FR2980710A1 - Composition a base de cellules souches mesenchymateuses viables et apoptotiques et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention d'un produit de thérapie cellulaire, à base d'une association de cellules apoptotiques et de cellules souches mésenchymateuses non-apoptotiques . En particulier, l'invention concerne une composition comprenant des cellules souches mésenchymateuses, caractérisée en ce que, entre 10 et 90% des cellules dans la composition sont des cellules souches mésenchymateuses apoptotiques, et au moins 10% des cellules sont des cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques. L'invention concerne également l'utilisation avantageuse de ces compositions en médecine régénérative, humaine ou vétérinaire, par exemple pour le traitement autologue ou allogénique des maladies inflammatoires, par exemple les lésions ostéo-articulaires chez l'homme, le chien ou le cheval.

Description

COMPOSITIONS A BASE DE CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES VIABLES ET APOPTOTIQUES ET LEURS UTILISATIONS DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé d'obtention d'un produit de thérapie cellulaire, à base d'une association de cellules apoptotiques et de cellules souches mésenchymateuses nonapoptotiques. En particulier, l'invention concerne une composition comprenant des cellules souches mésenchymateuses, caractérisée en ce que, entre 10 et 90% des cellules dans la composition sont des cellules souches mésenchymateuses apoptotiques, et au moins 10% des cellules sont des cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques. L'invention concerne également l'utilisation avantageuse de ces compositions en médecine régénérative, humaine ou vétérinaire, par exemple pour le traitement autologue ou allogénique des maladies inflammatoires, par exemple les lésions ostéo-articulaires chez l'homme, le chien ou le cheval. CONTEXTE DE L'INVENTION Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules multipotentes capables de se différencier en de nombreux types cellulaires dérivés du feuillet embryonnaire formant le mésoderme ; elles peuvent également se différencier en des types cellulaires se rapprochant des cardiomyocytes ou des neurones. Elles ont la propriété de migrer spécifiquement vers les sites tissulaires endommagés et siège d'une inflammation. Elles ont un potentiel de prolifération important et peuvent être cryoconservées tout en conservant leur potentiel de différenciation. Initialement identifiées au niveau de la moelle osseuse, ce type cellulaire a progressivement été retrouvé dans de nombreuses zones anatomiques comme la graisse, le derme, le muscle, périoste, cordon ombilical, sang périphérique, sang placentaire, membrane amniotique ....) et sont généralement associées à une zone périvasculaire bien que cela reste une hypothèse. Dans la plupart des atteintes tissulaires, physiologiques ou accidentelles, le pool de cellules souches de l'organisme est suffisant pour prendre en charge la cicatrisation des tissus endommagés. Mais lorsque les atteintes atteignent une taille critique, les capacités de l'organisme sont dépassées (atteinte chronique, ostéotomie...) justifiant l'apport exogène de cellules souches avec des capacités régénératives. C'est la médecine régénérative.

A ce jour, les cellules utilisées sont principalement obtenues à partir de la moelle osseuse dans une approche autologue (donneur et receveur sont la même personne) éliminant le risque de rejet des cellules. L'approche hétérologue (le donneur et le receveur sont deux personnes distinctes), est attractive pour éliminer les contraintes logistiques liées à l'obtention des cellules ; par ailleurs dans certains cas, le défaut à l'origine de la nécessité de traitement peut être intrinsèque aux cellules thérapeutique. Recourir à des cellules provenant d'un donneur sain lève alors cet obstacle. Aujourd'hui deux phénomènes biologiques, l'inflammation et l' alloréactivité, sont susceptibles de limiter l'efficacité et la sécurité de l'approche par thérapie cellulaire utilisant les cellules souches mésenchymateuses, en particulier par une approche hétérologues. Le premier, l'inflammation, est associé au déroulement des processus biologiques associés à la pathologie (arthrite ; tendinite). L'autre, spécifique à l'approche hétérologue, est lié à la reconnaissance des cellules allogéniques comme étrangères et leur rejet par le système immunitaire du receveur (qui en général n'est pas sous traitement immunosuppresseur). Les cellules souches mésenchymateuses ont une faible alloréactivité ; toutefois dans certaines circonstances, environnement inflammatoire en présence d'IFNy, ou d'injection répétées, elles peuvent exprimer les molécules entraînant leur reconnaissance par le système immunitaire (Cho et al. 2008; Prigozhina et al. 2008) comme l'induction de l'expression de HLA-DR (Tse et al. 2003). Un traitement immunosuppresseur associé pourrait être envisagé dans certaines affections, 25 mais le rapport bénéfice / risque ne le permet pas, en particulier au regard du risque de développement de maladies infectieuses (réactivation ou primo-infection ) ou de maladies cancéreuses (Roux et al. 2011). Par ailleurs, il a été montré que le potentiel biologique des cellules souches 30 mésenchymateuses était influencé, modifié par un environnement inflammatoire qu'il soit d'origine primaire comme dans le cas d'une polyarthrite rhumatoïde ou secondaire suite à un traumatisme Ainsi deux cytokines inflammatoires comme nup et le TNFOE inhibent la synthèse de matrice cartilagineuse par les chondrocyes (Saklatvala et al. 1986) par un mécanisme NFKB dépendant (Wehling et al. 2009). 35 Un traitement anti-inflammatoire non spécifique associé pourrait être envisagé mais un traitement anti-inflammatoire peut interférer avec les propriétés des CSM et induire l'apoptose des CSM Ainsi, l'ibuprofène diminue la différenciation ostéogénique des CSM (Abukawa et al. 2009) et l'aspirine inhibe la prolifération et induit l'apoptose des MSC (Deng et al. 2009). La déxaméthasone (corticoïde) ne modifie pas le potentiel immunosuppressif des cellules souches mésenchymateuses (Buron et al. 2009) mais elle peut induire la différenciation (ostéogénique...) des cellules dans une voie non souhaitée.

