CN109908178A - 脂肪血管基质组分在制备膝关节损伤治疗剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂肪血管基质组分在制备膝关节损伤治疗剂中的应用。所述脂肪血管基质组分为自体脂肪血管基质组分。所述治疗剂的使用方法为：(1)患者进行抽脂微创手术，抽取脂肪组织50ml；(2)利用脂肪组织提取脂肪血管基质组分，制备治疗剂10ml；(3)使用注射器将治疗剂注射入患者膝关节腔内，单侧膝关节腔注射3ml。本发明采用自体组织移植，方法快速简单，一次治疗，终身受益，避免关节置换，大大提高患者的生活质量，解放社会生产力。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及脂肪血管基质组分在制备膝关节损伤治疗剂中的应用。
背景技术
膝关节由于承载着身体重量，是人体最早衰老和损伤的部位，膝关节损伤常见的表现有髌骨软化、软骨缺损、软骨下骨炎症、软骨下骨髓水肿、半月板撕裂、韧带钙化、骨刺、关节积液、滑膜炎等等，可由衰老或运动损伤引起，由此带来的疼痛、关节僵直、关节变形等问题严重影响患者的生活质量，严重者丧失劳动力。目前临床上常见的处理方法有关节镜探查清扫、抽积水、关节注射玻璃酸钠、消炎药、激素进行抗炎止痛外加消肿敷贴和口服止痛药以及一些物理疗法，严重者行关节置换手术。近年来，发病人群成年轻趋势，发病率增加。
常规处理方法只能缓解症状，并不能阻止病程继续恶化，而关节置换的禁忌症比较严格，据国家软骨协会的统计，全国每年行关节置换的总例数为10万例左右，而有关节问题的总人数为1亿2千万。另外，人工关节是有使用寿命的，使用期从7、8年至20年不等，如果过早进行关节置换，寿命到期难免需要二次手术，给病人带来更大痛苦，到时病人的身体的状况也不能保证一定能做二次手术。临床上需要一种可以推迟或避免关节置换，不仅能阻止关节状况恶化，还能让关节状况好转的治疗方法。
血管基质组分(SVF)是人体脂肪中存在的成分，最早于2001年由美国杜克大学的Zuk PA等教授发现，富含脂肪前体细胞、间充质细胞、类血管上皮细胞、T调节细胞和M2巨噬细胞等，具有强大的自我更新、增殖能力及分化潜能，可替代坏死细胞，可通过旁分泌和自分泌合成多种生物活性因子，激活细胞及血管再生途径，对软骨起到营养作用，并具有归巢作用，在体内微环境的作用下能主动迁移至软骨缺血或受损部位进行修复重建，具有免疫抑制和抗炎作用，主动表达主要组织相容性复合体而逃避宿主的免疫清除，并通过抑制T淋巴细胞活性和抑制自然杀伤细胞分化实现抗炎作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了脂肪血管基质组分在制备膝关节损伤治疗剂中的应用。
本发明所采用的技术方案如下：
脂肪血管基质组分在制备膝关节损伤治疗剂中的应用。
其进一步的技术方案为，所述脂肪血管基质组分为自体脂肪血管基质组分。
其进一步的技术方案为，所述治疗剂的使用方法为：
(1)患者进行抽脂微创手术，抽取脂肪组织50ml；
(2)利用脂肪组织提取脂肪血管基质组分，制备治疗剂10ml；
(3)使用注射器将治疗剂注射入患者膝关节腔内，单侧膝关节腔注射3ml。
其进一步的技术方案为，利用脂肪组织提取脂肪血管基质组分的方法包括：
(11)洗涤脂肪：用脂肪清洗液洗涤抽取的脂肪组织，重复3～4次；直至洗出的废液比较澄清为止。
(12)消化脂肪：将洗涤后的脂肪置于离心管中，并加入等量的脂肪消化酶溶液，无菌情况下置入37℃恒温振荡培养箱中消化30～60min，振荡频率为200rpm；
(13)脂肪血管基质组分分离：将消化好的脂肪放入离心机，转速1100rpm,离心8min；之后去除上层脂肪及废液，用细胞缓冲液悬浮细胞，用100μm的滤网过滤掉余下的脂肪组织；之后再次放入离心机，转速1100rpm，离心5min；之后取出上清液，获得脂肪血管基质组分；最后加入生理盐水重悬脂肪血管基质组分，获得脂肪血管基质组分细胞溶液。
本发明的有益效果如下：。
本发明采用自体组织移植，方法快速简单，一次治疗，终身受益，避免关节置换，不涉及任何医学伦理问题，已经完成的I期临床实验充分表明了SVF对膝关节损伤的修复是安全有效的，本治疗方法有望摘掉包括骨关节炎在内的关节损伤“不死的癌症”的帽子，大大提高患者的生活质量，解放社会生产力。
附图说明
图1为案例1治疗前的膝关节影像。
图2为案例1治疗后的膝关节影像。
图3为案例2治疗前的膝关节影像。
图4为案例2治疗后的膝关节影像。
图5为案例3治疗前的膝关节影像。
图6为案例3治疗后的膝关节影像。
图7为案例4治疗前的膝关节影像。
图8为案例4治疗后的膝关节影像。
具体实施方式
实施例1。
实施例为动物实验。
