CN117165520A - 间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用 - Google Patents

间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及外泌体技术领域，具体涉及间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用。该外泌体以人脂肪间充质干细胞为原料，通过诱导分泌制备得到。该外泌体原料具有抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性，提示其具有作为美白祛斑的化妆品原料的应用前景。将制得的外泌体原料制备成凝胶制剂。该凝胶制剂具有更长的于体外释放时间，抗紫外线辐射，促进人真皮成纤维细胞增殖的功能。该外泌体还可增加创面组织Hyp含量，促进创面肉芽组织的形成，进而加快表皮损伤的创面愈合。

Description

间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的 应用
技术领域
本发明涉及外泌体技术领域，具体涉及间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用。
背景技术
间充质干细胞衍生外泌体(MSC-Exo)是负责MSC旁分泌作用的纳米囊泡(40-150nm)，含多种内容物，包括mRNA、miRNA细胞因子和蛋白质。MSC-Exo通过其成分的水平转移在改变靶细胞功能方面发挥重要作用。已有证据表明，MSC Exo在许多情况下表现出与MSC移植非常相似的结果，不仅具备免疫调节，促进血管再生的功能，还介导细胞增殖、分化、迁移，甚至改善瘢痕形成。据报道，人脐间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的外泌体在皮肤创伤愈合模型中表现出完全的再上皮生长。与MSC相比，MSC-Exo具有以下优势：首先，由于外泌体是机体固有的，其表面具有与细胞相似的固有生化特性，因此能够避免吞噬作用，与靶细胞融合以及逃避溶酶体吞噬。其次，MSC-Exo通过受体配体和细胞表面蛋白附着在靶细胞上，并将特定的信息转移至靶细胞。第三，MSC-Exo的有效成分不易被破坏，易储存及运输，且外泌体的浓度、剂量、使用途径和时间易于控制。最重要的一点是，外泌体可以抑制T细胞的激活，并有助于维持免疫稳态，避免了因细胞移植引起的免疫排斥和肿瘤发生。因此，MSC-Exo的生物学特性使其在创伤修复中具有良好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用。
本发明目的之一提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
获得脂肪间充质干细胞，培养于含10％的无外泌体胎牛血清中，
将第二代脂肪间充质干细胞接种于第一培养基中至汇合；
弃除所述第一培养基，接入第二培养基继续培养；
将收集培养液，进行多个离心步骤。
在所述的制备方法中，所述第一培养基为含1～5μg/mL肝素、2～12％v/v人血小板裂解液、0.1～0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.4～1.0μg/mL维生素C、2～6μg/mL血管内皮生长因子、0.5～1.5％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
在所述的制备方法中，所述第一培养基为含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
在所述的制备方法中，所述第二培养基为含1～5μg/mL肝素、2～6％v/v人血小板裂解液、0.1～0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.4～1.0μg/mL维生素C、2～6μg/mL血管内皮生长因子、0.4～1.0μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5～20μg/mL葡萄糖、0.5～1.5％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
在所述的制备方法中，所述第二培养基为含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、0.58μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
在所述的制备方法中，所述第二培养基为含1～5μg/mL肝素、0.2～1.0μg/mL L-谷氨酰胺、0.4～1.0μg/mL维生素C、5～20μg/mL血管内皮生长因子、0.4～1.0μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5～20μg/mL葡萄糖、0.5～1.5％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
