DE69907154T2

DE69907154T2 - Krebsbehandlung

Info

Publication number: DE69907154T2
Application number: DE69907154T
Authority: DE
Inventors: Hilmar Meek Warenius; Laurence Anthony Seabra
Original assignee: Theryte Ltd
Current assignee: Theryte Ltd
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: DE69907154D1; ATE238556T1; AU2630099A; EP1057030A2; JP2002504353A; DE69907155D1; DE69907156D1; WO1999042821A3; EP1057029B1; DE69907151D1; WO1999042839A2; AU2630199A; JP2002504354A; CA2321458A1; US6521407B1; AU2538099A; WO1999042828A3; DE69907153D1; EP1057028B1; WO1999042837A1

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Verfahren zum Auswählen der am besten geeigneten Therapie für Patienten, die an Krebs leiden. Die Anmeldung betrifft insbesondere die Messung der Beständigkeit von Krebszellen gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen.
Obwohl Strahlentherapie und Chemotherapie in der zweiten Hälfte dieses Jahrhunderts für die Heilung vieler Menschen von Krebs verantwortlich waren, gibt es immer noch eine große Anzahl von Tumoren, die entweder ein geringes Ansprechen auf die Behandlung zeigen oder anfangs auf diese ansprechen, nur um später wiederaufzutreten. Insbesondere Frauen, deren Eierstockkrebs mit Platinerungsmitteln behandelt wird, zeigen oft ermutigende erste Reaktionen auf die Chemotherapie (welche häufig die Verwendung von cis-Diammindichlorplatin (CDDP) als Arzneimittel der ersten Wahl einschließt), jedoch 5 Jahre nach der Diagnose sind 2/3 von ihnen ihrer Krankheit erlegen. Gleichermaßen mögen Lungenkrebspatienten günstig auf Kombinations-Chemotherapiesysteme, welche am Beginn der Behandlung CDDP umfassen, ansprechen, jedoch sehr wenige überleben auf lange Sicht. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Ansprechempfindlichkeit von Krebserkrankungen auf CDDP zugrunde liegen, könnte bei der Vorhersage helfen, welche Patienten am wahrscheinlichsten von CDDP profitieren oder ob alternative cytotoxische Wirkstoffe, wie z. B. Taxol, oder andere Therapien, wie z. B. die Strahlentherapie, geeignet sein könnten. Das Verstehen der Mechanismen des Ansprechens auf eine Behandlung beinhaltet auch die Möglichkeit, diese Mechanismen selektiv zu modulieren, um die Behandlung einer Krebserkrankung beim Menschen unter Anwendung von CDDP zu verbessern.
Es wurde zunehmend offensichtlich, dass bestimmte Onkogene und Tumorunterdrückungsgene nicht nur bei der Krebsentstehung ein Rolle spielen können, sondern auch die Empfindlichkeit von bösartigen Zellen auf therapeutische Wirkstoffe beeinflussen können. Es wurden daher Versuche unternommen, diese und andere Gene zu verwenden, um das therapeutische Ansprechen einer Krebserkrankung beim Menschen auf die zur Zeit verfügbaren Behandlungsmodalitäten, wie z. B. eine Strahlentherapie und/oder eine cytotoxische Chemotherapie, zu untersuchen und vorherzusagen. Die Forschung hat bis zum heutigen Zeitpunkt jedoch im Allgemeinen nur versucht, als Methoden zur Vorhersage des therapeutischen Ansprechens die Expression von einzelnen, mit Tumoren in Verbindung stehenden Genen zu untersuchen. Die Forschung im öffentlichen Bereich legte nahe, dass Mutationen im p53-Tumorunterdrückungsgen, welche bei etwa 50% der häufigen Krebserkrankungen, wie z. B. jener der Brust, der Lunge und des Eierstocks, zu finden sind, mit der Resistenz gegenüber einer Behandlung mit cytotoxischen Arzneimitteln oder einer Bestrahlung zusammenhängen. Trotz eines beträchtlichen Umfangs von Arbeiten gibt es zur Zeit dennoch keine erfolgreichen klnischen Tests, bei welchen die Detektion von Mutationen im p53-Gen allein dazu eingesetzt werden kann, mit einem akzeptablen Grad an Gewissheit vorherzusagen, ob die Krebserkrankung eines Patienten wahrscheinlich auf eine Chemotherapie mit z. B. Platinierungsmitteln oder den neueren cytotoxischen Wirkstoffen, wie z. B. Taxanen (z. B. Taxol), ansprechen wird oder nicht.
Die Expression von einzelnen Genen allein in Bezug auf das Ansprechen von menschlichen Krebszelllinien auf eine Behandlung mit cytotoxischen Arzneimitteln, wie z. B. CDDP, wurde in menschlichen in vitro-Zelllinien untersucht, da diese ein Modellsystem darstellen, welches für das Ansprechverhalten einer Krebserkrankung des Menschen im klinischen Bereich relevant ist. Insbesondere weisen sie den Umfang von Empfindliehkeiten gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln und ionisierender Strahlung auf, welcher im klinischen Bereich üblicherweise vorgefunden wird. Für Entdeckungen in menschlichen in vitro-Zelllinien besteht daher die große Möglichkeit, auf klinisch brauchbare Tests hinsichtlich der Frage, welche Qualität des Ansprechens von Krebserkrankungen auf eine Behandlung zu erwarten ist, übertragen werden zu können.
Das Fortwachsen von Zellen durch den Zellzyklus wird von Holoenzymen reguliert, welche durch eine Kombination von Proteinen, genannt Cyclinen, deren Pegel den gesamten Zellzyklus hindurch fluktuieren, und Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs), welche bei Verbindung mit Cyclinen aktiv werden, gebildet werden. Die Cyclin/CDK-Komplexe können durch Proteine, die als Cyclin-abhängige Kinasehemmer (CDKIs) bezeichnet werden und das Protein p21 WAF1/CIP1 (p21) einschließen, gehemmt werden.
Die Proteinprodukte der Cyclin-D1- und B1-Gene und deren jeweilige Cyclin-abhängige Kinasepartner CDK4 und CDK1 wurden untersucht. Cyclin D1 und CDK4 kontrollieren das Fortwachsen von Zellen durch den Zellzyklus-Kontrollpunkt zwischen G1- und S-Phase (die Phase der DNA-Synthese). Cyclin B1 und CDK1 kontrollieren den Zellzyklus-Kontrollpunkt direkt vor der Mitose. Es wurde gezeigt, dass die Expression des Cyclin-D1-Proteins in einer Reihe von 16 menschlichen Krebszelllinien mit deren Eigenresistenz gegenüber dem cytotoxischen Arzneimittel CDDP zusammenhängt (Warenius et al., 1996). Die Cyclin-D1-Proteinpegel wiesen jedoch keine Beziehung zur Radiosensitivität, einer weiteren Behandlungsmodalität, auf. Die Beziehung zwischen Cyclin D1 und der CDDP-Resistenz ist jedoch allein nicht stark genug, um die Basis für klinisch nützliche Vorhersageanalysen zu bilden.
Es gibt somit keine Indikatoren dafür, dass das Messen des Mutationsstatus oder der Expressionsstärken der Proteinprodukte von einzelnen Onkogenen, Proto-Onkogenen oder Tumorunterdrückungsgenen in menschlichen Krebszellen die Basis für einen verlässlichen klinischen Test hinsichtlich der Frage bilden könnte, ob klinische Tumore wahrscheinlich auf eine Behandlung mit chemotherapeutischen Wirkstoffen, einschließlich Platinierungsmitteln und CDDP, ansprechen würden.
Diese Erfindung schafft Verfahren zur Vorhersage, ob menschliche Krebszellen dazu neigen, auf Wirkstoffe zur Krebsbekämpfung (chemotherapeutische Wirkstoffe, wie z. B. Platinierungsmittel, z. B. CDDP) anzusprechen, indem die Eigenschaften von zwei oder mehreren mit Krebs in Verbindung stehenden Gene zugleich gemessen werden. Überdies liefert die wechselseitige Beziehung zwischen bestimmten, bei dieser Erfindung identifizierten, unabhängig exprimierten Krebsgenen auch zuvor nicht beschriebene Ziele, auf die eine Therapie, die krebsspezifischer ist, möglicherweise gerichtet werden kann.
Insbesondere stellt diese Anmeldung ein Verfahren zur Messung der Beständigkeit von Zellen gegenüber den cytotoxischen Wirkungen von chemotherapeutischen Wirkstoffen bereit, welches Verfahren die Untersuchung einer Zellen umfassenden Probe oder eines Extrakts davon hinsichtlich Folgendem umfasst:

