JP2002504683A

JP2002504683A - 癌の治療法

Info

Publication number: JP2002504683A
Application number: JP2000532712A
Authority: JP
Inventors: ヒルマーミークワレニウス; ローレンスアンソニーシーブラ
Original assignee: セライトリミテッド
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2002-02-12
Also published as: ATE238558T1; AU753588B2; WO1999042835A1; DE69907154T2; DE69907152D1; EP1057028B1; JP2002503822A; AU2538199A; EP1057027A2; EP1057032B1; WO1999042834A2; EP1057033A1; ATE238557T1; AU739001B2; WO1999042090A3; WO1999042821A3; CA2321438A1; ATE238555T1; CA2321458A1; AU741632B2

Abstract

(57)【要約】【課題】試験対象物の癌性状態または前癌性状態を診断する方法、および試験対象物の癌性状態または前癌性状態を診断するキットを提供する。【解決手段】細胞またはその抽出液を含有する試料中のCDK1およびCDK4が同時に上昇することを調べる工程を包含する診断方法である。また、（i）CDK1の上昇を調べる手段、および（ii）CDK4の上昇を調べる手段を包含する診断キットである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は癌の診断方法に関するものである。特に本発明は、癌細胞と疑われる
細胞中に存在する2種の蛋白質の濃度を測定することによって、癌を診断する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】

癌の顕著な特徴は、自律神経細胞を無制限に増殖させる能力である。正常細胞
の増殖能を損なうことなしに同時に癌細胞の増殖を選択的に阻害する手段が発見
されれば、腫瘍の分化、侵入または転移の程度とは関係なく腫瘍の生育を停止し
得る新しい方法が提供されることになる。癌細胞がどの様に分裂し、正常細胞の
分裂とどの様に異なるのかを理解することは興味深いことである。癌治療の大半
は広範な細胞毒性を有しており、一般に増殖細胞を標的としている。しかしなが
ら、正常組織も増殖する為、細胞毒性剤によって同様に損傷を受けることになる
。標的設定を可能にするか、または、薬剤開発用の特異的な標的を提供し得る癌
特異的マーカーを同定することができれば、腫瘍組織に対して一層特異的な毒性
を発揮し、化学療法による衰弱作用を軽減し得る治療法の開発が可能となる。

【０００３】 CDDPの様な細胞毒性剤を用いた治療では、ヒトin vitro細胞系で、ヒト癌細胞
系の応答に対してのみ単一遺伝子の発現作用が研究されているが、その理由は、
これらが臨床現場におけるヒト癌の応答に適切なモデル系を提供する為である。
特にこれらは、臨床現場で通常用いられる細胞毒性剤および電離放射線に対する
感受性域を有している。従って、ヒトin vitro細胞系における知見は、癌がどの
程度治療に応答すると期待できるのかについて、臨床上有用な試験へとつながる
可能性が強い。

【０００４】細胞周期を通じた細胞の進行は、その濃度が細胞周期を通じて変動するサイク
リンと呼ばれる蛋白質と、サイクリン結合して活性となるサイクリン依存性キナ
ーゼ（CDK）との組合せによって形成されるホロ酵素により決定される。サイクリン／CDKの複合体は、蛋白質p21 WAF1/CIP1（p21）を含むサイクリン依存性キ
ナーゼ阻害剤（CDKI）と呼ばれる蛋白質によって阻害される。

【０００５】サイクリンD1遺伝子およびB1遺伝子の蛋白質産生、並びに夫々のサイクリン依
存性キナーゼパートナーであるCDK4およびCDK1について研究されている。サイク
リンD1およびCDK4は、G1期とS-期の間（DNA合成期）の細胞周期チェックポイントを通じて細胞の進行を制御する。サイクリンB1およびCDK1は、有糸分裂直前の
細胞周期チェックポイントを制御する。一連の16ヒト癌細胞系におけるサイクリ
ンD1蛋白質の発現は、細胞毒性剤CDDPに対する内因性耐性と関連していることが
示されている（Warenius等、1996）が、サイクリンD1蛋白質の濃度は、別の治療
法である放射線感受性とは無関係である。しかしながら、サイクリンD1とCDDP耐
性との関係はそれ自身、臨床上有用な予測試験の根拠となる程、強いものではな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】

本発明は上記の従来技術に伴う問題点を解決し、癌診断用に改善された方法を
提供することを目的とするものである。

【０００７】

【発明の構成】

従って、本発明は、２種以上の腫瘍関連遺伝子の特性を同時に測定することに
より、癌性状態を診断する方法について記載するものである。本発明は、CDK１遺伝子の蛋白質産物およびCDK4遺伝子の蛋白質産物の濃度を測定し、好ましくは
、同時にp53の突然変異状態を測定することに関するものである。

