WO2015135894A1 - Verfahren zum testen neuroaktiver substanzen - Google Patents

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WO2015135894A1
WO2015135894A1 PCT/EP2015/054880 EP2015054880W WO2015135894A1 WO 2015135894 A1 WO2015135894 A1 WO 2015135894A1 EP 2015054880 W EP2015054880 W EP 2015054880W WO 2015135894 A1 WO2015135894 A1 WO 2015135894A1
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ictal
day
neurons
bursts
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PCT/EP2015/054880
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Olaf Schröder
Corina Ehnert
Alexandra Voss
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NeuroProof GmbH
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/5058—Neurological cells
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    • G01N33/5073—Stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing a substance for its neurological, in particular antiepileptic or anticonvulsant activity and / or optionally for further neurological activity, e.g. sedative activity. It cultivates a population of hippocampal neurons in cell culture exhibiting ictal activity, in particular spontaneous synchronized salvos of action potentials of at least 5 seconds duration, termed ictal bursts, and analyzes the ictal activity of the population before and after contact Bring the population with the substance to be tested, wherein the substance to be tested has a neurological activity, if the ictal activity differs before and after the contacting.
  • the hippocampal neurons are derived from dissociated embryonic cells, which in their stage of development correspond to cells of murine embryos on day 15 to day 18 of embryonic development, or stem cells.
  • the analysis preferably takes place on multi-electrode array (MEA) neurochips.
  • MEA multi-electrode array
  • the invention also relates to a population of such neurons on an MEA neurochip and a plurality of population of hippocampal neurons in a network in cell culture, all populations showing ictal bursts.
  • the invention also provides a computer program product and a sensor device which are suitable for use in the method according to the invention.
  • Epilepsies are neurological disorders characterized by spontaneous recurrent epileptic seizures. These epileptic seizures lead to spasmodic movements, are sometimes associated with loss of consciousness, and are associated for those affected with severe impairment of their quality of life and the consequences for their lifestyle.
  • epileptic seizures are characterized by synchronous discharges of neuronal groups in the brain. Between episodes the so-called inter-epileptiform activity can be registered in the EEG, which is characterized by "sharp waves” or “spike waves”, which are based on short synchronous neuron discharges. During the actual seizures (ictal activity) there is a rhythmic synchronous discharge of a large number of neurons, which can spread to adjacent brain regions. This discharge lasts for at least 5 s.
  • the treatment of epileptic seizures is usually in the form of anticonvulsant medications (anticonvulsants, also antiepileptic drugs).
  • TLE Temporal lobe epilepsy
  • TLE The origin of TLE is located in the hippocampus and in functionally connected brain areas, such as the amygdala and the entorhinal cortex. Neuropathologically there is a degeneration of hippocampal structures, the v.a. are due to unilateral loss of pyramidal cells in the CA1 and CA3 region and the interneurons of the dentate gyrus (Liu, Z. et al., 1994).
  • Anticonvulsants inhibit seizure susceptibility by suppressing the high-frequency action potential activity of neurons, thereby suppressing the spread of seizures to adjacent brain areas.
  • the mechanism of action of antiepileptic drugs is based on either inhibition of voltage-gated ion channels (e.g., carbamazepine, phenytoin, valproic acid) or enhancement of GABAergic transmitter transfer (e.g., benzodiazepines). But also completely new, not yet clarified mechanisms of action play a role (Levetiracetam).
  • TLE patients usually do not respond to monotherapy, which means that two or more drugs need to be combined. Nevertheless, 40-50% of patients do not get seizure-free. They are often offered a surgical resection of the epileptic tissue. Developing more effective drugs, especially for TLE patients, with a reduced side effect profile is therefore an important task. However, the etiology of epilepsy is still not fully understood, which makes the development of new drugs on target-based approaches only partially successful.
  • New epilepsy models are fundamentally enabling the development of new epilepsy drugs with new therapeutic approaches that expand the therapeutic spectrum and, in particular, help improve patient-centered treatment.
  • Models with initial status epilepticus systemic or central administration of kainic acid, pilocarpine or sustained electrical stimulation of the amygdala or hippocampus.
  • the seizures are only induced by the toxins, then propagate independently to status epilepticus.
  • Indling Increased spasm readiness due to repeated, initially sub-convulsive electrical stimulation of the hippocampus, amygdala, or entorhinal cortex.
  • the Kindling model is considered to be the most predictive animal model, but the preparation and drug testing are very labor and time consuming (Löscher, 2002).
  • animal models are very complex to perform, costly and time-consuming and require ethical review.
  • organotypic slices can be examined over a longer period of time (> 7 days). Epileptiform activities can be triggered by the addition of bicuculin or other GABA receptor antagonists. In organotypic cut cultures, a similar re-organization of the hippocampus can occur, as has also been observed in vivo (Gutierrez and Heinemann, 1999, Franck et al., 1995). However, even this technology is limited by the minimum number of tissue slices that can be obtained from an animal. Since epileptiform activity is chemically or electrically induced in the models, the predictive value for finding novel drugs is limited.
  • a typical epileptiform signal in most cortical structures lasts longer than 10 s (Heinemann, U. et al, 2006). After such an event, a period of post-ictal depression typically occurs. Thereafter inter-ictal activity begins again, characterized by short, highly synchronous potentials, which can either lead to the formation of the next epileptiform event or prevent the development of new epileptiform events.
  • the duration of inter-ictal events in humans is less than 100 ms, whereas the ictal events last several seconds (Huberfeld et al., 2011).
  • Various substances may favor or induce the generation of these epileptiform events. These include, for example, the GABA receptor modulator pentylenetetrazole, the cholinergic agonist pilocarpine (Avoli et al., 2002), or the potassium channel blocker 4-AP (Avoli and Perreault, 1987, Avoli et al., 2013).
  • Mg extracellular magnesium
  • a reduction in Mg concentration results in short electrical discharges of 60-150 ms duration comparable to inter-ictal discharges. These can be prevented by the application of carbamazepine, phenytoin or valproate.
  • the model could be clinically relevant because human epileptic seizures are also associated with a reduction in brain magnesium levels (Durlach, 1967).
  • the low Mg model has also been described in neuronal cultures of the hippocampus of postnatal 2-day-old mice (Deshpande et al, 2007, Sombati and Delorenzo, 1995). Spontaneous, lasting for several seconds bursts could be measured in individual neurons intracellularly. Simultaneous double leads showed a synchronous discharge of these epileptiform long bursts. Later it could be shown that these discharges are probably generated by pyramidal cells (Mangan and Kapur, 2004).
  • Neural cell networks can be cultured on microelectrode array (MEA) chips and provide a screening platform for the study of neuroactive substances. For this purpose, the electrical network activity of the neurons is recorded, analyzed and characterized and classified at the level of action potential patterns. Neuroactive substances modify the tissue-specific activity patterns in a specific way and can thus be characterized by their fingerprint of the network changes. This fingerprint can be evaluated by a multivariate data analysis developed by NeuroProof GmbH (Rostock, DE) which analyzes more than 200 electrical activity descriptors.
  • Rostock, DE NeuroProof GmbH
  • MEA Neurochips are available from, among others, the University of North Texas Center for Network Neuroscience (CNNS). These 5x5 cm glass chips have a central matrix with a diameter of 2 mm 2 , which includes 64 (or in another embodiment 2 x 32) passive electrodes and indium-tin interconnects that are embedded in silicone and terminate as gold-plated free electrodes , The electrode diameter is 20 ⁇ , the minimum distance between the electrodes is 40 ⁇ .
  • the MEA chips are deposited in a dissipation chamber (CNNS) on the preamplifier station (Plexon Inc, Dallas TX, USA), which contains a temperature control and 64 pre-amplifiers.
  • the extracellular action potentials are recorded using a computer-controlled 64-channel amplifier system (Plexon Inc, Dallas TX, USA) at a constant temperature of 37 ° C. After setting the threshold for the noise, action potentials of up to four different neurons can be derived from each electrode. The individual signals are separated and recorded using their action potential form using the recording software. As a result, signals from up to 256 neurons can be recorded on a 64-electrode MEA neurochip. The amplitude of the extracellular signals is in the range of 15 to 1800 ⁇ . The sampling frequency of the signals is 40 kHz. This makes it possible to analyze not only the temporal sequence of the action potentials but also their course (waveform).
  • Action potentials are continuously recorded in chronological order (spiketrains).
  • Action potentials are generated individually or in bursts (groups of rapidly successive action potentials).
  • the temporal sequence of action potentials is characteristic for the various brain tissue regions.
  • the bursts can be identified with the software NPWaveX (NeuroProof GmbH, Rostock, DE) developed by NeuroProof.
  • WO2010090285 describes a screening method for a therapeutic agent for epilepsy, in which the expression level of certain mRNA is to be determined.
  • the invention provides a method for testing a substance for its neurological activity
  • the substance to be tested has neurological activity when the ictal activity differs before and after contacting
  • hippocampal neurons are derived from dissociated embryonic, preferably non-human cells which in their developmental stage are cells of murine embryos on day 15 to day 18, preferably day 15, of embryonic development, or of stem cells, preferably human stem cells.
  • the inventors have found that when neurons are prepared and cultured from hippocampal tissue from embryonic mice on embryonic day E15 to EI8, especially E15-E16 or EI7, but especially E15, after 14-40 DIV (days in vitro), 21-35 DIV, especially after 27-34 DIV (eg 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 DIV) ictal and inter-ictal activity occurs (Figure 3).
  • the ictal activity is mainly characterized by spontaneous synchronized salvos of action potentials with a duration of at least 5 s. These are similar to the synchronous discharge of neuronal groups in epileptic events in humans and are referred to as ictal bursts, population bursts or ictal discharges. Synchronous In the context of the invention, it is indicated that at least 50%, more preferably at least 60%, preferably approximately 80-90% of the analyzed neurons have at the same time beginning salvos of action potentials, ie successive action potentials. A simultaneous start allows +/- 500 ms latency, preferably +/- 300 ms or + / 100 ms latency. Also, the end of the bursts may, as the beginning, be associated with appropriate latencies. Intermittent exposure of individual neurons involved in the population burst also occurs in synchronous population bursts.
  • a population is the group of all neurons cultivated in a cell culture vessel, the neurons forming a network with one another.
  • neurons there are other cell types in cell culture, in particular glial cells, which contribute significantly to the functionality of the neurons.
  • An analysis of the ictal activity of the population is carried out by measuring the activity of at least one neuron of the population, preferably 2, 3, 4, 5, 6 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, 50 or more, 100 or more, usually up to 256 neurons is examined. It can e.g. those neurons whose electrical activity was detected by the electrodes of an MEA neurochip.
  • the activity of all electrodes of an MEA neurochip is recorded and then those electrodes (units, this corresponds to the activity of a neuron) are selected for further analysis that meet certain minimum criteria (eg Spikerate at least 0.2 / s, Burstrate at least 6 bursts / minute).
  • certain minimum criteria eg Spikerate at least 0.2 / s, Burstrate at least 6 bursts / minute.
  • the activity of all neurons present in the population or all neurons present in a frame is examined, e.g. using imaging techniques.
  • synchronous pre-ectal bursts are preferably observed. These are characterized by a synchronous discharge of the neurons (80-100% of all neurons that also participate in the ictal discharge) in short bursts (20 ms to 1 s), followed by an activity-free interburst interval.
  • the pre-iktal bursts are different from the normal bursts of the same duration, which are not generated synchronously in any temporal sequence of neurons of the network.
  • Inter-iktal bursts have similar properties in duration and synchrony to the pre-iktal bursts described herein, but are induced by other neurons in adjacent brain regions (De Curtis and Avanzini, 2001, Cohen et al, 2002).
  • Pre-ictal discharges occur a few seconds before the ictal discharges and in the same neuronal regions (Huberfeld et al, 2001).
  • the synchronous ictal discharges are preferably followed by a longer lasting phase (> 5 s) of very low activity with only isolated action potentials or bursts ( ⁇ 1 Hz).
  • This phase corresponds to post-ictal depression (Heinemann et al., 2006).
  • pre-ictal activity and / or post-ictal depression are preferably also analyzed.
  • the demonstrated inter-iktal and ictal activity of the hippocampal neurons is comparable to in vivo single-tubal hippocampal derivations of rats in which epileptiform activities were induced by the administration of pilocarpine (Grasse et al, 2013). It is described here that interneurons have a very synchronous action potential discharge minutes before the onset of epileptiform activity. The action potential rate increases shortly before the onset of ictal activity. The high synchronicity of the neuronal electrical activity underlying the events is probably due to a reduction of synaptic inhibition in the involved brain regions (Dichter and Ayla, 1987.
  • the neurological activity to be studied in the method according to the invention may include, for example, sedative activity, anxiolytic activity, antidepressive activity, mood-stabilizing or mood-enhancing activity, antipsychotic activity, concentration-increasing activity, attention-increasing activity, memory activity. improving activity, analgesic activity, especially preventive or therapeutic against migraine, and / or anticonvulsant activity.
  • the neurological activity is anticonvulsant activity.
  • antiepileptic activity and anticonvulsive activity are used interchangeably.
  • the inventors were able to show that the duration of the ictal bursts (> 5 s) can be reduced in a concentration-dependent manner by application of anticonvulsants such as carbamazepine or valproate (FIGS. 4, 5). A reduction in the duration of the population bursts is therefore indicative of anticonvulsive activity. Sedative properties, e.g. are characterized by a reduction in general network activity, such as spike rate ( Figure 5).
  • the hippocampal neurons used are derived from stem cells or from dissociated embryonic cells which at their stage of development correspond to cells of murine embryos on day 15 to day 18, in particular day 15, 16 or 17, most preferably day 15, of embryonic development.
