DE10131382A1 - Screening-Verfahren - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung beschreibt das Verfahren, bei dem über die Bestimmung der Expression von Glykoproteinantigenen der CEACAM-Familie therapeutisch nutzbare Verbindungen identifiziert werden können, welche die Eigenschaften besitzen, frühe morphologische Vorläufer einer Krebsentstehung zu verhindern bzw. rückgängig zu machen. DOLLAR A Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen/Identifizieren und Auswahl von Verbindungen, die spezifisch die Expression von einem Gen(en) oder einem Genprodukt(en) regulieren. Insbesondere im Fall von Tumoren, wo eine Alteration der Genexpression zu beobachten ist. Diese ausgewählten Verbindungen sind in der Lage, durch Regulation der Genexpression die Apoptoserate dieser Zellen, insbesondere die Vorläuferzellen, zu erhöhen (Apoptoseresistenz erniedrigen).
Description
- Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Screenen/Identifizieren und Auswahl von therapeutisch nutzbaren Verbindung(en) durch Bestimmung der Expression von Glykoproteinantigenen der CEACAM-Familie bei An- und Abwesenheit der Verbindung(en). Diese Verbindung(en) weisen die Eigenschaften auf, frühe morphologische Vorläufer einer Krebsentstehung zu verhindern bzw. rückgängig zu machen.
- Entstehung von Tumoren am Beispiel des Kolonkarzinoms Karzinome entstehen in sukzessiven Schritten aus Normalgewebe über Zwischenformen (Normal-zu-Tumor-Transition oder Multistep-Karzinogenese). Hierzu sind genetische Veränderungen (Mutationen) beschrieben. Die Multi-Step-Karzinogenese wurde von der Gruppe um Bert Vogelstein (z. B. Fearon E. R. und Vogelstein B., Cell, 1990, 61 S. 759 ff) formuliert und hat sich seither bestätigt. Sie besagt, dass
- 1. Mehrere genetische Ereignisse notwendig sind, um die Transition vom Normal- zum Karzinomgewebe zu vollziehen.
- 2. Ein "Gatekeeper" genanntes Gen im Fall des polypösen Kolonkarzinoms (APC) den Point-of-no-return markiert, von dem aus sich eine weitere Tumorentwicklung ergibt.
- 3. Nicht nur die Zahl, sondern auch die Reihenfolge der Mutationen von Bedeutung ist. So wird das k-ras Gen häufig in hyperplastischen Läsionen (die als harmlos gelten) gefunden.
- Da es aber vor Eintritt der APC-Mutationen verändert ist, wandern die betroffenen Zellen in die Apoptose (programmierter Zelltod). Erst nach Defekt des APC bleiben k- ras-Mutationen konstant nachweisbar. Daraus ergibt sich, dass das Kriterium für die Bedeutung einer Veränderung im Zeitpunkt ihres Auftreten und in ihrer Persistenz liegt. Die Nichteinleitung der Apoptose der veränderten Zellen scheint also entscheidend für die Entwicklung des Tumors zu sein.
- Die Multi-Step-Karzinogenese setzt den funktionellen Verlust des APC-Proteins voraus. APC ist ein großes Multifunktionsprotein. Eine wichtige Funktion besteht in der Regulation der β-Cateninkonzentration in der Zelle. Dieses Protein ist mit Zelladhäsionsmolekülen assoziiert und wandert zwischen Zellmembran und Zellkern. Dort ist β-Catenin über die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern indirekt für die Aktivität verschiedener Gene verantwortlich. APC steuert den Abbau von β-Catenin. Defekte APC-Proteine können β-Catenin nicht abbauen - es kommt zu erhöhten β- Cateninkonzentrationen in der Zelle. Diese sind mit immunologischen und molekularbiologischen Standardmethoden nachweisbar. β-Catenin ist damit ein Surrogatmarker für die APC-Funktion. Siehe dazu auch Fearnhead et al., Hum Mol Gen 2001, Vol. 10, No. 7, S. 721 ff, Heppner Goss K., and Groden J., J. clin Oncol. 2000, 18, S. 1967 ff.