在所述的制备方法中，所述第二培养基为含2μg/mL肝素、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、15μg/mL血管内皮生长因子、0.58μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
本发明目的之二提供所述的制备方法制得的外泌体，所述外泌体表达CD9、CD81、CD63、TSG101、HSP70和Calnexin。
本发明目的之三提供一种凝胶制剂的制备方法，包括：
所述制备方法；
配制含50％松香的DMSO溶液，于封闭的玻璃瓶中旋转混合48h后，设置4组，分别加入终浓度为1％w/w的所述制备方法制得的外泌体，得到内相溶液；
以7.5％的质量比例加入GMS至橄榄油中，搅拌加热，生成外相溶液；
将所述内相溶液和所述外相溶液以1:1的体积比例混合，即可得到凝胶制剂。
本发明目的之四提供所述的制备方法制备的外泌体在制备表面创伤修复和祛斑制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：
本发明以人脂肪间充质干细胞为原料，通过诱导分泌，得到了一种特殊的外泌体原料。该外泌体原料表达CD9、CD81、CD63、TSG101、HSP70和Calnexin。该外泌体原料具有抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性，提示其具有作为美白祛斑的化妆品原料的应用前景。
本发明还将制得的外泌体原料制备成凝胶制剂。该凝胶制剂具有更长的于体外释放时间，抗紫外线辐射，促进人真皮成纤维细胞增殖的功能。
另外，本发明还将制得的凝胶制剂进行了动物实验。结果发现，实验组I和实验组II分别提供的外泌体可促进Wistar大鼠的人造皮肤创伤愈合效果，显著降低创面愈合过程中血液中白细胞数和血清IL-8含量和IL-10含量，减少创面处炎性细胞浸润，调节创面的炎症反应，加快创面愈合速度。本研究还表明，实验组I和实验组II分别提供的外泌体可增加创面组织Hyp含量，促进创面肉芽组织的形成，进而加快表皮损伤的创面愈合。
附图说明
图1为实验组I(泳道1)、实验组II(泳道2)、对照组I(泳道3)和对照组II(泳道4)的WB图，其中CD9为25kd，CD81为26kd，CD63为30kd，TSG101为44kd，HSP70为70kd，Calnexin为90kd。
图2为分别采用实验组III和对照组III提供的方法制得的外泌体凝胶制剂的体外释放外泌体的累积释放曲线。其中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图3为分别采用实验组III和对照组III提供的方法制得的外泌体凝胶制剂的抗紫外线结果图。图中，其中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图4为实验组I～II和对照组I～II分别制得的外泌体对成纤维细胞的增殖实验结果图。
图5为各组大鼠伤口面积结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图6为各组大鼠进行抗凝血检测的白细胞数结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图7为各组大鼠进行抗凝血检测的红细胞数结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图8为各组大鼠进行抗凝血检测的血红蛋白含量结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图9为各组大鼠进行抗凝血检测的红细胞压积结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图10为各组大鼠进行抗凝血检测的血小板数结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图11为各组大鼠血清中IL-8含量结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图12为各组大鼠血清中IL-10含量结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
图13为各组大鼠创面组织Hyp含量结果图。图中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
1、人脂肪间充质干细胞的准备
人脂肪间充质干细胞RAMSCs(品牌：埃泽思生物(Applied Cell)，规格：1×106cells/管，货号：AC-2001004)培养于含10％的无外泌体胎牛血清，1％青霉素/链霉素溶液的DMEM培养液中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育收集细胞培养48h后的上清液，以便进行后续的外泌体制备。
2、外泌体的诱导分泌