【０００８】具体的には本発明は、試験対象物の癌性状態または前癌性状態を診断する方法
を提供するものであり、細胞またはその抽出液を含有する試料中のCDK１およびC
DK４が同時に上昇することを調べる工程を包含するものである。

【０００９】 CDK1およびCDK4が同時に上昇することは、これらの発現または蛋白濃度のいず
れかが上昇する状態であり得る。CDK1およびCDK4の発現が上昇すること、または
CDK1およびCDK4蛋白濃度が上昇することは、ウエスタンブロット等の適切な方法
によって測定することができる。これらの濃度が上昇すると考えられる点、また
はこれらの発現が上昇すること(または過剰な発現）と考えられる点は、ヒト細胞系におけるCDK1およびCDK4の通常濃度に関する一般的文献に教示された内容に
基づき、当該技術者が容易に知り得るものである（Cancer Research, 1994, Nov
15;54(22)、5804-７；Cancer Research, 1993, Nov 15;53(22),5535-41;およびBr
itish Journal of Cancer, 1995, Jun.;71(6),1231-6参照）。この点は、関連す
る特定の細胞および患者に応じて、本発明の方法を実施する者の判断によって決
定することができる。

【００１０】更に本発明は、試験対象物における癌性状態または前癌性状態を診断するキッ
トを提供するものであり、 (i)CDK1の上昇を試験する手段;および (ii)CDK4の上昇を試験する手段を包含するものである。

【００１１】更に本発明は、本発明で開示された特徴を有する癌組織に対し、より特異的な
毒性を発揮する薬剤をもたらす薬剤スクリーニング用の新規な標的複合物を提供
するものである。

【００１２】本発明は特に、細胞中のCDK1蛋白濃度およびCDK4蛋白濃度を測定することに関
するものである。好ましくは、細胞のp53突然変異状態は、例えばDNA配列決定に
よって同定される。特にp53突然変異を有するヒト癌細胞において、高濃度のCDK
1およびCDK4が検出されている。

【００１３】 P53突然変異ヒト細胞におけるCDK1とCDK4との関連性の調節上記知見は珍しいもので、現時点において、CDK類に関して広く知られている所見と一致しないものである。P53突然変異細胞におけるCDK1/CDK4関連性の崩壊
は、抗癌剤療法の新しい標的とみなすことができる。更に、CDK1/CDK4が同時に上昇することと、p53突然変異とは、共に癌細胞に限定され、相互に関連していると考えられることから、これらが組合わさって標的複合物を形成し、この標的
複合物は、これまでに見出されている癌治療法のなかで最も特異的な標的複合物
を提供する可能性が高い。

【００１４】更に図面を参考にしながら本発明について詳述するが、これは例示のみを目的
とするに過ぎない。

【００１５】 CDK1蛋白質およびCDK4蛋白質の発現に基づく癌の2重パラメータ試験癌の臨床試験は、CDK1蛋白質の発現濃度、CDK4蛋白質の発現濃度を測定し、p5
3遺伝子の突然変異を検出することによって得られる。研究段階においてはCDK蛋
白質の濃度は、具体的には、ウエスタンブロットにより、または免疫細胞化学に
より測することができるが、診断目的の為には、より安価でより迅速な方法が好
ましい。

【００１６】 P53の突然変異状態の測定は、患者の遺伝子を有するゲノム遺伝子座を配列決定することにより、または、発現mRNAをcDNAに変換後に配列決定することにより
、行うことができる。現在、種々の核酸配列決定法を使用することができるが、
その全てが、本診断法に好適に用いられる。最も広く用いられている方法は、Sa
nger等、1977の方法を用いた鋳型ポリメラーゼ生成複写物への末端ヌクレオチド
の取込みに基づくものである。最近、多くの代替法が可能となり、数例を挙げれ
ば、アダプター配列決定（PCT／US95／12678）、連結に基づく配列決定（PCT／U
S96／05245）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（A.D.Mirzabekov、TIBT
ech12：27‐32、1994）等である。特定の突然変異を調べる為の様々な方法は当該分野で知られており、例えば、TaqMan試験、オリゴヌクレオチドリガーゼ法、
一重鎖コンホメーション多形性および鋳型核酸のオリゴヌクレオチドアレーへの
ハイブリダイゼーションに基づく試験法が挙げられる。