  • the age of the embryos was determined and documented by means of a catalog for the age determination of embryos of the respective species (Kaufmann, 1992, Schambra, 2008).
  • embryonic cells from mouse, rat, rabbit, guinea pig, pig or monkey are used.
  • the embryonic cells may also be stem cells, such as human stem cells (eg from dead or aborted embryos.)
  • they are non-human embryonic stem cells, eg from mouse or rat,
  • non-embryonic stem cells may also be used, eg stem cells from patient material or so-called induced pluripotent stem cells.
  • Dissociated in this context means: After preparation of the hippocampi of the embryo, the tissue is minced and the cells are dissociated, i. Tissue assembly of cells is resolved in vitro prior to culture. The resulting cell suspension is cultured.
  • the neurons can be derived from cells from the hippocampus of mouse embryos on day 15 to day 18 of embryonic development, preferably on day 15 to day 16, more preferably on day 15.
  • Hippocampi for neuronal cell cultures in the prior art are usually prepared in mice on embryonic day El 8 or E17, because on these late embryonic days the formation of the pyramidal neurones has been completed, but the formation of the dentate gyrus granule cells has not yet begun (Banker and Cowan, 1977).
  • the hippocampus is morphologically well characterized by its specific stratification (Grove and Tole, 1999). Morphologically, the hippocampus can be well separated from the surrounding cortex from the embryonic day E15. Preferably, the embryonic stage of development in which the cells are prepared, characterized in that the embryos already have a beginning layering of the hippocampus. Different molecular markers allow a specific differentiation of the different layers postnatally. Two of the markers can be used to detect stratification of the hippocampus on El 5.5 (Grove and Tole, 1999). When tissue from the hippocampal region is taken from El 2.5 and cultured, the markers can be detected in vitro after 3 days.
  • mice The gestation of mice is 18-21 days; from rats 21 to 23 days.
  • the development of the rat is about 1 day slower than that of the mouse.
  • rat embryos the corresponding stage of development is thus reached about 1 day later.
  • cells of rat embryos which have been prepared on E15-E19, preferably El6-17 or El8, most preferably on El6.
  • the mean duration of the bursts after 28 days of in vitro cultivation is between 100 and 400 ms.
  • An example of the typical activity pattern of such neural networks is shown in FIG.
  • 57.1% of the populations of hippocampal neuron cultures prepared on day E15 have ictal activity in the form of at least 5 s of population bursts. This proportion decreases on later prepared cultures.
  • At E16 only about 12.4% of the populations show this activity, at E17 it is 15% and at El8 only 6% of all populations of hippocampal neuron cultures.
  • the neurons are derived from stem cells, in particular embryonic stem cells or neuronal stem cells.
  • stem cells in particular embryonic stem cells or neuronal stem cells.
  • human stem cells can be used, which were preferably not obtained by destruction of human embryos.
  • Pluripotent stem cells can be obtained from human neuroectoderm tissue from patients and differentiated into cerebral organoids, which in addition to other cerebral structures, also the formation of hippocampal tissue could be shown (Lancaster et al, 2013). Hippocampal tissue may be removed from the organoids, dissociated, and further cultured on suitable substrates, preferably microelectrode arrays, preferably at an early stage of differentiation to examine ictal activity.
  • This embodiment is of particular interest for the production of human hippocampal neuronal cultures. It is also possible to differentiate human pluripotent stem cells via embryoid bodies into specific neurons of the hippocampus (granule cells) (Yu et al., 2014).
  • the neurons used can be prepared by a) predifferentiating stem cells in a three-dimensional cell aggregate (cerebral organoid) comprising at least two regions corresponding to different brain regions, one of which corresponds to the hippocampus and
  • a planar support e.g. an MEA neurochip further cultured to form a neuronal cell culture in which the cells form a neural network and have electrical activity specific to the hippocampus.
  • Three-dimensional means in connection with the invention that the cells not only grow in one plane, but also form three-dimensional structures. As a result, morphologically and physiologically different structures are formed.
  • Appropriate measures (Lancaster et al, 2013, Yu et al, 2014) can be used to produce three-dimensional cell aggregates comprising at least two regions corresponding to different brain regions, i.a. the hippocampus.
  • Simple three-dimensional cell aggregates are the spheres known in the art, but more complex organoids can also be used which are also known in the art. Both are referred to as cerebral organoid in the context of the invention.
  • brain regions are referred to in the invention: hippocampus, cerebellum, midbrain, striatum, amygdala, brain stem, thalamus, hypothalamus, basal ganglia, spinal cord, cortex, subcortical nuclei, olfactory bulb, optic nerve, retina, dorsal root ganglia and pituitary gland.
  • the cells are taken from the cerebral organoid at one stage, in which they are already terminally differentiated neurons, and also their direct progenitor cells. Cells act as the plasticity is increased to form a neural network with electrical activity. The neuron type is already defined. The time of collection is optimized so that especially many cultures produced have ictal activity. Typically, this will be done early, ie before the time of complete differentiation.
  • the region corresponding to the hippocampus, from which the cells in b) are taken, has at least one molecular marker for this brain region.
  • molecular markers for this brain region. Examples are parvalbumin, cholecystokinin, somatostatin, calretinin, NRP2, DZF9, PROX1.
  • One or more such molecular markers may be, e.g. after staining with fluorescently labeled antibodies or at the RNA level, to identify the hippocampus organoid.
  • the stem cells may comprise a detectable transgene, wherein the transgene is operably linked to a promoter which causes expression of the transgene in the hippocampus.
  • a suitable detectable transgene is e.g. the green fluorescent protein (GFP), or similar singular proteins, RNA or DNA markers, or a labeled cell type-specific fusion product such as e.g. GFP or His or similar markers fused to cell-type specific proteins, RNA or DNA.
  • GFP green fluorescent protein
  • Plasmid constructs can be integrated into the undifferentiated iPS cells, e.g. by viral transduction or transfection, thus resulting in cell type and differentiation stage specific cell labeling. This marks a defined region within the organoid.
  • multiple regions can be labeled simultaneously, with distinguishable detectable transgenes should be used.
  • a detection of the transgene is used to select the cells to be removed.
  • the promoters of the aforementioned markers can be used therefor.
  • the region corresponding to a particular brain region from which the cells in b) are taken may be identified upon removal by infrared spectroscopy.
  • the region may be identified microscopically visually by morphological and anatomical structural relationships.
  • Selection of the correct region can be verified after collection and culture by comparing the electrical activity of the cell culture with typical neuronal cell cultures from the hippocampus. Alternatively, in this way, the particular brain region can be identified retrospectively.
  • the cells are cultured for about 14 to 40, about 21 to 35, preferably for 27 to 34 days in vitro.
  • the culture is carried out under physiological conditions, ie, for example, at 37 ° C. at atmospheric humidity suitable for cell culture and C0 2 content in a medium suitable for the culture of neuronal cells of the corresponding species.
  • the substrates for the cells are pretreated with poly-D-lysine to optimally promote the adhesion and growth of the neurons.
  • the further division of the glial cells is inhibited by the addition of mitotic inhibitors (eg fluoro-deoxy-uridines, uridine). This requires a balanced ratio of neurons and glial cells after about 4-5 weeks in culture.
  • mitotic inhibitors eg fluoro-deoxy-uridines, uridine
  • a partial medium change is made about twice a week, with this should be done with minimal impairment of the culture.
  • the cultivation is carried out on substrates which are later used directly for the analysis of the activity, without the cells having to be detached and applied to new substrates.
  • the cells are only introduced into a measuring device whose conditions are adapted to those during the 4-week cultivation period.
  • the cultivation preferably takes place on microelectrode array (MEA) neurochips.
  • MEA microelectrode array
  • other means of analysis and culture may be used, e.g. Ca-imaging after culturing in classical cell culture dishes or coverslips or in multi-well format chips.
  • the population of hippocampal neurons used for testing is obtainable by a method comprising steps or consisting of steps of
  • hippocampal tissue of a preferably non-human (e.g., murine) embryo at a developmental stage that dissects a murine embryo on day 15 to day 18, especially day 15, which corresponds to embryonic development;
  • cultivating the cells wherein the cultivation is preferably for 4 to 40 days weeks, more preferably for about 27 to 34 days.
  • Culturing takes place, for example, in serum-containing DMEM medium with 30 mM glucose at a cell density of about 0.5-2 ⁇ 10 6 , preferably about 1.0 ⁇ 10 6 .
  • 300 ⁇ of this cell suspension are transferred to the electrode field on the MEA neurochips.
  • each 100 .mu.l feed cells are applied to the electrode field, which serve to condition the networks, but can not form any physical contacts with the neurons to be analyzed.
  • the population of neurons analyzed when analyzed with an MEA chip typically comprises between at least 6 and a maximum of 256, usually between 10 and 50 cells. In addition to the analyzed cells, there are other, non-electrically active cells in the culture, which fulfill important functions for the maintenance of the functions of the neurons.
  • the total number of cells in a network on an MEA electrode field is approximately 300,000.
  • the neurons in the cultures form networks with neighboring neurons.
  • a communication of the neurons of a network takes place via synapses or gap junctions.
  • the characteristics of this network communication can be analyzed with a variety of features based on the electrical activity of individual neurons. These features describe the synchrony and connectivity of the networks and their pharmacological influence.
  • the ictal bursts in the population of hippocampal neurons can take place without chemical, electrical or physical induction. Accordingly, no chemical, electrical or physical induction of an ictal activity is preferably carried out, in particular no reduction of Mg, no addition of hyaluronidase, no addition of substances such as picrotoxin or bicuculin which modulate receptors or ion channels or synaptic transmission, no direct or Chronic subliminal electrical stimulation (kindling), no temperature drop, and no genetic change.
  • the method according to the invention offers a more promising screening model for the preclinical development of new antiepileptic drugs, since it is intended to reverse a pathophysiologically chronic condition without prior stimulation or chemical induction. With such a phenotypic approach, it should be possible to multiparametrically investigate the effects of antiepileptic substances.
  • the neurons are brought into contact with a substance to be tested.
  • a substance may be an already known neurologically active drug (eg as a control or to further characterize the properties or the interaction with other drugs), but it may also be a substance with a hitherto unknown neurological spectrum of activity.
  • the substance may be, for example, a low molecular weight molecule ( ⁇ 900 g / mol), a protein, a peptide, a lipid, a sugar, an antibody, nanoparticles and / or another molecule.
  • the contact with the substance to be tested and the analysis of the effects can take place in any period.
  • it is also possible to analyze after addition of the substance to be tested at one (or more) specific time eg after 1 min to 14 d or after about 1 min, after about 2 min, after about 3 min, after approx. 5 min, approx. 10 min, approx. 15 min, approx. 30 min, approx. 45 min, approx. 1 h, approx. 2 h, approx. 3 h, approx. 5 h, after approx. 12 h, after approx. 24 h, after approx. 48 h, after approx.
  • the substance may remain in contact with the cells the entire time by being re-added each time the medium is changed or after a certain time, e.g. by changing medium, again removed, e.g. be diluted out. In one embodiment of the method according to the invention, it is thus also possible to carry out chronic examinations of substances, their mechanisms of action and their effects.
  • the duration of the analysis is at least about 10, preferably at least 20, most preferably at least 30 minutes in order to obtain the most meaningful results possible.
  • a continuous analysis is done.
  • the analysis of the ictal activity can be carried out, for example, with microelectrode array (MEA) neurochips or with a calcium-based imaging (Ca imaging).
  • MEA neurochips are particularly useful for examining the electrical activity of individual neurons in their overall network structure to investigate properties such as the shape and duration of bursts, synchronicity, refractory time between bursts, and so forth.
  • MEA neurochips can be used in a multiwell format for high throughput screening.
  • Ca-imaging is particularly useful if you want to study the activity of all cells (including electrically non-active glia or those neurons that are not in close proximity to an electrode).
  • ictal and inter-ictal activity are preferably analyzed in the inventive method, eg occurrence and duration of interburst intervals, the percentage of spikes in bursts relative to the total number of all spikes, the number of population bursts per unit time, the average number of spikes per burst, features describing the synchrony and connectivity of the neurons of a network, such as coefficients of variation of activity per unit time in different neurons or measures based on information entropy, occurrence, and Frequency of pre-acute bursts and / or the presence and duration of post-ictal depression.
  • the number of bursts and spikes before and after the iktal bursts in relation to the averaged spike and burst rates is set in relation here.
  • the method according to the invention is carried out as a high-throughput method, preferably in a multiwell format.
  • analyzes of at least about 24-48 substances can be carried out in individual concentrations.
  • the said period relates only to the steps b-d of the method according to the invention.
  • a substance is formulated in which a desired neurological activity, e.g. anticonvulsant activity, has been found in a pharmaceutical composition.
  • a desired neurological activity e.g. anticonvulsant activity
  • a pharmaceutical composition e.g. a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention also relates to the use of a substance whose desired neurological, e.g. anticonvulsant activity has been identified in a method of the invention for the treatment of a disorder in which this neurological activity relieves or alleviates a patient's discomfort.
  • a substance whose desired neurological, e.g. anticonvulsant activity has been identified in a method of the invention for the treatment of a disorder in which this neurological activity relieves or alleviates a patient's discomfort.
  • an anticonvulsant substance becomes e.g. used for the treatment of epilepsy.
  • a combination with other anticonvulsant substances is possible.
  • the invention relates to a population of hippocampal neurons in cell culture exhibiting ictal activity, in particular spontaneous synchronized salvos of action potentials with a duration of at least 5 s, which are referred to as ictal bursts, wherein the hippocampal neurons of dissociated embryonic, preferably non- human, in particular murine, cells which in their developmental stage are derived from cells of murine embryos on day 15 or day 16, preferably day 15, of embryonic development, or of preferably human stem cells, the population being on an MEA neurochip. Not all populations of hippocampal neurons produced as described above show ictal activity. However, it may be advantageous to select those populations which have ictal activity prior to testing.
