CN104099295A - 磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于促进间充质干细胞成骨分化技术领域，公开了一种磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。其中磁性纳米材料为活性成分，其具有促进间充质干细胞分化成成骨细胞的作用。毒性检测证明本发明的三氧化二铁纳米修饰的纳米钌和三氧化二铁纳米修饰的纳米硒磁性纳米材料对间充质干细胞几乎无毒性。茜素红和油红O染色证明本发明制备的磁性纳米材料具有促进间充质干细胞成骨分化，抑制成脂分化的作用。本发明制备的磁性纳米材料，如三氧化二铁纳米修饰的纳米钌或纳米硒，直接以过量的纳米钌或纳米硒与三氧化二铁纳米耦合，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。
Description
技术领域
本发明属于促进间充质干细胞成骨分化技术领域，特别涉及一种磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，它是人体新生细胞从增殖、迁移、分化直至达到成熟这一系列过程中的第一个细胞。关于干细胞的研究已成为目前生物学上最具挑战性、也最具有吸引力的领域之一。干细胞按其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。而间充质干细胞(MSCs，mesenehymal stem cells)就是成体干细胞的其中一种。作为一类具有自我更新能力的成体干细胞，间充质干细胞可以向多种细胞组织类型分化。它不仅可以向多种间质来源的细胞谱系分化，例如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌键细胞等等，也可以向其他的细胞谱系分化，比如星形胶质细胞、肌原细胞、心肌细胞以及神经细胞等。由于体外分离培养的MSCs在细胞表型上没有明显的改变，也无功能缺失，因此被认为其对于细胞疗法和组织修复工程具有重要的意义。
在MSCs的培养体系中添加一定浓度的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸可以使得人MSCs向成骨细胞方向分化。MSCs分化为成骨细胞主要需经历四个阶段，即：未成熟的骨祖细胞、成熟的骨祖细胞、前成骨细胞、成熟的成骨细胞。在此分化过程中，细胞的碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达都随之增强，同时可观察到细胞外基质中发生钙盐沉积、骨结节形成等现象。这一分化过程中多个因子起到了调控作用。其中Runx2(核心结合因子)对成骨细胞的发育至关重要。此外，骨形态发生蛋白(BMPs，bonemorphogenetic proteins)也是成骨细胞发育过程中非常重要的调节因子，它们可以促进较成熟的成骨细胞的分化和骨基质的形成；但是对于处在发育早期的成骨细胞，它们却抑制其分化而促进其增生。
胰岛素、IBMX(1-甲基-3-异丁基黄嘌呤)、引哚美辛的适量添加可以促进约95％的MSCs体外分化为脂肪细胞。其分化过程表现为细胞内出现富集的脂质小泡，过氧化物酶增殖激活受体γ、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)、脂蛋白脂酶(LPL)以及脂肪酸结合蛋白(A2)等表达增加。
磁性材料是一种古老而用途广泛的功能材料。1960年Freeman等提出铁磁性粒子可以通过血液循环系统和外界磁场的协同作用下到达身体的某一特定组织。磁性纳米颗粒是包被葡聚糖等不同生物大分子衣的纳米级氧化铁胶体溶液，具有高热稳定性、低毒性和超顺磁性。因其独特的超顺磁性质和纳米特性已经被越来越多的应用于生物医学和生物科技的研究中，包括靶向给药、肿瘤磁过热疗法、生物传感器以及特异性靶点(如细菌、白细胞、蛋白质)的浓度示踪等，具有广阔的应用前景和潜在的应用价值。
干细胞移植治疗各类疾病成为当今医学研究的热点，但移植后如何从受体辨别供体细胞，并观察其在活体内的生存迁徙情况一直是困扰其临床应用的瓶颈。随着分子影像学的发展，超顺磁性纳米铁颗粒(SPIO)作为磁共振成像(MRI)分子探针可以标记骨髓间充质干细胞、神经干细胞、心肌细胞、造血细胞等，并能活体监测细胞的迁徙，代谢和生物学行为。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其中磁性纳米材料为活性成分，其具有促进间充质干细胞分化成成骨细胞的作用；
所述的磁性纳米材料优选为三氧化二铁纳米修饰的纳米钌和三氧化二铁纳米修饰的纳米硒中的至少一种。
本发明中，所述的三氧化二铁纳米修饰的纳米钌结构式可表述为Fe2O3Ru；所述的三氧化二铁纳米修饰的纳米硒结构式可表述为Fe2O3Se。
本发明中，所述的三氧化二铁纳米修饰的纳米钌(Fe2O3Ru)，优选通过如下方法制备得到：