【００１７】 CDK1およびCDK4は転写制御下には直接おかれない為、CDK1およびCDK4に対する
mRNA濃度が、これらの蛋白質と同じパターンに従うとは考えられない。このこと
は、これらの遺伝子のmRNA濃度を測定したとしても、本試験の目的には不充分で
あることを意味している。

【００１８】免疫細胞化学本発明の好ましい実施態様では、共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察を用いた免疫
細胞化学によってCDK1およびCDK4の蛋白質濃度を測定することができる。好まし
くは、PCT／US91／09217、PCT／NL／00081およびPCT／US95／01886に記載された
走査システムが用いられる。CDK1に対する抗体（例えばマウスモノクローナル抗
体sc‐54, Santa Cruz Biotechnology, CA）を1番目の染料で標識し、CDL4に対する抗体（sc‐260, Santa Cruz Biotechnology, CA）を2番目の染料で標識し、
そして3番目のDNA結合染料を用いて異数性細胞を選択する。ATが豊富なDNAに結合するHoechst33258染料、またはGCが豊富なDNAに結合するクロモマイシンA₃の様なDNA結合染料が適切である。これらの染料から発せられる蛍光強度は、上記遺伝子の発明の指標となり得るものである。診断試験は下記工程を包含する。

【００１９】・患者から腫瘍の生検材料を取出す。・必要に応じて上記材料を微細切断し、腫瘍部から正常組織を分離する。・下記工程に従って顕微鏡検査用の生検材料を調製する。・CDK1およびCDK4に対する上記蛍光標識抗体プローブで生検材料を標識する。必要に応じて生検材料は、ｐ53突然変異蛋白質に対する抗体プローブ、およびDNA結合染料で標識する。・標識された細胞を非結合の標識プローブから分離する。・走査共焦点顕微鏡に標識された生検材料を載せ、下記細胞を計数する。・CDK1を過剰発現するか濃度上昇を示す、即ち、CDK1に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。・CDK４を過剰発現するか濃度上昇を示す、即ち、CDK４に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。・必要に応じてp53の変異型を発現する、即ち、p53変異体に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。或いは上記した通り、p53の突然変異状態はmRNAまたはゲノムDNAの分析によって測定される。・必要に応じて、DNA結合蛍光染料からの蛍光強度により検出される染色体増幅を示す。

【００２０】蛍光活性化細胞分類診断試験の一の実施態様は、蛍光活性化細胞分類（FACS）を利用したものであ
る。FACS機器は、蛍光マーカーで標識される細胞に依存した様式で懸濁液中の細
胞を分離する。典型的なFACS装置を以下に記載する。単一のファイル内を移動す
る懸濁液中の細胞は振動ノズルを通過すると、単細胞を含有するか、若しくは全
く含有しない液滴を形成する。この液滴は、レーザー光を通過する。レーザーに
より液滴中の個々の細胞各々から生じた蛍光を測定する。検出器の後方では、懸
濁液中の細胞流は静電気カラー部を通過すると、液滴の表面が荷電する。細胞を
担持した液滴には、正電荷または負電荷が与えられる。液滴中に特定の閾値を超
える強度の蛍光を示す細胞が含まれている場合には、この液滴は、一方の極性の
電荷を獲得する。未標識の細胞は逆の極性の電荷を獲得する。次に、荷電した液
滴が電場により偏向し、その表面電荷に応じて個別の容器内に輸送された液滴を
計数したとき、液滴中に1個より多い細胞を含有するときは、個々の細胞よりも多くの光を散乱するが、これは容易に検出される為、これらは未荷電のままで第
3の廃棄用容器に入る。

【００２１】マルチチャンネル蛍光検出装置は、複数の異なる蛍光標識による標識に基づい
て細胞を分離できる様に構築されている。これらは複数のレーザーを有しており
、これが異なる周波数の蛍光を励起することができる結果、検出器は異なる発光
周波数を検出し得る。この様な技術を用いれば、細胞を分類すること無しに、フ
ローサイクロメーター上のマルチパラメーターアレイによって試験を実施するこ
とができる。本試験には、3標識系が適切である。CDK1に対する抗体を1番目の染
料で標識し、CDK4に対する抗体を2番目の染料で標識し、そして3番目のDNA結合染料を用いて異数性細胞を選択する方法である。ATが豊富なDNAに結合するHoech
st33258染料、またはGCが豊富なDNAに結合するクロモマイシンA₃の様なDNA結合染料が適切である。更に、p53の突然変異型の一部を検出することができる多くの抗体が市販されている。この様な抗体は、4番目の染料で標識することができる。これらの染料から発せられる蛍光強度は、2種の蛋白質の発現濃度を示すものであり、検出器を通過する標識細胞の染色体状態を示している。個々の細胞中
に存在する各染料から発せられる蛍光強度の最小値は、ある細胞を癌性細胞とし
て分類する為に必要である。抗体は、p53蛋白質の既知突然変異型の多くに対して存在するが、現時点において、p53の全ての突然変異型を、抗体によって検出することはできない。診断試験は、下記工程を包含する。