实验组I：将第二代RAMSCs接种于含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基，在2％的氧含量条件下生长至80％汇合度，弃去皿内原有培养基，以无菌PBS冲洗3次，加入含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、0.58μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(可先用DMSO制备成1M的母液后稀释至培养基中)、12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基继续培养。3000×g常温离心以沉淀细胞碎片，分别收集上清液。高速离心机预冷至4℃，按以下流程离心：300×g，10min；2000×g，10min；10000×g，30min。将离心后的上清液经0.22μm微生物过滤筛滤入超高速离心管，于4℃真空超高速离心机以120000×g离心2h。弃去离心后的上清液，以适量无菌PBS洗涤离心管底以充分重悬外泌体。
实验组II：将第二代RAMSCs接种于含2μg/mL肝素、10％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、2μg/mL血管内皮生长因子、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基，在2％的氧含量条件下生长至80％汇合度，弃去皿内原有培养基，以无菌PBS冲洗3次，加入含2μg/mL肝素、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、15μg/mL血管内皮生长因子、0.58μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(可先用DMSO制备成1M的母液后稀释至培养基中)、12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基继续培养。3000×g常温离心以沉淀细胞碎片，分别收集上清液。高速离心机预冷至4℃，按以下流程离心：300×g，10min；2000×g，10min；10000×g，30min。将离心后的上清液经0.22μm微生物过滤筛滤入超高速离心管，于4℃真空超高速离心机以120000×g离心2h。弃去离心后的上清液，以适量无菌PBS洗涤离心管底以充分重悬外泌体。
对照组I：将第二代RAMSCs接种于含1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基，在20％的氧含量条件下生长至80％汇合度，弃去皿内原有培养基，以无菌PBS冲洗3次，加入含12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基继续培养。3000×g常温离心以沉淀细胞碎片，分别收集上清液。高速离心机预冷至4℃，按以下流程离心：300×g，10min；2000×g，10min；10000×g，30min。将离心后的上清液经0.22μm微生物过滤筛滤入超高速离心管，于4℃真空超高速离心机以120000×g离心2h。弃去离心后的上清液，以适量无菌PBS洗涤离心管底以充分重悬外泌体。
对照组II：将第二代RAMSCs接种于含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基，在2％的氧含量条件下生长至80％汇合度。3000×g常温离心以沉淀细胞碎片，分别收集上清液。高速离心机预冷至4℃，按以下流程离心：300×g，10min；2000×g，10min；10000×g，30min。将离心后的上清液经0.22μm微生物过滤筛滤入超高速离心管，于4℃真空超高速离心机以120000×g离心2h。弃去离心后的上清液，以适量无菌PBS洗涤离心管底以充分重悬外泌体。
3、外泌体的鉴定
(1)粒径及浓度检测
用2％戊二醇固定上述实验组I～II和对照组I～II分别得到的外泌体样品，将外泌体样品用PBS稀释后，用纳米颗粒跟踪分析(NTA)机NS300Nano-sight instrument(Malvern，UK)进行检测，分析出外泌体粒径大小以及浓度；WesternBlot验证外泌体特异性标志物CD81，TSG101，HSP70的表达。
结果用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测外泌体的粒径大小，实验组I～II和对照组I～II依次为123.5nm、123.3nm、125.1nm和125.7nm(粒径峰值)。实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体样品中的浓度依次为(1.22±0.15)×109particles/mL、(1.35±0.09)×109particles/mL、(4.75±0.33)×105particles/mL、(6.53±0.25)×107particles/mL，由此可知，实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体样品中的外泌体粒径相差无几，但实验组I～II制得的外泌体样品中的外泌体浓度显著高于对照组I～II。(2)Western Blot检测
采用Western Blot检测实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体样品中特异性及标志性蛋白。