往三氧化二铁(γ-Fe2O3)纳米粒子溶液中搅拌滴加三氯化钌溶液，再加入硫普罗宁，待悬浊液由红色变为棕黄色，磁性分离、水洗涤，得到三氧化二铁纳米修饰的纳米钌(Fe2O3Ru)。
所述三氧化二铁纳米粒子溶液浓度为8～15wt％。
所述三氯化钌溶液的浓度优选为0.04～0.05M。
所述三氧化二铁纳米粒子与三氯化钌的质量比为1:1.5～1:2。
所用三氯化钌与硫普罗宁的摩尔比为1:1～1:10。
将上述制备得到的三氧化二铁纳米修饰的纳米钌重悬于水中，得到Fe2O3Ru悬浊液。
所述的水优选为超纯水或蒸馏水。
本发明中，所述的三氧化二铁纳米修饰的纳米硒，优选通过如下方法制备得到：
往三氧化二铁(γ-Fe2O3)纳米粒子溶液中搅拌加入亚硒酸钠(Na2SeO3)，再加入硫普罗宁，待悬浊液由红色变为深红色，磁性分离、洗涤，得到三氧化二铁纳米修饰的纳米硒(Fe2O3Se)。
所述三氧化二铁纳米粒子溶液浓度为8～15wt％。
所用三氧化二铁纳米粒子与亚硒酸钠的质量比为1.5:1～2:1。
所用亚硒酸钠与硫普罗宁的摩尔比为1:1～1:4。
将上述制备得到的三氧化二铁纳米修饰的纳米硒重悬于水中，得到Fe2O3Se悬浊液。
所述的水优选为超纯水或蒸馏水。
本发明的机理为：
本发明的磁性纳米材料应用于间充质干细胞的成骨分化中。毒性检测证明本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se对间充质干细胞几乎无毒性。茜素红和油红O染色证明本发明制备的Fe2O3Ru和Fe2O3Se具有促进间充质干细胞成骨分化，抑制成脂分化的作用。本发明制备的磁性纳米材料，如三氧化二铁纳米修饰的纳米钌或纳米硒，直接以过量的纳米钌或纳米硒与三氧化二铁纳米耦合，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明提供磁性纳米材料在间充质干细胞的成骨分化中的应用。
(2)本发明制备的三氧化二铁纳米修饰的纳米钌(Fe2O3Ru)和三氧化二铁纳米修饰的纳米硒(Fe2O3Se)，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品可直接保存和使用。
附图说明
图1是三氧化二铁纳米修饰的纳米钌和三氧化二铁纳米修饰的纳米硒透视电镜图。
图2是三氧化二铁纳米修饰的纳米钌和三氧化二铁纳米修饰的纳米硒对间充质干细胞的毒性检测图。
图3是成骨实验与成脂实验：(A)成骨诱导14天，细胞间可见钙质沉积，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节，(×10)；(B)成脂诱导18天后，被诱导的细胞经油红O染色，胞浆中脂滴呈现红色(×20)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。
实施例1：三氧化二铁纳米修饰的纳米钌的制备
将20mgγ-Fe2O3纳米粒子研磨均匀后分散于160mL蒸馏水中，超声使其均匀分散于蒸馏水中。1min后，在转速为170r/min的机械搅拌速度下，滴加入4mL浓度为0.043M的RuCl3溶液，滴加完成后，接着加入0.28g的硫普罗宁。可以看到悬浊液逐渐由红色变为棕黄色。反应完成后，在磁场作用下用蒸馏水洗涤3次，以除去未反应的离子及生成的胶体钌颗粒。重悬于蒸馏水中，得到Fe2O3Ru悬浊液。离心分离，超纯水洗涤，产物于70℃条件下干燥2天，得到三氧化二铁纳米修饰的纳米硒。通过TEANAI-10型透射电子显微镜观察，结果如图1A所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径在120～130nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例2：三氧化二铁纳米修饰的纳米硒的制备
将20mgγ-Fe2O3纳米粒子研磨均匀后分散于160mL蒸馏水中，超声使其均匀分散于蒸馏水中。1min后，在转速为170r/min的机械搅拌速度下，加入11.6mg接着加入Na2SeO3，0.029g硫普罗宁。可以看到悬浊液逐渐由浅红色变为深红色。反应完成后，在磁场作用下用蒸馏水洗涤3次，以除去未反应的离子及生成的胶体硒颗粒。重悬于蒸馏水中，得到Fe2O3Se悬浊液。离心分离，超纯水洗涤，产物于70℃条件下干燥2天，得到三氧化二铁纳米修饰的纳米硒。其形貌通过TEANAI-10型透射电子显微镜观察，如图1B所示。其粒径在160～170nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例3：磁性纳米材料对人脐带间充质干细胞的毒性检测
本实验选择购自ATCC公司的人脐带间充质干细胞(MSCs)。所试样品编号为：Fe2O3Ru(三氧化二铁纳米修饰的纳米钌)、Fe2O3Se(三氧化二铁纳米修饰的纳米硒)和氟化钠。
(1)MTT测试方法