  • the invention therefore also relates to a multiplicity of populations of hippocampal neurons in cell culture, the populations being selected such that all populations show ictal bursts (within a control period of at least 2 h), the hippocampal neurons of embryonic cells, the at their stage of development, murine cells on day 15 to day 18 correspond to embryonic development, or are derived from stem cells.
  • a plurality comprises at least 6, preferably at least 10, at least 20, at least 50 or at least 100 populations.
  • Each population is preferably located on an MEA neurochip or other format suitable for high throughput screening (multiwell MEA chips, multiwell plates for calcium imaging).
  • a method according to the invention only such populations are brought into contact with a substance to be tested, which have ictal activity, in particular ictal bursts.
  • all populations are contacted with the substance to be tested but only data from populations that have ictal activity are analyzed. The physical discarding of populations that do not have ictal activity is therefore not important.
  • a subject of the invention is also a computer program product or a sensor device for analyzing the ictal activity of a population of neurons in a network in cell culture, wherein the computer program product or the sensor device in use, the temporal succession of all action potentials of a plurality of neurons in terms of duration and / or Frequency of ictal bursts is analyzed, optionally including interburst interval,% spikes in bursts, burst event rate, burst spike count, spike simplex (descriptive of the connectivity and complexity between neurons of a network), inter-ical events and / or post-ictal Depression will be analyzed.
  • the computer program product according to the invention is particularly suitable for enabling a multivariate data analysis on the basis of a plurality (> 200) of activity descriptive features of the neurons electrical activity, which show the activity of the neurons with respect to the general activity, characteristics of the bursts, regularity of the bursts and synchronicity, and Characterize connectivity of networks.
  • Commercially available computer programs allow only a limited number of analyzes.
  • the definition of the bursts can be adjusted individually depending on the electrical activity of the neurons.
  • the computer program product can be stored on a data medium.
  • the sensor device comprises a sensor, for example an MEA neurochip and / or a recording device for passing on the data obtained from the sensor.
  • the sensor device further comprises a device for processing the data. This can be controlled by the computer program product.
  • a hardware implementation is conceivable.
  • the sensor device preferably also comprises means for outputting and / or storing the data.
  • Fig. 1 Sectioning and preparation of the hippocampus from the cerebrum of embryonic mice. 1. Half of the brain (from the inside) 2. Lift the hippocampus 3. Separate the hippocampus
  • Fig. 2 Activity pattern of a network of hippocampal tissue prepared on embryonic day El 8. The distribution of the action potentials of the hippocampal neurons is diffuse, action potentials occur both individually, but preferably in bursts (salvos of successive action potentials). Shown is an excerpt of 80 seconds from the total record of the action potentials of 22 neurons. Each line represents the activity of a neuron.
  • Fig. 3 Spontaneously occurring action potentials of a network of 19 neurons of a hippocampus culture prepared on day E15.
  • the network is characterized by very long (> 5 sec) synchronous discharges or ictal bursts of neurons, designated B. These population bursts are followed by a prolonged period of inactivity (post-iktal depression) (designated C). Before beginning a burst of population, highly synchronous short bursts corresponding to pre-ectal activity (designated A) occur.
  • Fig. 4 Recording of the action potentials of a network of hippocampal neurons prepared at E17 according to DIV28.
  • the activity is characterized by ⁇ 9s continuous synchronous population bursts. Upon completion of a population burst, a short period of inactivity is evident (A). An application of 10 ⁇ carbamazepine did not reduce the length of these population bursts (B). An application of 50 ⁇ carbamazepine to the same network prevented the long population bursts. All neurons are still active and generate short bursts (C). Shown are the timestamps (spikes) of 10 neurons over a period of 80 s each.
  • FIG. 6 Comparison of the influence of carbamazepine on 14 activity-describing features in neuronal networks of the hippocampus, prepared on day E15 (green bars) and on day E1 8 (gray bars).
  • Fig. 7 Comparison of the effects of 500 mM valproate on the normal ( ⁇ 5 s) bursts and the long, ictal bursts (> 5 s) for the same Hc network.
  • the cells were prepared from embryonic mice on E15 and after 28 DIV activity was measured for MEAs.
  • the short and ictal bursts were determined using different burst detection methods and analyzed separately. Shown are the relative changes after administration of 500 mM valproate in 9 features. While valproate hardly affects the normal bursts, significant effects in the population bursts can be seen.
  • a time-mated mouse was sacrificed by cervical dislocation on the calculated embryonic day E15, the peritoneum (peritoneal) opened, the uterus cut free and the embryos removed and transferred to a Petri dish with preparation medium.
  • the embryos were removed one after the other from the uterus and the fetal membranes and transferred to a separate Petri dish with preparation medium.
  • the age of the embryos was determined by means of a catalog for the age determination of mouse embryos and documented. After decapitation of the embryos, the heads were transferred to a new Petri dish with preparation medium. Using a fine pair of tweezers, the entire cerebrum was prepared and transferred to a new Petri dish with preparation medium.
  • the enzymatic comminution was carried out by incubation in 3 ml papain and 50 ⁇ DNase C0 2 incubator at 37 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the tissue-enzyme mixture was centrifuged for 4 min at 800 rpm. The supernatant was carefully withdrawn with a serological pipette and discarded. The cell pellet was titrated with a 5 ml serological pipette until the cell suspension appears cloudy. Thereafter, the centrifuge tube was allowed to stand for 5 minutes to allow larger cell aggregates to settle. The supernatant was then transferred to a new 50 ml centrifuge tube and processed further. The cell count was determined by means of a Neubauer counting chamber and the cell number was adjusted. Each electrode field was given a drop of 300,000 cells each. In addition, one drop of 100,000 cells was added to each electrode field as a feeder area to condition the cells.
  • the cell suspension was applied to the electrode pads of MEA neurochips previously treated with poly-D-lysine and laminin for better attachment of the cells.
  • the MEA neurochips with the cell suspension drops were incubated in the incubator, after 2 h the chips were filled in each case with 3 ml of cell culture medium (DMEM).
  • DMEM cell culture medium
  • the cultivation takes place in an incubator at 37 ° C and a C0 2 content of 10%.
  • the cells were fed every 3-4 days by replacing 1/3 of the medium with fresh medium.
  • antimitotic treatment was performed by adding 17 ⁇ FDU (fluoro-deoxy-uridines) and 41.3 ⁇ uridines to the culture medium.
  • the two antimitotics were gradually removed with each further change of medium.
  • the electrical activity of the cultured neurons was examined. Electrical activity was already detectable after 7 days in vitro. The activity can be analyzed after 7d or later, eg after about 14 d, after about 21 d or preferably after about 27 or 28 d.
  • Valproic acid (valproate) is used clinically in anticonvulsive treatment.
  • the substance also has sedating side effects.
  • the effects of valproate on hippocampal networks prepared on day E15 are shown in FIG.
  • the network showed significant population bursts lasting 16.2 s.
  • An application of 2 mM valproate induced a 41% reduction in the duration of population bursts to 9.7 s.
  • the duration of normal, physiological bursts hardly changed (control: 300 ms, 2 mM valproate: 272 ms).
  • burst spike number the area under the bursts and the number of spikes in the bursts (burst spike number) decreased specifically with the long bursts of population after addition of valproate. Also the shape of the Bursts had changed in a specific way with the population bursts and the normal bursts. Population bursts showed an increase in bursts with multiple spike maxima, whereas normal bursts showed a decrease in multiple spike maxima. The burst event rate decreased with 2 mM valproate.
  • substances can be distinguished according to their sedating and anticonvulsant properties by features such as decreasing the duration of the population bursts, burst area and burst spike number, burst shape multi (fraction of bursts where multiple peak frequencies occur), or syn all mean Markers for anticonvulsant activity and decrease in spiking rate and burstrate can be used as markers for sedative effects.
  • Vedunova M. (2013). Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen einer Substanz auf ihre neurologische, insbesondere antiepileptische bzw. antikonvulsive Aktivität und/oder gegebenenfalls auf weitere neurologische Aktivität, z.B. sedierende Aktivität. Dabei kultiviert man eine Population von hippocampalen Neuronen in Zellkultur, welche iktale Aktivität, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, zeigt, analysiert die iktale Aktivität der Neurone vor und nach dem in Kontakt Bringen der Population mit der zu testenden Substanz, wobei die zu testende Substanz eine neurologische Aktivität aufweist, wenn die iktale Aktivität sich vor und nach dem in Kontakt Bringen unterscheidet. Die hippocampalen Neuronen sind von dissoziierten embryonalen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 bis Tag 18 der Embryonalentwicklung entsprechen, oder von Stammzellen abgeleitet. Dabei findet die Analyse bevorzugt auf Multielektroden-Array (MEA)-Neurochips statt. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Population derartiger Neuronen auf einem MEA-Neurochip und eine Vielzahl von Population von hippocampalen Neuronen in einem Netzwerk in Zellkultur, wobei alle Populationen iktale Bursts zeigen. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computerprogrammprodukt und eine Sensorvorrichtung, welche zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.

Description

Verfahren zum Testen neuroaktiver Substanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen einer Substanz auf ihre neurologische, insbesondere antiepileptische bzw. antikonvulsive Aktivität und/oder gegebenenfalls auf weitere neurologische Aktivität, z.B. sedierende Aktivität. Dabei kultiviert man eine Population von hippocampalen Neuronen in Zellkultur, welche iktale Aktivität zeigt, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, und analysiert die iktale Aktivität der Population vor und nach dem in Kontakt Bringen der Population mit der zu testenden Substanz, wobei die zu testende Substanz eine neurologische Aktivität aufweist, wenn die iktale Aktivität sich vor und nach dem in Kontakt Bringen unterscheidet. Die hippocampalen Neuronen sind von dissoziierten embryonalen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 bis Tag 18 der Embryonalentwicklung entsprechen, oder von Stammzellen abgeleitet. Dabei findet die Analyse bevorzugt auf Multielektroden- Array (MEA)-Neurochips statt. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Population derartiger Neuronen auf einem MEA-Neurochip und eine Vielzahl von Population von hippocampalen Neuronen in einem Netzwerk in Zellkultur, wobei alle Populationen iktale Bursts zeigen. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computerprogrammprodukt und eine Sensorvorrichtung, welche zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.
Epilepsien sind neurologische Erkrankungen, die durch spontan auftretende, wiederkehrende epileptische Anfälle charakterisiert sind. Diese epileptischen Anfälle führen zu krampfartigen Bewegungen, gehen teilweise mit Bewusstseinsverlust einher, und sind für die Betroffenen mit starken Beeinträchtigungen ihrer Lebensqualität und daraus resultierenden Folgen für ihre Lebensweise verbunden.
Auf neuronaler Ebene sind epileptische Anfälle durch synchrone Entladungen von Neuronengruppen im Gehirn gekennzeichnet. Zwischen den Anfällen kann im EEG die sogenannte inter-iktale (epileptiforme) Aktivität registriert werden, die durch„sharp waves" (scharfe Wellen) oder „spike waves" (spitze Wellen), beruhend auf kurzen synchronen Neuronenentladungen, charakterisiert ist. Während der eigentlichen Anfälle (iktale Aktivität) kommt es zur rhythmischen synchronen Entladung einer Vielzahl von Neuronen, die sich auf angrenzende Hirnregionen ausbreiten kann. Diese Entladung dauert mindestens 5 s an. Die Behandlung epileptischer Anfälle besteht zumeist in der Gabe Krampf unterdrückender Medikamente (Antikonvulsiva, auch Antiepileptika).
Die Temporallappenepilepsie (TLE) stellt mit einem Anteil von 40% die häufigste Form fokaler Epilepsien dar. Die TLE ist nur schwer medikamentös behandelbar und stellt eine Form der Epilepsie mit einer sehr hohen Zahl pharmakoresistenter Patienten dar. Oftmals führen bei deren Behandlung nur chirurgische Eingriffe zum Erfolg.
Der Ursprungsort der TLE liegt im Hippocampus und in funktionell verbundenen Hirnarealen, wie beispielsweise der Amygdala und dem entorhinalen Kortex. Neuropathologisch kommt es zur Degeneration hippocampaler Strukturen, die v.a. auf einseitige Verluste von Pyramidenzellen in der Region CA1 und CA3 und der Interneurone des Gyrus dentatus zurückzuführen sind (Liu, Z. et al, 1994).
Antikonvulsiva hemmen die Krampfbereitschaft über eine Unterdrückung der hochfrequenten Aktionspotenzial-Aktivität der Neurone, wodurch die Ausbreitung der Anfälle auf benachbarte Hirngebiete unterdrückt werden soll. Der Wirkmechanismus antiepileptisch wirksamer Medikamente beruht entweder auf einer Hemmung spannungsgesteuerter Ionenkanäle (z.B. Carbamazepin, Phenytoin, Valproinsäure) oder auf der Verstärkung GABAerger Transmitterübertragung (z.B. Benzodiazepine). Aber auch völlig neue, noch nicht aufgeklärte Wirkmechanismen spielen eine Rolle (Levetiracetam).
Alle bisher entwickelten Medikamente wirken auf die epileptischen Anfälle nur dämpfend, ohne ihre Ursachen zu beeinflussen. Da die pharmakologische antiepileptische Behandlung chronisch und meist lebenslang erfolgt, ist sie mit erheblichen Nebenwirkungen für die Patienten verbunden.