- APC-Mutationen, von denen weit über 700 beschrieben worden sind, werden heute als die prima causa der Tumorentwicklung im Dickdarm angesehen. APC-Mutationen werden in Dysplasien (Wucherungen mit qualitativen Veränderungen) beschrieben. In hyperplastischen Wucherungen (reine Zellvermehrung ohne qualitative Veränderungen) sind keine dauerhaften Veränderungen bekannt. Mutationen in diesen Hyperplasien (wie bei k-ras siehe oben) führen nach Stand des Wissens zur Apoptose. Auch deshalb werden hyperplastische Polypen oder hyperplastische "aberrant crypt foci" (ACF, Mikrowucherungen) als harmlos angesehen.
- APC-Mutationen werden in Hyperplasien nicht beobachtet.
- CEACAM-Familie
- Die CEACAM-Familie besteht aus 29 Genen auf Chromosom 19q. Die Glykoproteine werden in einer Vielzahl von Geweben exprimiert. Im Dickdarm kommen im wesentlichen CEACAM-1 (früher BGP oder CD66a), CEA, CEACAM-6 (früher NCA50/90 oder CD66c) und CEACAM-7 (früher CGM2) vor. Die Antigene finden sich auf der Zelloberfläche, die dem Darmlumen zugewandt ist (apikal luminale Lokalisation). Sie stellen dort einen großen Anteil der Glykocalix. Die Organisation der Glykocalix ist stark differenziert. Wie bei einem Wald bestehen die Stämme aus den Mikrovilli (apikale fingerartige Zytoplasmafortsätze), in die das CEACAM-1 fest verankert ist. Das Blätterdach wird durch die miteinander vernetzten anderen CEACAMs gebildet. Die CEACAM1-Moleküle halten über ihre zytoplasmatische Domäne Kontakt zur Innenseite der Zellmembran. Eine Signaltransduktion ist nachgewiesen.
- In kolorektalen Karzinomen ist die Expression der CEACAMs stark verändert. CEACAM-1- und CEACAM-7-Expression ist stark erniedrigt oder geht gänzlich verloren, während CEA und CEACAM-6 teils stark überexprimiert werden (Dysregulation oder Alteration der CEACAM-Expression). Das Ungleichgewicht führt zu einer Veränderung in Proliferation und Differenzierung der Schleimhautzellen des Kolons. Auch in Karzinomen anderer Gewebe z. B. Speiseröhre, Magen, Brustdrüse, Lunge sind Veränderungen in der CEACAM-Expression beobachtet worden.
- Die Dysregulation ist aber nicht auf Karzinome beschränkt. Sie findet sich in gleicher Frequenz (> 90% der Fälle) auch in adenomen, hyperplastischen Polypen und ACF.
- Die CEACAM-kodierenden Gene wurden auf molekulare Veränderungen hin untersucht, es wurden aber keine Änderungen gefunden.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist nun die Bereitstellung eines. Verfahrens zum Screenen/Identifizieren und Auswahl von therapeutisch nützlichen Verbindungen, die bei der präventiven Behandlung verwendet werden können.
- Insbesondere können diese Verbindungen Tumore des Gastrointestinums verhindern.
- Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Testsystems zum Screenen der Verbindungen.
- Weiterhin ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Verwendung dieser identifizierten Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Prävention der Tumorbildung bei Individuen, insbesondere solche mit Prädispositionen für eine Tumorbildung.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen/Identifizieren von therapeutisch nützlichen Verbindung(en) zur Prävention der Tumorbildung umfassend die Schritte
- - Inkubieren einer Probe, die ein Gen(e) bzw. ein Genprodukt(e) der CEACAM-Familie exprimieren mit einer oder mehreren Verbindungen
- - Bestimmen der Expression des/der Gens(e) bzw. Genprodukts(e) der CEACAM-Familie
- - Vergleich der Expression bestimmt im obigen Schritt mit der Expression in einer Probe, die in Abwesenheit der Verbindung(en) inkubiert wurde und
- - Auswahl der Verbindungen, die eine Regulation der Alteration aufzeigen.
- Verbindungen, die eine Dysregulation/Alteration der Expression von Gen(en) bzw. Genprodukt(en) regulieren können, können bei einem Therapiekonzept verwendet werden, das die Bildung von frühen Vorläuferläsionen, die zu Karzinomen führen können, verhindert.