在外泌体悬液中加入等体积RIPA裂解液，置于冰上进行裂解30分钟，12000rpm离心10分钟，取上清加入适量5×上样缓冲液，煮沸5分钟后冷却至室温，上样后于12％SDS-PAGE凝胶上电泳，湿转膜后以脱脂奶粉封闭2小时，分别加入CD9一抗(编号:AF1192，碧云天，稀释比例1:1000)、CD81(编号:AG1530，碧云天，稀释比例1:1000)、CD63一抗(编号:AF1471，碧云天，稀释比例1:1000)、TSG101一抗(编号:AF8259，碧云天，稀释比例1:1000)、HSP70一抗(编号:AF0189，碧云天，稀释比例1:1000)、Calnexin一抗(编号:AC019，碧云天，稀释比例1:1000)、于4℃摇床过夜，洗膜后加入二抗室温孵育2小时，成像系统检测荧光。
利用Western Blot方法进一步鉴定外泌体特异性标志物，结果图1显示，实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体均表达CD9、CD81、CD63，实验组I～II制得的外泌体还表达了TSG101、HSP70和Calnexin，而对照组I～II制得的外泌体不表达TSG101、HSP70和Calnexin。
4、外泌体对DPPH自由基的清除率测定
精密移取样品供试液2mL(含10mg/mL的实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体的PBS溶液)、质量浓度为20μg/mL二苯基苦基苯脐(DPPH)溶液2mL，先后加入同一具塞试管中摇匀，在暗室处、室温下静置30min，然后在517nm波长下测定样品的吸光度Ac。按以下公式(1)计算样品对DPPH自由基的清除率＝[l-Ai/Ac]×100％；式中：Ai为DPPH溶液和样品供试液混合液的吸光度；Ac为DPPH溶液的吸光度，并作F检验。试验结果显示：实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体对DPPH自由基的清除率分别为(83.76±1.54)％、(80.97±1.15)％、(61.35±1.52)％、(60.28±1.52)％，两组比较，P<0.05，由此可见，实验组I～II的外泌体抗氧化性能优于对照组I～II。
5、外泌体对酪氨酸酶抑制活性测定
样品供试液：含10mg/mL的实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体的PBS溶液。按照表1步骤依次加入PBS(pH＝6.8)、样品供试液、酪氨酸溶液(1.0mg/mL)，35℃水浴10min后加入1.0mL的酪氨酸酶溶液，摇匀，快速转移至比色管中，于475nm处测定吸光度A。
表1酪氨酸酶抑制活性测定试剂用量
计算对酪氨酸酶的抑制率＝[1－(A3－A4)/(A1－A2)]×100％
式中：A1～A4依次为测试样组1～4号在475nm处的吸光度值。试验结果显示，实验组I～II的外泌体对酪氨酸酶活性的抑制率分别为(56.39±1.21)％、(58.25±1.09)％，而对照组I～II制得的外泌体未检出对酪氨酸酶具有活性。由此说明，实验组I～II的外泌体具有抑制酪氨酸酶活性，具有作为抑制黑色素生成的功效，以及作为美白祛斑的化妆品原料的应用前景。
6、凝胶制剂的制备
实验组III：
(1)内相溶液
配制含50％(w/w)松香的DMSO溶液，于封闭的玻璃瓶中旋转混合48h后，设置4组，分别加入终浓度为1％(w/w)实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体样本。
(2)凝胶的制备
将GMS(7.5％，w/w，甘油单硬脂酸酯，上海泰坦科技股份有限公司)加入到橄榄油中，用60℃的磁力搅拌器加热，直到得到一个清晰的溶液生成外相溶液。
使用3mL一次性注射器将内相溶液和外相溶液以1:1的体积比例混合，并且以2rpm/s的速度，持续60秒，即可得到凝胶制剂。
对照组III：
将实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体样本(含10mg/mL的实验组I～II和对照组I～II制得的外泌体的PBS溶液)、海藻酸钠、β-磷酸三钙加入到去离子水中混匀，其中外泌体、海藻酸钠、β-磷酸三钙的质量浓度分别为1、20、60mg/mL；
聚乙二醇加入上述溶液中，使聚乙二醇的质量浓度为50mg/mL；葡萄糖酸内酯加入混合溶液中，使葡萄糖酸内酯的质量浓度为10mg/mL，制备得到负载外泌体的可注射葡萄糖酸内酯-海藻酸钠/β-磷酸三钙-聚乙二醇水凝胶。
7、检测凝胶的缓释性能
本实验检测了上述实验组III和对照组III分别制得的负载外泌体的凝胶于体外释放外泌体的性能。具体如下：
取96孔板，每孔加入100μL的实验组水凝胶，随后每孔加入150μL的PBS，置于摇床内振荡孵育(37℃、75r/min)，分别于孵育的0.5d、1d、3d、5d、9d、15d、20d、25d、30d后，每孔吸取100μL的PBS，离心后取上清液，检测吸光度值，计算外泌体累计释放率。每次取样后再补充新鲜的等量PBS。每个实验重复3次。
结果如图2所示，采用实验组III提供的方法制得的外泌体凝胶制剂，于体外具有更长释放时间。
8、凝胶的抗紫外线性能测定
按照QB/T2410-1998规定的防晒霜UVB区防晒效果的评定方法，分别称取上述实验组III和对照组III分别制得的负载外泌体的凝胶各2g，均匀涂抹在3M医用透气胶带上，于比色皿内壁，以样品的医用透气胶带为参比，波长在280～360nm范围内，每隔10nm描一次，记录吸光度A，以吸光度平均值来判断样品在UVB区(280～320nm)的防晒效果。结果如图3所示，采用实验组III提供的制备方法制得的负载外泌体的凝胶的抗紫外性能普遍高于对照组III，负载实验组I和II提供的外泌体的凝胶的抗紫外线性能高于对照组I～II。