1、大鼠骨性关节炎模型的建立：
选取实验用SD大鼠36只，适应性饲养7天以后，随机分为移植组、模型组和对照组，每组12只。
移植组每天早晚各用4℃冷水刺激大鼠双腿膝关节处各2小时。持续30天，以建立大鼠骨性关节炎模型。移植组在模型建成后注射膝关节损伤治疗剂进行修复。
模型组在与移植组同一部位注射等量生理盐水。
对照组不予处理。
各组大鼠在移植治疗后4周评定关节炎指数、关节肿胀度，检测脾脏CD4+CD25+调节性T细胞水平以及血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1水平。
2、关节炎指数(AI)评分法(0-4级)：
0分：无关节炎；1分：关节有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节中度红肿；3分：关节重度红肿；4分：关节严重红肿且不能负重。
3、移植组注射膝关节损伤治疗剂进行修复的方法：
(1)抽脂手术。从大鼠腹股沟处取2-5ml脂肪组织。
(2)利用脂肪组织制备治疗剂。经消化、离心获得治疗剂1ml。
(3)注射。使用治疗剂进行大鼠双腿膝关节腔内注射，每侧0.5ml。
于注射治疗剂后4周后进行大鼠关节炎指数评分、关节肿胀度评分，以及检测脾脏CD4+CD25+调节性T细胞水平以及血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1水平。
将治疗前后的数据用均数±标准差表示，统计学分析采用双样本等方差假设的t检验法，以P<0.05为差异有显著性。
4、实验结果：
(1)模型组大鼠关节炎指数明显高于对照组(P<0.05)，移植组大鼠关节炎指数明显低于模型组(P<0.05)；
(2)模型组大鼠后肢关节肿胀度明显高于对照组(P<0.05)，移植组大鼠后肢关节肿胀度明显低于模型组(P<0.05)；
(3)模型组大鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞水平明显低于对照组(P<0.05)；移植组大鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞水平明显高于模型组和对照组(P<0.05)；
(4)模型组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P<0.05)；移植组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平明显低于模型组(P<0.05)，移植组大鼠血清白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平高于对照组(P<0.05)；
(5)模型组大鼠血清转化生长因子β1水平明显低于对照组(P<0.05)；移植组大鼠血清转化生长因子β1水平明显高于模型组和对照组(P<0.05)；
结果表明，治疗剂对膝关节损伤的修复是安全有效的，而且它主要通过调节骨关节炎大鼠体内细胞因子水平和免疫功能发挥治疗作用。
实施例2。
实施例2为临床案例。
1、患者纳入标准：
(1)男性候选者23岁至59岁，女性患者27岁至59岁(育龄妇女确认没有怀孕且治疗4个月内放弃怀孕)；
(2)患有单腿或双腿膝关节退行性炎症，或者由运动造成的关节损伤，症状包括髌骨软化、软骨缺损、软骨下骨炎症、软骨下骨髓水肿、半月板撕裂、韧带钙化、骨刺、关节积液、滑膜炎等，KOOS/HOOS分级为IV级(含)以下，Kellgren-lawrence评级III级(含)以下；
(3)身体健康状况以ASA分级为I级、II级和III级为主。病人可以自主移动。
(4)受试病人确认没有活动性肿瘤、没有活动性炎症、没有梅毒、艾滋病。
(5)事先拍摄患病膝关节的MRI片子。
(6)体重指数BMI＜30
(7)参与受试人员必须要完全理解知情同意书并且自愿签署，而且要配合参与全程随访评估。
2、符合条件的纳入者分别用1、膝关节lysholm评分；2、骨关节炎指数WOMAC评分；3、SF-36量表评分；4、Kellgren Lawrence影像学分级。
3、患者通过一次门诊手术完成治疗。治疗过程如下：
(1)抽脂。患者在门诊进行抽脂微创手术，在后腰或下腹部抽脂约50ml。
(2)将抽取的脂肪组织交给制备人员，通过消化、离心，制备治疗剂10ml，时间约为70分钟。
(3)注射。使用10ml注射器将治疗剂注射入患者膝关节腔内，单侧膝关节腔注射3ml。如果需要，则注射双侧共6ml。剩余治疗剂用于细胞计数，免疫学标志物分别是间充质细胞的CD49d和血管内皮细胞的CD31。