Les anti-inflammatoires stéroïdiens (Celeste et al. 2005) et non-stéroïdiens (Brandt et al. 1987) inhibent la synthèse de matrice cartilagineuse Perruche et al proposent un procédé de traitement de l'inflammation articulaire et de la dégradation du cartilage associé à un processus arthritique, basé sur l'administration de cellules apoptotiques. Dans un modèle murin d'arthrite (injection d'un composé de la paroi du streptocoque), l'administration unique de cellules apoptotiques prévient le développement de l'inflammation et la dégradation de l'articulation. Ce mécanisme fait intervenir principalement le TGFI31.

Huynh et al ont également montré dans deux modèles inflammatoires aigus murins (Péritonite induite par du Thioglycollate et Pulmonaire par instillation de LPS) que l'administration de cellules apoptotiques induisait un environnement anti-inflammatoire et une sécrétion de TGFI31 par les macrophages ayant phagocyté les cellules apoptotiques. Cette sécrétion est dépendante de l'exposition des résidus PhosphatidylSérine par les cellules apoptotiques et de leur reconnaissance par les récepteurs macrophagiques. La demande de brevet W098/51317 (Osiris Therapeutics) décrit une méthode de régénération du cartilage par l'administration d'une suspension de cellules souches mésenchymateuses autologues.

En outre, le brevet européen EP1545567 (Medcell Bioscience Ltd) décrit le traitement d'une distension sous-cutanée naturelle ou d'un traumatisme induit dans un tendon ou ligament chez le cheval, le chien, le chameau ou l'homme par l'administration au site du traumatisme d'une composition de cellules souches mésenchymateuses dans une suspension de liquide de surnageant de moelle osseuse. OBJECTIFS DE L'INVENTION Un objectif de l'invention est de fournir de nouveaux moyens de traitements anti35 inflammatoires lors des traitements par thérapie cellulaire. En particulier, un objectif de l'invention est d'améliorer les conditions d'utilisation des cellules souches mésenchymateuses en médecine régénérative. L'invention vise notamment à réduire les complications et inconvénients associés aux méthodes de traitement par thérapie cellulaire utilisant les cellules souches mésenchymateuses. Un autre objectif de l'invention vise à fournir de nouveaux moyens de traitement de lésions des tissus ostéo-articulaires. Encore un autre objectif de l'invention consiste à fournir un procédé de production de produit de thérapie cellulaire, notamment vétérinaire, qui soit simple et économique à mettre en oeuvre. En particulier, il est du mérite de l'inventeur d'avoir mis en évidence que l'administration de cellules apoptotiques concomitamment ou préalablement à l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un produit de thérapie cellulaire, par exemple constitué de cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques, devrait permettre avantageusement i. de réduire les effets néfastes d'un environnement inflammatoire sur la survie et la fonctionnalité des cellules administrées, par exemple les souches mésenchymateuses, ii. d'obtenir une tolérance spécifique chez le patient (immunosuppression spécifique) vis-à-vis des cellules administrées (notamment dans le cas d'un traitement allogénique), diminuant par là le risque d'infection liée à une immunosuppression non spécifique.

BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention porte sur de nouveaux moyens de traitement utilisant des cellules souches mésenchymateuses et satisfaisants à l'ensemble des objectifs identifiés ci-dessus.