【００２２】・患者から腫瘍の生検材料を取出す工程。・必要に応じて上記材料を微細切断し、腫瘍部から正常組織を分離する工程。・細胞内接着を破壊して単細胞の懸濁液を生成する工程。・CDK1およびCDK4に対する上記蛍光標識抗体プローブで懸濁細胞を標識する工程。必要に応じて生検材料は、p53突然変異蛋白質に対する抗体プローブおよびDNA結合染料で標識する。・標識された細胞を非結合の標識プローブから分離する工程。・FACS装置に標識された細胞懸濁液を載せ、下記細胞を計数する工程。・CDK1を過剰発現するか濃度上昇を示す、即ち、CDK1に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。・CDK４を過剰発現するか濃度上昇を示す、即ち、CDK４に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。・必要に応じて、p53の変異型を発現する、即ち、p53変異型に対する抗体の少なくとも閾値量で標識される。或いは上記した通り、p53の突然変異状態はmRNAまたはゲノムDNAの分析によって測定される。・必要に応じて、DNA結合蛍光染料から発せられる蛍光強度により検出される染色体増幅を示す。

【００２３】実施例１クローン原性細胞生存性試験により測定したときに、細胞毒性剤に対し、一定
範囲の内因性感受性を示す種々の組織学的起源からなるヒトin vitro細胞系は、
化学療法に対する臨床的腫瘍の応答の適切なモデルを提供することが知られてい
る。特にこれらの細胞系は、臨床現場で通常適用される細胞毒性剤および電離放
射線に対し、ある程度の感受性を示す。この様なヒトin vitro癌細胞系は、現在
では、化学療法における腫瘍の臨床応答に関する該当モデルとして広く認識され
ている。従って、その発現および／または突然変異状態が腫瘍特異的である上記
癌モデルに由来する遺伝子を同定することが可能であり、これが、真の臨床的腫
瘍の特徴でもある。従って、本発明に到達するに至ったヒトin vitro細胞系にお
ける上記発見は、薬剤発見プログラム用の重要な標的として組込まれ得る可能性
が極めて高い。

【００２４】癌疾患過程に関与する多くの遺伝子の発現を分析する為に、多くの研究がなさ
れている。細胞分裂を制御する他の遺伝子について検討されたがこれらのいずれ
とも異なり、CDK1およびCDK4は、広範な種類のヒト癌細胞系および臨床結腸癌抽
出物において、一貫して共に高値を示している。理論に制約されず、癌細胞が連
続して細胞分裂を繰返す為には、a)CDK1およびCDK4がその正常機能を維持し、且
つ、b)ヒト癌におけるこれら2種の蛋白濃度が上昇することが、何らかの方法で関連していると推察されるが、そのメカニズムは不明である。

【００２５】上記の推測を検証する為に、2種の蛋白質発現の間に密接な関係が認められた2
0のヒト細胞系におけるCDK1とCDK4の双方の全エクソンについて、DNA配列決定を
行った。配列決定した20のヒトin vitro細胞系では、CDK1遺伝子とCDK4遺伝子の
エクソンに突然変異はみられなかった。この様な所見は非常に驚くべきものであ
る。というのは、癌細胞は、細胞分裂を制御する重要な遺伝子の突然変異を累進
的に蓄積させることが知られており、この様なことは、上記検討を行ったヒトin
vitro細胞系において最も顕著にみられることが当該分野の多数の専門家によっ
て指示されているからである。

【００２６】材料および方法細胞系およびクローン原性細胞生存率試験本分析に用いたヒトin vitro細胞系の生育特性クローン原生試験法は、Wareni
us ら、1994に記載されている。細胞系とその組織学的分類を表１に示す。これらは全て充分成熟しており、多くは数年間in vitroで生育させたものである。細
胞系は寄贈されたものか、当研究室が購入したものである。受領後全て5代継代培養し、液体窒素のバッチ保存用に充分な細胞とした。この期間中、抗生物質を
含有しない培地中で、少なくとも1回継代することにより汚染を防止し、全ての系についてマイコプラズマ試験を実施した。クローン原性試験は、細胞を所定の
一次液体窒素バッチから取出し、充分な成熟細胞が得られるまで3〜6代継代培養
した。これらの細胞から得られた追加のバッチは、液体窒素中に凍結した。RT11
2及びH322は、RPMI1640及びMGHU-1で生育させ、Ham' sF12培地で生育させたが、
それ以外の細胞は通常、DMEM培地中に維持した。全ての系に、10％加熱不活性化
ウシ胎児血清(HIFCS)を添加した。