TLE Patienten sprechen meist nicht auf eine Monotherapie an, was dazu führt, dass zwei oder mehr Medikamente kombiniert werden müssen. Trotzdem werden 40-50% der Patienten nicht anfallsfrei. Ihnen wird häufig eine chirurgische Resektion des epileptischen Gewebes angeboten. Die Entwicklung wirksamerer Medikamente, insbesondere für TLE Patienten, mit einem verringerten Nebenwirkungsprofil ist daher eine wichtige Aufgabe. Allerdings ist die Äthiologie der Epilepsie noch nicht vollständig aufgeklärt, was die Entwicklung neuer Medikamente auf Target-basierten Ansätzen nur bedingt erfolgreich werden lässt.
Zur Untersuchung der Wirksamkeit neuer antiepileptischer Substanzen werden bisher bevorzugt chronische Tiermodelle eingesetzt, da sie eine höhere Prädiktivität für die klinische Effektivität besitzen als solche Modelle, in denen Epilepsien künstlich induziert werden.
Aufgrund der großen Heterogenität und Komplexität der Epilepsie-Entstehung beim Menschen kommen bei der Testung neuer antiepileptischer Substanzen immer mehrere Tiermodelle parallel zum Einsatz, um das komplette therapeutische Potenzial der Substanzen abzuschätzen (Bialer, M. und White, S., 2010). Neue Modelle für die Epilepsie ermöglichen grundsätzlich die Entwicklung neuer Epilepsiemedikamente mit neuen therapeutischen Ansätzen, die das therapeutische Spektrum erweitern und insbesondere helfen, die patientenorientierte Behandlung zu verbessern.
Drei in vivo Modelle finden derzeit für die Untersuchung antiepileptischer Wirkstoffe zur Behandlung der TLE Anwendung:
(1) Modelle mit initialem Status epilepticus: systemische oder zentrale Applikation von Kainsäure, Pilocarpin oder nachhaltige elektrische Stimulierung der Amygdala oder des Hippocampus. Die Anfälle werden durch die Toxine nur induziert, propagieren sich dann selbständig zum Status epilepticus.
(2) indling: erhöhte Krampfbereitschaft durch wiederholte, anfänglich sub-konvulsive elektrische Stimulierung des Hippocampus, der Amygdala oder des entorhinalen Kortex.
(3) Erhöhung der Körpertemperatur junger Ratten: Durch schrittweise Erhöhung der Körpertemperatur mit warmer Luft können bei jungen Ratten Anfälle induziert werden.
Das Kindling-Modell gilt als das prädiktivste Tiermodell, die Präparation und die Wirkstofftestung sind aber sehr arbeits- und zeitintensiv (Löscher, 2002).
Generell sind Tiermodelle sehr aufwändig durchzuführen, kosten- und zeitintensiv und bedürfen einer ethischen Prüfung.
Deshalb sollten neue Wirkstoffe möglichst früh in der präklinischen Entwicklung mit prädiktiven in vitro Modellen untersucht werden, um die Zahl falsch positiver Substanzen zu minimieren. Daher ist ein solch hoch prädiktives in vitro Testverfahren ein bedeutender Fortschritt für die Entwicklung neuer AEDs und ihrer Kombinationen. Ein Modell, welches epileptische Anfälle bereits in vitro in ihren Wirkungsweisen nachbildet und die Untersuchung einer Vielzahl von Parametern mit phänotypischen Methoden erlaubt, wäre ein wichtiger Meilenstein für die präklinische Entwicklung neuer Antikonvulsiva.
Folgende Kriterien sollte ein Screening-Assay in der frühen präklinischen Wirkstoff-Findung für neue Antikonvulsiva erfüllen: niedrige Kosten pro Datenpunkt
hohe Prädiktivität: wenig falsch-negative Substanzen
geringe Zahl falsch-positiver Substanzen
hoher Durchsatz
hohe Reproduzierbarkeit
Target-unabhängige Induktion des epileptiformen Zustandes (phänotypischer Ansatz). Die in vitro Untersuchung der Ursachen epileptischer Anfälle, sowie der Wirksamkeit Epilepsie-aus lösender bzw. antikonvulsiver Substanzen erfolgt hauptsächlich in Gewebeschnitten des Hippocampus und angrenzender Hirnareale. Diese können entweder akut oder als Gewebekultur (organotypische Schnittpräparate) genutzt werden. Die iktale Aktivität wird zumeist chemisch oder durch elektrisches Kindling induziert. Untersuchungen mit akuten Hirnschnitt-Präparaten besitzen zwar eine gute Prädiktivität, sind aber technisch sehr aufwändig und erfordern ein sehr hohes Maß an technischem Geschick und Verständnis. Folgende Nachteile akuter Hirnschnitt-Präparate sind zu nennen: kurze Lebensdauer (wenige Stunden)
eingehende und abgehende Projektionen sind verletzt worden
Diffusionsprozesse (Versorgung der Nervenzellen mit Nährstoffen und Sauerstoff) sind wenig effizient
Austausch von Substanzen in der extrazellulären Lösung dauert 20-60 min
Reduktion der spontanen synaptischen Aktivität.
Im Gegensatz zu akuten Hirnschnitt-Präparaten kann man organotypische Schnittkulturen über einen längeren Zeitraum untersuchen (>7 Tage). Epileptiforme Aktivitäten können durch Zugabe von Bicucculin oder anderen GABA Rezeptor- Antagonisten ausgelöst werden. In organotypischen Schnittkulturen kann es zu einer ähnlichen Re-Organisation des Hippocampus kommen, wie sie auch in vivo beobachtet wurde (Gutierrez and Heinemann, 1999, Franck et al., 1995). Allerdings ist auch diese Technologie begrenzt durch die minimale Anzahl von Gewebeschnitten, die aus einem Tier gewonnen werden können. Da die epileptiforme Aktivität in den Modellen chemisch oder elektrisch induziert wird, ist die Prädiktivität für das Auffinden neuartiger Wirkstoffe begrenzt.
In vitro wird in den Hirnschnitten des Hippocampus die epileptiforme Aktivität anhand sogenannter elektrisch abgeleiteter Feldpotenziale charakterisiert. Diese extrazellulären Potenziale sind das Ergebnis synchroner Entladungen von Aktionspotenzialen einer Vielzahl von Neuronen im Hippocampus und in angrenzenden Hirnregionen. Diese Feldpotenziale korrelieren sehr gut mit den klinisch gemessenen EEG-Signalen, die auch durch synchrone Entladungen vieler Neurone entstehen.
Ein typisches epileptiformes Signal in den meisten kortikalen Strukturen dauert länger als 10 s (Heinemann, U. et al, 2006). Nach einem solchen Ereignis findet typischerweise eine Phase der post-iktalen Depression statt. Danach beginnt wieder die inter-iktale Aktivität, die durch kurze, sehr synchrone Potenziale gekennzeichnet ist und welche entweder zur Ausbildung des nächsten epileptiformen Ereignisses führen kann, oder die Ausbildung neuer epileptiformer Ereignisse verhindert. Die Dauer inter-iktaler Ereignisse bei Menschen beträgt weniger als 100 ms, wohingegen die iktalen Ereignisse mehrere Sekunden andauern (Huberfeld et al. 2011).
Verschiedene Substanzen können die Generierung dieser epileptiformen Ereignisse begünstigen oder hervorrufen. Dazu gehören beispielsweise der GABA-Rezeptor-Modulator Pentylentetrazol, der cholinerge Agonist Pilocarpine (Avoli et al. (2002) oder der Kaliumkanalblocker 4-AP (Avoli and Perreault, 1987; Avoli et al. 2013).
Eine Verringerung der extrazellulären Magnesium (Mg)-Konzentration (low-Mg-Modell) führt in vitro ebenfalls zur Induktion epileptiformer Ereignisse. In isolierten Hirnschnitten führt eine Verringerung der Mg Konzentration zu kurzen elektrischen Entladungen einer Dauer von 60-150 ms, die mit inter-iktalen Entladungen vergleichbar sind. Diese können durch die Applikation von Carbamazepin, Phenytoin oder Valproat verhindert werden. Das Modell könnte klinisch relevant sein, weil humane epileptische Anfälle auch mit einer Verringerung des Magnesium Spiegels im Gehirn einhergehen (Durlach, 1967).
Das low-Mg-Modell ist auch an neuronalen Kulturen des Hippocampus postnataler 2 Tage alter Mäuse bereits beschrieben worden (Deshpande et al, 2007; Sombati and Delorenzo, 1995). Spontan auftretende, über mehrere Sekunden andauernde Bursts konnten in einzelnen Neuronen intrazellulär gemessen werden. Simultane Doppelableitungen zeigten eine synchrone Entladung dieser epileptiformen langen Bursts. Später konnte gezeigt werden, dass diese Entladungen wahrscheinlich von Pyramidenzellen generiert werden (Mangan and Kapur, 2004).
Auch andere Substanzen können in Zellkulturen ähnliche elektrische Entladungen von Neuronen hervorrufen: Bicucculin (Colombi et al, 2013), Pilocarpine (Priel and Albuquerque, 2002), Kynurensäure (Furshpan and Potter, 1989).
Netzwerke neuronaler Zellen können auf Mikroelektroden-Array (MEA)-Chips kultiviert werden und liefern eine Screening-Plattform für die Untersuchung neuroaktiver Substanzen. Dazu wird die elektrische Netzwerkaktivität der Neurone aufgezeichnet, analysiert und auf Ebene der Aktionspotenzial-Muster charakterisiert und klassifiziert. Neuroaktive Substanzen verändern die gewebetypischen Aktivitätsmuster in spezifischer Art und Weise und können somit über ihren Fingerabdruck der Netzwerkveränderungen charakterisiert werden. Dieser Fingerabdruck kann durch eine von NeuroProof GmbH (Rostock, DE) entwickelte multivariate Datenanalyse ausgewertet werden, bei der mehr als 200 die elektrische Aktivität beschreibende Merkmale analysiert werden.
Der herausragende Vorteil der MEA-Technologie gegenüber anderen Techniken zur elektrophysio logischen Untersuchung neuronaler Zellen ist die gleichzeitige Aufzeichnung der elektrischen Signale in multi-zellulären Netzwerken, bei denen auch die Kommunikation zwischen den Neuronen untersucht werden kann.
Die Technologie wurde 1972 von Thomas et al. erstmals beschrieben und von Guenter Gross weiterentwickelt (Gross et al, 1977). Die Ableitung spontan aktiver, selbst-organisierter neuronaler Netzwerke auf diesen MEA Chips ermöglicht die Untersuchung des neuroaktiven Potenzials von Testsubstanzen durch die Aufzeichnung der extrazellulären Aktionspotenziale einer Vielzahl einzelner Neurone über mehrere Stunden.
MEA Neurochips sind unter anderem vom Center for Network Neuroscience (CNNS) der University of North Texas erhältlich. Diese 5x5 cm Glas Chips besitzen eine zentrale Matrix mit einem Durchmesser von 2 mm2, die 64 (oder in einer anderen Ausführung 2 mal 32) passive Elektroden und Indium-Zinn-Leiterbahnen umfasst, die in Silikon eingebettet sind und als vergoldete freie Elektroden enden. Der Elektroden-Durchmesser beträgt 20 μιη, der minimale Abstand zwischen den Elektroden beträgt 40 μιη. Die MEA Chips werden in einer Ableitkammer (CNNS) auf der Vorverstärker-Station (Plexon Inc, Dallas TX, USA) aufgebracht, welche eine Temperaturkontrolle und 64 Vorverstärker enthält. Die Aufnahme der extrazellulären Aktionspotenziale erfolgt mit einem Computer-kontrollierten 64-Kanal Verstärker System (Plexon Inc, Dallas TX, USA) bei einer konstanten Temperatur von 37°C. Nach Einstellung der Schwelle für das Rauschen können von jeder Elektrode Aktionspotenziale von bis zu vier verschiedenen Neuronen abgeleitet werden. Die einzelnen Signale werden anhand ihrer Aktionspotenzial-Form mit Hilfe der Aufnahme- Software voneinander getrennt und aufgezeichnet. Dadurch können auf einem 64 Elektroden MEA- Neurochip Signale von bis zu 256 Neuronen aufgezeichnet werden. Die Amplitude der extrazellulären Signale ist im Bereich von 15 bis 1800 μν. Die Abtast-Frequenz der Signale ist 40 kHz. Dadurch ist es möglich, neben der zeitlichen Abfolge der Aktionspotenziale auch deren Verlauf (Waveform) zu analysieren.
Die Zeitpunkte des Auftretens der Aktionspotenziale werden in zeitlicher Abfolge (Spiketrains) fortlaufend aufgezeichnet. Aktionspotenziale werden einzeln oder in Bursts (Gruppen schnell aufeinanderfolgender Aktionspotenziale) generiert. Die zeitliche Abfolge der Aktionspotenziale ist charakteristisch für die verschiedenen Hirngewebe-Regionen. Die Bursts können mit der von NeuroProof entwickelten Software NPWaveX (NeuroProof GmbH, Rostock, DE) identifiziert werden.
Auf Multielektroden-Arrays (MEAs) zeigten Kulturen hippocampaler Neurone, die am Embryonaltag El 8 präpariert und kultiviert wurden, spontan generierte simultane Bursts einer Dauer von 40 bis 60 ms (Li et al, 2007). Bei Hippocampus Neuronenkulturen von Ratten (El 8) auf MEAs können epileptische Phänotypen durch chemische Stimulation mit 30 μΜ Bicucculin induziert werden (Colombi et al, 2013). Bicucculin induzierte in den Kulturen einen Anstieg der Spikerate, Burstrate, Burstdauer und Spikefrequenz in den Bursts. Diese Merkmale werden durch Applikation der Antikonvulsiva Carbamazepin oder Valproinsäure wieder reduziert (Vedunova et al, 2013) zeigten synchronisierte Bursts in Kulturen hippocampaler Neuronen, die mit Hyaluronidase behandelt wurden.