取生长良好的第3代人脐带间充质干细胞，调整活细胞浓度为2×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，在培养箱中培养24h待贴壁后，再分别加入不同浓度磁性纳米材料水溶液100μL，阴性对照为等体积生理盐水，阳性对照为氟化钠，加样组和对照组均设4个复孔，置37℃，5％CO2培养72h，然后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，5h后离心弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100μL/孔，振荡10min左右，用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；
取生长良好的第3代人脐带间充质干细胞，调整活细胞浓度为2×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，在培养箱中培养24h待贴壁后，再分别加入不同浓度磁性纳米材料水溶液100μL，阴性对照为等体积生理盐水，阳性对照为氟化钠，加样组和对照组均设4个复孔，置37℃，5％CO2培养8天，每3天换液l次培养基，每天MTT法检测对照组和诱导组的细胞存活数。
实验结果见图2。本实施例采用MTT细胞活性测定法来测定纳米粒子对MSCs的细胞毒性效应。当MSCs用浓度低于5μM的纳米粒子培养72小时后，细胞活性几乎无变化；当MSCs用浓度大约为40μM的纳米粒子处理后，细胞活性降低了将近20％。据此，选择5μM的纳米粒子浓度用于后续实验。纳米粒子对人脐带间充质干细胞增殖的作用具有浓度依赖性，在5μM时对间充质干细胞的增殖没有影响；40μM时对间充质干细胞的增殖有抑制作用。由图2B可以看出第3～8天细胞生长缓慢，无明显的时间依赖性。该实验结果表明，本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se在5μM时对间充质干细胞的增殖没有影响，证明本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se在该浓度下对间充质干细胞几乎无毒性。
(2)细胞凋亡检测分析
取生长良好的第3代人脐带间充质干细胞，以2×105个/mL的密度接种于6孔板中，选5μM浓度的Fe2O3Ru和Fe2O3Se作用于MSCs细胞。培养72h后，胰酶消化，离心(1000r·min-1，5min)用PBS洗2次，加入AnnexinV/PI，避光染色15min，上流式细胞仪检测，分析细胞凋亡比例。本实验采用流式双染法分析三种纳米粒子对MSCs细胞凋亡的能力，按实验方法分组如下：control，NaF，Fe2O3Ru和Fe2O3Se。结果如图2C，横坐标为染料AnnexinV的荧光强度变化，纵坐标为染料碘化吡啶(PI)的荧光强度变化。对照组细胞凋亡率不到5％，NaF组和加药组凋亡率没有明显增加，说明Fe2O3Ru和Fe2O3Se不会通过凋亡或坏死诱导MSCs的死亡。该实验结果表明，本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se在5μM浓度下对间充质干细胞的细胞凋亡没有影响，证明本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se对间充质干细胞几乎无毒性。
(3)细胞周期检测分析
取生长良好的第3代人脐带间充质干细胞，以2×105个/mL的密度接种于6孔板中，选5μM的Fe2O3Ru和Fe2O3Se作用MSCs细胞。培养72h后，收集培养细胞，1000r/min离心5min，弃去培养液。用预冷PBS液重悬细胞，离心，1000r/min离心5min，重复两次；将收集的细胞团用4℃预冷的75％乙醇固定，4℃保存，冰盒送检。样本上机前作如下处理：1、将加入固定液的细胞悬液离心后，弃去固定液，用PBS洗两次；2、加入200μL PI综合染液(pH7.4)置4℃冰箱中，染色25min；3、400目的筛网过滤1次，应用流式细胞仪激发波长488nm，发射波长630nm，检测，计数10000个细胞，进行细胞周期和DNA含量分析。按实验方法分组如下：control，NaF，Fe2O3Ru和Fe2O3Se。结果如图2D，Fe2O3Ru和Fe2O3Se不会引起细胞周期变化。该实验结果表明，本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se在5μM浓度时对间充质干细胞的细胞周期没有影响，证明本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se对间充质干细胞几乎无毒性。
(4)活性氧(ROS)检测分析