Ainsi, l'invention, telle que définie dans les revendications, concerne un procédé in vitro d'obtention d'un produit de thérapie cellulaire, ledit procédé comprenant : a) la fourniture d'un ou plusieurs échantillons biologiques comprenant des cellules souches mésenchymateuses, préalablement collectés d'un ou plusieurs individus, b) l'extraction et, le cas échéant, l'amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses contenues dans les échantillons biologiques, c) la préparation d'une composition de cellules apoptotiques, de préférence de même génotype que les cellules souches mésenchymateuses amplifiées à l'étape b), d) la préparation du produit de thérapie cellulaire comprenant une quantité efficace de 35 cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques issues de l'étape b) et de cellules apoptotiques issues de l'étape c), lesdites cellules étant en suspension dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition de cellules apoptotiques est une composition de cellules souches mésenchymateuses apoptotiques. Aussi, l'invention concerne un procédé in vitro d'obtention d'un produit de thérapie cellulaire, ledit procédé comprenant : a) la fourniture d'un ou plusieurs échantillons biologiques comprenant des cellules souches mésenchymateuses, préalablement collectés d'un ou plusieurs individus, b) l'extraction et, le cas échéant, l'amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses contenues dans les échantillons biologiques, c) l'induction de l'apoptose sur seulement une partie des cellules souches 10 mésenchymateuses extraites et, le cas échéant, amplifiées à l'étape b), et, d) la préparation du produit de thérapie cellulaire comprenant une quantité efficace de cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques issues de l'étape b) et de cellules souches mésenchymateuses apoptotiques issues de l'étape c), lesdites cellules étant en suspension dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable. 15 Selon un mode de réalisation préféré, au moins 25% des cellules amplifiées à l'étape b), par exemple, 50% des cellules, sont isolées puis traitées pour l'induction de l'apoptose afin de constituer un lot de cellules apoptotiques, le reste des cellules constituant un lot de cellules non-apoptotiques, ledit produit de thérapie cellulaire étant constitué par la 20 combinaison des deux lots, lesdits lots étant aptes à être administrés ensemble ou séparément à un individu en attente de traitement par thérapie cellulaire. L'invention porte également sur une composition comprenant des cellules souches mésenchymateuses, caractérisée en ce que, entre 10 et 90% des cellules dans la 25 composition sont des cellules souches mésenchymateuses apoptotiques, et au moins 10%, par exemple, au moins 50% des cellules dans la composition, sont des cellules souches non apoptotiques, par exemple des cellules souches mésenchymateuses apoptotiques. L'invention vise également une composition comprenant au moins 107 cellules souches 30 mésenchymateuses non apoptotiques et au moins 106 cellules souches apoptotiques. L'invention concerne bien entendu une méthode de traitement par thérapie cellulaire, chez le mammifère, par exemple, l'homme, le chien ou le cheval, consistant à administrer chez un patient en attente d'un tel traitement, une composition ou un produit de thérapie 35 cellulaire selon l'invention. L'invention concerne également l'utilisation de ces compositions comme médicament ou produit de thérapie cellulaire, notamment pour le traitement allogénique par thérapie cellulaires, par exemple les traitements de maladies inflammatoires, et notamment les lésions ostéo-articulaires chez l'homme, le chien ou le cheval. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention porte en particulier sur de nouveaux produits de thérapie cellulaire utilisant les cellules souches mésenchymateuses et leur procédé de préparation. En particulier, l'invention porte sur un procédé in vitro d'obtention d'un produit de 10 thérapie cellulaire, ledit procédé comprenant : a. la fourniture d'un ou plusieurs échantillons biologiques comprenant des cellules souches mésenchymateuses préalablement obtenus d'un ou plusieurs individus, b. l'extraction et, le cas échéant, l'amplification ex vivo des cellules souches 15 mésenchymateuses contenues dans les échantillons biologiques, c. la préparation d'une composition de cellules apoptotiques, de préférence de même génotype que les cellules souches mésenchymateuses amplifiées à l'étape b), d. la préparation du produit de thérapie cellulaire comprenant une quantité 20 efficace de cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques issues de l'étape b. et de cellules apoptotiques issues de l'étape c., lesdites cellules étant en suspension dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable. 25 Dans un mode de réalisation particulier qui sera détaillé ci-après, on utilise une partie des cellules souches mésenchymateuses prélevées en vue de la thérapie cellulaire pour la préparation de la composition de cellules apoptotiques Ainsi le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) la fourniture d'un ou plusieurs échantillons biologiques comprenant des cellules souches 30 mésenchymateuses, préalablement collectés d'un ou plusieurs individus, b) l'extraction et, le cas échéant, l'amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses contenues dans les échantillons biologiques, c) l'induction de l'apoptose sur seulement une partie des cellules souches mésenchymateuses extraites et, le cas échéant, amplifiées à l'étape b), et, 35 d) la préparation du produit de thérapie cellulaire comprenant une quantité efficace de cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques issues de l'étape b) et de cellules souches mésenchymateuses apoptotiques issues de l'étape c), lesdites cellules étant en suspension dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable.

Définitions Par « thérapie cellulaire », on entend un traitement thérapeutique comprenant 5 l'administration de cellules biologiques viables, ou non viables, susceptibles d'induire un effet thérapeutique bénéfique chez le patient. Dans le cadre d'une approche de médecine régénérative, cette thérapie cellulaire est susceptible de favoriser directement (différenciation cellulaire) ou indirectement (sécrétion 10 de facteurs biologiques) la régénération in vivo d'un ou plusieurs tissus biologiques chez un individu en attente d'un tel traitement. Par « produit de thérapie cellulaire », on entend une substance ou composition thérapeutique comprenant des cellules biologiques issues d'un sujet donneur, pour le 15 traitement par thérapie cellulaire d'un sujet receveur. Lorsque le sujet receveur et le sujet donneur sont identiques, on parlera de produit de thérapie cellulaire autologue (ou syngénique). Lorsque le sujet receveur est différent du sujet donneur, on parlera de produit de thérapie cellulaire hétérologue ou allogénique. Le produit de thérapie cellulaire selon l'invention peut être une composition cellulaire, par exemple une suspension de cellules 20 dans un milieu pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir d'une composition cellulaire enrichie en cellules souches mésenchymateuses, selon les méthodes d'enrichissement connues de l'art antérieur ou tel que décrit ci-après. Il peut également s'agir d'une composition cellulaire obtenue à partir de cellules souches mésenchymateuses préalablement isolées et le cas échéant, amplifiées, notamment à l'aide d'un milieu de 25 culture susceptible d'obtenir leur prolifération en l'absence de différenciation. Par « population de cellules », on entend un ensemble de cellules comprenant un ou plusieurs types cellulaires différents, par exemple un mélange de cellules à différents stades de différentiation. 30 Par « cellules souches mésenchymateuses » (CSM), ou cellules stromales mésenchymateuses, on entend les cellules multipotentes, adhérant au plastique, exprimant les marqueurs de surface suivant : CD105 ; CD44 ; CD90 ; CD166 ; CD73 et n'exprimant pas les marqueurs suivants (CD45, CD34, CD19, CD11a, HLA-DR) et susceptibles de 35 différentiation vers les trois voies adipocytaire (adipocytes), chondrogénique (chondrocytes) et ostéogénique (ostéoblastes). Une composition de cellules souches mésenchymateuses comprend majoritairement les cellules répondant aux caractéristiques ci dessus.