- Man kann die Expression von Mitgliedern der CEACAM-Familie verwenden, um Substanzen zu identifizieren, welche die Expression der Antigene beeinflussen.
- Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Testsystem und KIT bereit, mit dem Verbindungen auf ihre Fähigkeiten hin untersucht werden können, die Dysregulation der Expression von Mitgliedern der CEACAM-Familie zu regulieren, z. B. auf Normalniveau zurückzuführen.
- Diese Substanzen können in pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, die Verwendung bei der präventiven Behandlung von Tumoren, insbesondere Kolonkarzinomen finden.
- Fig. 1 zeigt die Suszeptibilität (Apoptoseresistenz) der HT29 Zellen in Abhängigkeit der CEA-Expression. Durch Zugabe von gamma-Interferon wird in den Zellen Apoptose induziert. Zellen mit reduziertem CEA (linke Seite, entsprechend der Normalsituation), zeigen einen wesentlich höheren Prozentsatz an induzierter Apoptose in Vergleich zu den Zellen mit erhöhter CEA Expression (rechte Seite, wie sie in Tumorenzellen und deren Vorläufer zu beobachten ist), auf.
- Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zum Screenen/Identifizieren von Verbindungen, die die Alteration der Expression von ein oder mehreren Gen(en) und Genprodukt(en) der CEACAM-Familie spezifisch regulieren, umfassend die Schritte
- - Inkubieren einer Probe, die ein Gen(e) bzw. ein Genprodukt(e) der CEACAM-Familie exprimieren mit einer oder mehreren Verbindungen
- - Bestimmen der Expression des/der Gens(e) bzw. Genprodukts(e) der CEACAM-Familie
- - Vergleich der Expression bestimmt im obigen Schritt mit der Expression in einer Probe, die in Abwesenheit der Verbindung(en) inkubiert wurde und
- - Auswahl der Verbindungen, die eine Regulation der Alteration aufzeigen.
- Insbesondere die Expression der Mitglieder CEACAM-1, CEA, CEACAM-6 und CEACAM-7 wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt.
- Die Nützlichkeit der zu untersuchenden Verbindung als Verbindung zur Regulation der Dysfunktion/Alteration der Expression von Mitgliedern der CEACAM-Familie kann auch indirekt durch Bestimmung der Apoptosesuszeptibilität erfolgen.
- Die Bestimmung der Apoptosesuszeptibilität (Apoptoseresistenz) kann durch allgemein bekannte Methoden erfolgen, wie Färbung mit AnnexinV, Propidiumjodid oder andere.
- Eine nützliche Verwendung führt bei deren Anwesenheit dazu, das die Apoptoserate im Vergleich zu der Probe, wo die Verbindung nicht anwesend ist, erhöht ist (die Apoptoseresistenz erniedrigt ist).
- Als Methoden zum Nachweis der Expression von Gen(en) oder Genprodukt(en) können beispielhaft die Folgenden genannt werden. Diese Verfahren sind allgemein etablierte Verfahren und dem Fachmann bekannt.
- Die Expression kann immunhistochemisch in Gewebeschnitten oder Zellkulturen durch Einsatz von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Diese Antikörper können sowohl monoklonal als auch polyklonal sein. Als beispielhafte monoklonale Antikörper sind hier Antikörper gegen CEA (Klon T84.66, C1P83), CEACAM-1 (Klon 4D1C2, Klon7 und Klon4), CEACAM-6 (Klon Bu33) und CEACAM-7 (Klon Bac-2) genannt.
- Die Expression kann auch quantitativ in Gewebehomogenaten und Zellkulturlysaten nachgewiesen werden. Zur Anwendung kommen spezifische Antikörper gegen die entsprechenden Genprodukte der Mitglieder der CEACAM-Familie: Als Verfahren bieten sich Standard-Enzymimmunoassays an, wie ELISA, RIA, etc. Weiterhin bieten sich Assays auf Immunfluoreszenz-Basis an, wie FACS- Analyse etc.