9、成纤维细胞增殖实验
为研究实验组I～II和对照组I～II分别制得的外泌体是否对成纤维细胞有调节作用，将人真皮成纤维细胞(货号：CP-H103，规格：5×105Cells/T25培养瓶，武汉普诺赛)作为皮肤损伤修复的重要细胞类型，并与实验组I～II和对照组I～II分别制得的外泌体分别进行孵育，通过细胞计数法测定细胞活力。
人真皮成纤维细胞消化计数后按2×103/孔种至96孔板置于37℃，体积分数5％CO2培养箱中培养，6h贴壁后换液加入实验培养液，每组设6个复孔。实验分组共3组，其中空白对照组仅含培养基无细胞，阴性组为无血清培养基常规培养人真皮成纤维细胞，实验组为含10μg/mL外泌体(实验组I～II和对照组I～II)的无血清培养基孵育人真皮成纤维细胞。24h后，每孔加入10μL CCK8试剂(碧云天，中国)继续在培养箱中孵育2h，用酶标仪(Tecan，瑞士)在450nm波长处测定每组吸光度(OD)值，各组细胞相对活力＝(实验组OD值－空白对照组OD值)/(阴性组/OD值－空白对照组OD值)。
图4示出了用CCK8法检测两种外泌体与hDF共培养24h后的增殖情况。结果显示相对于阴性组，对照组I和II分别提供的外泌体对人真皮成纤维细胞无明显的增殖促进作用，而实验组I和II分别提供的外泌体的增殖促进作用明显。
10、动物实验
(1)实验动物和供试品
Wistar大鼠，江苏艾菱菲生物科技有限公司。实验组I～II和对照组I～II分别制得的外泌体凝胶作为供试品。
(2)皮肤创伤模型建立
分别肌肉注射阿托品0.5mg/kg体重和陆眠宁0.3mL/kg体重，将大鼠进行全身麻醉。无菌操作于每只大鼠脊柱两侧2cm处对称取全层皮肤直径20mm，深度为1mm的全层皮肤伤口(表皮、真皮、皮下组织均剪除)。
(3)动物分组与处理
将模型大鼠随机分为模型组、阴性组、实验组III-实验组I、实验组III-实验组II、实验组III-对照组I、实验组III-对照组II、对照组III-实验组I、对照组III-实验组II、对照组III-对照组I、对照组III-对照组II。其中，“实验组III-实验组I”表示采用实验组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-实验组II”表示采用实验组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组I”表示采用实验组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“实验组III-对照组II”表示采用实验组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组I”表示采用对照组III提供的方法负载实验组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-实验组II”表示采用对照组III提供的方法负载实验组II提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组I”表示采用对照组III提供的方法负载对照组I提供的外泌体制得的凝胶；“对照组III-对照组II”表示采用对照组III提供的方法负载对照组II提供的外泌体制得的凝胶。
每组设置5只大鼠，每只大鼠6个创面。模型组不做处理。阴性组肌肉注射20000IU/次青霉素钠，1次/d，连用7d。其他各组分别肌肉注入20 000IU/次青霉素钠，1次/d，同时在创面使用对应的供试品，每日2次，连用7d。
(4)伤口创面愈合检测
给药后每日观察动物及创面情况，并用Image J软件测量伤口面积。结果如图5所示，给药后第7、14、21和28d，各组大鼠创面伤口面积均不断减小。然而，实验组III-实验组I、实验组III-实验组II、对照组III-实验组I和对照组III-实验组II的大鼠创面伤口面积下降明显，并且实验组III-实验组I和实验组III-实验组II的大鼠创面伤口面积于给药后第28日最小。
(5)血液常规及血清IL-8、IL-10含量测定
给药后28d采集抗凝血和非抗凝血，利用全自动血液细胞分析仪对抗凝血进行白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)和血小板数(PLT)测定。结果如图6～10所示，给药后28d，各组大鼠抗凝血进行白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)和血小板数(PLT)均处于正常范围内。
非抗凝血经离心后制备为血清，利用酶标仪，按照ELISA试剂盒说明方法测定血清中IL-8和IL-10的含量。结果如图11～12所示，除阴性组以外，实验组III-实验组I、实验组III-实验组II、对照组III-实验组I和对照组III-实验组II的大鼠血清中IL-8和IL-10含量较低，说明实验组I和实验组II分别提供的外泌体能够降低血清中炎症因子含量。
(6)创面组织Hyp含量