Obtention de l'échantillon biologique comprenant des cellules souches mésenchymateuses La phase d'extraction comprend les étapes suivantes : a. collecte d'un tissu contenant des cellules souches mésenchymateuses ; b. le cas échéant, traitement du tissu afin d'individualiser les cellules ; c. le cas échéant, lavage ou filtration des cellules, remise en suspension des cellules et isolement des cellules souches mésenchymateuses.

On connait maintenant différents tissus à partir desquels il est possible d'extraire des cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses sont présentes notamment dans la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang de cordon ombilical, le liquide amniotique, la membrane synoviale, le périoste et le périchondre, l'os trabéculaire, le fluide synovial, le muscle, la graisse, le placenta, la gelée de Wharton, le coeur, la pulpe dentaire, le sang menstruel, les trompes de Fallope ou encore le sang périphérique. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'homme du métier choisira bien entendu la source de cellules souches mésenchymateuses la plus appropriée en fonction du type de traitement. Ce choix portera notamment sur les caractéristiques du sujet donneur, par exemple son âge, son sexe, son immuno-histocompatibilité avec le sujet receveur, ou encore sur le type de tissus source de cellules souches mésenchymateuses en fonction de l'objectif thérapeutique. En effet le potentiel qualitatif et quantitatif de différenciation des cellules souches mésenchymateuses est variable selon l'origine des cellules. L'objectif est d'obtenir un matériel de base pour l'extraction et le cas échéant l'amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses. En règle générale, on choisira une source permettant d'obtenir le plus grand nombre de cellules souches 30 mésenchymateuses afin de minimiser le temps nécessaire à l'amplification ex vivo. Dans le cas d'un traitement autologue, la source de cellules souches mésenchymateuses sera constituée d'un tissu préalablement prélevé de l'individu à traiter, par exemple du sang de cordon ombilical prélevé à la naissance de l'individu à traiter, par exemple chez le 35 poulain, ou de la moelle osseuse prélevée sur le cheval adulte.

Aussi, dans un mode de réalisation, les cellules souches mésenchymateuses sont extraites de la gelée de Wharton contenue dans le cordon ombilical, par exemple, du cordon ombilical humain ou équin.

Pour l'extraction des cellules souches mésenchymateuses, le tissu est collecté et, si nécessaire, est traité, par exemple par traitement enzymatique et/ou broyage, pour individualiser les cellules souches mésenchymateuses et faciliter leur mise en culture ou leur isolement. Les cellules peuvent également être filtrées pour les séparer des débris résultant de l'étape de traitement. Typiquement, on peut obtenir entre 10E6 et 10E8 cellules à partir d'une portion de 20 cm d'un cordon ombilical. Par extraction, on entend l'opération consistant à extraire par un processus enzymatique et/ou mécanique les cellules contenues dans un tissu et sa matrice extracellulaire. Par amplification, on entend l'opération consistant à enrichir une population cellulaire de base en cellules souches mésenchymateuses. L'extraction peut comprendre ou pas une phase de sélection ou d'isolement des cellules souches mésenchymateuses. Tout type de méthodes d'extraction des cellules souches mésenchymateuses peut être utilisé selon le procédé de l'invention. En particulier, les cellules souches mésenchymateuses peuvent être sélectionnées par leur propriété d'adhérence sur support plastique. Cette méthode est décrite par exemple dans Pittenger et al. (Pittenger et al. 1999). D'autres méthodes pour l'obtention d'une population de cellules enrichies en cellules souches mésenchymateuses utilisent la reconnaissance de marqueurs cellulaires de surface caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses et la sélection (ou le tri) des cellules exprimant ces marqueurs (immunosélection positive). Des méthodes de sélection de cellules sur la base de leurs marqueurs cellulaires de surfaces incluent notamment le tri des cellules par cytométrie de flux (FACS), les billes magnétiques couplées à des anticorps spécifiques. Des anticorps ou fragments d'anticorps reconnaissant un ou plusieurs marqueurs caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses peuvent être utilisés à cette fin. La méthode peut également comprendre la déplétion de la population cellulaire en cellules exprimant des marqueurs qui ne sont pas exprimées chez les cellules souches mésenchymateuses (immunosélection négative). La technique d'élutriation peut également être utilisée basée sur les comportements rhéologiques différentiels des types cellulaire dans un flux liquide (Majore et al. 2009).