(a) hinsichtlich der Expressionsstärke von p21 oder hinsichtlich der Häufigkeit des p21-Proteins; sowie
(b) hinsichtlich der Expressionsstärke von Cyclin D1 oder hinsichtlich der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins.

Die Reihenfolge, in der die Schritte (a) und (b) ausgeführt werden, ist nicht besonders beschränkt. So kann der Schritt (a) dem Schritt (b) vorangehen, oder wahlweise kann der Schritt (b) dem Schritt (a) vorangehen.
Diese Anmeldung sieht auch eine Ausstattung zur Messung der Beständigkeit von Zellen gegenüber den cytotoxischen Wirkungen von chemotherapeutischen Wirkstoffen vor, welche Ausstattung Folgendes umfasst:

(i) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von p21 oder der Häufigkeit des p21-Proteins; sowie
(ii) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von Cyclin D1 oder der Häufigkeit des Cyclin-D 1-Proteins.

Somit betrifft diese Anmeldung die Messung der Cyclin-D1-Proteinpegel in Zellen, deren p21-Proteinpegel (z. B. durch Western-Blotting) bestimmt wurde, um die Resistenz eines Tumors gegenüber (beispielsweise) CDDP zu bestimmen. Hohe Cyclin-D1-Pegel oder eine starke Cyclin-D1-Expression zusammen mit nicht erhöhten (vorzugsweise im Wesentlichen nicht nachweisbaren) p21-Proteinpegeln (oder einer im Wesentlichen Nichtanhebung (vorzugsweise im Wesentlichen Fehlen) einer p2l-Expression) hängen eng mit der Beständigkeit gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen, z. B. CDDP, in menschlichen Krebszellen zusammen.
Die Überexpression von Cyclin D1 oder die Anhebung der Cyclin-D1-Proteinpegel kann durch jegliches geeignetes Verfahren, z. B. Western-Blotting, gemessen werden. Der Punkt, an dem der Pegel als erhöht oder die Expression als eine Überexpression angesehen wird, ist dem Fachmann auf diesem Gebiet klar gemäß der allgemeinen Lehre aus der Literatur bezüglich üblicher Cyclin-D1-Pegel in menschlichen Zelllinien (siehe Oncogene, 1993, Band 8, 2127–2133; und Oncogene, 1995, Band 10, 775–778). Dieser Punkt kann gemäß der Beurteilung durch die das vorliegende Verfahren durchführende Person bestimmt werden, und zwar abhängig von den speziellen Krebszellen und dem Patienten, die involviert sind.
Gleichermaßen kann die Expression von p21 oder der Pegel des p21-Proteins durch irgendein geeignetes Verfahren gemessen werden, einschließlich Verfahren, die jenen entsprechen, auf die obenstehend hinsichtlich der Messung der Cyclin-D1-Pegel Bezug genommen wurde. Im Speziellen ist p21 ein Cyclin-abhängiger Kinasehemmer, welcher durch Western-Blotting, Imnunzytochemie oder in jüngerer Zeit entwickelte Techniken, wie z. B. die Bestimmung der relativen Häufigkeit von p21 mRNA, nachgewiesen werden kann. Der Punkt, an dem davon ausgegangen wird, dass das p21 nicht wirksam exprimiert wird (oder die Expression nicht erhöht ist) oder das p21-Protein nicht wirksam nachweisbar ist (oder nicht wirksam erhöht ist), ist dem Fachmann auf diesem Gebiet klar gemäß der allgemeinen Lehre aus der Literatur bezüglich üblicher p21-Proteinpegel in menschlichen Zeltlinien (siehe Oncogene, 1995, Band 11, 2021–2028; und Oncogene, 1996, Band 12(6), 1319–1324).
Die vorliegende Erfindung wird rein beispielhaft detaillierter beschrieben, und zwar unter Bezugnahme auf die angeschlossene Zeichnung, in welcher:
1 die Beziehung zwischen dem Cyclin-D1-Proteinpegel und der relativen Resistenz gegenüber CDDP in Zeltlinien, in denen das p21-Protein im Wesentlichen nicht nachweisbar ist darstell; und
2 die entsprechende Beziehung in Zeltlinien, in denen das p21-Protein angehoben ist, darstellt.
Menschliche Krebszelllinien mit einer Kombination aus nicht erhöhten (vorzugsweise nicht nachweisbaren) p21-Proteinpegeln und hohen Expressionsstärken des Cyclin-D1-Ptoteins sind resistent gegenüber CDDP. Diese Entdeckung schafft wichtige klinische Möglichkeiten in Hinblick auf die Bereitstellung eines potentiell neuen Parameters für Vorhersageanalysen hinsichtlich der Ansprechempfindlichkeit auf CDDP oder eines neuen Ziels für die Modulation der Ansprechempfindlichkeit auf CDDP.
Die starke Wechselbeziehung zwischen den p21-Proteinpegeln und den hohen Cyclin-D1Pegeln oder einer Cyclin-D1-Überexpression liefert auch ein potentielles Ziel für die Arzneimittelentwicklung. Es werden Anstrengungen unternommen, Arzneimittel gegen Cyclin D1 zu entwickeln. Derartige Arzneimittel versprechen, wirksamer zu sein, wenn sie zusammen zur Behandlung von Krebs mit den obenstehenden p21-Proteinpegeln und einer Cyclin-D1-Überexpression eingesetzt werden. Solche Arzneimittel könnten auch in Kombination mit anderen Wirkstoffen, wie z. B. CDDP, als Verstärker ihrer Wirksamkeit eingesetzt werden.