WO2010090285 beschreibt ein Screening- Verfahren für ein therapeutisches Agens für Epilepsie, bei dem das Expressionsniveau bestimmter mRNA bestimmt werden soll.
Dem gegenüber stellt sich dem Fachmann die Aufgabe, alternative Tests für die Identifikation und/oder Untersuchung von neurologisch wirksamen Substanzen zur Verfügung zu stellen, welche die genannten Nachteile zumindest zum Teil überwinden.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Testen einer Substanz auf ihre neurologische Aktivität zur Verfügung, bei dem man
(a) eine Population von hippocampalen Neuronen in Zellkultur kultiviert, welche iktale Aktivität, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, zeigt,
(b) die iktale Aktivität der Population analysiert;
(c) die Population mit der zu testenden Substanz in Kontakt bringt;
(d) die iktale Aktivität der Population analysiert,
wobei die zu testende Substanz eine neurologische Aktivität aufweist, wenn die iktale Aktivität sich vor und nach dem in Kontakt Bringen unterscheidet,
wobei die hippocampalen Neuronen von dissoziierten embryonalen, bevorzugt nicht-humanen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 bis Tag 18, bevorzugt Tag 15, der Embryo nalentwicklung entsprechen, oder von Stammzellen, bevorzugt humanen Stammzellen, abgeleitet sind.
Überraschenderweise haben die Erfinder gefunden, dass, wenn Neuronen von Hippocampus- Gewebe aus embryonalen Mäusen am Embryonaltag E15 bis El 8, vor allem an E15-E16 oder El 7, insbesondere aber an E15 präpariert und kultiviert werden, nach 14-40 DIV (days in vitro), 21-35 DIV, insbesondere nach 27-34 DIV (z.B. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 DIV) iktale und inter-iktale Aktivität auftritt (Fig. 3).
Die iktale Aktivität ist vor allem gekennzeichnet durch spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s. Diese sind mit der synchronen Entladung von Neuronengruppen bei epileptischen Ereignissen beim Menschen vergleichbar und werden als iktale Bursts, Populationsbursts oder iktale Entladungen bezeichnet. Synchron be- deutet im Rahmen der Erfindung, dass mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt ca. 80-90% der analysierten Neuronen gleichzeitig beginnende Salven von Aktionspotentialen, also aufeinander folgende Aktionspotentiale, aufweisen. Ein gleichzeitiger Beginn erlaubt +/- 500 ms Latenz, bevorzugt +/- 300 ms oder +/ 100 ms Latenz. Auch das Ende der Bursts kann, wie der Beginn, mit entsprechenden Latenzen verbunden sein. Auch ein zwischenzeitliches Aussetzen einzelner, am Populationsburst beteiligter Neurone kommt bei synchronen Populationsbursts vor.
Als Population wird im Rahmen der Erfindung die Gruppe aller Neuronen bezeichnet, die in einem Zellkulturgefäß kultiviert ist, wobei die Neuronen untereinander ein Netzwerk bilden. Neben Neuronen liegen in der Zellkultur auch weitere Zelltypen, insbesondere Gliazellen vor, die zur Funktionalität der Neuronen maßgeblich beitragen. Eine Analyse der iktalen Aktivität der Population wird durchgeführt, indem die Aktivität von mindestens einem Neuron der Population, bevorzugt von 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr, 40 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, meist bis zu 256 Neuronen untersucht wird. Es können z.B. jene Neuronen untersucht werden, deren elektrische Aktivität von den Elektroden eines MEA-Neurochips erfasst wurde. Dabei wird zunächst die Aktivität aller Elektroden eines MEA-Neurochips aufgezeichnet und anschließend werden diejenigen Elektroden (Units, dies entspricht der Aktivität eines Neurons) für die weitere Analyse ausgewählt, die gewisse Mindest-Kriterien erfüllen (z.B. Spikerate mindestens 0.2/s, Burstrate mindestens 6 Bursts/Minute). In einer anderen Ausführungsform wird die Aktivität aller in der Population anwesenden Neuronen oder aller in einem Bildausschnitt vorliegenden Neuronen untersucht, z.B. mit bildgebenden Verfahren.
Vor Beginn der iktalen Entladungen sind bevorzugt synchrone prä-iktale Bursts zu beobachten. Diese sind gekennzeichnet durch eine synchrone Entladung der Neurone (80-100 % aller Neurone, die auch an der iktalen Entladung beteiligt sind) in kurzen Bursts (20 ms bis 1 s), gefolgt von einem aktivitäts-freien Interburst-Intervall. Die prä-iktalen Bursts unterscheiden sich von den normalen Bursts derselben Dauer, die nicht synchron in beliebiger zeitlicher Abfolge von Neuronen des Netzwerkes generiert werden. Inter-iktale Bursts besitzen bezüglich ihrer Dauer und Synchronität ähnliche Eigenschaften wie die hier beschriebenen prä-iktalen Bursts, werden aber von anderen Neuronen in benachbarten Hirnregionen induziert (de Curtis and Avanzini, 2001; Cohen et al, 2002). Prä-iktale Entladungen treten einige Sekunden vor den iktalen Entladungen und in den gleichen neuronalen Regionen auf (Huberfeld et al, 2001).
Den synchronen iktalen Entladungen (Populationsbursts) folgt bevorzugt eine länger andauernde Phase (>5 s) sehr geringer Aktivität mit nur vereinzelten Aktionspotenzialen oder Bursts (<1 Hz). Diese Phase entspricht der post-iktalen Depression (Heinemann et al., 2006). Neben der iktalen Aktivität der Neuronen liegt also bevorzugt auch die prä-iktale Aktivität und/oder post-iktale Depression (inter-iktale Aktivität) vor, die bevorzugt ebenfalls analysiert wird.
Die gezeigte inter-iktale und iktale Aktivität der hippocampalen Neurone ist vergleichbar mit in vivo Einzelneuronenableitungen aus dem Hippocampus von Ratten, bei denen epileptiforme Aktivitäten durch Applikation von Pilocarpin induziert wurden (Grasse et al, 2013). Hier wird beschrieben, dass Interneurone Minuten vor Beginn der epileptiformen Aktivität eine sehr synchrone Aktionspotentialentladung aufweisen. Die Aktionspotentialrate steigt kurz vor Beginn der iktalen Aktivität. Die hohe Synchronität der den Ereignissen zugrunde liegenden elektrischen Aktivität der Neurone wird wahrscheinlich durch eine Reduktion der synaptischen Hemmung in den beteiligten Hirnregionen gewährleistet (Dichter and Ayla, 1987.
Es wird daher erfindungsgemäß ein Verfahren zur Gewinnung hippocampaler Neuronenkulturen zur Verfügung gestellt, die eine spontane iktale Aktivität in neuronalen Netzwerken aufweisen. Dies stellt einen enormen Fortschritt für die Testung z.B. neuer antiepileptischer Wirkstoffe dar. Neue Wirkstoffe können dadurch schon sehr früh in der präklinischen Entwicklung kostengünstig getestet werden. Gegenüber herkömmlichen primären Screening-Methoden, bei denen lediglich die Effekte der Substanzen an einem Rezeptor/Ionenkanal gestestet werden, können mit der hier aufgezeigten Methode prädiktive Aussagen über die tatsächliche antiepileptische Wirksamkeit der Substanzen getroffen werden. Die Verminderung oder Vermeidung von epileptischen Anfällen mittels der Einwirkung chemischer Substanzen stellt ein neues Testverfahren für potenziell neue Epilepsiemedikamente dar. Dadurch ist es z.B. möglich, die Weiterentwicklung falsch positiver Substanzen schon sehr früh in der präklinischen Phase zu stoppen und gleichzeitig die Zahl benötigter Tierversuche drastisch zu reduzieren. Dies ermöglicht eine enorme Fokus- sierung auf die Wirksamkeit präklinischer Substanzen und ermöglicht es der Medizinalchemie, auch pharmakokinetisch oder pharmakodynamisch unausdifferenzierte Substanzen hinsichtlich ihrer neurologischen, z.B. antiepileptischen Wirkung zu charakterisieren.
Da synchrone Entladungen von Neuronengruppen nicht nur bei epileptischen Erkrankungen, sondern auch bei sonstigen neurologischen Vorgängen eine Rolle spielen, können auch andere Vorgänge, Erkrankungen oder gewünschte Wirkspektra bei den Untersuchungen im Vordergrund stehen. So werden synchrone Bursts z.B. bei Gedächtnis- und Lernvorgängen beobachtet (Li et al, 2007). Auch bei Migräne spielen ähnliche Vorgänge eine Rolle. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchende neurologische Aktivität kann z.B. sedierende Aktivität, anxiolytische Aktivität, antidepressive Aktivität, Stimmungsstabilisierende oder stimmungsaufhellende Aktivität, antipsychotische Aktivität, konzentrationssteigernde Aktivität, aufmerksamkeitssteigernde Aktivität, Gedächtnis- verbessernde Aktivität, analgetische Aktivität, insbesondere vorbeugend oder therapeutisch gegen Migräne, und/oder antikonvulsive Aktivität sein. Bevorzugt ist die neurologische Aktivität antikonvulsive Aktivität. Im Rahmen dieser Anmeldung werden die Begriffe antiepileptische Aktivität und antikonvulsive Aktivität synonym verwendet.
Neben der Untersuchung der Wirkungen der Substanzen auf epileptische Aktivität ist es möglich, auch Aussagen über potenzielle Nebenwirkungen der Substanzen zu treffen bzw. Nebenwirkungsprofile zu charakterisieren. Es kann z.B. das Verhältnis verschiedener neurologischer Aktivitäten zueinander analysiert werden, insbesondere das Verhältnis von antikonvulsiver zu sedierender Aktivität. Dies ermöglicht z.B. die Entwicklung optimierter Substanzen bezüglich des Verhältnisses von antikonvulsiven zu sedierenden Eigenschaften.
Die Erfinder konnten zeigen, dass die Dauer der iktalen Bursts (>5 s) durch Applikation von Antikonvulsiva wie Carbamazepin oder Valproat konzentrationsabhängig verringert werden kann (Fig. 4, Fig. 5). Eine Reduktion der Dauer der Populationsbursts ist also kennzeichnend für antikonvulsive Aktivität. Sedierende Eigenschaften, können z.B. anhand einer Reduktion der allgemeinen Netzwerkaktivität, wie Spike rate, charakterisiert werden (Fig. 5).
Die eingesetzten hippocampalen Neuronen sind von Stammzellen oder von dissoziierten embryonalen Zellen abgeleitet, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 bis Tag 18, insbesondere Tag 15, 16 oder 17, am meisten bevorzugt Tag 15, der Embryonalentwicklung entsprechen. Das Alter der Embryonen wurde anhand eines Katalogs zur Altersbestimmung von Embryonen der jeweiligen Spezies bestimmt und dokumentiert (Kaufmann, 1992; Schambra, 2008).
In einer Ausführungsform werden embryonale Zellen aus Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein oder Affe eingesetzt. Die embryonalen Zellen können auch Stammzellen sein, wie humane Stammzellen (z.B. aus abgestorbenen oder abgetriebenen Embryonen. In einer Ausführungsformen handelt es sich um nicht-menschliche embryonale Stammzellen, z.B. aus Maus oder Ratte. Alternativ können auch nicht-embryonale Stammzellen verwendet werden, z.B. Stammzellen aus Patientenmaterial oder sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen.
Dissoziiert bedeutet in diesem Zusammenhang: Nach Präparation der Hippocampi des Embryos wird das Gewebe zerkleinert und die Zellen dissoziiert, d.h. der Gewebeverbund der Zellen wird vor der Kultivierung in vitro aufgelöst. Die erhaltene Zellsuspension wird kultiviert.
Erfindungsgemäß können die Neuronen von Zellen aus dem Hippocampus von Maus- Embryonen an Tag 15 bis Tag 18 der Embryonalentwicklung abgeleitet sein, bevorzugt an Tag 15 bis Tag 16, mehr bevorzugt an Tag 15. Hippocampi für neuronale Zellkulturen werden im Stand der Technik üblicherweise bei Mäusen am Embryonaltag El 8 oder E17 präpariert, weil an diesen späten Embryonaltagen die Bildung der Pyramidenneurone abgeschlossen ist, aber die Bildung der Körnerzellen des Gyrus dentatus noch nicht begonnen hat (Banker and Cowan, 1977).
Der Hippocampus ist durch seine spezifische Schichtung morphologisch gut charakterisiert (Grove and Tole, 1999). Morphologisch lässt sich der Hippocampus ab dem Embryonaltag E15 gut vom umgebenden Cortex abgrenzen. Bevorzugt ist das embryonale Entwicklungsstadium, in dem die Zellen präpariert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Embryonen bereits eine beginnende Schichtung des Hippocampus aufweisen. Verschiedene molekulare Marker erlauben postnatal eine spezifische Unterscheidung der verschiedenen Schichten. Zwei der Marker können verwendet werden, um eine Schichtung des Hippocampus an El 5.5 nachzuweisen (Grove und Tole, 1999). Wenn Gewebe aus der hippocampalen Region an El 2.5 entnommen und kultiviert wird, können in vitro nach 3 Tagen die Marker nachgewiesen werden. Dies zeigt eine Differenzierung der CA1 und CA3- Regionen des Hippocampus auch in vitro (Tole et al, 1997) nach Gewebeentnahme in einem frühen Embryonalstadium. Bevorzugt hat bei der Präperation die Bildung der Körnerzellen des Gyrus dentatus noch nicht begonnen, wobei bevorzugt auch die Bildung der Pyramidenneurone noch nicht abgeschlossen ist.