- Die Expression kann ebenfalls in-situ auf mRNA-Ebene untersucht werden. Entsprechende Gen-Sonden kann der Fachmann einfach aus den publizierten Sequenzen der Mitglieder der CEACAM-Familie erhalten. Die in-situ Hybridisierung erfolgt nach Standardverfahren.
- Die Expression kann weiterhin mit Hilfe der Analyse durch Northern Blots semiquantitativ bzw. nach Densitometrie quantitativ bestimmt werden. Northern Blots können mit entsprechenden Gen-Sonden, erhalten aus den entsprechenden Sequenzen der CEACAM-Mitglieder. Der Fachmann kann die verwendbaren Gen-Sonden einfach erhalten und anwenden.
- Die Expression kann darüber hinaus über CEACAM-spezifische Primer-Oligonukleotide bestimmt werden. Diese Primer sind einfach aus den bekannten Sequenzen ableitbar und auf ihre Spezifität hin untersuchbar. Verfahren, bei denen diese spezifischen Primer einsetzbar sind, liefern (semi)quantitative Ergebnisse der Genexpression und sind ebenfalls etabliert (z. B. Real-time RTPCR mit dem LightCycler (Applied Biosystems, oder TaqMan®)
- Das Nachweisverfahren zur Bestimmung der Expression von Gen(en) bzw. Genprodukt(en) ist nicht auf die oben genannten beschränkt. Es können auch andere Verfahren verwendet werden, die einen Vergleich der Expression der Mitglieder der CEACAM- Familie in Proben bei An- und Abwesenheit der zu untersuchenden Verbindung(en) erlauben.
- Die Probe, bei der die Expression der Gen(e) bzw. Genprodukt(e) in An- und Abwesenheit der zu untersuchenden Verbindungen erfindungsgemäß bestimmt wird kann beispielhaft sein:
Eine Zellkulturlinie, z. B. HT29, A818 etc. Diese bei den entsprechenden Zentren kommerziell erhältlichen Zelllinien können in entsprechender Menge z. B. in Mikrotiterplatten ausgesät sein und werden dann für eine vorherbestimmte Zeit mit und ohne zu untersuchender Verbindung inkubiert. - Weiterhin können Zellhomogenate entsprechender Gewebe verwendet werden. Insbesondere Gewebe von Individuen, die mit der zu identifizierenden Substanz therapiert werden sollen.
- Die Verbindungen sind dadurch charakterisiert, dass sie die Dysregulation/Alteration der Expression von einem Gen(en)bzw. Genprodukt(en) eines Mitglied/Mitgliedern der CEACAM-Familie in Zellen regulieren, auf ein Niveau, wie es in Zellen vorhanden ist, die keine Dysregulation aufzeigen und
dass diese dysregulierten Zellen nach Regulation durch die Verbindung eine höhere Apoptosesuszeptibilität in Vergleich zu den Zellen aufzeigen, die nicht der Verbindung ausgesetzt waren. - Verbindungen, wie sie zum Screenen eingesetzt werden können, sind nicht besonders eingeschränkt. Sie können z. B. sein:
- - herkömmliche, pharmazeutisch aktive Verbindungen
- - DNA oder RNA-Sequenzen,
- - Peptide, wie Oligo- oder Polypeptide, insbesondere auch rekombinante CEACAM-Domänen,
- - Proteine, wie Zytokine und Antikörper,
- - Kleine Moleküle, mit einem Molekulargewicht zwischen 50 und 1000 Da.
- Diese zu untersuchende Verbindungen können als Bibliotheken vorliegen, wie sie z. B. beim Hochdurchsatzuntersuchungen eingesetzt werden. Diese Bibliotheken sind unter anderen kommerziell erhältlich.
- Die Verbindungen können als Verbindungen als solche oder als Salz vorliegen.
- Verbindungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert und ausgewählt werden, zeichnen sich dadurch aus, das sie z. B. die Expression von CEACAM-1 und CEACAM-7 heraufregulieren können. Andererseits können sie z. B. die Expression von CEACAM-6 und CEA herunterregulieren.
- Diese Regulation bewirkt, dass die Suszeptibilität der Probe gegenüber dem Ereignis der Apoptose erhöht ist (die Apoptoseresistenz ist erniedriegt), so dass die Zellen nicht weiter teilungsfähig bleiben oder ausdifferenzieren können, was bei einer verlängerten Lebenszeit der Fall sein könnte.
