, Borroni RG, Truzzi F et al. ?Hypoxia-Inducible Factor-1? and CD271 inversely correlate with melanoma invasiveness?. Exp Dermatol 2015; 24:396-398). In modelli equivalenti della pelle, CD271 ? altamente espresso a livello epidermico nei melanomi allo stadio iniziale e tende a scomparire quando il melanoma inizia a invadere il derma. Inoltre, CD271 ? completamente assente nelle ricostruzioni cutanee derivate da linee cellulari metastatiche. L'espressione di CD271 ? pi? alta negli sferoidi derivati da cellule primarie di melanoma, diminuisce nelle cellule derivate da melanomi metastatici, per scomparire negli sferoidi altamente invasivi. Le cellule CD271-negative sono associate a un numero pi? elevato di metastasi nel pesce zebra, rispetto alle cellule CD271-positive.

Per trattare le malattie correlate a CD271, in particolare il melanoma, si palesa quindi la necessit? di molecole in grado di legare selettivamente CD271.

RIASSUNTO DELL?INVENZIONE

? stato sorprendentemente scoperto che il peptide Ac-DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly-DCys- NH2 con un polimero lineare di metossi-PEG da 20 kDa coniugato con il residuo D-Cys attraverso l'atomo di zolfo di quest'ultimo (peptide qui definito come XYZ) ? in grado di legare selettivamente il recettore CD271. In particolare, ? stato scoperto che l'uso di sequenze ?retro-inverse?, in cui gli aminoacidi sono in configurazione D, invece di L, insieme all'inversione totale della sequenza, fornisce un peptide che ? in grado di attivare il recettore senza essere nemmeno parzialmente degradato dagli enzimi proteolitici, con conseguente maggiore resistenza a peptidasi e proteasi. Al fine di rendere pi? stabile il peptide, ? possibile utilizzare due tipi di carrier: il primo prevede la coniugazione del peptide con catene polimeriche di PEG. Infatti, attraverso la PEGhilazione, la filtrazione renale del peptide coniugato ? piuttosto lenta, se non completamente eliminata. Inoltre, la PEGhilazione consente di allungare la permanenza in circolazione di peptidi e proteine veicolari e terapeutici, preferibilmente in aree riccamente vascolarizzate come il cancro. In secondo luogo, ? stato scoperto che i sistemi liposomiali non solo rendono il peptide pi? stabile, ma anche proteggono e mascherano il peptide. Inoltre, la superficie dei liposomi pu? essere progettata per dirigere il peptide in modo specifico verso il bersaglio.

Il peptide dell'invenzione consente quindi la riduzione o l'arresto della crescita delle cellule primarie di melanoma e della proliferazione delle linee cellulari metastatiche.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DALL?INVENZIONE

? quindi un oggetto dell'invenzione un peptide comprendente la sequenza, dall?N-terminale al C-terminale: R1-R2-Gly-R3-R4-R5-Gly-R6-R7-R8-Gly (SEQ ID NO: 1) o la sequenza, dall?N-terminale al C-terminale: Gly-R8-R7-R6-Gly-R5-R4-R3-Gly-R2-R1 (SEQ ID NO: 2) in cui:

- R1 ? selezionato dal gruppo costituito da: Met, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr e Trp

- R2 ? selezionato dal gruppo costituito da: Leu, Met, Ala, Val, Ile e Phe

- R3 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ile, Met, Ala, Val, Leu e Phe

- R4 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ile, Met, Ala, Val, Leu e Phe

- R5 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ala, Met, Val, Ile, Leu e Phe

- R6 ? selezionato dal gruppo costituito da: Lys e Arg

- R7 ? selezionato dal gruppo costituito da: Asn, Gln, His, Ser, Thr, Tyr e Cys

- R8 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ser, Asn, Gln, His, Thr, Tyr e Cys

- l?N-terminale della sequenza o del peptide ? W-CO-NH-, in cui W ? un gruppo alchilico C1-C12 o un atomo di idrogeno, oppure H2N-- il C-terminale della sequenza o del peptide ? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 ? un atomo di idrogeno o gruppo alchilico C1-C6 e Z2 ? un atomo di idrogeno o gruppo alchilico C1-C6, oppure -COOH e in cui i residui da R1 a R8 possono trovarsi nella loro configurazione enantiomerica D o L e loro frammenti funzionali o derivati.

Preferibilmente il peptide secondo l'invenzione si lega selettivamente al recettore CD271.

Preferibilmente il peptide dell'invenzione comprende o ha la seguente sequenza:

DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly (SEQ ID NO: 3)

in cui l'N-terminale della sequenza ? W-CO-NH-, dove W ? CH3

e il C-terminale della sequenza ? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 e Z2 sono atomi di idrogeno e loro frammenti funzionali o derivati.

Nel peptide secondo l'invenzione un polimero di poli(etilenglicole) (PEG) lineare o ramificato, preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa, ? coniugato con uno o entrambi i terminali N e C della sequenza o del peptide. L'estremit? non coniugata del polimero PEG pu? essere libera o bloccata; preferibilmente ? alcossilata.

In una forma di realizzazione preferita, un residuo di D-Cys o L-Cys viene aggiunto sull?N- e/o sul C-terminale della sequenza del peptide dell'invenzione.

Il peptide secondo l'invenzione comprende o ha preferibilmente la seguente sequenza:

DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly-DCys (SEQ ID NO: 4)

in cui l'N-terminale della sequenza o del peptide ? W-CO-NH-, dove W ? CH3

e il C-terminale della sequenza o del peptide ? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 e Z2 sono atomi di idrogeno

e loro frammenti funzionali o derivati.

Nel peptide dell'invenzione uno o entrambi i residui di Cys sono preferibilmente coniugati a un polimero di PEG lineare o ramificato preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa. Preferibilmente, l'estremit? non coniugata del polimero PEG ? libera o bloccata, preferibilmente ? alcossilata. Preferibilmente il polimero di PEG ? un polimero metossi-PEG lineare da 20 kDa coniugato al peptide attraverso l'atomo di zolfo del residuo D-Cys.

Preferibilmente, il peptide secondo l'invenzione ?:

Ac-DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly-DCys-NH2 (SEQ ID NO:5)

in cui un polimero metossi-PEG lineare 20 kDa ? coniugato al residuo D-Cys attraverso l'atomo di zolfo di quest'ultimo.

Un altro oggetto dell'invenzione ? un polimero di PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato, preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa, coniugato ad almeno due peptidi come sopra definiti o loro miscele.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione ? un liposoma comprendente un peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti e almeno una sostanza selezionata dal gruppo costituito da un lipide biodegradabile e/o biocompatibile, colesterolo, una nanoparticella, un polimero o loro miscele.

Un altro oggetto dell'invenzione ? una composizione farmaceutica comprendente almeno un peptide o un derivato come definito sopra o almeno un carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide come definito sopra o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato come sopra definito o il liposoma come sopra definito e almeno un eccipiente e/o un veicolo accettabile a livello farmaceutico, preferibilmente sotto forma di una formulazione farmaceutica iniettabile.

Il peptide o il derivato come definito sopra o il carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide come definito sopra o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato come definito sopra o il liposoma o la composizione farmaceutica come definiti sopra sono per uso medico, preferibilmente per l'uso nel trattamento di malattie correlate a CD271, preferibilmente di cancro o psoriasi, pi? preferibilmente di melanoma, neuroblastoma o carcinoma a cellule di Merkel. Preferibilmente il peptide o il derivato come definiti sopra o il veicolo a base lipidica comprendente almeno un peptide come definito sopra o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato come definito sopra o il liposoma come definito sopra devono sono per l'uso nel trattamento di forme di cancro correlate a CD271.

Il peptide o il derivato come sopra definiti o il carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide come definito sopra o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato come definito sopra o il liposoma o la composizione farmaceutica come definiti sopra per l'uso secondo l'invenzione sono preferibilmente in combinazione con almeno un agente (o farmaci) chemioterapico e/o antinfiammatorio, o in seguito al pre-trattamento della stessa malattia mediante chemioterapia e/o farmaci (o agenti) antinfiammatori e/o qualsiasi trattamento che aumenti l'espressione di CD271.

Preferibilmente, l'agente chemioterapico viene selezionato dal gruppo costituito da: dacarbazina, carmustina, cisplatino e/o miscele di qualsiasi trattamento che aumenti l'espressione di CD271.

Preferibilmente i farmaci (o agenti) antinfiammatori appartengono al gruppo dei farmaci (o agenti) antinfiammatori non steroidei (FANS). Preferibilmente, l'agente antinfiammatorio non steroideo ? selezionato dal gruppo costituito da: ibuprofene, dexibuprofene, naprossene, fenoprofene, ketoprofene, dexketoprofene, flurbiprofene, oxaprozina, loxoprofene e loro miscele e/o miscele di qualsiasi trattamento che aumenti l'espressione di CD271.

Ulteriori oggetti dell'invenzione sono una sequenza di acido nucleico codificante per il peptide come sopra definito, un vettore di espressione comprendente detta sequenza di acido nucleico o una cellula ospite comprendente detto vettore di espressione.

L'N-terminale dei presenti peptidi o delle sequenze sopra definite pu? essere libero (cio? H2N-) o acilato (cio? W-CO-NH-, dove W ? un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico C1-C12).

Il C-terminale dei presenti peptidi o delle sequenze come sopra definiti pu? essere un C-terminale libero (cio? -COOH) o sotto forma di amide (cio? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 ? un atomo di idrogeno o gruppo alchilico C1 -C6 e Z2 ? un atomo di idrogeno o gruppo alchilico C1-C6).