Die Trächtigkeit von Mäusen beträgt 18-21 Tage; von Ratten 21 bis 23 Tage. Die Entwicklung der Ratte ist etwa 1 Tag langsamer als die der Maus. Bei Ratten-Embryonen wird das entsprechende Entwicklungsstadium also ca. 1 Tag später erreicht. Es werden also insbesondere Zellen von Rattenembryonen verwendet, die an E15-E19, bevorzugt El 6- 17 oder El 8 präpariert wurden, am meisten bevorzugt an El 6.
In murinen Kulturen, die an E17 oder El 8 präpariert wurden, beträgt die mittlere Dauer der Bursts nach 28 Tagen in vitro Kultivierung zwischen 100 und 400 ms. Ein Beispiel des typischen Aktivitätsmusters solcher neuronalen Netzwerke ist in Fig. 2 dargestellt. Auch solche Zellen können jedoch, wenn auch seltener als an E15 präparierte Zellen, iktale Bursts zeigen und somit in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. 57,1 % der Populationen von an Tag E15 präparierten Hippocampus-Neuronenkulturen weisen eine iktale Aktivität in Form von mindestens 5 s andauernden Populationsbursts auf. Dieser Anteil nimmt an später präparierten Kulturen ab. An E16 weisen nur noch ca. 12,4% der Populationen diese Aktivität auf, an E17 sind es 15% und an El 8 nur noch 6% aller Populationen von Hippocampus-Neuronenkulturen. Daher ist eine Präparation an E15 bei murinen Kulturen (und bei anderer Herkunft in einem entsprechenden Entwicklungsstadium) erfindungsgemäß bevorzugt. In einer anderen Ausführungsform sind die Neuronen von Stammzellen, insbesondere embryonalen Stammzellen oder neuronalen Stammzellen abgeleitet. Dabei können humane Stammzellen verwendet werden, welche bevorzugt nicht durch Zerstörung menschlicher Embryonen gewonnen wurden. Pluripotente Stammzellen können aus humanem neuroektodermen Gewebe von Patienten gewonnen und zu cerebralen Organoiden ausdifferenziert werden, wobei neben anderen cerebralen Strukturen auch die Ausbildung hippocampalen Gewebes gezeigt werden konnte (Lancaster et al, 2013). Hippocampus- Gewebe kann aus den Organoiden entnommen, dissoziiert und auf geeigneten Substraten, bevorzugt Microelektroden-Arrays, bevorzugt in einem frühen Differenzierungsstadium weiter kultiviert werden, um die iktale Aktivität zu untersuchen. Diese Ausführungsform ist von besonderem Interesse für die Herstellung von humanen Hippocampus-Neuronenkulturen. Es ist auch möglich, humane pluripotente Stammzellen über embryoide Körper in spezifische Neurone des Hippocampus (Körnerzellen) zu differenzieren (Yu et al., 2014).
In einer Ausführungsform können die verwendeten Neuronen hergestellt werden, indem man a) Stammzellen in einem dreidimensionalen Zellaggregat (zerebrales Organoid) vordifferenziert, welches mindestens zwei Regionen umfasst, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen, wobei eine dieser Regionen dem Hippocampus entspricht und
b) Zellen aus der Region, die dem Hippocampus entspricht, entnimmt und
c) auf einem planaren Träger, z.B. einem MEA-Neurochip, weiter kultiviert, wobei eine neuronale Zellkultur entsteht, bei der die Zellen ein neuronales Netzwerk bilden und eine elektrische Aktivität aufweisen, welche für den Hippocampus spezifisch ist.
Dreidimensional bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung, dass die Zellen nicht nur in einer Ebene wachsen, sondern auch dreidimensionale Strukturen ausbilden. Dadurch bilden sich morphologisch und physiologisch unterschiedliche Strukturen aus. Durch geeignete Maßnahmen (Lancaster et al, 2013, Yu et al, 2014) lassen sich dreidimensionale Zellaggregate herstellen, die mindestens zwei Regionen umfassen, die unterschiedlichen Gehirnregionen entsprechen, u.a. dem Hippocampus. Einfache dreidimensionale Zellaggregate sind die im Stand der Technik bekannten Sphären, es können aber auch komplexere Organoide verwendet werden, die ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind. Beides wird im Rahmen der Erfindung als zerebrales Organoid bezeichnet. Als unterschiedliche Gehirnregionen werden im Rahmen der Erfindung bezeichnet: Hippocampus, Kleinhirn, Mittelhirn, Striatum, Amygdala, Stammhirn, Thalamus, Hypothalamus, Basalganglien, Rückenmark, Kortex, subkortikale Kerne, Riechkolben, optischer Nerv, Retina, Spinalganglien und Hypophyse.
Die Zellen werde in einem Stadium aus dem zerebralen Organoid entnommen, in dem es sich bereits um terminal differenzierte Neurone, und auch noch um deren direkte Progenitor- Zellen handelt, da zur Ausbildung eines neuronalen Netzwerks mit elektrischer Aktivität so die Plastizität erhöht wird. Der Neuronentypus ist dabei aber bereits festgelegt. Der Zeitpunkt der Entnahme wird so optimiert, dass besonders viele hergestellte Kulturen iktale Aktivität aufweisen. Typischerweise wird dies frühzeitig, also vor dem Zeitpunkt kompletter Ausdifferenzierung, erfolgen.
Die Region, die dem Hippocampus entspricht und aus der die Zellen in b) entnommen werden, weist mindestens einen molekularen Marker für diese Gehirnregion auf. Beispiele sind Parvalbumin, Cholecystokinin, Somatostatin, Calretinin, NRP2, DZF9, PROX1. Ein oder mehrere derartige molekulare Marker können, z.B. nach Anfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder auf RNA-Ebene, zur Identifizierung des Hippocampus Organoids verwendet werden.
Optional können die Stammzellen ein detektierbares Transgen umfassen, wobei das Transgen funktionell mit einem Promotor verbunden ist, der eine Expression des Transgens in dem Hippocampus bewirkt. Ein geeignetes detektierbares Transgen ist z.B. das grün- fluoreszierende Protein (GFP), oder ähnliche singulär bestehende Proteine, RNA- oder DNA-marker, oder ein markiertes Zelltyp-spezifisches Fusionsprodukt wie z.B. GFP- oder His- oder ähnliche Marker, welche an zelltyp-spezifische Proteine, -RNA oder DNA fusioniert wurden. Beim Einsatz von z.B. Plasmidkonstrukten können diese in die undifferenzierten iPS-Zellen integriert werden, z.B. durch virale Transduktion oder Transfektion, was somit zu einer für Zelltyp- und Differenzierungsstadium spezifischen Markierung von Zellen führt. Damit wird eine definierte Region innerhalb des Organoids markiert. Auch mehrere Regionen können gleichzeitig markiert werden, wobei unterscheidbare detektierbare Transgene verwendet werden sollten. Dabei dient eine Detektion des Transgens zur Auswahl der zu entnehmenden Zellen. Zum Beispiel können die Promotoren der zuvor genannten Marker hierfür verwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich kann die Region, die einer bestimmten Gehirnregion entspricht und aus der die Zellen in b) entnommen werden, bei der Entnahme mittels Infrarotspektroskopie identifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Region mittels morphologischer und anatomischer Strukturzusammenhänge mikroskopisch auf visuellem Wege identifiziert werden.
Die Auswahl der korrekten Region kann nach der Entnahme und Kultur durch einen Vergleich der elektrischen Aktivität der Zellkultur mit typischen neuronalen Zellkulturen aus dem Hippocampus verifiziert werden. Alternativ kann auf diese Weise die bestimmte Gehirnregion im Nachhinein identifiziert werden.
Die Herstellung und Verwendung von Zellen aus zerebralen Organoiden ist in der parallel eingereichten Anmeldung der Neuroproof GmbH„Gewinnung von Gehirnregion-spezifischen neuronalen Kulturen aus dreidimensionalen Gewebekulturen von Stammzellen" näher beschrieben.
Vor dem Testen werden die Zellen (embryonale Zellen z.B. murine embryonale Zellen, oder Stammzellen) für ca. 14 bis 40, ca. 21 bis 35, bevorzugt für 27 bis 34 Tage in vitro kultiviert. Die Kultur erfolgt unter physiologischen Bedingungen, also z.B. bei 37°C bei für Zellkultur geeigneter Luftfeuchtigkeit und C02-Gehalt in einem für die Kultur von neuronalen Zellen der entsprechenden Spezies geeigneten Medium. Die Substrate für die Zellen werden mit Poly-D-Lysin vorbehandelt, um die Anhaftung und das Wachstum der Neurone optimal zu fördern. An Tag 3-7, insbesondere an Tag 4-5 der Kultur wird die weitere Teilung der Glia- zellen durch Zugabe von Mitoseinhibitoren (z.B. Fluoro-Desoxy-Uridine, Uridin) gehemmt. Dies bedingt ein ausgewogenes Verhältnis von Neuronen und Gliazellen nach ca. 4-5 Wochen in Kultur.
Ein Teil-Mediumwechsel wird ca. zweimal pro Woche vorgenommen, wobei dieser unter minimaler Beeinträchtigung der Kultur vorgenommen werden sollte. Die Kultivierung erfolgt auf Substraten, die später unmittelbar für die Analyse der Aktivität verwendet werden, ohne dass die Zellen abgelöst und auf neue Substrate aufgebracht werden müssen. Die Zellen werden lediglich in eine Mess- Vorrichtung eingebracht, deren Bedingungen denen während der 4-wöchigen Kultivierungszeit angepasst sind. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung auf Mikro- electroden-Array (MEA)-Neurochips. Alternativ können aber auch andere Wege der Analyse und entsprechend der Kultivierung verwendet werden, z.B. Ca-Imaging nach Kultivierung in klassischen Zellkulturschalen oder Deckgläschen oder in Multi-Well-Format-Chips.
Erfindungsgemäß ist die zum Testen verwendete Population von hippocampalen Neuronen durch ein Verfahren erhältlich, welches Schritte umfasst oder aus Schritten besteht, bei denen man
(i) Hippocampus-Gewebe eines bevorzugt nicht-menschlichen (z.B. murinen) Embryos in einem Entwicklungsstadium, das einem murinen Embryo an Tag 15 bis Tag 18, insbesondere Tag 15, der Embryonalentwicklung entspricht, präpariert,
(ii) das Hippocampus-Gewebe zerkleinert und dissoziiert, um eine Suspension von Zellen zu erhalten,
(iii) die Zellsuspension auf einen geeigneten Träger, bevorzugt einen MEA-Neurochip, aufbringt,
(iv) die Zellen kultiviert, wobei die Kultivierung bevorzugt für 4 bis 40 Tage Wochen, mehr bevorzugt für etwa 27 bis 34 Tage erfolgt.
Die Kultivierung erfolgt z.B. in serumhaltigem DMEM Medium mit 30 mM Glucose bei einer Zelldichte von ca. 0,5-2 x 106, bevorzugt ca. 1,0 x 106. Auf die MEA Neurochips werden jeweils 300 μΐ dieser Zellsuspension auf das Elektrodenfeld gebracht. Außerhalb des Elektrodenfeldes werden zusätzlich jeweils 100 μΐ Fütterzellen aufgebracht, welche der Konditionierung der Netzwerke dienen, aber keinerlei physische Kontakte mit den zu analysierenden Neuronen ausbilden können.
Die Population der analysierten Neuronen umfasst bei Analyse mit einem MEA-Chip üblicherweise zwischen mindestens 6 und maximal 256, üblicherweise zwischen 10 und 50 Zellen. Neben den analysierten Zellen befinden sich noch weitere, elektrisch nicht aktive Zellen in der Kultur, die wichtige Funktionen für die Aufrechterhaltung der Funktionen der Neurone erfüllen. Die Gesamtszahl an Zellen in einem Netzwerk auf einem MEA- Elektrodenfeld beträgt ca. 300000.
Die Neuronen bilden in den Kulturen Netzwerke mit benachbarten Neuronen. Eine Kommunikation der Neurone eines Netzwerkes erfolgt über Synapsen oder gap junctions. Die Eigenschaften dieser Netzwerk-Kommunikation kann mit einer Vielzahl von Merkmalen, die auf der elektrischen Aktivität einzelner Neurone beruhen, analysiert werden. Diese Merkmale beschreiben die Synchronität und Konnektivität der Netzwerke und deren pharmakologische Beeinflussung.
Einer der wesentlichen Unterschiede zum Stand der Technik ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, dass die iktalen Bursts bei der Population von hippocampalen Neuronen ohne chemische, elektrische oder physikalische Induktion erfolgen können. Demgemäß wird bevorzugt auch keine chemische, elektrische oder physikalische Induktion einer iktalen Aktivität durchgeführt, insbesondere erfolgt keine Absenkung von Mg, keine Zugabe von Hyaluronidase, keine Zugabe von Substanzen wie Picrotoxin oder Bicucculin, welche Rezeptoren oder Ionenkanäle oder die synaptische Übertragung modulieren, keine direkte oder chronisch unterschwellige elektrische Stimulation (Kindling), keine Temperaturabsenkung, und keine genetische Veränderung.