- Die Veränderungen in der Expression der CEACAMs stellen die frühesten permanenten Veränderungen in der Krebsentstehung dar. Diese sind mit Veränderungen in der Schleimhaut assoziiert, welche ihrerseits Mutationen in Tumorsuppressorgenen und damit die Tumorentstehung begünstigen. Die Expression von CEACAMs findet sich in den meisten Bereichen des Darmkanals, besonders im Dickdarm.
- Ein spezieller CEACAM-1-Verlust ist häufiger als APC-Mutation und tritt - bezogen auf die Tumorgeschichte - früher auf.
- Verbindungen, welche als geeignet angesehen werden, lassen sich in in-vivo Versuchen (z. B. transgene Tiere, Versuchspersonen) untersuchen. Die Wirkung von Verbindungen, welche als präventive Therapeutika in Frage kommen, lassen sich z. B. über Knipsbiopsien im Darm (oder allgemein Zielgewebe), bei denen dann die resultierenden CEACAM- Expression mit den beschriebenen Verfahren untersucht werden (Monitoring, Stratifizierung), verifizieren.
- Das erfindungsgemäße Testsystem kann ein automatisiertes Testsystem sein, welches die oben genannten Schritte durchführt. Insbesondere kann es sich um ein Testsystem handeln, das zur Hochdurchsatzanalyse geeignet ist.
- Das erfindungsgemäße Kit kann die notwendigen Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten und schließt die Probe, sowie alle notwendigen Reagenzien zur Inkubation ein.
- Die Verwendung der identifizierten Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen kann in üblichen Mengen und Dosierungen erfolgen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in den für den Verabreichungsweg üblichen Formulierungen vorliegen mit der ausgewählten Verbindung als wirksames Agens.
- Bei den prädisponierten Kreisen, bei denen ein präventive, therapeutische Anwendung der identifizierten Verbindungen besonders vorteilhaft ist, handelt es sich um Indiv, die an FAP (familial adenomatous polyposis) und HNPPC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) erkranken bzw auch bei spontanen Risikogruppen. Bei diesen Prädispositionen ist das Auftreten von Kolonkarinomen sehr wahrscheinlich.
- Aber auch in Karzinomen anderer Gewebe z. B. Speiseröhre, Magen, Brustdrüse, Lunge sind Veränderungen in der CEACAM- Expression beobachtet worden. Auch hier können die erfindungsgemäß identifizierten Verbindungen zum Einsatz kommen.
- Es wurden Frischproben von Adenomen von Patienten auf die Expression des CEACAM-1 Proteins hin untersucht,
- Dazu wurde die Gesamt-RNA aus den Proben durch ein herkömmliches Verfahren isoliert und einer Analyse mittels eines Northern Blots durchgeführt (siehe dazu Neumaier et al. PNAS, 1993, 90 (22), S. 10744 ff).
- Die Northern Blots wurden mit Hilfe der quantitativen Densitometrie und Image Analyse analysiert und die Abnahme der CEACAM-1 Expression gegenüber Normalgewebe wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 unten aufgeführt. Tabelle 1
- Mit Hilfe von Ribozym-regulierter mRNA-Expression wird der Einfluss der CEA-Protein Expression auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber der Apoptose untersucht.
- HT29 Kolonkrebs-Zellen (erhältlich von ATCC, Rockville, USA) wurden mit CEA-targeted Hammerkopf Ribozym Expressionsvektor transfiziert.
- Die Herstellung des Vektors erfolgte dabei analog wie in Schulte et al., PNAS 1996, 93, S. 14759 ff und Juhl, H., et al. 1997, JBC 272, S. 29482 ff beschrieben.
- Dabei wurden die folgenden Oligonukleotide als Ribozym sense und antisense Nukleotide verwendet.