将生长良好的第3代人脐带间充质干细胞消化处理后接种于12孔培养板中，培养24h后分别加入5μM的Fe2O3Ru和Fe2O3Se置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养72h。后继处理如下：1、收集细胞：用300μL0.25％胰酶对细胞进行消化，相同体积的培养液终止，收集包括漂浮在培养基上的细胞；2、离心：1000r/min，5min，弃上清；3、染色：加入200μL DCFH-DA染液，混匀，37℃避光孵育15min后利用流式细胞仪对细胞内的活性氧进行定量检测。结果显示，经Fe2O3Ru和Fe2O3Se处理后ROS水平没有显著变化(图2E)。该实验结果表明，本发明所述的Fe2O3Ru和Fe2O3Se在5μM浓度时对间充质干细胞的ROS水平没有影响，证明本发明的Fe2O3Ru和Fe2O3Se对间充质干细胞几乎无毒性。
实施例4：成骨实验
取第3代的人脐带间充质干细胞，按1×104个/mL接种在6孔培养板中，37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，DMEM完全培养基培养24h后，细胞贴壁生长，弃去培养基，换为成骨诱导培养基，培养基中分别加入Fe2O3Ru或Fe2O3Se(最终浓度为5μM)，对人脐带间充质样干细胞向成骨细胞诱导分化，每2～3天换液1次，在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。后续处理如下：1、培养2周，弃上清，PBS洗涤3次，每次5min；2、置4％多聚甲醛固定10min；3、PBS洗涤2次，每次1min；4、以10mg/mL茜素红染色10min；5、去染液，PBS洗涤3次，置倒置显微镜下观察，拍照。结果显示成骨诱导培养1周，干细胞原始形态逐渐消失，呈多角形，细胞质内颗粒状物质增多，折光性强，诱导第2周后，细胞呈集落样生长，细胞质内充满颗粒，经茜素红染色呈阳性反应，细胞内颗粒样物质被染成深红色，考虑细胞内钙结节形成(图3A)。图3A的结果表明，本发明制备的磁性纳米具有促进间充质干细胞成骨分化的作用，说明本发明的磁性纳米能够作为促进干细胞成骨分化的药物。
实施例5：成脂实验
取第3代的人脐带间充质样干细胞，细胞按1.5×104个/mL接种在6孔培养板中，37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，DMEM完全培养基培养24h后，细胞贴壁生长，弃去培养基，换为成脂诱导培养基，培养基中加入Fe2O3Ru或Fe2O3Se(最终浓度为5μM)，每3天换液，培养18天，倒置相差显微镜观察细胞状态。后续处理如下：1、弃上清，PBS洗涤3次，每次5min；2、置4％多聚甲醛固定10min；3、PBS洗涤2次，每次1min；4、新鲜配制5mg/ml油红O染色30min；5、去染液，70％乙醇浸洗2min，PBS洗涤2次，倒置显微镜下观察，拍照。结果显示细胞内空泡折光性强，出现在成脂诱导5天，意味着小脂滴已形成，约18天后细胞内空泡样变增加，部分出现相互融合，干细胞的形态也发生改变，细胞由长梭形变短、变粗，油红“O”染色显示细胞内有大量脂质被染为红色(图3B)。图3B的结果表明，本发明制备的磁性纳米具有抑制间充质干细胞成脂分化的作用，说明本发明的磁性纳米能够作为抑制干细胞成脂分化的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其特征在于：其中磁性纳米材料为活性成分，其具有促进间充质干细胞分化成成骨细胞的作用。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其特征在于：所述的磁性纳米材料为三氧化二铁纳米修饰的纳米钌和三氧化二铁纳米修饰的纳米硒中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其特征在于：所述的三氧化二铁纳米修饰的纳米钌通过如下方法制备得到：往三氧化二铁纳米粒子溶液中搅拌滴加三氯化钌溶液，再加入硫普罗宁，待悬浊液由红色变为棕黄色，磁性分离、水洗涤，得到三氧化二铁纳米修饰的纳米钌。
4.根据权利要求3所述的磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其特征在于：所述三氧化二铁纳米粒子溶液浓度为8～15wt％；所述三氯化钌溶液的浓度为0.04～0.05M；所述三氧化二铁纳米粒子与三氯化钌的质量比为1:1.5～1:2；所用三氯化钌与硫普罗宁的摩尔比为1:1～1:10。
5.根据权利要求2所述的磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其特征在于：所述的三氧化二铁纳米修饰的纳米硒通过如下方法制备得到：往三氧化二铁纳米粒子溶液中搅拌加入亚硒酸钠，再加入硫普罗宁，待悬浊液由红色变为深红色，磁性分离、洗涤，得到三氧化二铁纳米修饰的纳米硒。
6.根据权利要求5所述的磁性纳米材料在促进间充质干细胞成骨分化中的应用，其特征在于：所述三氧化二铁纳米粒子溶液浓度为8～15wt％；所用三氧化二铁纳米粒子与亚硒酸钠的质量比为1.5:1～2:1；所用亚硒酸钠与硫普罗宁的摩尔比为1:1～1:4。
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