Da alle im Stand der Technik bekannten Modelle epileptiforme Aktivitäten chemisch, physikalisch oder elektrisch in nativem/gesundem Gewebe induzieren, sind sie vom jeweiligen Mechanismus der Induktion abhängig. Außerdem unterscheidet sich das Gewebe epileptischer Hirne von gesundem Gewebe in der Konnektivität, der Aktivierung von Gliazellen und der Expression von Ionenkanälen oder Rezeptoren. Daher ist die Identifikation völlig neuartiger Substanzen in diesen Modellen nur eingeschränkt möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet ein erfolgversprechenderes Screening-Modell für die präklinische Entwicklung neuer Antiepileptika, da hier ein pathophysiologisch chronischer Zustand ohne vorherige Stimulation oder chemische Induktion umgekehrt werden soll. Mit einem solchen phänotypischen Ansatz soll es eher möglich sein, Wirkungen antiepiletischer Substanzen multiparametrisch zu untersuchen. Die Neurone werden mit einer zu testenden Substanz in Kontakt gebracht. Eine solche Substanz kann ein bereits bekanntermaßen neurologisch wirksames Medikament sein (z.B. als Kontrolle oder zur weiteren Charakterisierung der Eigenschaften oder des Zusammenspiels mit anderen Medikamenten), es kann sich jedoch auch um eine Substanz mit einem bisher noch nicht bekannten neurologischen Wirkungsspektrum handeln. Die Substanz kann z.B. ein niedermolekulares Molekül (<900 g/mol), ein Protein, ein Peptid, ein Lipid, ein Zucker, ein Antikörper, Nanopartikel und/oder ein sonstiges Molekül sein.
Der Kontakt mit der zu testenden Substanz und die Analyse der Effekte können in einem beliebigen Zeitraum erfolgen. Insbesondere ist es möglich, die iktale Aktivität gleich nach der Zugabe der Substanz (oder durchgehend vor und nach Zugabe) zu analysieren. Alternativ ist es auch möglich, die Analyse nach Zugabe der zu testenden Substanz zu einem (oder mehreren) bestimmten Zeitpunkt (z.B. nach 1 min bis 14 d oder nach ca. 1 min, nach ca. 2 min, nach ca. 3 min, nach ca. 5 min, nach ca. 10 min, nach ca. 15 min, nach ca. 30 min, nach ca. 45 min, nach ca. 1 h, nach ca. 2 h, nach ca. 3 h, nach ca. 5 h, nach ca. 12 h, nach ca. 24 h, nach ca. 48 h, nach ca. 3 d, nach ca. 4d, nach ca. 5 d, nach ca. 7 d, nach ca. 14 d, nach ca. 28 d) durchzuführen. Bevorzugt wird nach ca. 30-60 min ausgewertet, wenn akute Wirkungen mit einem MEA-Neurochip untersucht werden sollen. Dabei kann die Substanz die gesamte Zeit in Kontakt mit den Zellen bleiben, indem sie bei jedem Mediumwechsel neu dazugegeben wird oder nach einer bestimmten Zeit, z.B. durch Mediumwechsel, wieder entfernt, z.B. herausverdünnt werden. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können also auch chronische Untersuchungen von Substanzen, deren Wirkmechanismen und ihren Effekten durchgeführt werden.
Die Dauer der Analyse beträgt mindestens ca. 10, bevorzugt mindestens 20, am meisten bevorzugt mindestens 30 min, um möglichst aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Selbstverständlich kann auch, z.B. mit Hilfe der MEA-Neurochips, eine kontinuierliche Analyse erfolgen.
Erfindungsgemäß kann die Analyse der iktalen Aktivität z.B. mit Mikroelektroden-Array (MEA)-Neurochips oder mit einem bildgebenden Verfahren auf Basis von Kalzium (Ca- Imaging) durchführt werden. MEA-Neurochips sind besonders geeignet, wenn man die elektrische Aktivität der einzelnen Neurone in ihrem Gesamtgefüge im Netzwerk untersuchen möchte, um Eigenschaften wie Form und Dauer der Bursts, Synchronität, Refraktärzeit zwischen Bursts usw. zu untersuchen. MEA-Neurochips können z.B. in einem Multiwell-For- mat für Hochdurchsatzscreenmg verwendet werden. Ca-Imaging ist besonders geeignet, wenn man die Aktivität aller Zellen (inklusive elektrisch nicht aktiver Glia oder derjenigen Neurone, die sich nicht in unmittelbarer Nähe zu einer Elektrode befinden) untersuchen möchte. Bevorzugt werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren neben Häufigkeit und/oder Dauer der iktalen Bursts auch andere Merkmale der iktalen und inter-iktalen Aktivität analysiert, z.B. Auftreten und Dauer von Interburst-Intervallen, der prozentuale Anteil der Spikes in Bursts bezogen auf die Gesamtzahl aller Spikes, die Anzahl der Populationsbursts pro Zeiteinheit, die mittlere Anzahl der Spikes pro Bursts, Merkmale, die die Synchronität und Konnektivität der Neurone eines Netzwerkes beschreiben, wie zum Beispiel Variationskoeffizienten der Aktivität pro Zeiteinheit in verschiedenen Neuronen oder Maße basierend auf der Informationsentropie, das Auftreten und die Häufigkeit prä-iktaler Bursts und/oder das Vorhandensein und die Dauer der post-iktalen Depression. Insbesondere wird hier die Anzahl der Bursts und Spikes vor und nach den iktalen Bursts in Verhältnis zu den gemittelten Spike und Burstraten ins Verhältnis gesetzt.
In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren als Hochdurchsatzverfahren, bevorzugt in einem Multiwell-Format, durchgeführt. Dabei können innerhalb kurzer Zeit, bevorzugt in ca. 1-2 h Analysen von mindestens ca. 24-48 Substanzen in Einzelkonzentrationen durchgeführt werden. Der genannte Zeitraum betrifft dabei nur die Schritte b-d des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens formuliert man eine Substanz, bei der mit diesem Verfahren eine gewünschte neurologische Aktivität, z.B. antikonvulsive Aktivität, festgestellt wurde, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Diese kann z.B. einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfassen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer Substanz, deren gewünschte neurologische, z.B. antikonvulsive Aktivität in einem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, zur Behandlung einer Störung, bei der diese neurologische Aktivität die Beschwerden eines Patienten lindert oder behebt. So wird eine antikonvulsive Substanz z.B. zur Behandlung von Epilepsie eingesetzt werden. Eine Kombination mit anderen antikonvulsiven Substanzen ist möglich.
Gegenstand der Erfindung ist eine Population von hippocampalen Neuronen in Zellkultur, welche iktale Aktivität, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, zeigt, wobei die hippocampalen Neuronen von dissoziierten embryonalen, bevorzugt nicht-humanen, insbesondere murinen, Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 oder Tag 16, bevorzugt Tag 15, der Embryonalentwicklung entsprechen, oder von bevorzugt humanen Stammzellen abgeleitet sind, wobei die Population sich auf einem MEA- Neurochip befindet. Nicht alle Populationen von hippocampalen Neuronen, welche wie oben beschrieben hergestellt wurden, zeigen iktale Aktivität. Es können jedoch vorteilhafterweise vor dem Testen solche Populationen selektiert werden, welche iktale Aktivität aufweisen. Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Vielzahl von Populationen von hippocampalen Neuronen in Zellkultur, wobei die Populationen so ausgewählt sind, dass alle Populationen iktale Bursts (innerhalb eines Kontroll-Zeitraumes von mindestens 2 h) zeigen, wobei die hippocampalen Neuronen von embryonalen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium murinen Zellen an Tag 15 bis Tag 18 der Embryonal entwicklung entsprechen, oder von Stammzellen abgeleitet sind. Eine Vielzahl umfasst mindestens 6, bevorzugt mindestens 10, mindestens 20, mindestens 50 oder mindestens 100 Populationen. Jede Population befindet sich bevorzugt auf einem MEA- Neurochip oder einem anderen zum Hochdurchsatzscreening geeigneten Format (Multiwell- MEA-Chips, Multiwell-Platten für Calcium Imaging). In einer Ausführungsform werden in einem erfindungsgemäßen Verfahren nur solche Populationen mit einer zu testenden Substanz in Kontakt gebracht, welche iktale Aktivität, insbesondere iktale Bursts aufweisen. In einer Ausführungsform werden alle Populationen mit der zu testenden Substanz in Kontakt gebracht, aber nur Daten von Populationen, welche iktale Aktivität aufweisen, analysiert. Auf das physische Verwerfen der Populationen, welche keine iktale Aktivität aufweisen, kommt es also nicht an.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computerprogrammprodukt oder eine Sensorvorrichtung zur Analyse der iktalen Aktivität einer Population von Neuronen in einem Netzwerk in Zellkultur, wobei das Computerprogrammprodukt oder die Sensorvorrichtung bei Verwendung die zeitliche Abfolge aller Aktionspotenziale einer Vielzahl von Neuronen in Bezug auf Dauer und/oder Häufigkeit von iktalen Bursts analysiert, wobei optional auch Interburst-Intervall, %Spikes in Bursts, Burst Event Rate, Burst Spikezahl, Spike Simplex (beschreibend für die Konnektivität und Komplexität zwischen Neuronen einen Netzwerkes), inter-iktale Events und/oder post-iktale Depression analysiert werden. Das erfindungsgemäße Computerprogrammprodukt ist speziell dazu geeignet, eine multivariate Datenanalyse anhand einer Vielzahl (>200) von Aktivitätsbeschreibenden Merkmalen der elektrischen Aktivität der Neurone zu ermöglichen, welche die Aktivität der Neurone bezüglich der allgemeinen Aktivität, Eigenschaften der Bursts, Regelmässigkeit der Bursts und Synchronität, sowie Konnektivität der Netzwerke charakterisieren. Kommerziell erhältliche Computerprogramme erlauben nur eine limitierte Anzahl von Analysen. Die Definition der Bursts kann individuell in Abhängigkeit der elektrischen Aktivität der Neurone eingestellt werden. So ist es möglich, gleichzeitig die Eigenschaften der physiologisch normalen Bursts in den interiktalen Phasen (wenige 100 ms) und die Eigenschaften der iktalen, pathophysio logisch langen Bursts (Dauer von mindestens 5 s) zu analysieren. Das Computerprogrammprodukt kann auf einem Datenträger gespeichert sein. Die Sensorvorrichtung umfasst einen Sensor, z.B. einen MEA-Neurochip und/oder eine Aufnahmevorrichtung zur Weitergabe der vom Sensor erhaltenen Daten. Die Sensorvorrichtung umfasst ferner eine Vorrichtung zur Verarbeitung der Daten. Diese kann durch das Computerprogrammprodukt gesteuert werden. Alternativ ist auch eine Hardwaremäßige Umsetzung denkbar. Die Sensorvorrichtung umfasst bevorzugt auch Mittel zur Ausgabe und/oder Speicherung der Daten.
Hierin zitierte Dokumente werden durch die Referenz vollumfänglich aufgenommen. Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung illustrieren, nicht aber beschränken.
Legende
Fig. 1 Schnittführung und Präparation des Hippocampus aus dem Großhirn embryonaler Mäuse. 1. Hirnhälfte (von innen) 2. Hippocampus anheben 3. Hippocampus abtrennen
Fig. 2 Aktivitätsmuster eines Netzwerkes aus Hippocampus Gewebe, präpariert an Embryonaltag El 8. Die Verteilung der Aktionspotenziale der hippocampalen Neurone ist diffus, Aktionspotenziale treten sowohl einzeln, aber bevorzugt in Bursts (Salven kurz hintereinander folgender Aktionspotenziale) auf. Dargestellt ist ein Ausschnitt von 80 Sekunden aus der Gesamtaufzeichnung der Aktionspotenziale von 22 Neuronen. Jede Zeile stellt die Aktivität eines Neurons dar.
Fig. 3 Spontan auftretende Aktionspotenziale eines Netzwerkes von 19 Neuronen einer Hippocampus Kultur, die an Tag E15 präpariert wurde. Das Netzwerk ist charakterisiert durch sehr lange (>5 s) synchrone Entladungen oder iktale Bursts der Neurone, bezeichnet mit B. Diese Populationsbursts werden von einer länger andauernden Phase der Inaktivität (post- iktale Depression) gefolgt (bezeichnet mit C). Vor Beginn eines Populationsbursts treten hochsynchrone kurze Burts auf, die der prä-iktalen Aktivität entsprechen (bezeichnet mit A).
Fig. 4 Aufzeichnung der Aktionspotenziale eines Netzwerkes von Hippocampus Neuronen, die an E17 präpariert wurden nach DIV28. Die Aktivität ist durch ~9s andauernde synchrone Populationsbursts gekennzeichnet. Nach Beendigung eines Populationsbursts ist eine kurze Phase der Inaktivität erkennbar (A). Eine Applikation von 10 μΜ Carbamazepin führte noch nicht zu einer Reduktion der Länge dieser Populationsbursts (B). Eine Applikation von 50 μΜ Carbamazepin auf dasselbe Netzwerk führte zur Verhinderung der langen Populationsbursts. Alle Neurone sind aber noch aktiv und generieren kurze Bursts (C). Dargestellt sind die Timestamps (Spikes) von 10 Neuronen über eine Dauer von jeweils 80 s.
Fig. 5 Auswahl von 14 Aktivitäts-beschreibenden Merkmalen zur Charakterisierung der Effekte von 10 μΜ und 50 μΜ Carbamazepin auf die langen Bursts der Hippocampus- Neuronenkulturen, welche am E15 präpariert wurden (siehe Fig. 3). Die allgemeine Aktivität (spike rate und burst rate) wird verringert. Es kommt ebenfalls zur Verkürzung der Burst- Dauer um 50%. Die Bursts werden insgesamt kleiner und weniger kompakt.
Fig. 6 Vergleich des Einflusses von Carbamazepin auf 14 Aktivitätsbeschreibende Merkmale in neuronalen Netzwerken des Hippocampus, präpariert an Tag E15 (grüne Balken) und an Tag El 8 (graue Balken).
Fig. 7 Vergleich der Effekte von 500 mM Valproat auf die normalen (<5 s) Bursts und der langen, iktalen Bursts (> 5 s) für dasselbe Hc Netzwerk. Die Zellen wurden aus embryonalen Mäusen an E15 präpariert und nach 28 DIV wurde die Aktivität auf MEAs gemessen. Die kurzen und iktalen Bursts wurden mit verschiedenen Burst-Detektions-Methoden ermittelt und separat analysiert. Dargestellt sind die relativen Änderungen nach einer Applikation von 500 mM Valproat bei 9 Merkmalen. Während Valproat kaum die normalen Bursts beeinflußt, sind deutliche Effekte bei den Populationsbursts zu erkennen.