5'-agcttTGCTCTTCTGATGAGTCCGTTAGGACGAAACTATGGAgggcc-3' (sense) und
5'-cTCCATAGTTTCGTCCTAACGGACTCATCAGAAGAGCAa-3' (antisense) - Diese wurden annealed und in den pTET Vektor, wie in Schulte et al., PNAS 1996, 93, S. 14759 ff beschrieben, ligiert. Das erhaltene Plasmid pTET/Rz2113 enthält nun CEA spezifische flankierende Bereiche am 5'-Ende (7 Nukleotide lang) und am 3'-Ende (8 Nukleotide lang). Diese schließen die katalytische Kernsequenz der Hammerkopfstruktur ein und zielt diese auf die B3 Domäne von CEA.
- Zuerst wurden die Zellen mit Hilfe des LipofectAmine Systems (Life Technologies) mit dem Vektor pUHG15-1 (Gossen and Bujard, PNAS, 1992, 89, S. 5547 ff) transfiziert, um den Zellklon HT29/tTA-5 zu erhalten. Dieser Klon zeigte die beste transaktivierte Tetrazyklinaktivität auf.
- Dieser Klon wurde dann mit den oben hergestellten Plasmid pTET/Rz2113 (10 µg) vermischt mit 1 µg pZeo (Invitrogen, San Diego, USA) cotransfiziert. Damit konnten Zeocin resistente Klone mit dem Ribozym erhalten werden. Die Klone wurden in Kultur mit 0,4 mg/ml Zeocin und 1 µg/ml Tetrazyklin selektioniert und auf eine regulierte CEA-Expression hin mit Hilfe der FACS Analyse (FACStar plus, Becton-Dickinson) untersucht. Die HT29 Zellen wurden im übrigen in IMEM Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA) versetzt mit 10% hitzeinaktiviertem foetalen Rinderserum und Glutamin bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
- Es wurde ein Klon HT29/Rz4 erhalten, bei dem die CEA Expression Tetrazyklin-abhängig reguliert wird. Diese Regulation war hier ca. 50% und beträgt im Allgemeinen mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%.
- 1 × 106 Zellen wurden geerntet, zweimal mit 300 µl kaltem PBS, pH 7,4 gewaschen und dann in 100 µl Propidiumjodid/Annexin V- FITC Doppelfärbelösung (TACSTM Annexin V-FITC Protokoll, Trevigen, Gaithersburg, USA) gemäß Herstellerprotokoll gefärbt. Sie wurden für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. 400 µl 1x Bindungspuffer wurde dann zu der Zellsuspension gegeben und die Zellen wurde innerhalb einer Stunde mit dem Durchflusszytometer analysiert.
- Die Ergebnisse der Analyse in der Fig. 1 dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Zellen mit einer erhöhten Expression, d. h. die HT29 Zellen ohne Zugabe von Tetrazyklin, so dass die Zellen ihr erhöhtes Niveau an CEA, wie es in Kolonzellen vorkommt, exprimieren, eine geringere Apoptoserate aufzeigen, wenn die Apoptose durch Zugabe von 25 U/ml gamma-interferon induziert wird. Hingegen zeigen die Zellen, bei denen das CEA spezifische Ribozym durch Gabe von Tetrazyklin induziert wurde, eine wesentliche höhere Apoptoserate auf. Die Zellen exprimieren das CEA nur reduziert, ähnlich der Situation in Normalgewebe. Die Gefahr der Transformation von Normalzellen zu Vorläuferkrebszellen durch Nichteinleiten der Apoptose wird also durch Regulation der CEACAM-Familie erniedrigt.
Claims (20)
1. Verfahren zum Screenen/Identifizieren von Verbindungen,
die die Alteration der Expression von ein oder mehreren
Gen(en) und Genprodukt(en) der CEACAM-Familie spezifisch
regulieren, umfassend die Schritte
- inkubieren einer Probe, die ein Gen(e) bzw. ein
Genprodukt(e) der CEACAM-Familie exprimieren mit
einer oder mehreren Verbindungen
- bestimmen der Expression des/der Gens(e) bzw.
Genprodukts(e) der CEACAM-Familie
- Vergleich der Expression bestimmt im obigen Schritt
mit der Expression in einer Probe, die in
Abwesenheit der Verbindung(en) inkubiert wurde
- Auswahl der Verbindungen, die eine Regulation der
Alteration aufzeigen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das/die Gen(e) bzw.