Nei peptidi secondo l'invenzione tutti gli aminoacidi possono trovarsi nella loro configurazione enantiomerica L o D, con l'ovvia eccezione di Gly.

In una forma di realizzazione preferita, la presente invenzione fornisce un peptide comprendente o avente la sequenza: Ac-DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly-DCys-NH2 (SEQ ID NO:4) e suoi frammenti funzionali o derivati.

In una forma di realizzazione pi? preferita, nel peptide di cui sopra i residui DCys sono coniugati a un polimero PEG lineare o ramificato, preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa, ancor pi? preferibilmente 20KDa. Preferibilmente, l'estremit? non coniugata del polimero PEG ? libera o bloccata, preferibilmente ? alcossilata. Preferibilmente il polimero PEG ? un polimero metossi-PEG lineare 20 kDa coniugato al peptide attraverso l'atomo di zolfo del residuo DCys.

La presente invenzione include derivati PEGhilati dei peptidi secondo l'invenzione.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione ? il peptide o il derivato come definito sopra o il carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide come definito sopra o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato come definito sopra o il liposoma come sopra definito per l'uso nella riduzione o nell'arresto della crescita di melanoma primario e metastatico.

La presente invenzione fornisce inoltre un metodo per attivare il CD271 comprendente il contatto del CD271 con il peptide o il derivato come sopra definito o il carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide come definito sopra o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato come definito sopra o il liposoma.

Altri oggetti dell'invenzione sono un anticorpo o un suo frammento che si lega al peptide secondo l'invenzione e un multimero di peptidi comprendente almeno un peptide secondo l'invenzione.

Nella formula generale riportata sopra, gruppi chimici, che formino legami amidici, possono essere aggiunti al gruppo aminico N-terminale o al carbonile C-terminale del peptide o della sequenza.

Se si aggiunge un idrogeno all'N-terminale, si ottiene un'amina libera al N-terminale; allo stesso modo, un gruppo acetile pu? essere aggiunto generando cos? un peptide acetilato all'N-terminale. Se viene aggiunto un gruppo ossidrilico, viene generato un acido carbossilico terminale. Se un gruppo aminico viene aggiunto al terminale acido carbonilico della sequenza oligopeptidica o del peptide, si forma un'amide.

Nel contesto della presente invenzione, per Ac si intende che il terminale della sequenza ? W-CO-NH-, e W ? CH3.

Ac ? preferibilmente all' N-terminale della sequenza o del peptide.

Nel contesto della presente invenzione, per NH2 si intende che il terminale della sequenza ? -CO-N(Z1)(Z2) e Z1 e Z2 sono atomi di idrogeno.

NH2 ? preferibilmente al C-terminale della sequenza o del peptide.

Il termine "derivato funzionale" viene qui utilizzato per indicare un derivato chimico dei peptidi ora descritti che hanno la stessa funzione fisiologica della corrispondente controparte non modificata o, in alternativa, che hanno la stessa funzione in vitro in un test funzionale (ad esempio, in uno di i saggi descritti in uno degli esempi qui descritti).

Una composizione farmaceutica ? formulata per essere compatibile con la sua via di somministrazione prevista. Esempi di vie di somministrazione comprendono la somministrazione parenterale, ad esempio endovenosa, intradermica, sottocutanea, orale, per inalazione, transdermica (topica), transmucosale e rettale.

L'invenzione riguarda anche un polinucleotide codificante per i peptidi come sopra definiti, un vettore comprendente il suddetto polinucleotide e una cellula ospite ingegnerizzata geneticamente che esprime il peptide come sopra definito. Preferibilmente il polinucleotide ? selezionato dal gruppo costituito da: RNA o DNA, preferibilmente detto polinucleotide ? DNA.

Preferibilmente il vettore ? un vettore di espressione selezionato dal gruppo costituito da: plasmidi, particelle virali e fagi.

Preferibilmente detta cellula ospite ? selezionata dal gruppo costituito da: cellula batterica, cellula fungina, cellula insetto, cellula animale e cellula vegetale, preferibilmente detta cellula ospite ? una cellula animale.

I peptidi dell'invenzione sono sotto forma di peptidi sintetici o ricombinanti, lineari e multimerici in qualsiasi forma chimica, fisica e/o biologica tali da mantenere la loro funzione.

I peptidi dell'invenzione possono essere sintetizzati e usati nella forma ramificata come peptide antigenico multiplo (MAP), come descritto ad es. nel brevetto US 5,229,490.

Tutti gli aminoacidi nel peptide possono avere la stessa stereochimica, ad esempio il peptide pu? consistere solo di L-aminoacidi o solo D-aminoacidi. In alternativa, il peptide pu? comprendere una combinazione di aminoacidi L- e D-.

Il peptide della presente invenzione pu? essere sotto forma di un dimero o multimero. Nella presente descrizione, esempi di spaziatori compresi nel dimero o multimero includono legami estere (-CO-O-, -O-CO-), legami eterei (-O-), legami amide (NHCO, CONH), linker a base di catene di zuccheri, linker di polietilenglicole, linker peptidici e simili. Esempi di linker peptidici includono linker contenenti almeno uno dei 20 aminoacidi naturali che costituiscono una proteina. Il numero di aminoacidi del peptide linker ?, ad esempio, ma non limitato a, da 1 a 20, da 1 a 15, da 1 a 12, da 1 a 10, da 1 a 8, da 1 a 6 o da 1 a 4. Esempi di linker peptidici comprendono dimero di arginina, trimero di arginina, tetramero di arginina, dimero di lisina, trimero di lisina, tetramero di lisina, dimero di glicina, trimero di glicina, tetramero di glicina, pentamero di glicina, esamero di glicina, alanina-alanina-tirosina-leucina (AAY), isoleucina-leucina-alanina (ILA), arginina-valina-lisina-arginina (RVKR) e simili. Lo spaziatore pu? essere bivalente o multivalente.

Quando il peptide della presente invenzione ? un multimero, un linker multivalente ramificato (ad es. dendrimero), un complesso metallico o simile pu? essere usato per il collegamento.

Esempi di linker multivalente ramificato includono dietilentriamina, spermina, spermidina, trietanolamina, etilendiaminatetraacetato (EDTA), pentaeritritolo, azido-propil(alchil)amina, lisina, ornitina, acido aspartico, acido glutammico, peptidi polifunzionali, (dipeptide, tripeptide o tetrapeptide contenenti lisina, ornitina o acido glutammico) e amino composti organici multivalenti (ad es. poli(amidoamina) (PAMAM), tris(etileneamina)ammoniaca e poli(propilenimina) (Astramol (marchio registrato))). Il dendrimero della presente invenzione include, ad esempio, un dimero ottenuto collegando gli N-terminali (o i C-terminali) dei peptidi qui descritti. Inoltre, il dendrimero della presente invenzione include anche un tetramero ottenuto collegando ulteriormente un "dimero ottenuto collegando gli N-terminali dei suddetti peptidi" e un "dimero ottenuto collegando i C-terminali dei suddetti peptidi".

Sono inclusi nella presente invenzione anche derivati o varianti dei peptidi sopra definiti. Adeguatamente, i "derivati" o "varianti" includono quelli in cui invece dell'aminoacido presente in natura l'aminoacido che appare nella sequenza ne ? un analogo strutturale. Gli aminoacidi usati nelle sequenze possono anche essere derivatizzati o modificati, ad es. etichettati, sempre che la funzione del peptide non sia influenzata negativamente in modo significativo. Derivati e varianti come sopra descritti possono essere preparati durante la sintesi del peptide o mediante modifica post-produzione o quando il peptide ? in forma ricombinante usando le tecniche note di mutagenesi sito-diretta, mutagenesi casuale o scissione enzimatica e/o ligazione di acidi nucleici.

I "frammenti" funzionali secondo l'invenzione possono essere ottenuti mediante troncamento, ad es. mediante rimozione di uno o pi? aminoacidi dalle estremit? N- e/o C-terminali. Tali frammenti possono essere derivati dalle sequenze qui descritte o possono essere derivati da un peptide funzionalmente equivalente come descritto sopra.

In modo appropriato, varianti o derivati funzionali secondo l'invenzione hanno una sequenza di aminoacidi che ha pi? del 70%, ad es. 75 o 80%, preferibilmente pi? dell'85%, ad es. pi? del 90 o 95% di omologia alle sequenze qui divulgate.

I peptidi dell'invenzione, come qui definiti, possono essere modificati chimicamente, ad esempio post-traduzionalmente modificati. Ad esempio, possono essere glicosilati o comprendere residui di aminoacidi modificati. Possono essere in una variet? di forme di derivati polipeptidici, comprese amidi e coniugati con polipeptidi.

I peptidi modificati chimicamente includono anche quelli che hanno uno o pi? residui derivatizzati chimicamente dalla reazione di un gruppo laterale funzionale. Tali gruppi laterali derivatizzati includono quelli che sono stati derivati per formare cloridrati di amina, gruppi ptoluensulfonile, gruppi carbobenzossi, gruppi t-butilossicarbonile, gruppi cloroacetile e gruppi formile. I gruppi carbossilici liberi possono essere derivatizzati per formare sali, esteri metilici ed etilici o altri tipi di esteri o idrazidi. I gruppi idrossilici liberi possono essere derivatizzati per formare derivati O-acilici o O-alchilici. L'azoto dell'imidazolo dell'istidina pu? essere derivatizzato per formare N-im-benzilistidina.