On obtient ainsi une population de cellules enrichie en cellules souches mésenchymateuses. Une telle population est susceptible de contenir au moins 50% de cellules exprimant les marqueurs caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses, par exemple au moins 60, 70, 80, 90, 95, voire 99% des cellules exprimant les marqueurs caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses. Cette population peut être associée à un taux plus ou moins important de fibroblastes. Amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses La population de cellules enrichie en cellules souches mésenchymateuses peut ensuite être cultivée dans des conditions permettant la prolifération (ou amplification) des cellules souches mésenchymateuses tout en limitant voire en bloquant leur différenciation.

Afin de limiter l'épuisement métabolique et le risque de sénescence cellulaire lié à une amplification ex vivo trop poussée, on choisira d'obtenir un matériel de départ contenant un nombre important de cellules souches mésenchymateuses, par exemple au moins 10E6 ou 10E8 cellules et on limitera le nombre de passages, par exemple entre 6 et 10 passages, pour la constitution d'un lot de cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques, ou plus, dans le cas du lot de cellules souches apoptotiques. Par ailleurs il est connu que le potentiel de différenciation diminue avec le nombre de passages cellulaires. A ce stade, on peut également séparer cette population en au moins deux lots distincts, un premier lot pour la constitution d'un lot de cellules souches mésenchymateuses, viable ou 20 non-apoptotique, et un second lot pour la constitution d'un lot de cellules souches mésenchymateuses apoptotiques. Des conditions de culture spécifique pour l'amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses sont décrites dans les exemples. D'autres conditions sont décrites dans 25 l'art antérieur et notamment dans (Bernardo et al. 2007) (Stute et al. 2004) (Stewart et al. 2007) (Koller et al. 1998) A l'issue de l'étape d'amplification, on obtient un ou plusieurs lots de population de cellules constituées majoritairement de cellules souches mésenchymateuses, par exemple 30 entre 50 et 90% de cellules exprimant les marqueurs caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses, ou au moins 107 cellules souches mésenchymateuses, c'est-à-dire des cellules exprimant au moins les marqueurs CD105, CD90 et CD73 et n'exprimant pas au moins les marqueurs CD45 ; CD34, CD14 et CD11b. 35 Composition de cellules apoptotiques Le procédé de l'invention repose sur la mise en évidence de propriétés anti-inflammatoires et/ou immunosuppressives des cellules apoptotiques lorsque celles-ci sont administrées en combinaison avec un produit de thérapie cellulaire à base de cellules souches mésenchymateuses. Dans un mode de réalisation, les cellules apoptotiques sont des cellules prélevées de 5 l'individu en attente d'un traitement par thérapie cellulaire à base de cellules souches mésenchymateuses. Une fois prélevée, ces cellules peuvent être amplifiées et on induit l'apoptose sur ces cellules. Dans un mode de réalisation préféré, on induit l'apoptose sur une partie des cellules 10 souches mésenchymateuses extraites comme décrit précédemment. Par exemple, on peut induire l'apoptose sur une partie des cellules extraites, avant ou après amplification ex vivo. Dans un mode de réalisation particulier, on induit l'apoptose sur au moins 25% des cellules 15 amplifiées préalablement, par exemple environ 50% des cellules, isolées du reste des cellules amplifiées afin de constituer un lot de cellules apoptotiques, le reste des cellules constituant le lot de cellules non-apoptotiques. Au sens de l'invention, l'apoptose (aussi connu sous le nom de mort cellulaire 20 programmée) se définit comme le processus par lequel des cellules déclenchent leur autodestruction, en général, en réponse à un signal. C'est l'une des voies possibles de la mort cellulaire, qui est physiologique, génétiquement programmée, nécessaire à la survie des organismes multicellulaires. 25 Au sens de l'invention, on entend par « cellules apoptotiques », une population de cellules ayant subi une étape d'induction de l'apoptose et dont au moins 50% des cellules expriment un ou plusieurs marqueurs caractéristiques des cellules apoptotiques. De tels marqueurs de l'apoptose sont notamment l'expression des marqueurs suivants : annexine V, et/ou l'absence d'expression des marqueurs suivants : 7 AAD. 30 De préférence, une population de cellules apoptotiques est une population dont au moins 50% des cellules expriment également l'annexine V mais n'expriment pas le marqueur 7 AAD. 35 Dans un autre mode de réalisation, on induit l'apoptose sur une partie des cellules souches mésenchymateuses extraites, et, le cas échéant amplifiées, de sorte à obtenir au moins 106 cellules souches mésenchymateuses exprimant les marqueurs caractéristiques des cellules apoptotiques.

Plusieurs méthodes d'induction de l'apoptose peuvent être utilisées. On citera en particulier la méthode décrite dans Bittencourt (Bittencourt et al. 2001).

Une méthode consiste à dépriver les cellules en culture de sérum. Une autre méthode consiste à incuber les cellules avec un agent intercalant, par exemple le 8-MOP (8- méthoxysporalène) suivi d'une irradiation par UV A (Maeda et al. 2005) ; (Gatza et al. 2008).