给药28d每组随机选取3个创面，无菌采集创面组织，置于4％甲醛中固定，以制作组织切片，置于匀浆管中，以1:9倍体积与生理盐水混合研磨；3500r/min离心10min，取0.1mL上清液加人0.4mL生理盐水中，按照试剂盒说明书进行ELISA测定Hyp含量，每个样本测3次。结果如图13所示，各组大鼠创面组织中Hyp含量均高于阴性组，且实验组III-实验组I、实验组III-实验组II、对照组III-实验组I和对照组III-实验组II的大鼠创面组织中Hyp含量较高，说明实验组I和实验组II分别提供的外泌体能够提高大鼠创面组织中Hyp含量。
皮肤创伤愈合是一个包括炎症、肉芽组织形成及组织重塑等连贯而交叉进行的复杂的生物学过程。IL-8和IL-10为血清中的细胞因子，其中IL-10具有抗炎功能，而IL-8则通过促进炎性细胞浸润进而使炎症反应延长。创伤愈合的最后一个阶段为组织重塑阶段，在此阶段成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，胶原蛋白IQ被交换为胶原蛋白I，而后者更具拉伸强度，促进创面组织中胶原蛋白与其他蛋白质分子紧密交联。胶原蛋白的沉积和修复是创面愈合的一个主要标志，而Hyp是胶原蛋白合成的特有原料，又因其含量相对稳定，因此Hyp含量可以反映创面愈合过程中胶原蛋白代谢水平。
本研究表明，实验组I和实验组II分别提供的外泌体可促进Wistar大鼠的人造皮肤创伤愈合效果，显著降低创面愈合过程中血液中白细胞数和血清IL-8含量和IL-10含量，减少创面处炎性细胞浸润，调节创面的炎症反应，加快创面愈合速度。本研究还表明，实验组I和实验组II分别提供的外泌体可增加创面组织Hyp含量，促进创面肉芽组织的形成，进而加快表皮损伤的创面愈合。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得脂肪间充质干细胞，培养于含10％的无外泌体胎牛血清中，
将第二代脂肪间充质干细胞接种于第一培养基中至汇合；
弃除所述第一培养基，接入第二培养基继续培养；
将收集培养液，进行多个离心步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一培养基为含1～5μg/mL肝素、2～12％v/v人血小板裂解液、0.1～0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.4～1.0μg/mL维生素C、2～6μg/mL血管内皮生长因子、0.5～1.5％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一培养基为含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二培养基为含1～5μg/mL肝素、2～6％v/v人血小板裂解液、0.1～0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.4～1.0μg/mL维生素C、2～6μg/mL血管内皮生长因子、0.4～1.0μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5～20μg/mL葡萄糖、0.5～1.5％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二培养基为含2μg/mL肝素、5％v/v人血小板裂解液、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、5μg/mL血管内皮生长因子、0.58μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二培养基为含1～5μg/mL肝素、0.2～1.0μg/mL L-谷氨酰胺、0.4～1.0μg/mL维生素C、5～20μg/mL血管内皮生长因子、0.4～1.0μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5～20μg/mL葡萄糖、0.5～1.5％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二培养基为含2μg/mL肝素、0.5μg/mL L-谷氨酰胺、0.75μg/mL维生素C、15μg/mL血管内皮生长因子、0.58μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、12.5μg/mL葡萄糖、1％青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基。
8.权利要求1～7任一所述的制备方法制得的外泌体，所述外泌体表达CD9、CD81、CD63、TSG101、HSP70和Calnexin。
9.一种凝胶制剂的制备方法，其特征在于，包括：
权利要求1～7任一所述的制备方法；
配制含50％松香的DMSO溶液，于封闭的玻璃瓶中旋转混合48h后，设置4组，分别加入终浓度为1％w/w的权利要求1～7任一所述的制备方法制得的外泌体，得到内相溶液；
以7.5％的质量比例加入GMS至橄榄油中，搅拌加热，生成外相溶液；
将所述内相溶液和所述外相溶液以1:1的体积比例混合，即可得到凝胶制剂。
10.权利要求1～7任一所述的制备方法制备的外泌体在制备表面创伤修复和祛斑制剂中的应用。
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