1 zeigt, dass in Zeltlinien, in denen die p21-Proteinpegel nicht nachweisbar sind, eine starke Beziehung zwischen dem Cyclin-D1-Proteinpegel und der relativen Resistenz gegenüber CDDP besteht, wie durch die D0,1-Werte gemessen. Dies impliziert, dass menschliche Krebszellen mit nicht erhöhten oder nicht nachweisbaren p21-Proteinpegeln und hohen Cyclin-D1-Proteinpegeln wahrscheinlich nicht auf CDDP ansprechen und eine Alternativtherapie, wie z. B. die Strahlentherapie oder Taxol, in Betracht gezogen werden sollte. Möglicherweise wird die Taxolempfindlichkeit nicht durch eine Kombination von p21-Proteinpegeln und einer Überexpression des Cyclin-D1-Proteins beeinflusst. Der Cyclin-D1/p21-Test kann auch eine Resistenz gegenüber anderen cytotoxischen Arzneimitteln, wie z. B. Etoposid, nachweisen. Somit zeigt der Test Situationen an, in denen eine Bestrahlung eine brauchbare Alternative zu CDDP darstellen könnte, bzw. ob andere cytotoxische Wirkstoffe geeigneter sein könnten.
Basierend auf der zweifachen Messung der Cyclin-D1-Proteinexpression und der p21-Proteinexpression kann ein klinischer Test hinsichtlich der CDDP-Empfindlichkeit entwickelt werden. Das Cyclin-D1-Protein wird typischerweise in einer Forschungs umgebung durch Western-Blotting oder Immunzytochemie gemessen, für diagnostische Zwecke werden jedoch kostengünstigere und schnellere Verfahren bevorzugt.
Da Cyclin D1 ein relativ kurzlebiges Protein unter cyclischer Transkriptionskontrolle ist, ist es wahrscheinlich, dass die mRNA-Pegel für Cyclin D1 demselben Muster folgen wie das Cyclin-D1-Protein und eine ähnlich starke Beziehung zur CDDP-Resistenz aufweisen. Dies würde die Durchführung einer funktionellen Analyse hinsichtlich der Resistenz gegenüber CDDP ermöglichen, indem mRNA aus Tumorproben entnommen und zum Bestimmen der relativen Häufigkeit von Cyclin D1 mRNA (und, falls gewünscht, der relativen Häufigkeit von p21 mRNA) verwendet wird.
Oligonucleotid-Reihen
Die Bestimmung der mRNA-Pegel kann auf eine Reihe von Anen durchgefühn werden. Unter Anwendung der Reverse Transcription kann eine poly-A-tragende mRNA ohne weiteres in cDNA umgewandelt werden – ein Verfahren ist im diese Erfindung erläuternden Beispiel beschrieben. Reverse Transcriptase-PCR (RTPCR)-Verfahren erlauben die Bestimmung der Menge von einzelnen RNAs, jedoch mit einem relativen niedrigen Genauigkeitsgrad. Oligonucleotid-Reihen stellen einen relativ neuatrigen Zugang zur Nucleinsäure-Analyse dar, wobei eine Mutationsanalyse, eine Sequenzierung durch Hybridisierung und eine mRNA-Expressionsanalyse ermöglicht werden. Es wurden Verfahren zur Konstruktion solcher Reihen entwickelt (siehe beispielsweise A. C. Pease et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5022–5026, 1994; U. Maskos und E. M. Southern, Nucleic Acids Research 21, 2269–2270, 1993; E. M. Southern et al, Nucleic Acids Research 22, 1368–1373, 1994), und weitere Verfahren werden ins Auge gefasst. Reihen sind in Entwicklung, welche die Expressionsstärken von mRNAs messen und in diesen RNAs Mutationen nachweisen, und diese bieten eine attraktive Ausführungsform des diagnostischen Tests, der von dieser Erfindung vorgeschlagen wird.
Immunzytochemie
Eine alternative Ausführungsform dieser Erfindung kann Cyclin-D1-Proteinpegel und p2l-Proteinpegel mittels Immunzytochemie messen, wobei die konfokale Laserfluoreszenzmikroskopie angewandt wird. Vorzugsweise wird ein Abtastsystem eingesetzt, wie jene, die in der PCT/US91/09217, PCT/NL/00081 und PCT/US95/01886 beschrieben sind. Zusätzlich ist es wünschenswen, dass das Mikroskopiesystem auch in der Lage ist, mehrere fluoreszierende Farbstoffe zu analysieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper gegen Cyclin D1 (sc-6281, Santa Cruz Biotechnology, CA) mit einem ersten Farbstoff und ein Antikörper gegen p21 mit einem zweiten Farbstoff markiert, während ein dritter DNA-bindender Farbstoff zum Auswählen von Aneuploidzellen eingesetzt werden kann. DNA-bindende Farbstoffe, wie z. B. der Hoechst 33258-Farbstoff, welcher AT-reiche DNA bindet, oder Chromomycin A₃, welcher GC-reiche DNA bindet, sind geeignet. Ein diagnostischer Test kann die folgenden Schritte umfassen:

– Das Entnehmen einer Biopsie des Tumors eines Patienten.
– Gegebenenfalls das Zerlegen des Materials unter dem Mikroskop, um normales Gewebe von Tumormaterial zu trennen.
– Das Vorbereiten des Biopsiematerials für die mikroskopische Untersuchung, was die folgenden Schritte umfasst:
– Das Markieren des Biopsiematerials mit den obenstehenden fluoreszenzmarkienen Antikörpersonden gegen Cyclin D1. Das Biopsiematerial kann gegebenenfalls auch mit Antikörpersonden gegen p21 und mit einem DNAbindenden Farbstoff markien werden.
– Das Trennen der markienen Zellen von ungebundenen markienen Sonden.
– Das Legen des markienen Biopsiematerials in ein konfokales Rastermikroskop, um Zellen zu zählen, welche:
– Cyclin D1 überexprimieren oder erhöhte Anteile davon aufweisen, d. h. mit zumindest einer Schwellenwert-Menge eines Antikörpers gegen Cyclin D1 markien sind.
– Gegebenenfalls solche, welche p21 nicht exprimieren oder nicht überexprimieren oder keine erhöhten Anteile davon aufweisen; d. h. mit einer unter dem Schwellenwert liegenden Menge von Antikörpern gegen p21 markien sind. Wahlweise könnte die p21-Expression durch eine Analyse der mRNA oder der genomischen DNA bestimmt werden, wie obenstehend besprochen.
– Gegebenenfalls solche, welche chromosomale Amplifikationen besitzen, wie durch die Intensität der Fluoreszenz von DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen.

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
Eine weitere Ausführungsform des diagnostischen Tests kann sich die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zunutze machen. Ein FACS-Instrument trennt die Zellen einer Suspension in einer Weise, die von den Zellen, die mit einem Fluoreszenz-Marker markiert sind, abhängt. Ein typisches FACS-Gerät funktioniert wie folgt: Die Zellen in einer Suspension, welche sich in einer einzelnen Reihe fonbewegen, werden durch eine Schwingdüse geleitet, welche die Bildung von eine einzelne Zelle oder überhaupt keine Zelle enthaltenden Tröpfchen hervorruft. Die Tröpfchen passieren einen Laserstrahl. Die Fluoreszenz, die von jeder einzelnen Zelle in ihrem Tröpfchen durch den Laser angeregt wird, wird gemessen. Nach dem Detektor tritt der Strom von Zellen, die sich in Suspension befinden, durch einen elektrostatischen Ring, welcher den Tröpfchen eine Oberflächenladung verleiht. Den Tröpfchen, die Zellen tragen, wird eine positive oder negative Ladung verliehen. Enthält der Tropfen eine Zelle, die mit einer oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts liegenden Intensität flüoresziert, so erhält der Tropfen eine Ladung von einer Polarität. Unmarkierte Zellen erhalten eine Ladung von entgegengesetzter Polarität. Die geladenen Tröpfchen werden danach von einem elektrischen Feld abgelenkt und werden in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenladung in getrennte Behälter geleitet und gezählt. Tröpfchen, die mehr als eine Zelle enthalten, streuen das Licht mehr als einzelne Zellen, was leicht nachzuweisen ist, und somit bleiben diese ungeladen und kommen in einen dritten Entsorgungsbehälter. Mehrkanal-Fluoreszenz-Detektionsgeräte wurden konstruien, die basierend auf der Markierung mit mehreren verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen Zellen trennen können. Diese haben Mehrfachlaser, die Fluoreszenz in verschiedenen Frequenzen. anregen können, und der Detektor weist verschiedene Emissionsfrequenzen nach. Ein Systemmit drei Markierungen ist für diesen Test geeignet. Dieselben markienen Sonden wie jene, die obenstehend hinsichtlich der Verwendung in einem konfokalen Rasterfluoreszenzmikroskop beschrieben wurden, wären geeignet. Ein diagnostischer Test könnte die folgenden Schritte umfassen:

– Das Entnehmen einer Biopsie des Tumors eines Patienten.
– Gegebenenfalls das Zerlegen des Materials unter dem Mikroskop, um normales Gewebe von Tumormaterial zu trennen. –
– Das Zerstören der intrazellulären Adhäsion zwecks Bildung einer Einzelzellen-Suspension.
– Das Markieren der suspendienen Zellen mit den obenstehenden flüoreszenzmärkierten Sonden gegen Cyclin D1. Das Biopsiematerial kann gegebenenfalls auch mit . Antikörpersonden gegen p21 und mit einem DNA-bindenden Farbstoff markien werden.
– Das Trennen der markienen Zellen von ungebundenen markienen Sonden.
– Das Leiten der Suspension von markienen Zellen durch ein FACS-Gerät, um Zellen zu zählen, welche:
– Cyclin D1 überexprimieren oder erhöhte Anteile davon aufweisen, d. h. mit dem Anti-Cyclin-D1-Antikörper markiert sind, und zwar oberhalb eines Schwellenwens für die „normale" Expression.
– Gegebenenfalls Zellen, die p21 nicht exprimieren oder nicht überexprimieren oder keine erhöhten Anteile davon aufweisen, d. h. mit einer unter dem Schwellenwert ligenden Menge eines Antikörpers deden p21 markiert sind.
– Gegebenenfalls Zellen, die chromosomale Amplifikationen besitzen, wie durch die Intensität der Fluoreszenz von DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen.

Modulation der Cyclin-D1-Expression bei Krebserkrankungen des Menschen
Zur Zeit werden viele Versuche unternommen, Arzneimittel zu entwickeln, die Cyclin D1 hemmen. Da dieses Molekül eine lebenswichtige Funktion bei der Kontrolle des Wachstums normaler Zellen durch die „Stan"-Komponente des G1/S-Kontrollpunkts ausübt, wären solche Hemmstoffe wahrscheinlich extrem unselektiv und äußerst giftig für normale Zellen. Die speziellere Beziehung zwischen der Resistenz gegenüber CDDP und der Empfindlichkeit gegenüber Taxanen in menschlichen Krebszellen mit erhöhten Cyclin-D1-Pegeln und nicht nachweisbaren p21-Pegeln, die hier beschrieben sind, schafft ein viel genauer definienes Ziel für neuanige therapeutische Wirkstoffe, welche möglicherweise in Verbindung mit Taxanen verwendet werden könnten, wobei dies ein Wirkstoff mit einer bewiesenen Geschichte des Erfolges bei der Heilung vieler (allerdings bei weitem nicht aller) Krebserkrankungen ist. Dieser Zugang basien auf einem Konzept des Beginnens mit therapeutischen Wirkstoffen, welche bereits bis zu einem gewissen Grad wirken, und des Anwenders von Techniken, wie z. B. des Abzielens auf Gene, zur Steigerung der Wirksamkeit von bereits verfügbaren therapeutischen Wirkstoffen.
Im Fall von Patienten, die nicht nachweisbare oder nicht erhöhte p21-Pegel aufweisen, kann es möglich sein, deren Ansprechempfindlichkeit auf Platinierungsmittel zu steigern, indem deren Cyclin-D1-Pegel verringen werden. Cyclin-D1-Hemmer neigen dazu, in unselektiver Weise toxisch zu sein, jedoch bei Verabreichung in geringen Dosen und in Verbindung mit einem Wirkstoff, wie z. B. einem Taxan, kann diese Kombination wirksamer gegen Tumore sein als jeder Wirkstoff für sich, insbesondere gegenüber Zellen, die Cyclin D1 überexprimieren.
Beispiel 1
Es zeigte sich, dass menschliche in vitro-Zelllinien von unterschiedlicher histologischer Herkunft, welche eine Reihe von intrinsischen Empfindlichkeiten gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln aufweisen, wie durch klonogene Zellüberlebensanalysen gemessen, geeignete Modelle für das Ansprechen von klinischen Tumoren auf die Chemotherapie darstellen. Insbesondere weisen diese Zelllinien den Umfang von Empfindlichkeiten gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln und ionisierender Strahlung auf welcher im klinischen Bereich üblicherweise vorgefunden wird. Diese menschlichen in vitro-Krebszelllinien werden nunmehr weitgehend als relevante Modelle für das klinische Ansprechen von Tumoren auf die Chemotherapie anerkannt. Die intrinsische Empfindlichkeit gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln wird mittels klonogener Analysen einer Reihe von menschlichen Krebszelllinien gemessen. Es ist daher möglich, Gene zu identifizieren, deren Expression und/oder Mutationsstatus mit der intrinsischen Empfindlichkeit gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln in einem breiten Umfang von menschlichen in vitro-Zelllinien zusammenhängen, indem die Expression von Zielgenen gemessen und/oder deren Mutationsstatus bestimmt wird und diese Parameter mit der Zelllinien-Empfindlichkeit gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln in eine Wechselbeziehung gebracht werden. Dieser Vorgang identifiziene Gene, welche für eine klinische Ansprechempfindlichkeit auf CDDP relevant sind. Für Entdeckungen bei menschlichen in vitro-Zelllinien, wie z. B. jene, die zu dieser Erfindung führen, besteht daher die große Möglichkeit, auf klinisch brauchbare Tests hinsichtlich der Frage, welche Qualität des Ansprechens von Krebserkrankungen auf eine Behandlung zu erwanen ist, übenragen werden zu können. Der Umfang an Arbeiten, der zur Messung des klonogenen Zellüberlebens einer breiten Auswahl von menschlichen in vitro-Zelllinien von nterschiedlicher Histologie nach dem Ausgesetztsein an CDDP ausgeführt wurde, wird nachstehend beschrieben.
Materialien und Verfahren
Zelllinien und klonogene Zellüberlebensanalysen