Sono anche inclusi come peptidi modificati chimicamente i peptidi ciclizzati, cio? peptidi dell'invenzione che siano collegati con un legame covalente a generare un anello. Tipicamente un amino-terminale e un carbossi terminale (la cosiddetta ciclizzazione testa-coda), un aminoterminale e una catena laterale (la cosiddetta ciclizzazione testa-catena laterale), il terminale carbossi e una catena laterale (la cosiddetta ciclizzazione catena laterale-coda), o una catena laterale e una catena laterale (la cosiddetta ciclizzazione catena laterale-catena laterale) possono essere collegati con un legame covalente per formare un peptide ciclico. I peptidi ciclici testacoda possono tipicamente essere formati attraverso la formazione di legami amidici. Cicli catena laterale-catena laterale possono tipicamente essere formati attraverso la formazione di ponti disolfuro Cys-Cys o formazione di legame amidico all'interno di un peptide ciclico. In alternativa, un amino-terminale, un terminale carbossilico o una catena laterale possono essere collegati con un legame covalente allo scheletro peptidico per formare un peptide ciclico.

Sono anche inclusi come peptidi modificati chimicamente quelli che contengono uno o pi? derivati aminoacidici presenti in natura dei venti aminoacidi standard. Ad esempio, la 4-idrossiprolina pu? essere sostituita alla prolina o l'omoserina pu? essere sostituita alla serina.

Un peptide dell'invenzione pu? portare una marcatura rivelatrice. Le marcature adatte includono radioisotopi, marcature fluorescenti, marcature enzimatiche o altre marcature proteiche come la biotina.

Qualsiasi formula qui fornita ha anche lo scopo di rappresentare sia forme dei peptidi non marcate, sia forme marcate isotopicamente. I peptidi marcati isotopicamente hanno strutture rappresentate dalle formule fornite nel presente documento tranne per il fatto che uno o pi? atomi sono sostituiti da un atomo con una massa atomica o numero di massa scelti. Esempi di isotopi che possono essere incorporati nei peptidi dell'invenzione includono isotopi di idrogeno, carbonio, azoto, ossigeno, fosforo, fluoro e cloro. Solvatati farmaceuticamente accettabili secondo l'invenzione includono quelli in cui il solvente di cristallizzazione pu? essere sostituito isotopicamente, ad es. D2O, d6-acetone, d6-DMSO.

I peptidi come sopra descritti per l'uso in conformit? con l'invenzione possono essere preparati mediante modalit? di sintesi convenzionali, inclusi mezzi genetici o chimici inclusi.

Tecniche sintetiche, come la sintesi di tipo Merrifield in fase solida, possono essere preferite per ragioni di purezza, specificit? antigenica, libert? da prodotti collaterali indesiderati e facilit? di produzione. Tecniche adatte per la sintesi di peptidi in fase solida sono ben note agli esperti del ramo (vedere per esempio, Merrifield et al., 1969, Adv. Enzymol 32, 221-96 e Fields et al., 1990, Int. J. Peptide Protein Res, 35, 161-214). La sintesi chimica pu? essere eseguita con metodi ben noti nell'arte che coinvolgono insiemi ciclici di reazioni di deprotezione selettiva dei gruppi funzionali di un aminoacido terminale e accoppiamento di residui di aminoacidi selettivamente protetti, seguiti infine da deprotezione completa di tutti i gruppi funzionali. La sintesi pu? essere eseguita in soluzione o su un supporto solido usando opportune fasi solide note nell'arte.

In una forma di realizzazione alternativa, un peptide dell'invenzione pu? essere prodotto o somministrato sotto forma di un polinucleotide che lo codifica ed ? in grado di esprimerlo. Tali polinucleotidi possono essere sintetizzati secondo metodi ben noti nell'arte, come descritto a titolo di esempio in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Tali polinucleotidi possono essere usati in vitro o in vivo nella produzione di un peptide dell'invenzione. Tali polinucleotidi possono quindi essere somministrati o usati nel trattamento del cancro o di un'altra malattia o condizione come qui descritto.

La presente invenzione include anche vettori di espressione che comprendono tali sequenze di polinucleotidi. Tali vettori di espressione sono abitualmente assemblati nell'arte della biologia molecolare e possono ad esempio implicare l'uso di DNA plasmidico e opportuni iniziatori, promotori, esaltatori e altri elementi, come ad esempio segnali di poliadenilazione che possono essere necessari e che sono posizionati con il corretto orientamento, al fine di consentire l'espressione di un peptide dell'invenzione. Altri vettori adatti sono comunque evidenti alle persone esperte nella tecnica. A titolo di ulteriore esempio al riguardo, ci riferiamo a Sambrook et al. (ibid).

Pertanto, il peptide pu? essere fornito trasportando un tale vettore ad una cellula e permettendo che avvenga la trascrizione dal vettore. In modo opportuno, un polinucleotide dell'invenzione o per l'uso nell'invenzione in un vettore ? operativamente collegato a una sequenza di controllo che ? in grado di provvedere all'espressione della sequenza di codifica da parte della cellula ospite, cio? il vettore ? un vettore di espressione. Il termine "operativamente collegato" si riferisce a una giustapposizione in cui i componenti descritti sono in una relazione che consente loro di funzionare nel modo previsto. Una sequenza regolatoria, come un promotore, "operativamente collegata" a una sequenza di codifica ? posizionata in modo tale che l'espressione della sequenza di codifica sia ottenuta in condizioni compatibili con la sequenza regolatrice.

I vettori possono essere ad esempio vettori costituiti da plasmidi, virus o fagi provvisti di un'origine di replicazione, facoltativamente un promotore per l'espressione di detto polinucleotide e facoltativamente un regolatore del promotore. I vettori possono contenere uno o pi? geni marcatori selezionabili, ad esempio un gene di resistenza all'ampicillina nel caso di un plasmide batterico o un gene di resistenza per un vettore fungino. I vettori possono essere utilizzati in vitro, ad esempio per la produzione di DNA o RNA o utilizzati per trasfettare o trasformare una cellula ospite, ad esempio una cellula ospite di mammifero. I vettori possono anche essere adattati per essere utilizzati in vivo, ad esempio per consentire l'espressione in vivo del polipeptide.

L'invenzione include anche cellule che sono state modificate per esprimere un peptide dell'invenzione. Tali cellule includono linee di cellule eucariotiche transienti o preferibilmente tassonomicamente pi? elevate, come le cellule di mammiferi oppure cellule di insetti, cellule eucariotiche inferiori, come lieviti o cellule procariotiche come le cellule batteriche. Esempi particolari di cellule che possono essere modificate inserendo vettori che codificano per un peptide dell'invenzione includono cellule di mammifero HEK293T, CHO, HeLa e COS. Opportunamente, la linea cellulare selezionata sar? non solo stabile, ma consentir? anche una matura glicosilazione e l'espressione della superficie cellulare di un polipeptide. L'espressione pu? essere ottenuta in ovociti trasformati. Un peptide adatto pu? essere espresso nelle cellule di un animale transgenico non umano, in particolare un topo. Un animale transgenico non umano che esprime un peptide dell'invenzione ? incluso nell'ambito dell'invenzione. Un peptide dell'invenzione pu? anche essere espresso in ovociti o melanofori di Xenopus laevis.

La presente invenzione si estende anche agli anticorpi (monoclonali o policlonali) e ai loro frammenti leganti l'antigene (ad es. frammenti F(ab)2, Fab e Fv, cio? frammenti della regione "variabile" dell'anticorpo, che comprende il sito di legame dell'antigene) diretti ai peptidi come precedentemente definito, cio? che si legano agli epitopi presenti sui peptidi e quindi si legano selettivamente e specificamente a tali peptidi e che possono essere usati nei metodi dell'invenzione.

I peptidi della presente invenzione possono essere impiegati da soli come unica terapia o in combinazione con altri agenti terapeutici per la prevenzione e/o il trattamento delle malattie sopra menzionate.

Sono anche fornite composizioni comprendenti uno o pi? peptidi o polinucleotidi qui descritti. Tali composizioni includono tipicamente un veicolo farmaceuticamente accettabile. Come qui utilizzato, il "veicolo farmaceuticamente accettabile" include, ma non ? limitato a, una soluzione salina, solventi, mezzi di dispersione, rivestimenti, agenti antibatterici e antifungini, agenti ritardanti dell'assorbimento e isotonici e simili, compatibili con la somministrazione farmaceutica. Composti aggiuntivi possono anche essere incorporati nelle composizioni.

Una composizione pu? essere preparata con metodi noti nell'arte farmaceutica. In generale, una composizione pu? essere formulata per essere compatibile con la sua via di somministrazione prevista. Una formulazione pu? essere solida o liquida. La somministrazione pu? essere sistemica o locale. In alcuni aspetti la somministrazione locale pu? presentare vantaggi per una gestione mirata e sito-specifica della malattia. Le terapie locali possono fornire concentrazioni elevate clinicamente efficaci direttamente nel sito di trattamento, con meno probabilit? di causare effetti collaterali sistemici.