【００２７】

【表１】

【００２８】 PCRおよびDNA配列決定によるp53遺伝子中の突然変異の同定 p53のPCR及びDNA配列決定用の材料は、クローン原性細胞生存率のデータ用に細胞を提供するのに用いたものと同じ液体窒素バッチから得た。細胞は３代継代
培養した後、以下の処置に付した。

【００２９】核酸の単離 RNAおよびゲノムDNAは、グアニジニウムイソチオシアネートCsCl勾配法により
、本明細書に記載の細胞系から調製した(Chirgwin等, 1979, Barraclough等, 19
87)。即ち、細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水(PBS)中に採取し、グアニジニウムイソ
チオシアネート緩衝液（4Mグアニジウムイソチオシアネート、50mM Tris ｐH7.5
，25mM EDTA ｐH8.0）中でホモジナイズした。0.5％(w/v)ナトリウムラウリルサ
ルコシンおよび8％(v/v)2-メルカプトエタノールを使用直前に添加した。このホ
モジネートを4℃で10分間、8,000rpmで遠心分離(SS34ローター、 Sorvall RC-5B
遠心分離機)して清澄化した後、得られたホモジネ−トを、5.7M塩化セシウム／0
.1M EDTAの緩衝液を介して20℃で20時間、32,000rpmで遠心分離(TST41.14ロータ
ー、Kontron Centrikon T20 60超遠心分離機)し、RNAをペレット化した。RNAのペレットを0.1％(w/v)SDS中に再懸濁し、-20℃で一晩エタノール中に沈殿させた
後、定量した。

【００３０】ポリメラーゼ連鎖反応、cDNA合成およびヌクレオチドの配列決定 PCR(エクソン2-8およびエクソン9-11)は、ヒト癌細胞系から抽出したDNAおよびRNAを用いて行った。次に、各エクソンをDNA配列決定で調べた。PCRプライマーは、各エクソンを平坦化する様に設計され、Applied Biosystems 381A DNA合成装置で合成した。1ユニットとして増幅させたエクソン2および3、並びに、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RTPCR)で一緒に増幅させたエクソン9,10および11を除き、各エクソンは個別に増幅させた。下記プライマーを使用した。エクソン 2/3 センス 5'-CCC ACT TTT CCT CTT GCA GC-3' エクソン 2/3 アンチセンス 5'-AGC CCA ACC CTT GTC CTT AC-3' エクソン 4 センス 5'-CTG CTC TTT TCA CCC ATC TA-3' エクソン 4 アンチセンス 5'-GCA TTG AAG TCT CAT GGA AG-3' エクソン 5 センス 5'-TGT TCA CTT GTG CCC TGA CT-3' エクソン 5 アンチセンス 5'-CAG CCC TGT CGT CTC TCC AG-3' エクソン 6 センス 5'-GCC TCT GAT TCC TCA CTG AT-3' エクソン 6 アンチセンス 5'-TTA ACC CCT CCT CCC AGA GA-3' エクソン 7 センス 5'-ACT GGC CTC ATC TTG GGC CT-3' エクソン 7 アンチセンス 5'-TGT GCA GGG TGG CAA GTG GC-3' エクソン 8 センス 5'-T ATC CTG AGT AGT GG-3' エクソン 8 アンチセンス 5'-T GCT TGC TTA CCT CG-3' エクソン 9/10/11 センス 5'-AGA AAG GGG AGC CTC ACC AC-3' エクソン 9/10/11 アンチセンス 5'-CTG ACG CAC ACC TAT TGC AA-3'