Über die klonogenen Analysevorgängehinsichtlich der Wachstumscharakteristika der menschlichen in vitro-Zelllinien, die bei dieser Analyse verwendet werden, wurde bereits berichtet (Warenius et al, 1994). Die Zelllinien sind mit ihrer histologischen Klassifizierung in Tabelle 1 aufgelistet. Alle sind gut etablien; viele wurden mehrere Jahre lang in vitro wachsen gelassen. Die Zelllinien waren entweder Schenkungen oder wurden von unseren Laboratorien erworben. Nach dem Erhalt wurden alle 5 Passagen lang wachsen gelassen, um genügend Zellen für eine chargenweise Lagerung in flüssigem Stickstoff zu ergeben. In dieser Periode wurde die Kontamination durch zumindest eine Passage in einem antibiotischen freien Medium ausgeschlossen, und eine Mycoplasma-Untersuchung wurde mit allen Linien durchgeführt. Für die klonogenen Analysen wurden aus einer bestimmten primären Charge in flüssigem Stickstoff Zellen entnommen und 3–6 Passagen lang wachsen gelassen, bis genügend gut wachsende Zellen existienen. Weitere Chargen von diesen Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Zellen wurden routinemäßig in einem DMEM-Medium aufbewahn, mit Ausnahme von RT112 und H322, die in RPMI1640 wachsen gelassen wurden, und von MGHU-1, das in einem Ham-F12-Medium wachsen gelassen wurde. Alle Linien wurden mit 10%igem, durch Hitze deaktivienem Kälberfötusserum (HIFCS) ergänzt. Tabelle 1

	Zelllinie
I407	Embryonales Darmepithel
HEP 2	Schuppenförmiges Karzinom des Kehlkopfs
MGHU1	Übergangskarzinom der Blase
HRT 18	Adenokarzinom des Mastdarms
2780	Eierstockkarzinom
OAW 42	Eierstockkarzinom
HT 29/5	Adenokarzinom des Kolons
COLO 320	Adenokarzinom des Kolons
H 322	Kleinzellen-Lungenkarzinom
H 417	Kleinzellen-Lungenkarzinom
RPMI 7951	Melanom
RT 112	Übergangskarzinom der Blase
MOR	Adenokarzinom der Lunge
MEL 2	Melanom

Zwecks Analyse der CDDP-Empfindlichkeit wurden 10²–10⁵ Zellen auf 6 Quellplatten in 3 ml eines mit 10% FCS ergänzten Ham-F12-Mediums plattiert und bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ 8 Stunde lang inkubiert. Danach wurden aus 1 mg/ml (lichtgeschützter) CDDP-Stammlösung verdünnte Lösungen von 0,02–2,0 μg/ml hergestellt, und 1 ml der geeigneten verdünnten Lösung wurde zu jeder Platte hinzugefügt, um ein endgültiges Volumen von 4 ml zu ergeben. Die Platten wurde danach bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ 14 Tage lang bei Dunkelheit und in Gegenwan des CDDPs inkubiert. Das Medium wurde daraufhin entfernt, die Zellen wurden in 70%igem Ethanol fixien und mit 10%igem Giemsa gefärbt, und Kolonien von >100 Zellen wurden gezählt. Für jede verdünnte Arzneimittellösung wurde eine der 6 Quellplatten verwendet. Die Datenpunkte aller Analysen wurden zur Schaffung von Mittelwerten und SEMs gepoolt. Ein Minimum von 3 separaten klonogenen Analysen mit 6 Punkten/Arzneimitteldosis/Analyse war für jede Zelllinie notwendig. Durch Interpolation der angepassten Regressionskurve wurde das CDDP-Zellüberleben beim klonogenen Zellüberlebensgrad von 10% (D0,1) bestimmt.
Western-Blotting für Cyclin D1
Zwei unabhängige Western-Blottings wurden mit Lysaten für jede Zelllinie durchgefühn, wobei diese paarweise auf jedem Gel aufgetragen waren. Zur Herstellung von Zellen für die Lysate für das Western-Blotting auf jeder Zelllinie wurden Standardbedingungen angewandt; 10⁷ Zellen wurden in 162 cm² großen Gewebekultivierungskolben (Costas Ltd., High Wycombe, Bucks) gezüchtet, bis sie präkonfluent waren, jedoch immer noch exponentiell wuchsen, wie mittels einer Durchflusszytometrie bestätigt. Die Zellen wurden daraufhin mittels Trypsinisation abgetrennt, in einem vollständigen Medium +10% FCS resuspendiert und 3mal durch Serienzentrifugation und Resuspension in PBS ohne Serum gewaschen. 1–3 × 10⁸ lebensfähige Zellen wurden danach durch Zentrifugation pelletiert und bei 3 × 10⁷ Zellen pro ml Lysatpuffer resuspendiert (Stammlösung: 10%iges SDS 10 ml, 0,5 M Tris pH 6,8, Glycerin 10 ml, doppelt destillienes Wasser 62 ml. 100 ml von 10 mM Leupeptin + 10 ml von 100 mM PMSF wurden zu 10 ml Stammlösung hinzugefügt.) Proteinabschätzungen wurden durchgefühn, und die endgültige Konzentration der Lysate wurde auf 300 μg Gesamtzellprotein pro 100 μl eingestellt. Zur Messung des Cyclin-D1-Proteins wurden pro Bahnquelle 150 μg Gesarntzellprotein in 50 μl Lysatpuffer einem 7,5%igen Laemmli-Trenngel hinzugefügt und wurde bei 16°C unter 16-stündiger Anwendung von 60V sowie eines konstanten Stroms von 500 mA eine Elektrophorese durchgefühn. Unter Verwendung eines Halbtrocken-Blotting-Apparats (Biorad, Richmond, CA) wurden 16 Stunden lang bei 22°C Blots auf Nitrocellulose übenragen, mit einem monoklonalen IgG₁-Maus-Antikörper gegen Säugetier-Cycline (G124-259.5, Pharmingen) inkubiert und danach mit Anti-Maus-konjugierten Kaninchen-Antikörpern (Dako, UK) bei 1/1000 inkubien und in einem alkalischen Phosphatasepuffer, der Nitroblue Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (Sigma, Poole, Dorset, UK) (50 mg/ml in Dimethylformamid) enthielt; eine Stunde lang bei Raumtemperatur und Dunkelheit entwickelt. Die Farbentwicklung wurde mit doppelt destillienem Wasser gestoppt, und die Blots wurden getrocknet. Die Cycline würden als getrennte Bänder klar aufgelöst, wobei Cyclin D1 flach die geringste Beweglichkeit hatte.
Die Quantisierung des Proteinprodukts des Cyclin-D1-Gens wurde durch Messung der optischen Dichte mit einem Schimadzu-Abtastdensitometer mit Wolframlicht durchgefühn und als O. D.-Einheiten pro 150 μg Gesamtzellprotein ausgedrückt. Die durch Einfüllung verschiedener Mengen von Gesamtzellprotein erhaltenen Titrationskurven hatten zuvor gezeigt, dass lineare Beziehungen hinsichtlich der optischen Dichte (O. D.) in dem Bereich erhälten werden konnten, der für das Cyclin-D1-Protein quer durch die Zeltlinien vorgefunden wurde (Warenius et al 1994, Browning 1997). Um verschiedene Cyclin-D1-Proteinpegel zwischen den Zilllinien zu vergleichen, wurde der mittlere O. D.-Wert für all diese Linien berechnet und wurde die relative O. D. für das Cyclin-D1-Protein in jeder einzelnen Zelllinie auf die mittlere O. D. normien und mit einem beliebigen Wen von 5,0 multiplizien.
Western-Blotting wurde auch zur Messung der p21-Pegel der Zelllinien eingesetzt, und zwar im Wesentlichen gemäß demselben obenstehend beschriebenen Verfahren.
Die Beziehung zwischen den Cyclin-D1-Pegeln, den p21-Pegeln und der CDDP-Empfindlichkeit wurde für die Zelllinien untersucht. Bei Zellen, in denen das p21-Protein nicht nächweisbar war, wurde eine nützliche Wechselbeziehung zwischen den Cyclin-D1-Proteinpegeln und der Resistenz gegenüber CDDP festgestellt.
Somit ist es bei Zelllinien, in denen das p21-Protein nicht nachweisbar ist, umso wahrscheinlicher, dass die Zeilen gegenüber CDDP resistent sind, je höher die Cyclin-D1-Pegel sind (1). Diese Wechselbeziehung ist bei Zelllinien, in denen die p21-Proteinpegeln erhöht sind, nicht zu finden (2).
Referenzliste