Esempi di vie di somministrazione comprendono la somministrazione parenterale (ad es. endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intramuscolare), enterale (ad es. orale o rettale) e topica (ad es. epicutanea, inalatoria, transmucosale). Forme di dosaggio appropriate per la somministrazione enterale del composto della presente invenzione possono includere compresse, capsule o liquidi. Forme di dosaggio appropriate per la somministrazione parenterale possono includere la somministrazione endovenosa. Forme di dosaggio appropriate per la somministrazione topica possono includere spray nasali, inalatori dosati, inalatori di polvere secca o mediante nebulizzazione. Le soluzioni o le sospensioni possono includere i seguenti componenti: un diluente sterile come acqua per somministrazione, soluzione salina, oli non volatili, glicoli polietilenici, glicerina, glicole propilenico o altri solventi sintetici; agenti antibatterici come alcool benzilico o metil parabeni; antiossidanti come acido ascorbico o bisolfito di sodio; agenti chelanti come acido etilendiaminotetraacetico; tamponi come acetati, citrati o fosfati; elettroliti, come ione sodio, ione cloruro, ione potassio, ione calcio e ione magnesio e agenti per la regolazione della tonicit? come cloruro di sodio o destrosio. Il pH pu? essere regolato con acidi o basi, come acido cloridrico o sodio idrossido. Una composizione pu? essere racchiusa, ad esempio, in fiale, siringhe monouso o fiale a dose multipla in vetro o plastica.

Le composizioni possono includere soluzioni o dispersioni acquose sterili e polveri sterili per la preparazione estemporanea di soluzioni o dispersioni sterili. Per la somministrazione endovenosa, i veicoli adatti includono albumina umana, soluzione fisiologica, acqua batteriostatica, Cremophor EL? (BASF, Parsippany, N.J.) o soluzione salina tamponata con fosfato. Tipicamente, una composizione ? sterile e, quando adatta per l'uso iniettabile, deve essere fluida in modo tale da permettere una facile siringabilit?. Dovrebbe essere stabile nelle condizioni di produzione e conservazione e preservata dall'azione contaminante di microrganismi come batteri e funghi. Il veicolo pu? essere un solvente o mezzo di dispersione contenente, ad esempio, albumina, acqua, etanolo, un poliolo (ad esempio glicerolo, glicole propilenico e polietilenglicole liquido e simili) e loro opportune miscele. La prevenzione dell'azione dei microrganismi pu? essere ottenuta per mezzo di vari agenti antibatterici e antifungini, ad esempio parabeni, clorobutanolo, fenolo, acido ascorbico, thimerosal e simili. In molti casi, sar? preferibile includere nella composizione agenti isotonici, ad esempio zuccheri, polialcoli come mannitolo, sorbitolo e cloruro di sodio. L'assorbimento prolungato delle composizioni iniettabili pu? essere ottenuto includendo nella composizione un agente che ritardi l'assorbimento, ad esempio monostearato di alluminio e gelatina. Le soluzioni sterili possono essere preparate incorporando il composto attivo (ad esempio un peptide o un polinucleotide qui descritto) nella quantit? richiesta in un solvente appropriato con un ingrediente o una combinazione di ingredienti come quelli sopra elencati, come richiesto, seguito da filtrazione sterile. Generalmente, le dispersioni vengono preparate incorporando il composto attivo in un veicolo sterile, che contiene un mezzo di dispersione e altri ingredienti come quelli elencati sopra. Nel caso di polveri sterili per la preparazione di soluzioni iniettabili sterili, i metodi di preparazione che possono essere utilizzati comprendono l'essiccazione sottovuoto e la liofilizzazione che producono una polvere del principio attivo e qualsiasi altro ingrediente desiderato da una soluzione precedentemente filtrata per renderla sterile.

Per la somministrazione enterale, una composizione pu? essere somministrata, ad esempio, per sondino nasogastrico, clistere, colonscopia o per via orale. Le composizioni orali possono includere un diluente inerte o un veicolo commestibile. Ai fini della somministrazione terapeutica orale, il composto attivo pu? essere incorporato con eccipienti e utilizzato sotto forma di compresse, troch o capsule. Le composizioni orali possono anche essere preparate usando un veicolo fluido. Agenti leganti farmaceuticamente compatibili possono essere inclusi come parte della composizione. Le compresse, le pillole, le capsule, i troch e simili possono contenere uno qualsiasi dei seguenti ingredienti o composti di natura simile: un legante come cellulosa microcristallina, gomma tragacanth o gelatina; un eccipiente come amido o lattosio, un agente disintegrante come acido alginico, Primogel o amido di mais; un lubrificante come magnesio stearato o Sterotes; un glidante quale biossido di silicio colloidale; un agente dolcificante come saccarosio o saccarina; o un agente aromatizzante come menta piperita, metil salicilato o aroma di arancia.

Per la somministrazione per inalazione, i composti attivi possono essere erogati sotto forma di spray aerosol, nebulizzatore o inalatore, come spray nasale, inalatore dosato o inalatore di polvere secca. La somministrazione sistemica pu? avvenire anche con mezzi transmucosali o transdermici. Per la somministrazione transmucosale o transdermica, nella formulazione vengono utilizzati penetranti appropriati alla barriera da permeare. Tali penetranti sono generalmente noti nella tecnica e includono, ad esempio, per la somministrazione transmucosale, detergenti, sali biliari e derivati dell'acido fusidico. La somministrazione transmucosale pu? essere effettuata mediante l'uso di spray o supposte nasali. Per la somministrazione transdermica, i composti attivi possono essere formulati in unguenti, sali, gel o creme come generalmente noti nell'arte. Un esempio di somministrazione transdermica comprende il trasporto ionoforetico al derma o ad altri tessuti rilevanti. I composti attivi possono anche essere preparati sotto forma di supposte (ad es. con basi convenzionali per supposte come burro di cacao e altri gliceridi) o clisteri di ritenzione per il rilascio rettale. I composti attivi possono essere preparati con veicoli che proteggeranno il composto dalla rapida eliminazione dal corpo, come una formulazione a rilascio controllato, compresi gli impianti. Si possono usare polimeri biodegradabili e biocompatibili, come etilene vinil acetato, polianidridi, acido poliglicolico, collagene, poliesteri e acido polilattico. Tali formulazioni possono essere preparate usando tecniche standard. I materiali possono anche essere ottenuti commercialmente. Le sospensioni liposomiali possono anche essere usate come carrier farmaceuticamente accettabili. Questi possono essere preparati secondo metodi noti agli esperti del ramo. Possono anche essere usati reagenti di trasporto come lipidi, lipidi cationici, fosfolipidi, liposomi e microincapsulazione.

Come ? prassi comune, le composizioni sono normalmente accompagnate da istruzioni scritte o stampate per l'uso nel trattamento in questione.

L'esperto nella tecnica selezioner? la forma di somministrazione e i dosaggi efficaci selezionando diluenti, adiuvanti e/o eccipienti adatti.

Il peptide pu? essere somministrato come composizioni separate (simultanee, sequenziali) dei singoli componenti del trattamento o come singola forma di dosaggio contenente entrambi gli agenti. Quando il peptide della presente invenzione ? in combinazione con altri ingredienti attivi, gli ingredienti attivi possono essere formulati separatamente in preparazioni a ingrediente singolo di una delle forme sopra descritte e quindi fornite come preparazioni combinate, che sono date contemporaneamente o in momenti diversi, o pu? essere formulato insieme in una preparazione a due o pi? ingredienti.

I peptidi come sopra definiti possono essere somministrati a un paziente in una dose giornaliera totale, ad esempio, da 0,1 a 500 mg/kg di peso corporeo al giorno. Le composizioni di unit? di dosaggio possono contenere quantit? di sottomultipli tali da costituire la dose giornaliera. La determinazione dei dosaggi ottimali per un particolare paziente ? ben nota ai tecnici del ramo.

La presente invenzione ? pertanto illustrata mediante esempi non limitativi in riferimento alle seguenti figure.

Figura 1. Il peptide immunoprecipita con CD271 in due linee cellulari di melanoma metastatico. Gli estratti proteici di due linee cellulari di melanoma sono stati immunoprecipitati con il peptide e rilevati con CD271. Come controllo negativo ? stato utilizzato il lisato proteico con le biglie di sefarosio (senza CD271), mentre come controllo positivo ? stato utilizzato il lisato proteico di WM266-4 non immunoprecipitato.

Figura 2. Il peptide e la forma NON PEGhilata riducono la proliferazione delle cellule di melanoma. Cinque linee cellulari di melanoma primarie o metastatiche sono state coltivate e trattate con la forma PEGhilata e non PEGhilata del peptide e valutate mediante saggio MTT a 48 e a 96 ore.

Figura 3. Il peptide riduce la proliferazione cellulare nelle linee di melanoma primario e metastatico. Sono state coltivate tre linee cellulari di melanoma primario e metastatico, poi sono state trattate con il peptide (XYZ) a diverse dosi e valutate mediante dosaggio MTT a diversi tempi.

Figura 4. Nelle linee cellulari di melanoma la morte cellulare indotta da peptidi ? correlata ai livelli di espressione di CD271. Sono state coltivate cinque linee cellulari di melanoma primarie e metastatiche e la vitalit? ? stata valutata mediante la colorazione Trypan blue. Per valutare i livelli di espressione del recettore CD271 ? stata utilizzata la citometria a flusso. Figura 5. Il peptide aumenta significativamente l'apoptosi nelle cellule di melanoma. ? stata coltivata la linea cellulare di melanoma WM266-4 ed il tasso di apoptosi ? stato valutato mediante citometria a flusso dopo il trattamento con il peptide (XYZ) rispetto al diluente a diversi tempi (A) conteggio della % di cellule in sub-G1 con colorazione ioduro di propidio e (B) conteggio della % di cellule positive all?Annessina. Per il confronto delle medie ? stato utilizzato il test t di Student.