Genprodukt(e) CEACAM-1, CEA, CEACAM-6 und CEACAM-7
ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die
Expression von CEACAM-1 bestimmt wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
die Bestimmung auf RNA-Ebene erfolgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
die Bestimmung der Expression auf Proteinebene
erfolgt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei
die zu untersuchende Verbindung die Expression von
CEACAM-1 und/oder CEACAM-7 bei Anwesenheit im
Vergleich zur Abwesenheit heraufreguliert.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei
die zu untersuchende Substanz die Expression von CEA
und CEACAM-6 bei Anwesenheit im Vergleich zur
Abwesenheit herabreguliert.
8. Verbindungen dadurch charakterisiert, dass sie die
Dysregulation/Alteration der Expression von einem
Gen(en)bzw. Genprodukten) eines Mitglied/Mitgliedern
der CEACAM-Familie in Zellen regulieren, auf ein
Niveau, wie es in Zellen vorhanden ist, die keine
Dysregulation aufzeigen und
dass diese dysregulierten Zellen nach Regulation
durch die Verbindung eine höhere
Apoptosesuszeptibilität in Vergleich zu den Zellen
aufzeigen, die nicht der Verbindung ausgesetzt waren.
9. Verbindung gemäß Anspruch 8 ausgewählt aus der Gruppe
von DNA-Molekülen, RNA-Molekülen, herkömmlichen,
pharmazeutisch aktiven Verbindungen, Peptiden, wie
Oligo- oder Polypeptiden, Proteine, Zytokine,
Antikörper und kleinen Molekülen, mit einem
Molekulargewicht zwischen 50 und 1000 Da.
10. Pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend als
wirksame Verbindung ein oder mehrere Verbindungen
gemäß Anspruch 8 oder 9.
11. Verwendung der einer Verbindung, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie die
Dysregulation/Alteration der Expression von einem
Gen(en) bzw. Genprodukt(en) eines Mitglied/Mitgliedern
der CEACAM-Familie in Zellen regulieren, auf ein
Niveau, wie es in Zellen vorhanden ist, die keine
Dysregulation aufzeigen und
dass diese dysregulierten Zellen nach Regulation durch
die Verbindung eine höhere Apoptosesuszeptibilität in
Vergleich zu den Zellen aufzeigen, die nicht der
Verbindung ausgesetzt waren zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung zur präventiven
Behandlung von Tumoren.
12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Tumor ein
Tumor des Gastrointestinums ist.
13. Verwendung gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei der Tumor
ein Kolonkarzinom ist.
14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei
die Objekte eine Prädisposition für die Entwicklung
von Tumoren haben.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei
der Nachweis immunhistochemisch oder immuncytologisch
erfolgt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Verfahren
ausgewählt ist aus Immunhistochemie mit polyklonalen
oder monoklonalen Antikörper(n), Enzymimmunoassay,
Immunfluoreszenzassay, Northern Blot, Western Blot,
in situ Hybridisierung, PCR.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 15
oder 16, wobei die Probe ausgewählt ist aus den
Zelllinien HT29 oder A818 oder Zellhomogenaten
entsprechender Gewebe.
18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 15
bis 17, wobei das Screenen/Identifizieren durch
Bestimmung der Apoptosesuszeptibilät der Zellen in
einer Probe in An- oder Abwesenheit der zu
untersuchenden Verbindung erfolgt.
19. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 7 und 14 bis 16.
20. Testsystem zur Durchführung des Verfahrens gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 7 und 14 bis 16.
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| DE10131382A DE10131382A1 (de) | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Screening-Verfahren |
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| CA002452094A CA2452094A1 (en) | 2001-06-28 | 2002-06-28 | Screening method for identifying cancer therapy-relevant compounds |
| US10/482,107 US20050100903A1 (en) | 2001-06-28 | 2002-06-28 | Screening method |
| EP20020745418 EP1404874A2 (de) | 2001-06-28 | 2002-06-28 | Screening-verfahren zur identifikation von krebstherapie-relevanten verbindungen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10131382A DE10131382A1 (de) | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Screening-Verfahren |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE10131382A Withdrawn DE10131382A1 (de) | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Screening-Verfahren |
Country Status (6)
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