Barraclough et al, J. Cell Physiolog 131: 393–401, 1987.
Chirgwin et al, Biochernistry 18: 5294–5299, 1979.
Maskos und Southern, Nucleic Acids Research 21, 2269–2270, 1993.
Pease et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5022–5026, 1994.
Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467, 1977.
Southern et al, Nucleic Acids Research 22, 1368–1373, 1994.
Warenius et al., Int. J. Cancer. 67: 224–231, 1996.
Bristow et al., Oncogene 9: 1527–1536, 1994.
Bristow et al., Radiotherapy and Oncology 40: 197–223, 1996.
P. W. G. Browning, "Proto-oncogene expression and intrinsic radiosensitivity, PhD
Thesis, University of Liverpool, 1997.
Deacon et al, Radiotherapy and Oncology 2, 317–323, 1984.
Fan et al, Cancer Res. 54: 5824–5830, 1994.
Fertil & Malaise, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 7: 621–629, 1981.
FitzGerald et al, Radiat Res. 122: 44–52, 1990.
Hollstein et al, Science 253: 49–53, 1991.
Iliakis et al., Cancer Res. 50: 6575–6579, 1990.
Kasid et al., Cancer Res. 49: 3396–3400, 1989.
Kastan et al, Cancer Res. 51: 6304–6311, 1991.
Kawashima et al., Int J. Cancer 61: 76–79, 1995.
Kelland et al, Radiat. Res. 116: 526–538, 1988.
Lee und Bernstein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5742–5746, 1993.
McIlwrath et al., Cancer Res. 54: 3718–3722, 1994.
McKenna et al., Cancer Res. 50: 97–102, 1990.
McKenna et al., Radiat. Res. 125: 283–287, 1991.
Nunez et aI, Br. J. Cancer 71: 311–316, 1995.
Pardo et al., Radiat Res. 140: 180–185, 1994.
Pirallo et al., Int. J. Radiat Biol. 55: 783–796, 1989.
Pirollo et al., Radiat Res. 135: 234–243, 1993.
Powell & McMillan, Int. J. Rad: Oncol. Biol. Phys., 29: 1035–1040, 1994.
Radford, Int. J. Radiat Biol. 66: 557–560, 1994.
Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467, 1977.
Schwanz et al., Int J. Radiat. Biol. 59: 1314–1352, 1991.
Shimm et al., Radiat. Res. 129: 149–156, 1992.
Siles et al., Br. J. Cancer 73: 581–588, 1996.
Su & Little, Int. J. Radiat. Biol. 62: 461–468, 1992.
Su & Little, Radiat Res. 133: 73–79, 1993.
Suzuki et al., Radiat Res. 129: 157–162; 1992.
Warenius et al., Eur. J. Cancer 30, 369–375, 1994.
Warenius et al., Rad. Research 146, 485–493, 1996.
Whitaker et al., Int. J. Radiat. Biol. 67: 7–18, 1995.
Xia et al., Cancer Res. 55: 12–15, 1995.
Zhen et al., Mut. Res. 346, 85–92, 1995.