Figura 6. Il peptide riduce la vitalit? delle cellule di melanoma attraverso il CD271. La linea cellulare di melanoma WM115 ? stata transfettata transitoriamente con siRNA CD271, come mostrato dal western blotting. Il test MTT ? stato utilizzato per misurare la vitalit? cellulare nelle cellule con siRNA o siRNA di controllo dopo il trattamento con il peptide (XYZ) o il diluente. La linea cellulare del melanoma SKmel28 ? stata transfettata transitoriamente con mRNA CD271, come mostrato dal western blotting. Il test MTT ? stato utilizzato per misurare la vitalit? cellulare nelle cellule siRNA per CD271 e di controllo dopo il trattamento con il peptide (XYZ) o il diluente. Per il confronto delle medie ? stato utilizzato il test t di Student.

Figura 7. La chemioterapia nelle linee cellulari di melanoma primario e metastatico upregola il CD271. (A) Utilizzando i primer per il recettore CD271 intra ed extracellulare ? stata eseguita una PCR in tempo reale su estratti di RNA di tre linee cellulari di melanoma dopo il trattamento con carmustina (BCNU), cisplatino, dacarbazina (DTIC) o con il diluente. (B) Gli estratti proteici di tre linee cellulari di melanoma, trattate con dosi differenti di cisplatino, carmustina, dacarbazina o diluente, sono stati separati su gel di poliacrilamide e trasferiti su membrane di nitrocellulosa. (C) Le linee cellulari di melanoma sono state trattate con la chemioterapia o il diluente (vedi sopra), marcate con il mAb anti CD271 e analizzate mediante citometria a flusso.

Figura 8. Il peptide aumenta la riduzione della proliferazione delle cellule di melanoma indotta dalla dacarbazina (DTIC). Cinque linee cellulari di melanoma sono state trattate con DTIC, DTIC in combinazione con il peptide o con il diluente da solo. La proliferazione ? stata misurata mediante saggio MTT. Il test t di Student ? stato utilizzato per il confronto delle medie.

Figura 9. Il peptide aumenta la migrazione delle cellule di melanoma indotta dalla dacarbazina. La linea cellulare di melanoma SKMel28 seminata nelle camere di Boyden con Matrigel a 24 pozzetti ? stata stimolata con il peptide, il peptide in combinazione con DTIC o il diluente da solo. Il numero delle cellule invasive ? stato misurato a 48 ore con il test della ferita da graffio. Il test t di Student ? stato utilizzato per il confronto dei mezzi.

Figura 10. Nessun effetto tossico in 6 topi trattati con XYZ. Il test di tossicit? acuta ? stato eseguito su topi CD1 con dosi diverse di XYZ fino a sei giorni dopo il trattamento. Dopo un giorno di digiuno, sei topi sono stati iniettati per via endovenosa (ago da 28 G) attraverso la vena della coda con una dose totale di 17.5, 175, 550 o 1750 mg/kg/topo di XYZ in soluzione fisiologica. Due ore dopo erano a disposizione 50 grammi di cibo. Lo stato di salute (pelo e aspetto) dei topi ? stato osservato dal primo giorno dopo il trattamento. (a) I topi sono stati pesati prima dell'iniezione di XYZ e poi ogni giorno fino al sesto giorno. (b) Sono state misurate sia la quantit? di cibo ingerito che (c) l'acqua bevuta.

Figura 11. Il peptide riduce la formazione iniziale di metastasi nei pesci zebra iniettati con cellule di melanoma. Le cellule di melanoma metastatico di un paziente con mutazione BRAF sono state trattate con il peptide, il DTIC, il peptide in combinazione con DTIC, DTIC da solo, inibitore di BRAF o non trattati. Le cellule sono state colorate con Vibrant Cell Labeling Solution (in rosso), iniettate nel sacco vitellino delle larve trasparenti di pesci zebra e monitorate. 5 giorni dopo l'iniezione ? stato contato il numero di embrioni con le metastasi.

Figura 12. Il peptide in combinazione con DTIC blocca la formazione di metastasi complete. La linea cellulare di melanoma SKMel28 ? stata trattata con XYZ, DTIC, con il peptide in combinazione con DTIC o non trattata. Le cellule sono state colorate con Vibrant Cell Labeling Solution (in rosso) iniettate nel sacco vitellino delle larve trasparenti di pesci zebra e monitorate.

5 giorni dopo l'iniezione ? stato contato il numero di embrioni con le metastasi.

Figura 13. I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) aumentano i livelli di CD271 nelle linee cellulari di melanoma. Tre linee cellulari di melanoma sono state trattate con dosi crescenti di ketoprofene (A) o ibuprofene (B) e la percentuale di cellule CD271 positive ? stata misurata mediante citometria a flusso.

Figura 14. I FANS riducono la proliferazione delle linee cellulari di melanoma. Tre linee cellulari di melanoma sono state trattate con concentrazioni crescenti di ketoprofene (A) o ibuprofene (B). La proliferazione ? stata misurata mediante test MTT a 48 ore.

Figura 15. Il peptide in combinazione con i FANS riduce ulteriormente la proliferazione delle linee cellulari di melanoma. Due linee cellulari di melanoma sono state trattate con il solo peptide, con ibuprofene o ketoprofene da solo o in combinazione con il peptide. La proliferazione ? stata misurata mediante test MTT a 48 ore. Il test t di Student ? stato utilizzato per il confronto delle medie.

Figura 16. La combinazione del peptide con i FANS riduce la migrazione cellulare nelle linee cellulari di melanoma. La linea cellulare di melanoma SKMel 28 ? stata trattata con il solo peptide, con ibuprofene o ketoprofene da solo o in combinazione con il peptide. Il numero di cellule invasive ? stato calcolato a 48 ore dal test della ferita da graffio. Il test t di Student ? stato utilizzato per il confronto delle medie. * 0.01 <p <0.05; * p <0.01

ESEMPI MATERIALI E METODI

Linee cellulari di melanoma e cellule primarie umane

Le linee cellulari di melanoma WM-115 (Parte della collezione ?Wistar Special Collection?, N. di Catalogo CRL-1675), WM-266-4 (Parte della collezione ?Wistar Special Collection?, N. di Catalogo CRL-1676), e SK-MEL-28 (N. di Catalogo HTB-72) (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) sono state mantenute nel terreno per melanoma BME composto da: BME (Lonza, Basilea, Svizzera) integrato con siero di bovino fetale al 10% (SBF), L-glutamina 2 mM, piruvato di sodio 1 mM, aminoacidi non essenziali 0,1 mM, penicillina 1% / streptomicina e 1,5 g/L di bicarbonato di sodio.

Le linee cellulari di melanoma WM793-B (Parte della collezione ?Wistar Special Collection?, N. di Catalogo CRL-2806) e 1205Lu (Parte della collezione ?Wistar Special Collection?, N. di Catalogo CRL-2812) (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) sono state coltivate in terreno per tumori al 2% contenente: terreno MCDB154CF (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA) integrato con 2% SBF, 1,5 g/L di bicarbonato di sodio, terreno di Leibovitz L-15, L-glutamina 2mM, CaCl2 200mM, 5mg/ml di insulina e 1% di penicillina/streptomicina (Lonza, Basilea, Svizzera).

L'utilizzo delle biopsie di melanoma ? stato approvato dal comitato etico (Comitato Etico dell'Area Vasta Emilia Nord). Le biopsie sono state prelevate dal Policlinico dell'Universit? di Modena e i pazienti hanno dato il consenso informato. Immediatamente dopo la resezione chirurgica, le cellule di melanoma sono state dissociate in cellule singole con la collagenasi (1mg/ml Biochem, Nuoro, Italia) come precedentemente indicato (Civenni et al., 2011). La sospensione di cellule singole ? stata filtrata e le cellule singole sono state raccolte e seminate secondo la tecnica di sovrapposizione dei liquidi per ottenere gli sferoidi. Le cellule sono state mantenute in RPMI, SBF senza complemento al 10%, L-glutamina 2mM e penicillina/streptomicina all'1% e utilizzate per eseguire lo xenotrapianto del pesce zebra.

Immunoprecipitazione

Le linee cellulari di melanoma 1205Lu e WM266-4 sono state trattate con o senza XYZ. 24 ore dopo, le cellule sono state raccolte in tampone RIPA (10mM Tris, pH 8,0; NaCl 150mM; 1% Nonidet P-40, 0,5% desossicolato; 0,1% SDS) contenente gli inibitori della proteasi. I nuclei sono stati rimossi mediante centrifugazione (11.000 rpm per 3 minuti). L'anticorpo monoclonale antip75NTR (Upstate) ? stato legato alle biglie di sefarosio per 1h a 4?C in rotazione. Quindi, i lisati pre-chiarificati sono stati coniugati per una notte in rotazione a 4?C con il complesso anticorpobiglie di sefarosio o con le biglie di sefarosio da sole come controllo negativo. Gli immunocomplessi sono stati lavati per sei volte con il tampone Port (10 mM Tris-HCl, pH 8,5; NaCl 150 mM; 0.1% Renex 30; 0,01% BSA; 2,5% NaN3) e per tre volte con il tampone PT (10 mM Tris-HCl, pH 8,5; 150 mM NaCl; 0,5 % Tween 20; 2,5% NaN3). I campioni sono stati eluiti con il tampone di Laemnli 1X per 5?C a 90?C ed ? stato eseguito il Western Blotting per p75NTR.