Beispiele
Werden neuronale Netzwerke von Hippocampus-Gewebe aus embryonalen Mäusen am Embryonaltag E14-E19, bevorzugt E15, präpariert und über 4 Wochen kultiviert, können z.B. nach 28 DIV (days in vitro) sehr lang andauernde, über das Netzwerk synchrone Bursts (Salven von Aktionspotenzialen) aufgezeichnet werden (z.B. Fig. 3).
Zur Gewinnung solcher Kulturen wurde eine zeitlich verpaarte Maus durch zervikale Dislokation am errechneten Embryonaltag E15 getötet, das Peritoneum (Bauchfell) geöffnet, der Uterus frei geschnitten und die Embryonen entnommen und in eine Petrischale mit Präparationsmedium überführt. Die Embryonen wurden nacheinander aus dem Uterus und den Eihäuten entnommen und in eine separate Petrischale mit Präparationsmedium überführt. Das Alter der Embryonen wurde anhand eines Katalogs zur Altersbestimmung von Maus- Embryonen bestimmt und dokumentiert. Nach dem Dekapitieren der Embryonen wurden die Köpfe in eine neue Petrischale mit Präparationsmedium überführt. Mit Hilfe einer feinen Pinzette wurde das komplette Großhirn präpariert und in eine neue Petrischale mit Präparationsmedium überführt. Danach wurden die beiden Hirnhälften getrennt, die Hippocampi abgetrennt, von den Hirnhäuten befreit und in einer neuen Petrischale mit Präparationsmedium gesammelt. Lokalisierung und Schnittführung zur Präparation der Hippocampi ist in Fig. 1 dargestellt. Nachdem alle Hippocampi präpariert wurden, wurde das Präparationsmedium vorsichtig mit einer Mikroliterpipette abgezogen, und das Gewebe wurde mit gekreuzten Skalpellklingen zerkleinert. Dazu wurden die Klingen in entgegen gesetzter Richtung eng aneinander vorbei gezogen. Der Gewebshaufen wurde auf diese Weise mit fünf parallelen Schnitten einmal von unten nach oben und einmal von oben nach unten durchgearbeitet. Ziel des Vorgangs ist die Vergrößerung der Oberfläche in Hinblick auf die folgende enzymatische Zerkleinerung. Die enzymatische Zerkleinerung erfolgte durch eine 20 min dauernde Inkubation in 3 ml Papain und 50 μΐ DNase C02-Brutschrank bei 37 °C. Danach wurde das Gewebe-Enzym-Gemisch für 4 min bei 800 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer serologischen Pipette vorsichtig abgezogen und verworfen. Das Zellpellet wurde mit einer 5 ml serologischen Pipette titriert, bis die Zellsuspension trüb erscheint. Danach wurde das Zentrifugenröhrchen für 5 min stehengelassen, damit sich größere Zellverbände absetzen. Der Überstand wurde dann in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und weiter verarbeitet. Die Zellzahl wurde mittels einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und die Zellzahl eingestellt. Auf jedes Elektrodenfeld wurde ein Tropfen mit jeweils 300000 Zellen gegeben. Zusätzlich wurde noch jeweils ein Tropfen mit je 100000 Zellen neben jedes Elektrodenfeld als„Feeder area" zum Konditionieren der Zellen gegeben.
Die Zellsuspension wurde auf die Elektrodenfelder der MEA-Neurochips aufgebracht, die zuvor mit Poly-D-Lysin und Laminin zum besseren Anheften der Zellen behandelt wurden. Die MEA Neurochips mit den Zellsuspensions-Tropfen wurden im Brutschrank inkubiert, nach 2 h wurden die Chips mit jeweils 3 ml Zellkulturmedium (DMEM) aufgefüllt. Die Kultivierung erfolgt in einem Brutschrank bei 37°C und einem C02 Gehalt von 10%. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage gefüttert, indem jeweils 1/3 des Mediums durch frisches Medium ersetzt wurden. Wenn die Gliazellen konfluent waren (typischerweise nach 4-5 Tagen nach Zellaussaat), wurde eine antimitotische Behandlung durch Zugabe von 17 μΜ FDU (Fluoro- Desoxy-Uridine) und 41.3 μΜ Uridine ins Kulturmedium durchgeführt. Dies verhindert die weitere Proliferation der Gliazellen. Die beiden Antimitotika wurden bei jedem weiteren Mediumwechsel ausschleichend wieder entfernt. In dem vorliegenden Versuch wurde nach 27 Tagen in Kultur die elektrische Aktivität der kultivierten Neurone untersucht. Elektrische Aktivität war bereits nach 7 d in vitro registrierbar. Die Aktivität kann nach 7d oder später, z.B. nach ca. 14 d, nach ca. 21 d oder bevorzugt nach ca. 27 oder 28 d analysiert werden.
Beispiel 2
Valproinsäure (Valproat) findet klinische Anwendung bei der antikonvulsiven Behandlung. Die Substanz besitzt aber auch sedierende Nebenwirkungen. Die Effekte von Valproat auf hippocampale Netzwerke, die an Tag E15 präpariert wurden, sind in Fig. 7 gezeigt. Das Netzwerk zeigte deutliche Populationsbursts einer Dauer von 16.2 s. Eine Applikation von 2 mM Valproat induzierte eine Verringerung der Dauer der Populationsbursts um 41% auf 9.7 s. Die Dauer der normalen, physiologischen Bursts veränderte sich dahingegen kaum (Kontrolle: 300 ms, 2 mM Valproat: 272 ms). Neben der Burstdauer nahm auch die Fläche unter den Bursts (burst area) und die Anzahl der Spikes in den Bursts (burst spike number) spezifisch bei den langen Populationsbursts nach Zugabe von Valproat ab. Auch die Form der Bursts hatte sich bei den Populationsbursts und den normalen Bursts in spezifischer Art und Weise verändert. Bei den Populationsbursts war eine Zunahme der Bursts mit mehreren Spike-Maxima zu verzeichnen, wohingegen es bei den normalen Bursts zu einer Abnahme des Anteils mit mehreren Spike-Maxima kam. Die Burst Event Rate (Rate der Populationsbursts) nahm bei 2 mM Valproat ab. Der Anteil der Neurone, die an synchronisierten Burst-Events teilnehmen, nahm unter Einfiuss von Valproat bei den langen Populationsbursts ab, wohingegen sich die Synchronität der Netzwerke in den normalen Bursts nicht änderte (Merkmal Syn all mean, beschreibt die Stärke synchroner Aktivität in Form von Latenzen des Beginns von Bursts innerhalb eines Populationsbursts). Parallel dazu kam es zu einer Abnahme der Spikerate und der Burstrate der normalen Bursts durch Valproat. Diese Abnahme der allgemeinen Aktivität ist als ein Indikator für die sedierenden Eigenschaften der Substanz anzusehen. Demnach können Substanzen nach ihren sedierenden und antikonvulsiven Eigenschaften unterschieden werden, indem Merkmale wie die Abnahme der Dauer der Populationsbursts, Burst Area und Burst spike number, Burst shape multi (Anteil der Bursts, bei denen mehrere Peak-Frequenzen auftreten) oder Syn all mean als Marker für antikonvulsive Aktivität und Abnahme der Spikerate und Burstrate als Marker für sedierende Wirkungen verwendet werden.
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WO2010090285

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Testen einer Substanz auf ihre neurologische Aktivität, bei dem man
(a) eine Population von hippocampalen Neuronen in Zellkultur kultiviert, welche iktale Aktivität, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, zeigt,
(b) die iktale Aktivität der Population analysiert;
(c) die Population mit der zu testenden Substanz in Kontakt bringt;
(d) die iktale Aktivität der Population analysiert,
wobei die zu testende Substanz eine neurologische Aktivität aufweist, wenn die iktale Aktivität sich vor und nach dem in Kontakt Bringen unterscheidet,
dadurch gekennzeichnet, dass die hippocampalen Neuronen von dissoziierten embryonalen, bevorzugt nicht-humanen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 bis Tag 18, bevorzugt Tag 15, der Embryonalentwicklung entsprechen, oder von bevorzugt humanen Stammzellen abgeleitet sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die neurologische Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend sedierende Aktivität, anxiolytische Aktivität, antidepressive Aktivität, Stimmungsstabilisierende oder stimmungsaufhellende Aktivität, antipsychotische Aktivität, konzentrationssteigernde Aktivität, aufmerksam- keitssteigernde Aktivität, Gedächtnis-verbessernde Aktivität, analgetische Aktivität, insbesondere vorbeugend oder therapeutisch gegen Migräne, oder antikonvulsive Aktivität.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die neurologische Aktivität antikonvulsive Aktivität ist.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verhältnis verschiedener neurologischer Aktivitäten zueinander analysiert, insbesondere das Verhältnis von antikonvulsiver zu sedierender Aktivität.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen von Zellen aus dem Hippocampus von Maus-Embryonen an Tag 15 bis Tag 18 der Embryonalentwicklung abgeleitet sind, bevorzugt an Tag 15 bis Tag 16, mehr bevorzugt an Tag 15.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das embryonale Entwicklungsstadium dadurch gekennzeichnet ist, dass die Embryonen bereits eine beginnende Schichtung des Hippocampus aufweisen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen von Stammzellen, insbesondere embryonalen Stammzellen oder neuronalen Stammzellen, abgeleitet sind, wobei in einer Ausführungsform humane Stammzellen verwendet werden, welche bevorzugt nicht durch Zerstörung menschlicher Embryonen gewonnen wurden.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen vor dem Testen 7 bis 40 Tage, mehr bevorzugt etwa 27 bis 34 Tage in vitro kultiviert wurden, bevorzugt auf Mikroelectroden-Array (MEA)-Neurochips, mehr bevorzugt MEA-Multiwell-Chips.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die iktalen Bursts bei der Population von hippocampalen Neuronen ohne chemische, elektrische oder physikalische Induktion erfolgen.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von hippocampalen Neuronen durch ein Verfahren erhältlich ist, Schritte umfassend oder aus Schritten bestehend, bei denen man
(i) Hippocampus-Gewebe eines bevorzugt nicht-humanen Embryos in einem Entwicklungsstadium, das einem murinen Embryo an Tag 15 bis Tag 18, insbesondere Tag 15, der Embryo nalentwicklung entspricht, präpariert,
(ii) das Hippocampus-Gewebe zerkleinert und dissoziiert, um eine Suspension von Zellen zu erhalten,
(iii) die Zellsuspension auf ein geeignetes Substrat, bevorzugt einen MEA-Neurochip, aufbringt,
(iv) die Zellen unter physiologischen Bedingungen kultiviert, wobei die Kultur bevorzugt für 7 bis 40 Tage, insbesondere für etwa 27-34 Tage, erfolgt.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die analysierte iktale Aktivität iktale Bursts, insbesondere deren Häufigkeit und/oder Dauer, Interburst-Intervall, %Spikes in Bursts, Burst Event Rate (Rate der Populationsbursts), Burst Spikezahl, prä-iktale Events und/oder post-iktale Depression umfasst, indem bei letzeren die prä-iktale und die post-iktale Aktivität mit der mittleren Aktivität in Beziehung gesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Analyse der iktalen Aktivität mit Mikroelectroden-Array (MEA)-Neurochips oder mit einem bildgebenden Verfahren auf Basis von Calcium durchführt.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Substanz mit einer gewünschten neurologischen Aktivität in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
14. Eine Population von hippocampalen Neuronen in Zellkultur, welche iktale Aktivität, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, zeigt, wobei die hippocampalen Neuronen von dissoziierten embryonalen, bevorzugt nicht-humanen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium Zellen muriner Embryonen an Tag 15 bis Tag 16, bevorzugt Tag 15, der Embryonalentwicklung entsprechen, oder von bevorzugt humanen Stammzellen abgeleitet sind, wobei die Population sich auf einem MEA- Neurochip befindet.
15. Eine Vielzahl von Populationen von hippocampalen Neuronen in Zellkultur, wobei die Populationen so ausgewählt sind, dass alle Populationen iktale Aktivität, insbesondere spontane synchronisierte Salven von Aktionspotentialen mit einer Dauer von mindestens 5 s, die als iktale Bursts bezeichnet werden, innerhalb von 2 Stunden zeigen, wobei die hippocampalen Neuronen von embryonalen Zellen, die in ihrem Entwicklungsstadium murinen Zellen an Tag 15 bis Tag 18 der Embryonal entwicklung entsprechen, oder von Stammzellen abgeleitet sind, wobei die Vielzahl mindestens 6, bevorzugt mindestens 10, mindestens 20, mindestens 50 oder mindestens 100 Populationen umfasst, wobei jede Population sich bevorzugt auf einem MEA-Neurochip oder einem anderen zum Hochdurchsatzscreening geeigneten Format befindet.
16. Computerprogrammprodukt oder Sensorvorrichtung zur Analyse der iktalen Aktivität einer Population von Neuronen in Zellkultur, wobei das Computerprogrammprodukt oder die Sensorvorrichtung bei Verwendung Aktionspotenziale einer Vielzahl von Neuronen der Population in Bezug auf Dauer und/oder Häufigkeit von iktalen Bursts analysiert, wobei optional auch Interburst-Intervall, %Spikes in Bursts (prozentualer Anteil von Spikes in Bursts, relativ zur Gesamtzahl aller Spikes), Burst Event Rate, Burst Spikezahl, Synchronitäts- und Konnektivitäts-Eigenschaften, prä-iktale Events und/oder post-iktale Depression analysiert werden.
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