Alternativement, une irradiation des cellules par UVB peut être effectuée (par exemple 200J/m2 UVB (Sankyo Denky, Japan). On peut également induire l'apoptose par irradiation avec une source de rayonnement gamma, par exemple d'environ 40Gy (Bittencourt et al. 2001) ou 1500 rad (Perruche et al. 15 2009). Les cellules sont ensuite éventuellement congelées ou resuspendues, de préférence en phase précoce d'apoptose, ou utilisées de préférence dans les 24h à 48h après l'induction de l'apoptose. 20 Préparation du produit de thérapie cellulaire L'invention porte également sur la préparation d'un produit de thérapie cellulaire, consistant à combiner un lot de cellules souches mésenchymateuses non-apoptotiques et un 25 lot de cellules apoptotiques, par exemple un lot de cellules souches mésenchymateuses apoptotiques, lesdits lots pouvant être constitués comme décrits dans les paragraphes précédents. Dans un mode de réalisation préféré du procédé de préparation, les cellules 30 mésenchymateuses sont resuspendues dans un milieu de suspension choisi dans le groupe constitué par une solution saline, par exemple du PBS, du sérum de sang, par exemple du sérum de sang de cordon ombilical et/ou du surnageant de moelle osseuse. Avantageusement, dans le cas de la préparation d'un produit de thérapie cellulaire pour un 35 traitement autologue (syngénique), le milieu de suspension est constitué par du sérum de sang ou du surnageant de moelle osseuse provenant du même individu que le donneur de cellules souches mésenchymateuses, ledit individu étant le sujet à traiter.

Dans un autre mode de réalisation, le produit de thérapie cellulaire est constitué de deux lots distincts préparés pour être administrés à un même individu mais séparément. Aussi l'invention porte également sur un kit en vue du traitement par thérapie cellulaire, comprenant, une première composition constituée d'un lot de cellules mésenchymateuses amplifiées ex vivo et non apoptotiques, et une deuxième composition constituée d'un lot de cellules apoptotiques, les deux lots ayant essentiellement le même génotype, par exemple, étant issue du même donneur. L'invention porte également sur des compositions comprenant des cellules souches mésenchymateuses, caractérisée en ce que, entre 10 et 90% des cellules dans la composition sont des cellules souches mésenchymateuses apoptotiques, et au moins 10% des cellules dans la composition sont des cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques. De préférence, entre 10 et 50% des cellules souches mésenchymateuses sont apoptotiques.

L'invention porte également sur une composition comprenant des cellules souches mésenchymateuses, caractérisée ce qu'elle comprend au moins 107 cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques, et au moins 106 cellules apoptotiques, de préférence au moins 106 cellules souches mésenchymateuses apoptotiques. Afin d'obtenir un effet de tolérance spécifique vis-à-vis des cellules souches mésenchymateuses, avantageusement, les cellules souches mésenchymateuses ont essentiellement le même génotype, par exemple, proviennent du même donneur (cellules apoptotiques et non-apoptotiques). Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les compositions selon l'invention comprennent des cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse, du sang de cordon ombilical (gelée de Wharton) de mammifère, notamment humain, canin ou équin. Selon un mode encore plus préféré, ces compositions comprennent les cellules souches mésenchymateuses en suspension dans un milieu de suspension choisi dans le groupe constitué par une solution saline, du sérum, notamment du sérum de sang de cordon ombilical, ou du surnageant de moelle osseuse. 25 30 35 Ces compositions sont utiles comme indiquée précédemment comme composition pharmaceutique, notamment comme produit de thérapie cellulaire.

Aussi, l'invention porte sur l'utilisation de ces compositions comme composition pharmaceutique, par exemple comme produit de thérapie cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, les compositions selon l'invention comprennent environ entre 105 et 108 cellules/kg (par rapport au poids du sujet à traiter), par exemple entre 1.106 et 1.107 cellules/kg. Le nombre exact de cellules à administrer dépend de différents facteurs, et notamment, l'âge, le poids, le sexe du sujet à traiter, la pathologie et l'étendue ou la sévérité de la pathologie à traiter.

Ces compositions peuvent comprendre, d'autres principes actifs ou des excipients pharmaceutiquement acceptables, et choisis selon le type de formulation souhaitée. Les compositions peuvent comprendre notamment des biomatériaux ou substrats tridimensionnels. De tels substrats peuvent être utilisés dans le milieu de culture des cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques, et permettent leur différenciation pour la formation de greffons, par exemple, des greffons osseux ou cartilagineux. Les biomatériaux incluent, sans être restrictif, les biomatériaux poreux de nature polymériques ou céramiques, des structures métalliques de type titane, tantale, ou nitinol. Parmi les biomatériaux poreux de type polymérique, on peut citer par exemple, l'acide polylactique (PLA), l'acide polyglycolique (PGA), l'acide polylactique co-glycolique (PLAGA), l'acide hyaluronique ou encore de polycaprolactone (PCL). Les céramiques synthétiques (hydroxyapatite et phosphates tricalciques) ou naturelles (corail et nacre) sont également utilisables en tant que biomatériau, notamment pour la culture d'organoïdes osseux.