Test MTT

5x10<3 >cellule/pozzetto sono state seminate in piastre di coltura da 96 pozzetti. A diversi tempi, le cellule sono state incubate con MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) allo 0,5% per 4 ore a 37 ? C e quindi disciolte con 100 ?l di isopropanolo contenente 0.04 N di HCl. La piastra ? stata letta a 560 nm con un filtro di riferimento di 650 nm. I risultati sono espressi come percentuale di vitalit? rispetto al controllo.

Espressione di CD271 mediante analisi citometrica a flusso

Le linee cellulari di melanoma sono state trattate con la chemioterapia o il diluente per 48 ore, poi sono state raccolte e incubate con anticorpo anti CD271 (1:100 in PBS, Lab Vision Corporation, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) per 20 minuti a 4?C. Le cellule sono state marcate con l'anticorpo secondario Alexa Fluor anti-topo 488 (1:50, Thermo Fisher Scientific) per 20 minuti a 4?C e analizzate con il citometro a flusso Epics XL (Beckman Coulter).

Analisi della morte cellulare mediante citometria a flusso

La linea cellulare WM266-4 ? stata trattata con il peptide (XYZ) o con il diluente a diversi tempi. Dopo 24 e 48 ore, le cellule sono state tripsinizzate e risospese in una soluzione ipotonica con fluorocromo: 50 ?g/ml di ioduro di propidio contenente 0,1% di citrato di sodio e 0,5% di Triton X-100 (Sigma Aldrich, Milano, Italia). Dopo 15 minuti, le cellule sono state analizzate utilizzando un citometro a flusso Epics XL (Coulter Electronics Inc., Hialeah, FL, USA). L'apoptosi ? stata rilevata valutando la ridotta fluorescenza del colorante PI che lega il DNA nei nuclei apoptotici.

Colorazione dell'annessina V

La linea cellulare WM266-4 ? stata trattata con il peptide (XYZ) o con il diluente a diversi tempi. Dopo 24 e 48 ore, le cellule sono state tripsinizzate, raccolte mediante centrifugazione e risospese in 500 ?L di tampone legante contenente annessina V-FITC e propidio ioduro (PI). Dopo l?incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti al buio, il legame con l'annessina V-FITC ? stato analizzato mediante citometria a flusso utilizzando il rivelatore di segnale FITC e la colorazione PI mediante il rivelatore di segnale di emissione della ficoeritrina.

Transfezione di cellule di melanoma con siRNA

Le cellule di melanoma sono state seminate in 2D per 24 ore in terreno privo di antibiotici. La linea cellulare WM115 ? stata quindi transfettata con siRNA di controllo o siRNA di CD271 (rispettivamente 50nM e 100nM) (Dharmacon Inc, Lafayette, CO, USA) in terreno privo di antibiotico/FBS e integrato con 0,1% di BSA. 48 ore dopo, le cellule sono state seminate per il test MTT o lisate per western blotting.

Infezione di cellule di melanoma

La linea cellulare Skmel28 ? stata seminata secondo il metodo di sovrapposizione di liquidi. Dopo 24 ore, le cellule sono state trasdotte mediante infezione con surnatante virale generato dalle cellule di confezionamento CD271-LNSN o dalle cellule di confezionamento LNSN (gentilmente fornite da F. Mavilio) in un terreno appropriato per il melanoma, come precedentemente descritto in presenza di polibrene (8 ?g/ml).48 ore dopo l?infezione, le cellule sono state lisate per l'analisi mediante WB o seminate per il test MTT.

PCR in tempo reale

L'RNA cellulare totale ? stato estratto dalle tre linee cellulari di melanoma dopo il trattamento chemioterapico usando il metodo del reagente TRI eseguito secondo le istruzioni del produttore (Sigma-Aldrich). La PCR quantitativa in tempo reale per la sortilina ? stata eseguita con un ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Come controllo interno, l'espressione dell?mRNA del gene di controllo beta-actina ? stata misurata in una provetta separata. Come controllo negative ? stata utilizzata H2O priva di RNAsi. 1microg di RNA ? stato sottoposto a retro-trascrizione e amplificazione in una miscela di reazione da 50?l utilizzando il kit One-Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems). Sia la PCR in tempo reale della sortilina che la beta-actina sono state eseguite utilizzando i reagenti di analisi TaqMan pre-sviluppati (la sonda MGB CD271 ? stata marcata con colorante FAM; la sonda MGB beta-actina ? stata marcata con colorante VIC, Applied Biosystems). Le condizioni cicliche per RT-PCR One-Step sono state: trascrizione inversa iniziale a 48?C per 30 minuti, seguita dall?attivazione della DNA polimerasi a 95?C per 10 minuti, poi da 40 cicli di denaturazione a 95?C per 15 s, appaiamento/ estensione a 60?C per 1 min. I dati di ciascun campione sono stati confrontati con l'espressione di CD271 delle cellule non trattate, considerate calibratori, utilizzando il software di Rilevazione delle Sequenze versione 1.2.3, secondo il Metodo di Studio della Quantificazione Relativa (ddCt) (Applied Biosystems). I risultati sono stati ottenuti come media di tre esperimenti indipendenti. Il test t di Student a due vie ? stato eseguito tra campioni e calibratore.

Western Blotting

Gli sferoidi di melanoma sono stati disaggregati e raccolti, per il CD271, in tampone di lisi pH 7,5 (NaCl 150mM, 15mMMgCl, EGTA 1mM, Hepes 50mM, Glicerolo 10%, Triton 1%). Le membrane sono state dapprima incubate in tampone bloccante e poi per una notte a 4?C con gli anticorpi primari: anticorpo monoclonale di topo anti-CD271 umano (1:1000, Upstate, Lake Placid, NY, USA), anticorpo policlonale di coniglio anti-TrkB umano (1:750, Upstate), anticorpo policlonale di capra anti-TrkC umano (1:750, Upstate), anticorpo policlonale di coniglio anti-TrkA umano (1:1000, Upstate) e anticorpo monoclonale anti-beta-actina umana (1:5000, Sigma-Aldrich). Le membrane sono state quindi incubate per 45 minuti a temperatura ambiente con i seguenti anticorpi secondari coniugati con la perossidasi: anticorpo di capra anti-topo (1: 3000, Biorad, Hercules, CA, USA) per p75NTR e beta-actina; anticorpo di capra anti-coniglio (1: 3000, Biorad) per TrkA e TrkB; anticorpo di asino anti-capra (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc Santa Cruz, CA) per TrkC. Le membrane sono state lavate e sviluppate utilizzando il sistema di rilevazione chemiluminescente ECL (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, Inghilterra). L'intensit? della banda ? stata determinata quantitativamente utilizzando il software ImageJ (Wayne Rasband).

Test di graffiatura

50.000 cellule sono state seminate su piastre di coltura tissutale a sei pozzetti e sono state trattate con 10?g/ml di mitomicina C per 2 ore. 24 ore dopo, le cellule sono state lavate tre volte con un terreno privo di siero e sono state tracciate tre linee per ciascun pozzetto lungo il monostrato cellulare con una punta in plastica sterile. Le piastre sono state lavate due volte con terreno privo di siero per rimuovere tutte le cellule distaccate e incubate in terreno privo di siero con XYZ, chemioterapico, ibuprofene o ketoprofene da soli o in combinazione con il peptide. Le cellule sono state monitorate dopo 48 ore dalla stimolazione. Il risultato di ciascun esperimento ? stato espresso come media delle cellule migrate in sei diverse aree. I risultati finali sono espressi come media ? DS di tre diversi esperimenti. Per il confronto delle medie ? stato utilizzato il test T di Student.

Manipolazione del pesce zebra per xeno-trapianto

La manipolazione del pesce zebra ? stata eseguita presso il Centro per i pesci zebra dell'Universit? di Padova, in Italia, con l'autorizzazione del comitato etico (OPBA) 407/2015-PR. Gli embrioni di pesce zebra sono stati ottenuti dalla deposizione naturale di adulti albini, allevati secondo i protocolli standard (Westerfield, M et al., 2000) e mantenuti secondo Kimmel et al. (1995). Per lo xeno-trapianto, 2 giorni dopo la fecondazione (dpf), gli embrioni sono stati dechorionati meccanicamente, anestetizzati con tricaina 0.16 mg/ml e posizionati lungo corsie di plastica immerse in metilcellulosa al 2%/PBS. Le cellule umane del melanoma sono state colorate con la soluzione Vybrant Cell-Labeling (5ug / ml, Molecular Probes) o CFSE (2uM, Invitrogen) per 20 minuti a 37?C secondo le indicazioni del produttore. Le cellule colorate sono state caricate in un ago capillare di vetro e microiniettate nel sacco vitellino (circa 50 cellule/embrione), utilizzando l?apparato WPI PicoPump. Gli embrioni con xenotrapianto sono stati mantenuti a 33?C, trattati con XYZ, DTIC, il peptide in combinazione con DTIC o non trattati. I pesci zebra sono stati monitorati quotidianamente e documentati dal giorno 1 post iniezione (dpi) fino ad 1 settimana (endpoint sperimentale). Le immagini sono state ottenute con il microscopio da dissezione Leica MZFLIII dotato di una fotocamera Leica DFC7000T. I pannelli sono stati assemblati utilizzando il software Adobe Photoshop CC v. 14.0 x64

RISULTATI

Per dimostrare che il peptide ? in grado di legare direttamente il CD271, i lisati proteici totali delle linee cellulari di melanoma WM266-4 e Lu1205 sono stati immunoprecipitati con il peptide coniugato con biglie di sefarosio. Gli immunocomplessi sono stati lavati con tampone Port e tampone PT, quindi eluiti con tampone Laemnli per 5 'a 90?C. I campioni sono stati caricati in un gel di poliacrilamide al 7%, trasferiti sulla membrana di nitrocellulosa e marcati con anticorpo monoclonale anti-CD271. Come controllo negativo ? stato utilizzato il complesso peptide-biglie di sefarosio senza lisati proteici, mentre come controllo positivo ? stato utilizzato il lisato proteico totale di WM266-4 senza complesso di peptide-biglie di sefarosio (Fig. 1).