【００３１】ゲノムDNAをEcoR1で消化し、エタノールで沈殿させた後、水50μl(Sigma)に再
懸濁し、PCR増幅に付した。DNA(1μg)を、各プライマー20pmolを含有する50μl のPCR反応溶液中で増幅した。ワックス緩衝液上で残りの反応成分から予め分離しておいたｄNTPおよびTaq酵素を用い、「ホットスタート」PCR法を行った。反応混合物を95℃で2分間、予備加熱PCRブロック上に置き、その後、変性(95℃で3
0秒）、アニーリング（エクソン2〜3、4および6は60℃で30秒、エクソン5および
8は65℃、エクソン7は67℃、エクソン9〜11は68℃）、および伸長（72℃で1分）
を30サイクル行った。PCR産物を0.8％(w/v)アガロースゲル上で確認した後、Wiz
ardミニカラム(Promega)を用いて精製し、直接配列決定反応に付した。

【００３２】ｃDNA合成およびRTPCR 相補DNAは、プライマーとしてオリゴ(dT)を用い、総RNA約5μgから合成した。
総RNA(5μg)、ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤(HPRI)20U、および1μgのオリゴ
(dT)を70℃で10分間加熱した後、氷冷し、これを、1×第1鎖緩衝液(50mMTris-HC
l,pH8.3,75mM塩化カリウムおよび3mM塩化マグネシウム）、0.01M DTT、dNTP(各デオキシリボヌクレオシド3リン酸につき0.5mM）、スーパースクリプト逆トラン
スクリプターゼ（Superscript Reverse Transcriptase）(Gibco)400Uに添加し、
37℃で1時間インキュベートした。エクソン9〜11のPCRは前述の通り、PCR反応溶
液50μL中で上記インキュベーション液5μlを用いて行った。

【００３３】ヌクレオチド配列の決定配列決定用プライマー(10pmole)を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)(9.7U 、Pharmacia)および1×T4PNK緩衝液(10mMTris酢酸、10mM酢酸マグネシウムおよび50mM酢酸カリウム)を含有する反応混合物中、37℃で30分間、³²P-ATP(45μCi)
で5’末端において放射標識した。使用したプライマーは、別のセンス配列決定プライマーを5’-TAC TCC CCT GCC CTC-3’となる様に設計したエクソン5を除き
、PCRに用いたものと同一であった。配列決定はfmol DNA Sequencing System(Pr
omega)を用い、ジデオキシヌクレオチド酵素法（Sanger等,1977)により行った。
この様にして同定した突然変異型の推定配列の全てについて、アンチセンス方向
のエクソン配列決定を更に行うと共に、PCRを反復し、細胞系の配列決定を行って確認した。

【００３４】結果多くの細胞系において、p53遺伝子から発現したmRNA中に突然変異が認められた（表1を参照）。本明細書に記載した細胞系で確認された突然変異は、大部分のp53突然変異を含むことが知られているエクソン5〜8で観察された(Hollstein 等、1991)。これらの突然変異は全て、RPMI7951系のコドン166で確認されたナン
センス突然変異以外、従来より報告されているものである。これとH417のコドン
298におけるGからTへの変異は、p53遺伝子が最も高度に維持された領域内には存
在しない。OAW42卵巣癌細胞系においては、CGAからCGGへの１塩基ミスセンス突然変異はサイレントであり、突然変異３塩基はなお、野生型p53(wtp53)蛋白質中
に存在するものと同様のアミノ酸(Arg)をコードしていた。即ち、正常p53蛋白質
は細胞系の半数で発現していた。細胞系の残り半数のmRNAは、異常p53蛋白質をコードしていた。RPMI7951およびH417は停止突然変異を有しており、夫々、165 および297アミノ酸で蛋白質を切断していた。COLO320およびH322は夫々独立して
、ミスセンスのG：CからA：Tへの突然変異を同じ部位で示しており、その結果、
ArgからTrypへのアミノ酸置換が生じていた。RT112とHT29/5もまた、Argにおける（夫々、GlyおよびHisへの）変化をコードする突然変異を有していた。COLO32
0,H322およびRT112は、p53突然変異に関してホモ接合体であった。その他の突然
変異系は、ヘテロ接合度を有しているという証拠を示していた。HT29/5およびRP
MI7951は共に、野生型p53のmRNAを少量発現したのに対し、H417は比較的高濃度で発現していた。