4、患者治疗后随访，并将随访结果记录在档案里。记录时间节点分别为术前、术后1天、1周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年，其中术后1个月、3个月、6个月和1年分别进行和术前评估一样的lysholm、WOMAC、SF-36评分，组内时间点比较采用重复测量方差分析，两两比较采用配对t检验，计数资料采用x2检验，检验水平P＝0.05。患者术前和术后4个月行受损关节部位MRI影像拍摄(相同部位相同条件)。
实施例2包括四个案例。
案例1：
(1)患者情况：约翰.莫里斯，65岁，慢性关节炎；
(2)治疗前：约翰.莫里斯是一位赛车爱好者、直升机飞行员，但因为膝关节损伤，不能驾驶，不能赛车，且膝关节持续疼痛。
(3)治疗后：接受治疗剂在膝关节关节腔注射治疗后，可以驾驶，可以赛车，而且疼痛消失，自述像是重回35岁。
(4)影像对比见图1和图2。图1为案例1治疗前的膝关节影像，图2为案例1治疗后的膝关节影像。
案例2：
(1)患者情况：王女士，67岁，膝关节疼痛；
(2)治疗前：王女士是位退休医生，随着年龄的增加，膝关节开始出现退化，行动变得困难，双膝关节开始有刺痛感，后来痛感越来越强烈。在医院接受一段时间的传统治疗后，效果并不理想。
(3)治疗后：接受治疗剂膝关节关节腔注射治疗后，1个月后，王女士双膝痛感显著改善，3个月后回访发现，王女士双膝关节痛感基本消失，生活恢复正常。
(4)影像对比见图3和图4。图3为案例2治疗前的膝关节影像，图4为案例2治疗后的膝关节影像。对比显示，其骨关节已经生成软骨，骨间隙增加明显。
案例3：
(1)患者情况：郑女士，60岁，慢性关节炎。
(2)治疗前：郑女士双膝关节损伤严重，行动十分不便，疼痛多年，严重影响生活质量。2014年，郑女士选择左膝关节做了关节置换手术。2015年4月，郑女士接受了治疗剂在膝关节关节腔注射治疗。
(3)治疗后：1个月后，郑女士的疼痛基本消失，状况好了很多。一段时间过后，郑女士腿的力气也比以前有了大幅的提高。
(4)影像对比。影像对比见图5和图6。图5为案例3治疗前的膝关节影像，图6为案例3治疗后的膝关节影像。图5和图6的影响对比显示，郑女士右膝关节生出了软骨，骨间隙明显增加。
案例4：
(1)患者情况：刘先生，61岁，半月板撕裂。
(2)治疗前：刘先生是位教师，每天都需要较长时间站立、走动，增加了他的双膝关节磨损，痛感逐渐加重。经医院检查，刘先生半月板软组织磨损较为严重，并建议其接受双膝关节置换术，考虑到手术风险，刘先生选择了保守治疗。最终在2015年5月，刘先生选择了治疗剂在膝关节关节腔注射治疗。
(3)治疗后：1个月后，刘先生双膝痛感显著改善，其中右腿恢复情况良好，已无明显痛感。
(4)影像对比。影像对比见图7和图8。图7为案例4治疗前的膝关节影像，图8为案例4治疗后的膝关节影像。图7和图8的影像对比显示，刘先生半月板软组织得到较好的修复。
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的基本结构的情况下，本发明可以作任何形式的修改。
Claims (4)
1.脂肪血管基质组分在制备膝关节损伤治疗剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂肪血管基质组分为自体脂肪血管基质组分。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗剂的使用方法为：
(1)抽取患者的脂肪组织50ml；
(2)利用脂肪组织提取脂肪血管基质组分，制备治疗剂10ml；
(3)使用注射器将治疗剂注射入患者膝关节腔内，单侧膝关节腔注射3ml。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用脂肪组织提取脂肪血管基质组分的方法包括：
(11)洗涤脂肪：用脂肪清洗液洗涤抽取的脂肪组织，重复3～4次；
(12)消化脂肪：将洗涤后的脂肪置于离心管中，并加入等量的脂肪消化酶溶液，无菌情况下置入37℃恒温振荡培养箱中消化30～60min，振荡频率为200rpm；
(13)脂肪血管基质组分分离：将消化好的脂肪放入离心机，转速1100rpm,离心8min；之后去除上层脂肪及废液，用细胞缓冲液悬浮细胞，用100μm的滤网过滤掉余下的脂肪组织；之后再次放入离心机，转速1100rpm，离心5min；之后取出上清液，获得脂肪血管基质组分；最后加入生理盐水重悬脂肪血管基质组分，获得脂肪血管基质组分细胞溶液。
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2019
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