Sono state utilizzate cinque linee cellulari di melanoma per testare l'efficacia di XYZ o del suo componente peptidico non PEGhilato: WM115 e WM266-4, che sono rispettivamente cellule di melanoma primario e metastatico derivate dallo stesso paziente ed esprimono alti livelli di CD271, e SKmel28, una linea cellulare di melanoma metastatico che esprime bassi livelli di CD271, WM793B, da melanoma primario e 1205Lu da melanoma metastatico polmonare. La vitalit? della coltura cellulare ? stata valutata mediante test MTT. La soluzione MTT ? stata aggiunta alle piastre poste in un incubatore per coltura cellulare per 4 ore. Il metabolita blu di formazano prodotto dalle cellule vitali ? stato poi estratto con isopropanolo e l'assorbanza ? stata misurata a 570 nm con uno spettrofotometro. XYZ e il peptide non PEGhilato riducono la proliferazione cellulare, come dimostrato dal dosaggio MTT, in tutte le cellule di melanoma a 48h e 96h dopo il trattamento, senza differenze significative (Fig. 2), indicando che la coniugazione con il PEG non altera l'efficacia del peptide.

Inoltre, XYZ riduce la proliferazione cellulare, come dimostrato dal dosaggio MTT, in modo dose-dipendente nelle linee cellulari WM115, WM266-4 e SKmel28 (Fig. 3).

Poich? il CD271 media l'apoptosi in molti sistemi cellulari, abbiamo analizzato l'effetto di XYZ nelle linee cellulari del melanoma in relazione ai livelli del recettore. Dopo il trattamento, le linee cellulari di melanoma sono state raccolte e incubate con la soluzione colorante Trypan Blue o incubate con l?anticorpo CD271 per l'analisi mediante citometria a flusso. Come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso e dal conteggio delle cellule vitali al microscopio, XYZ ? pi? efficace nelle linee cellulari che esprimono livelli pi? elevati di CD271 (Fig. 4).

In particolare, XYZ innesca nel melanoma l'apoptosi, un tipo ben noto di morte cellulare programmata in coltura. In effetti, XYZ induce una percentuale significativamente pi? alta di apoptosi rispetto al diluente da solo in due saggi di apoptosi (propidio ioduro, analisi del subG1; colorazione dell?annessina) (Fig. 5). In dettaglio, le linee cellulari di melanoma sono state delicatamente tripsinizzate e lavate una volta con terreno contenente siero prima dell'incubazione con annessina V-FITC o con ioduro di propidio. 24 e 48 ore pi? tardi, ? stato osservato in citometria di flusso il rilevatore di segnale FITC o il picco G0/G1, rispettivamente con la colorazione dell?annessina o con la colorazione con il PI.

Inoltre, XYZ innesca la morte delle cellule di melanoma in coltura attraverso CD271. XYZ non riesce a ridurre la vitalit? cellulare (saggio MTT) nella linea cellulare di melanoma WM115 silenziata per CD271 (siRNA), mentre induce la morte cellulare in misura maggiore nelle linee cellulari di melanoma SKMel28 che sovraesprimono CD271 (vettore virale CD271) (Fig.6). Ci? indica che CD271 media gli effetti di XYZ nel melanoma.

? stato anche scoperto che gli agenti chemioterapici regolano il CD271 aumentando in modo dose-dipendente l'espressione a livello di mRNA (Real-time PCR) e di proteine (Western bloting e citometria a flusso) (Fig. 7). Pertanto, l'RNA cellulare totale ? stato estratto dalle linee cellulari di melanoma usando il metodo del reagente TRI. Per verificare la qualit? dell'RNA, abbiamo utilizzato un minigel di agarosio in condizioni prive di RNAsi. 1 ml di RNA ? stato sottoposto a retro-trascrizione e amplificazione in una miscela di reazione da 50 ?l utilizzando il kit di reagenti Master Mix RT-PCR One-Step. La PCR quantitativa in tempo reale per il recettore CD271 ? stata eseguita con il sistema PCR Real-Time ABI 7500. Per quanto riguarda l'espressione proteica, le cellule di melanoma sono state raccolte in tampone di lisi pH 7,5, caricate su gel di poliacrilamide al 7% e trasferite sulla membrana di nitrocellulosa. Le membrane sono state dapprima incubate in tampone bloccante, poi con l?anticorpo CD271 primario, quindi con l?anticorpo secondario. Infine, le membrane sono state lavate e sviluppate utilizzando il sistema di rilevazione chemiluminescente ECL.

In effetti, XYZ (180 mM) combinato con DTIC (200 mg/ml) ? significativamente pi? efficace nel ridurre la proliferazione cellulare (dosaggio MTT) rispetto al solo agente chemioterapico 48 ore dopo il trattamento (Fig. 8). Inoltre, XYZ combinato con DTIC, inibisce la migrazione delle cellule di melanoma in misura significativamente maggiore rispetto al DTIC o a XYZ da solo, come mostrato dal test della ferita da graffio con la linea cellulare SKmel28 (Fig. 9).

XYZ non ha mostrato alcun effetto tossico acuto (aspetto, peso, assunzione di acqua e cibo), come mostrato dalla procedura ?su e gi??. Iniezioni endovenose sono state eseguite nelle code di sei topi CD1 (Charles River, Calco (MI) Italia) con la somministrazione di XYZ da 17,5 mg/kg a 1750 mg/kg (Fig. 10).

Il modello pesce Zebra rappresenta un modello in vivo di xenotrapianto alternativo che offre un approccio rapido ed efficace per valutare gli effetti dei farmaci nelle cellule tumorali umane. (Haldi M, Ton C, Seng WL, McGrath P: cellule di melanoma umano trapiantate in pesce zebra proliferano, migrano, producono melanina, formano masse e stimolano l'angiogenesi in pesce zebra. Angiogenesis 2006; 9: 139-151). Gli embrioni di pesce zebra sono particolarmente utili nell'analisi microscopica in quanto sono traslucidi, offrendo cos? l'opportunit? di visualizzare il processo metastatico ad alta risoluzione (Stoletov K, Montel V, Lester RD, Gonias SL, Klemke R: imaging ad alta risoluzione della interfaccia vascolare della cellula tumorale dinamica nel pesce zebra trasparente; PNAS 2007; 104: 17406-17411). Abbiamo recentemente dimostrato che la sotto-regolazione del CD271 promuove la progressione e la metastasi del melanoma nei pesci zebra (Saltari A, Truzzi F, Quadri M, Lotti R, Palazzo E, Grisendi G, Tiso N, Marconi A, Pincelli C: la sotto-regolazione del CD271 promuove la progressione del melanoma e l?invasione in modelli tridimensionali e nel pesce zebra; J Invest Dermatol 2016; 136: 2049-2058).

Per lo xenotrapianto, gli embrioni di albino sono stati ?dechorionated? meccanicamente 2 giorni dopo la fecondazione, sono stati anestetizzati con tricaina 0,16 mg/ml e posti lungo le corsie di plastica immerse in metilcellulosa al 2%/ PBS. Le cellule SKmel28 e le cellule di melanoma dalle metastasi dei pazienti sono state colorate con la soluzione Vybrant Cell-Labeling. Le cellule colorate sono state caricate in un ago capillare di vetro e microiniettate nel sacco vitellino (circa 50 cellule/embrione), gli embrioni xenotrapiantati sono stati monitorati quotidianamente e documentati a partire da un giorno dopo l'iniezione fino a una settimana.

XYZ da solo riduce, rispetto al controllo, la formazione di metastasi nel pesce zebra iniettato con cellule di melanoma derivate da pazienti con mutazione BRAF. Inoltre, XYZ, in combinazione con DITC, migliora ulteriormente questo effetto (Fig. 11).

In aggiunta, mentre nel pesce zebra xenotrapiantato con la linea cellulare SKmel 28 di melanoma primario, DTIC o XYZ riducono le metastasi complete, XYZ in combinazione con DTIC ne blocca la formazione (Fig. 12).

Vi sono prove crescenti che l'infiammazione possa esacerbare le metastasi del cancro e numerosi studi clinici dimostrano che l'assunzione di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sembra ridurre le metastasi. Il TNF-? regola la migrazione del melanoma maligno in vitro aumentandola e questo aumento potrebbe essere ridotto dall'ibuprofene sia in soluzione che in idrogel (Redpath M, Marques CM, Dibden C, Waddon A, Lalla R, Macneil S: Ibuprofene e ibuprofene rilasciato dall'idrogel nella riduzione della migrazione indotta dall'infiammazione nelle cellule di melanoma; Br J Dermatol.2009; 161: 25-33).