【００３５】 CDK1およびCDK４のウエスタンブロット各ゲル上に対にして載せた各細胞系の溶解物を用いて、2つの独立したウエスタンブロットを行った。10⁷個の細胞を162cm²の組織培養フラスコ（Costar Ltd.
, High Wycombe, Bucks）中、前集密的（pre-conflunet）ではあるがなお指数的
に生育していることがフローサイトメトリーで確認されるまで生育させた。次に
、細胞をトリプシン処理により回収し、完全培地+10％FCS中に再懸濁し、連続遠
心分離で3回洗浄した後、血清無添加PBS中に再懸濁した。次に、1-3×10⁸の生存
細胞を遠心分離によりペレット化し、溶解緩衝液１ミリリットル当たり3×10⁷個
の細胞となる様に再懸濁した（保存溶液：10％ SDS 10mL、0.5M Tris pH6.8, グ
リセロール10mL, 2重蒸留水62mL。保存溶液10mLに10mMロイペプチン100mL+100mM
PMSF 10mLを添加する）。蛋白質の推定を行い、溶解液の最終濃度を、100μL当
たり総細胞蛋白質300μgとなる様に調節した。CDK1蛋白質の発現濃度を測定する
為に、ブロットを、ヒトCDK1に対するsc-054マウスモノクローナル抗体（Santa
Cruz Biotechnology, CA)と共にインキュベートし、次に、1/1000のウサギ抗マウスコンジュゲート抗体(Dako UK)と共にインキュベートした後、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルホスフェート(Sigma, Po
ole, Dorset,UK)（ジメチルホルムアミド中50mg/mL)を含有するアルカリホスファターゼ緩衝液で発色させた。CDK4蛋白質の発現濃度を測定する為に、ブロット
を、ヒトCDK4に対するsc-260ウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechno
logy, CA)と共にインキュベートし、次に、1/1000のウサギ抗マウスコンジュゲート抗体(Dako UK)と共にインキュベートした後、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルホスフェート(Sigma, Poole, Dorset,UK
)（ジメチルホルムアミド中50mg/mL)を含有するアルカリホスファターゼ緩衝液で発色させた。

【００３６】 CDK1遺伝子およびCDK4遺伝子の蛋白質産物の定量は、タングステン光による島
津製走査光学密度計で光学密度を測定することにより行い、総細胞蛋白質150μg
当たりのOD単位で表した。様々な量の総細胞蛋白質を適用して得られた滴定曲線
により、光学密度(OD)の直線関係は、細胞系を通じてCDK1蛋白質およびCDK4蛋白
質に対して見出された範囲に渡って得られることが、従来より知られている(War
enius等,1994,Browning 1997)。様々なCDK1蛋白質およびCDK4蛋白質の濃度を細胞系間で比較する為に、全ての系の平均OD値を計算し、個々の細胞系各々におけ
るCDK1蛋白質およびCDK4蛋白質に対する相対的OD値を平均OD値で規格化し、任意
値5.0を掛けた。

【００３７】調査した細胞系の結果を下記表２に示す。

【００３８】

【表２】

【００３９】これらの結果を図３および図４に示す。

【００４０】一連のヒトin vitro癌細胞系では、CDK1とCDK4の発現の間に密接な相関関係が
観察されている。多くの上記系に対するp53突然変異状態に関するDNA配列決定デ
ータを用いると、CDK1/CDK4の関連性はp53突然変異を有する細胞系で特に顕著に
見られることが更に観察された（図５および図６を参照）。

【００４１】更に驚くべきことには、上記細胞系について蛋白質発現との間に見られた相関
関係は、対応するmRNAでは見られなかった。また、一の遺伝子における蛋白質発
現と、他の遺伝子のmRNAにおける蛋白質発現との間にも、相互相関は見られなか
った。これらの結果により、CDK1蛋白質およびCDK4蛋白質が同時に上昇すること
は、転写制御レベルの段階ではなく、翻訳または翻訳後の段階で生じることが示
唆される。即ち、蛋白質自身が、何らかの方法で相互に影響し合っているか、或
いは、双方が未知の因子の影響を受けていると考えられる。

【００４２】ヒトin vitro細胞系および臨床結腸癌におけるCDK1蛋白質およびCDK4蛋白質の
相関関係に関する上記知見は、ラット正常筋上皮細胞系RAMA37へのトランスフェ
クション試験によって指示される。RAMA37を用いたプロット試験により、無条件
プロモーター制御下において、CDK4がうまくトランスフェクションしてCDK4蛋白
質が過剰に発現すると、CDK1の構成的発現が同時に上昇することが示唆された。

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒト癌細胞系におけるCDK1濃度とCDK4濃度との間の相関性、並びに、
ヒトケラチノサイトおよびヒト繊維芽細胞の様な正常細胞における上記に相当す
る濃度を示すものである。

【図２】図２は、ヒト癌細胞系において、サイクリンDとサイクリンB(各々、CDK4とCDK
1のパートナー)の濃度の間に相関性が比較的欠如していることを示すものである
。