D'autres biomatériaux dits « résorbables » ont été développés et comprennent les matériaux d'origine biologique (par exemple, alginate, collagène, ou encore gels de fibrine) ou encore les hydrogels poreux par exemple à base de polymères choisi parmi les Poly-Ethylène Glycol (PEG), le poly(vinyl alcohol) (PVA) et le poly(2-hydroxy ethyl methacrylate) (pHEMA). Ces matériaux peuvent comprendre également différents additifs, par exemple différents collagènes, le chitosan, etc., favorisant des phases spécifiques dans le développement cellulaire ou modifiant les propriétés physico-chimiques du matériau. Dans un mode de réalisation spécifique, les compositions selon l'invention ne comprennent pas d'agents anti-inflammatoires et/ou immunosuppresseurs. En effet, l'un des avantages des compositions selon l'invention est de permettre d'atténuer ou de prévenir des phénomènes inflammatoires ou des réactions auto-immunes associées à la pathologie du patient ou au traitement par thérapie cellulaire.

Les compositions de l'invention peuvent comprendre le cas échéant d'autres facteurs, par exemple des facteurs de croissance favorisant le homing des cellules souches et/ou la reconstitution in vivo des tissus à traiter.

Méthodes de traitement par thérapie cellulaire Les produits de thérapie cellulaire ou compositions tels que décrits précédemment sont destinés en particulier au traitement en médecine régénérative, notamment, chez l'homme, 10 le chien ou le cheval. En particulier, l'invention porte sur l'utilisation du produit de thérapie cellulaire ou composition pharmaceutique pour a. le traitement des lésions ostéo-articulaires (ligaments/tendons), 15 b. le traitement de l'ostéochondrose, c. le traitement de l'ostéonécrose, d. le traitement des lésions cartilagineuses, e. les traitements des maladies autoimmunes et inflammatoires, et notamment la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, le diabète de 20 type I, f. le traitement des affections inflammatoires pulmonaires, par exemple, la bronchopathie pulmonaire chronique obstructive (BPCO), l'asthme, ou encore, g. le traitement des maladies cardiovasculaire, et notamment l'ischémie du myocarde. 25 Le produit de thérapie cellulaire ou composition pharmaceutique peut être administré par voie intraveineuse ou administré localement. Dans un mode de réalisation, le produit de thérapie cellulaire ou la composition pharmaceutique selon l'invention est injectée chez le sujet à traiter par voie intraveineuse. 30 Le mode d'administration est évidemment adapté en fonction du patient et de la pathologie à traiter. Dans un mode de réalisation, les cellules souches mésenchymateuses non-apoptotiques 35 sont administrées localement et les cellules souches mésenchymateuses apoptotiques sont injectées par voie intraveineuse.

Dans un autre mode de réalisation préféré, les cellules souches mésenchymateuses nonapoptotiques sont co-administrées soit localement soit par voie intraveineuse. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer sans être limitatif certains modes de 5 réalisation de l'invention. EXEMPLES Préparation d'un produit de thérapie cellulaire chez le cheval 10 Collecte du cordon ombilical. Les cordons ombilicaux sont obtenus à la naissance des poulains juste après la section, naturelle ou provoquée du cordon ombilical. Le site de section est décontaminé avec une solution antiseptique et une portion du cordon ombilical d'environ 10-30 cm au dessus de la zone nacrée est découpée. Le cordon ombilical peut 15 être nettoyé à l'aide d'une solution stérile physiologique (p.ex NaC1 0,9%) avant d'être conditionné dans un contenant stérile avec une solution de conservation du tissu complémenté d'un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques. Transport du cordon ombilical. Le cordon ombilical est acheminé vers le site de 20 transformation par un transport à température dirigée (par exemple entre +2°C et +12°C) si la durée du transport excède 6h. Lavage du cordon ombilical. Le cordon est manipulé préférentiellement en circuit clos. Alternativement il peut être manipulé dans un environnement avec une atmosphère 25 contrôlée (idéalement de type Classe B ou IS05) avec des gants stériles. Les vaisseaux sont flushés avec du sérum physiologique ou tout autre liquide physiologique, additionné d'antibiotique ou non, à l'aide d'une seringue à embout mâle. Le cordon est aspergé et trempé dans du liquide physiologique dans un bac stérile. Il peut être massé pour faciliter le nettoyage. Le cordon est transféré dans un autre bac de lavage contenant du liquide 30 physiologique. Idéalement cette opération est réalisée 2-3 fois. Elle peut être poursuivie éventuellement. Un échantillon du dernier liquide de rinçage peut être fait pour vérifier la qualité microbiologique du prélèvement. Extraction des cellules de la matrice du cordon ombilical 35 Dissection pour mettre à jour la matrice. Le cordon ombilical est disséqué à l'aide d'un scapel, pince et ciseau. La matrice entourant les vaisseaux ombilicaux est extraite. D'autres zones anatomiques du cordon ombilical peuvent éventuellement être associées (paroi des vaisseaux ; membranes amniotiques). Les morceaux de matrice sont découpés en petits morceaux de 1-3 mm2 ou 1-3 mm3 puis plongés dans 10 ml solution physiologique (idéalement du milieu de culture cellulaire complet (avec sérum avec ou sans antibiotiques) Traitement de la matrice par un cocktail enzymatique. Un traitement incluant de la Collagenase (de type I préférentiellement) à une concentration comprise entre 100-1000 UI/ml et associé ou non à de la Hyaluronidase et ou de la Tryspine peut être utilisé pour dégrader la matrice afin de libérer les cellules. L'ajout de DNase I (1-10 U/m1) peut être envisagé pendant toute la durée de l'incubation. L'incubation peut aller de 20 min à 2 heures selon le niveau de pureté de la matrice isolé et la taille des morceaux obtenus. Elle se fera préférentiellement à 37°C dans une enceinte à 5% de CO2. L'action de l'enzyme est stoppée soit par l'ajout d'un inhibiteur de l'enzyme utilisée soit par dilution à l'aide par exemple du milieu de culture qui sera utilisé par la suite.