Khwaja et al. hanno osservato che a concentrazioni pi? elevate, alcuni FANS inibiscono la proliferazione e inducono l'apoptosi delle cellule tumorali. Hanno anche osservato che p75NTR ? un importante modulatore a monte degli effetti antitumorali dei FANS e che l'induzione della proteina p75NTR da ibuprofene stabilisce un meccanismo alternativo attraverso il quale l'ibuprofene pu? esercitare un effetto antitumorale (Khwaja F1, Allen J, Lynch J, Andrews P, Djakiew D: L'ibuprofene inibisce la sopravvivenza delle cellule tumorali della vescica attraverso l'espressione indotta della proteina soppressore del tumore p75NTR; Cancer Res.2004; 64: 6207-13)

Studi epidemiologici dimostrano che i pazienti che consumano cronicamente i FANS per l'artrite mostrano una ridotta incidenza di cancro alla prostata. Inoltre, alcuni FANS mostrano una attivit? antitumorale in vitro. I FANS esercitano i loro effetti antinfiammatori inibendo l'attivit? della cicloossigenasi (COX); tuttavia, evidenze suggeriscono che meccanismi indipendenti dalla COX mediano la ridotta sopravvivenza delle cellule del carcinoma prostatico. ? stato trovato che nelle cellule tumorali della prostata, R-flurbiprofene e ibuprofene inducono selettivamente una ridotta sopravvivenza dipendente da p75NTR, indipendentemente dall'inibizione della COX (Quann EJ, Khwaja F, Zavitz KH, Djakiew D: L'acido propilico R-flurbiprofene induce selettivamente una diminuzione della sopravvivenza delle cellule tumorali prostatiche dipendente da CD271; Cancer Res.2007; 67: 3254-62).

Il ketoprofene ? un FANS ampiamente utilizzato che esibisce anche una attivit? citotossica contro vari tumori. Un profarmaco di un estere di ketoprofene analogo al carboranile ha mostrato un'alta attivit? citostatica contro le linee cellulari di melanoma e di cancro al colon, con una attivit? maggiore nelle linee cellulari sensibili allo stress ossidativo (Buzharevski A, Paskas S, Laube M, L?nnecke P, Neumann W , Murganic B, Mijatovic S, Maksimovic-Ivanic D, Pietzsch J, Hey-Hawkins E: Analoghi carboranilici del ketoprofene con attivit? citostatica contro il melanoma umano e le linee cellulari di cancro al colon; ACS Omega.2019; 4: 8824-8833).

Abbiamo scoperto che le colture cellulari di melanoma 2D (WM115, WM266-4 e SKMEL28) trattate con ketoprofene o ibuprofene da 1 a 2,5 mM mostrano livelli aumentati di proteina CD271 dopo 48 ore di trattamento (Fig. 13).

Abbiamo anche dimostrato che il trattamento con ketoprofene e ibuprofene riduce la proliferazione delle colture cellulari di melanoma (WM115, WM266-4 e SKMEL28) CD271-positive in maniera dose-dipendente (Fig. 14).

Nei nostri esperimenti, due diverse colture di cellule di melanoma 2D (WM266-4 e SKMEL28), trattate con una combinazione di XYZ con ibuprofene o ketoprofene, hanno mostrato chiaramente una riduzione statisticamente significativa della sopravvivenza cellulare (ovvero una maggiore efficacia) rispetto al trattamento con il solo agente antinfiammatorio (test MTT), suggerendo un effetto sinergico tra l'effetto citotossico intrinseco dell'agente antinfiammatorio e il bersagliamento di CD271 da parte di XYZ (Fig. 15).

La combinazione di XYZ con trattamenti antinfiammatori come l'ibuprofene e il ketoprofene ha anche dimostrato di ridurre la migrazione cellulare nelle colture cellulari di melanoma 2D, come dimostrato dal test di ferita da graffio con la linea cellulare SKmel28 (Fig. 16).

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un peptide che comprende o ? costituito dalla sequenza dall'N-terminale al C-terminale: R1-R2-Gly-R3-R4-R5-Gly-R6-R7-R8-Gly (SEQ ID NO:1) o la sequenza: Gly-R8-R7-R6-Gly-R5-R4-R3-Gly-R2-R1 (SEQ ID NO:2) in cui: - R1 ? selezionato dal gruppo costituito da: Met, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr e Trp - R2 ? selezionato dal gruppo costituito da: Leu, Met, Ala, Val, Ile e Phe - R3 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ile, Met, Ala, Val, Leu e Phe - R4 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ile, Met, Ala, Val, Leu e Phe - R5 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ala, Met, Val, Ile, Leu e Phe - R6 ? selezionato dal gruppo costituito da: Lys e Arg - R7 ? selezionato dal gruppo costituito da: Asn, Gln, His, Ser, Thr, Tyr e Cys - R8 ? selezionato dal gruppo costituito da: Ser, Asn, Gln, His, Thr, Tyr e Cys - l?N-terminale della sequenza o del peptide ? W-CO-NH-, in cui W ? un gruppo alchilico C1-C12 o un atomo di idrogeno, oppure H2N-- il C-terminale della sequenza o del peptide ? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 ? un atomo di idrogeno o gruppo alchilico C1-C6 e Z2 ? un atomo di idrogeno o gruppo alchilico C1-C6, oppure -COOH e in cui i residui da R1 a R8 possono trovarsi nella loro configurazione enantiomerica D o L e loro frammenti funzionali o derivati.
2. 2. Il peptide secondo la rivendicazione 1 in cui detto peptide si lega selettivamente al recettore CD271.
3. 3. Il peptide secondo la rivendicazione 1 o 2 comprendente o avente la seguente sequenza: DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly (SEQ ID NO: 3) in cui l'N-terminale della sequenza o del peptide ? W-CO-NH-, dove W ? CH3 e il C-terminale della sequenza o del peptide ? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 e Z2 sono atomi di idrogeno e loro frammenti funzionali o derivati.
4. 4. Il peptide di una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui un polimero di poli(etilenglicole) (PEG) lineare o ramificato, preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa, ? coniugato a uno o entrambi i terminali N- e C- della sequenza, in cui l'estremit? non coniugata del polimero PEG ? libera o bloccata, preferibilmente ? alcossilata.
5. 5. Il peptide secondo la rivendicazione 1 o 2 o 3, in cui un residuo D-Cys o L-Cys viene aggiunto al C-terminale e/o all'N-terminale della sequenza.
6. 6. Il peptide secondo la rivendicazione 5 avente la seguente sequenza: DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly-DCys (SEQ ID NO:4) in cui l'N-terminale della sequenza ? W-CO-NH-, dove W ? CH3 e il C-terminale della sequenza ? -CO-N(Z1)(Z2), dove Z1 e Z2 sono atomi di idrogeno e loro frammenti funzionali o derivati.
7. 7. Il peptide secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui uno o entrambi i residui di Cys sono coniugati a un polimero PEG lineare o ramificato, preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa, in cui l'estremit? non coniugata del polimero PEG ? libera o bloccata, preferibilmente ? alcossilata, preferibilmente il polimero PEG ? un polimero metossi-PEG lineare da 20 kDa coniugato al peptide attraverso l'atomo di zolfo del residuo D-Cys.
8. 8. Il peptide secondo la rivendicazione 7 essendo Ac-DMet-DLeu-Gly-DIle-DIle-DAla-Gly-DLys-DAsn-DSer-Gly-DCys-NH2 (SEQ ID NO:5) in cui un polimero metossi-PEG lineare da 20 kDa ? coniugato al residuo D-Cys attraverso l'atomo di zolfo di quest'ultimo.
9. 9. Un polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato, preferibilmente nell'intervallo di peso molecolare (MW) da 1 a 200 kDa, pi? preferibilmente da 1 a 100 kDa coniugato con almeno due peptidi di una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti o loro miscele.
10. 10. Un liposoma comprendente un peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti e almeno una sostanza selezionata dal gruppo costituito da un lipide biodegradabile e/o biocompatibile, colesterolo, una nanoparticella, un polimero o loro miscele.
11. 11. Una composizione farmaceutica comprendente almeno un peptide o un derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 o almeno un carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide delle rivendicazioni 1-8 o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato secondo la rivendicazione 9 o il liposoma secondo la rivendicazione 10 e almeno un eccipiente e/o veicolo farmaceuticamente accettabili, preferibilmente sotto forma di una formulazione farmaceutica iniettabile.
12. 12. Il peptide o il derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 o il carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide delle rivendicazioni 1-8 o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato secondo la rivendicazione 9 o il liposoma secondo la rivendicazione 10 o la composizione farmaceutica della rivendicazione 11 per uso medico, preferibilmente per l'uso nel trattamento di malattie correlate a CD271, preferibilmente del cancro o della psoriasi, pi? preferibilmente del melanoma, neuroblastoma o carcinoma a cellule di Merkel.
13. 13. Il peptide o il derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 o il carrier a base lipidica comprendente almeno un peptide delle rivendicazioni 1-8 o il polimero PEG bi- o multifunzionale, lineare o ramificato secondo la rivendicazione 9 o il liposoma secondo la rivendicazione 10 o la composizione farmaceutica della rivendicazione 11 per l'uso secondo la rivendicazione 12, in combinazione con almeno un agente chemioterapico e/o antinfiammatorio non steroideo, o in seguito a pretrattamento della stessa malattia mediante chemioterapia e/o con farmaci antinfiammatori non steroidei e/o qualsiasi trattamento che aumenti l'espressione di CD271, preferibilmente l'agente chemioterapico ? selezionato dal gruppo costituito da: dacarbazina, carmustina, cisplatino e/o miscele di qualsiasi trattamento che aumenti l'espressione di CD271, preferibilmente l'agente antinfiammatorio non steroideo ? selezionato dal gruppo costituito da: ibuprofene, dexibuprofene, naprossene, fenoprofene, ketoprofene, dexketoprofene, flurbiprofene, oxaprozin, loxoprofene e loro miscele e/o miscele di qualsiasi trattamento che aumenti l'espressione di CD271.