Claims

Verfahren zur Messung der Beständigkeit von Zellen gegenüber den cytotoxischen Wirkungen eines chemotherapeutischen Wirkstoffs, welches Verfahren die Untersuchung einer Zellen umfassenden Probe oder eines Extrakts davon hinsichtlich Folgendem umfasst: (a) hinsichtlich der Expressionsstärke von p21 oder hinsichtlich der Häufigkeit des p21-Proteins; sowie (b) hinsichtlich der Expressionsstärke von Cyclin D1 oder hinsichtlich der Häufigkeit des Cyclin-D 1-Proteins; wobei eine Beständigkeit angezeigt wird, wenn hohe Cyclin D1-Pegel oder eine hohe Cyclin D1-Expression zusammen mit nicht erhöhten p21-Proteinpegeln oder einer wesentlichen Nicht-Verstärkung der p21-Expression auftreten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe einer Testperson entnommen wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der chemotherapeutische Wirkstoff ein Platinierungsmittel ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Platinierungsmittel CDDP ist.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die Untersuchung hinsichtlich der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins die Messung der Häufigkeit von Cyclin-D1 mRNA umfasst.
Verfahren gemäß, Anspruch 5, wobei die Messung der Häufigkeit von Cyclin-D1 mRNA das In-Kontakt-Bringender Probe mit einer Sonde für Cyclin-D1 mRNA umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die Untersuchung unter Anwendung von Western-Blotting durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die Untersuchung das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem markierten Antikörper gegen das Cyclin-D1-Protein umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Antikörper gegen das Cyclin-D1-Protein 14841 C (von Klon Nummer G-124-259.5) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei zumindest ein Antikörper mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen wird.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, weiters umfassend das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem DNA-bindenden Farbstoff zur Markierung von Aneuploidzellen.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der DNA-bindende Farbstoff der Hoechst 33258- oder Chromomycin A₃-Farbstoff ist.
Verfahren gemäß jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die Probe eine Zellprobe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Untersuchung mittels Durchführung einer Zellzählung bewerkstelligt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Zellzählung unter Anwendung einer Multiparameter-Durchflusszytometrie durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Zellzählung unter Anwendung der konfokalen Rastermikroskopie durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei. die Zellzählung unter Anwendung der fluoreszenzaktivienen Zellsortierung durchgefühn wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14–17, wobei die Zellprobe vor der Durchführung der Zellzählung unter dem Mikroskop zerlegt wird, um normales Gewebe von Tumorgewebe zu trennen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14–18, wobei vor der Durchführung der Zellzählung die intrazelluläre Adhäsion in. der Zellprobe zerstön wird, um eine Einzelzellen-Suspension zu bilden.
In vitro-Verfahren zum Auswählen eines Wirkstoffs zur Krebsbehandlung, welches Verfahren das Untersuchen einer Probe von Zellen oder eines Extrakts davon umfasst, welche Probe von Zellen gewonnen wird, die p21 nicht expwimieren oder in denen die p21- Expression nicht verstärkt ist, und/oder von Zellen, in denen die p21-Proteinpegel im Wesentlichen nicht nachweisbar oder nicht erhöht sind, und zwar: (a) hinsichtlich der Expressionsstärke von Cyclin D1 oder hinsichtlich der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins; sowie (b) ob Cyclin D1 überexprimiert wird und/oder das Cyclin-D1-Protein in erhöhten Anteilen vorhanden ist, wobei zur Behandlung ein anderer Wirkstoff als ein Platinierungsmittel ausgewählt wird; (c) ob Cyclin D1 nicht überexprimiert wird, und/oder das Cyclin-D1-Protein im Wesentlichen nicht in erhöhten Anteilen vorhanden ist, wobei zur Behandlung ein ein Platinierungsmittel umfassender, chemotherapeutischer Wirkstoff ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Auswahl zur Behandlung gemäß Schritt (b) durchgefühn wird und der von einem Platinierungsmittel verschiedene Wirkstoff eine ionisierende Strahlung oder ein Taxan ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Auswahl zur Behandlung gemäß Schritt (e) durchgeführt wird und der ein Platinierungsmittel umfassende Wirkstoff ein CDDP umfassender Wirkstoff ist.
Ausstattung zur Messung der Beständigkeit von Zellen gegenüber den cytotoxischen Wirkungen eines chemotherapeutischen Wirkstoffs, welche Ausstattung Folgendes umfasst: (i) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von p21 oder der Häufigkeit des p21-Proteins; sowie (ii) ein Mittel zum Untersuchen der Expressionsstärke von Cyclin D1 oder der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins.
Ausstattung gemäß Anspruch 23, wobei das Mittel zum Untersuchen der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins eine Sonde für Cyclin-D1 mRNA umfasst.
Ausstattung gemäß Anspruch 23, wobei das Mittel zum Untersuchen der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins einen markienen Antikörper gegen das Cyclin-D1-Protein umfasst.
Ausstattung gemäß Anspruch 25, wobei der Antikörper gegen das Cyclin-D 1-Protein 14841 C (von Klon Nummer G-124-259.5) ist.
Ausstattung gemäß Anspruch 25 oder Anspruch 26, wobei zumindest ein Antikörper mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen ist.
Ausstattung gemäß einem der Ansprüche 23–27, weiters umfassend einen DNAbindenden Farbstoff zur Markierung von Aneuploidzellen.
Ausstattung gemäß Anspruch 28; wobei der DNA-bindende Farbstoff der Hoechst 33258- oder Chromomycin A₃-Farbstoff ist.
Verwendung eines Mittels zum Untersuchen der Expressionsstärke von p21 oder der Häufigkeit des p21-Proteins und zusätzlich eines Mittels zum Untersuchen der Expressionsstärke von Cyclin D 1 oder der Häufigkeit des Cyclin-D1-Proteins, und zwar zur Messung der Beständigkeit von Zellen gegenüber den cytotoxischen Wirkungen eines chemotherapeutischen Wirkstoffs, in einem Verfahren gemäß Anspruch 1.