【図３】図３は、特定のヒトin vitro細胞系で実施した幾つかのウエスタンイムノブロ
ット試験で得られたCDK1濃度の数値範囲を示す(標準誤差も併せて示す）ものである。

【図４】図４は、CDK4に関して得られた図３に相当するデータを示すものである。

【図５】図５は、p53突然変異ヒト癌細胞系におけるCDK1濃度とCDK4濃度の間の相関関係を示すものである。

【図６】図６は、野生型p53ヒト細胞系に関して得られた図５に相当する相関関係を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９８１２１５１．０ (32)優先日平成10年６月５日(1998．6．5) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９８１４５４５．１ (32)優先日平成10年７月３日(1998．7．3) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９０３０３５．５ (32)優先日平成11年２月10日(1999．2．10) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB03 BB24 CB01 CB30 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA80 FA12 FA16 FA37 FB01 FB02 FB03 FB05 FB06 FB07 FB12 FB15 GC22 GC30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験対象物の癌性状態または前癌性状態を診断する方法であ
って、該方法は、細胞またはその抽出液を含有する試料中のCDK1およびCDK4が同
時に上昇することを調べる工程を包含するものである診断方法。
【請求項２】上記試料は試験対象物から抽出されるものである請求項１に
記載の方法。
【請求項３】上記試験は、試料をCDK1に対する標識抗体および／またはCD
K4に対する標識抗体と接触させる工程を包含するものである請求項１または２に
記載の方法。
【請求項４】上記CDK1に対する抗体はsc-54（Santa Cruz Biotechnology
Inc., CA）であり、および／または、CDK4に対する抗体はsc-260（Santa Cruz B
iotechnology Inc., CA）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】上記細胞は突然変異p53細胞である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】上記突然変異p53細胞は、試料を突然変異p53に対する標識抗
体と接触させることにより同定されるものである請求項１〜５のいずれかに記載
の方法。
【請求項７】少なくとも一つの抗体は、蛍光標識で標識されているもので
ある請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】上記試験は、ウエスタンブロットを用いて行われるものであ
る請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】上記試料は細胞の試料である請求項１〜８のいずれかに記載
の方法。
【請求項１０】細胞計数を行うことにより試験を実施するものである請求
項９に記載の方法。
【請求項１１】マルチパラメーターフローサイトメトリーを用いて細胞計
数を行うものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】走査型共焦点顕微鏡検査を用いて細胞計数を行うものであ
る請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】蛍光活性化細胞分類法を用いて細胞計数を行うものである
請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】上記細胞計数を行う前に、細胞の試料を微細切断すること
によって正常組織と腫瘍組織を分けるものである請求項１０〜１３のいずれかに
記載の方法。
【請求項１５】細胞の試料を、異数性細胞標識用DNA結合染料と接触させることにより正常細胞を腫瘍細胞から分離し、次いで、標識細胞を非標識細胞と
分離するものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】上記DNA結合染料は、Hoechst 33258染料またはクロモマイ
シンA₃染料である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】上記細胞計数を行う前に、細胞試料中の細胞内接着を破壊
して単細胞の懸濁液を生成するものである請求項１０〜１６のいずれかに記載の
方法。
【請求項１８】 CDK1およびCDK4は野生型のCDK1およびCDK4である請求項１
〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】試験対象物の癌性状態または前癌性状態を診断するキット
であって、該キットは、（i）CDK1の上昇を調べる手段、および（ii）CDK4の上昇を調べる手段を包含するものであるキット。
【請求項２０】上記のCDK1の上昇を調べる手段は、CDK1に対する標識抗体
を含有し、上記のCDK4の上昇を調べる手段は、CDK4に対する標識抗体を含有する
ものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】上記CDK1に対する抗体はsc-54（Santa Cruz Biotechnolog
y Inc., CA）であり、CDK4に対する抗体はsc-260（Santa Cruz Biotechnology I
nc., CA）である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】更に、突然変異p53細胞を同定する手段を包含するものである請求項１９〜２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】上記の突然変異p53細胞を同定する手段は、突然変異p53に
対する標識抗体を含むものである請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】少なくとも一つの抗体は、蛍光標識で標識されている請求
項２０〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】更に、異数性細胞標識用DNA結合染料を含むものである請求項１９〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】上記DNA結合染料は、Hoechst 33258染料またはクロモマイ
シンA₃染料である請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】 CDK1およびCDK4は野生型のCDK1およびCDK4である請求項１
９〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】癌を診断する為に、CDK1の上昇を調べる手段を用いる方法
。
【請求項２９】癌を診断する為に、CDK4の上昇を調べる手段を用いる方法
。