Traitement complémentaire physique par broyage. Le traitement se fait en circuit clos idéalement avec du matériel stérile à usage unique ou stérilisé. Il consiste à broyer le matériel à l'aide de billes en métal ou en verre, ou à l'aide d'un statif/rotor par exemple pendant environ 10 secondes. Le matériel est maintenu dans de la glace pour éviter le réchauffement du matériel biologique. Filtration. La filtration se fait par passage successif sur des filtres de taille de maille décroissante. Idéalement 500 ium / 250 ium / 100 ium / 70 ium / 10 um. Les morceaux retenus peuvent être rincés avec milieu physiologique.

Culture cellulaire et amplification cellulaire Comptage cellulaire. La suspension cellulaire est centrifugée (150 g - 10 min). Le culot cellulaire est remis en suspension dans le milieu de culture. Un aliquot cellulaire (50 iLt1) est mélangé à 50 iul d'une solution de bleu trypan (colorant vital) puis le mélange est déposé sur une cellule de comptage type Mallassez et les cellules réfringentes (vivantes) et bleues (mortes) sont comptées. Typiquement, entre 107 et 108 cellules peuvent être obtenues à partir d'une portion de 20 cm d'un cordon ombilical.

Extraction des cellules souches mésenchymateuses On utilise de préférence la méthode par adhérence plastique pour l'extraction des cellules souches mésenchymateuses : Les CSM possèdent la propriété d'adhérer au surfaces plastiques type polystyrène. Le support peut donc être un plastique prétraité ou non ou tout autre support favorable à la culture de cellules adhérentes (bioréacteur). Densité cellulaire : Entre 10.000 et 100.000 5 cellules vivantes /cm2. Volume de culture. 30 ml pour un flask de 175 cm2. Les cellules sont ensemencées et placées dans un incubateur à CO2 (5%) à 37°C et 95% d'humidité pendant 24-48h. Alternativement, on peut utiliser l'Immuno-sélection Positive (marqueur spécifique des 10 CSM) ou Négative (marqueur absent sur les CSM) ; Elutriation (Majore et al. 2009). Amplification ex vivo des cellules Milieu d'amplification 15 Sans facteurs de croissance exogène. C'est un milieu à base d'un milieu de culture classique type DMEM 1g/1 glucose (ou MEMx), avec ou sans antibiotiques (Pénicilline 0100 U/m1 ; Streptomycine 0-0,1 mg/mi ; Amphotéricine B 0-25 mg/mi...), et complémenté avec une source de facteurs de croissance comme le sérum de veau foetal (p.ex 0-20%), ou du sérum adulte hétérologue ou du sérum autologue ou hétérologue obtenu à partir du sang 20 placentaire à une concentration comprise entre 5 et 30% (v/v) typiquement. Des facteurs de croissance exogènes (p.ex FGF 2 ng/ml (1-10 ng/ml)) peuvent être rajoutés au milieu décrit ci-dessus. L'amplification des CSM avec le FGF-2 permet de maintenir le potentiel chondrogénique (Solchaga et al. 2005) mais pourrait induire l'expression d'HLA 25 DR par les CSM (Sotiropoulou et al. 2006). Degré d'amplification est de préférence le plus faible possible. La culture et le nombre de passage des CSM peuvent en effet modifier certaines propriétés biologiques des CSM (Briquet et al.) On limitera le nombre de passage des cellules mais afin d'optimiser 30 l'expansion, on utilise les cellules souches mésenchymateuses de sang de cordon ombilical amplifiée avec du sérum de sang placentaire autologue (Shetty et al. 2007) jusqu'à passage 6-10 pour les cellules viables qui sont ensuite congelées, et jusqu'à passage > 6-20 pour les cellules pour apoptose. 35 Entre chaque passage, les cellules sont lavées avec du PBS stérile à 37°C puis incubées 2 min à 37°C et sous 5% de CO2 avec 50g1/cm2 de Trypsin/EDTA. Cela permet de détacher les cellules et de former une population de cellules isolées.

Contrôles qualité Nombre de cellules. La quantité de cellules obtenues est vérifiée par un comptage manuel (bleu trypan et cellules de Mallassez) ou à l'aide d'un cytomètre.

Phénotype cellulaire L'expression des marqueurs membranaires caractéristiques des CSM est vérifiée par cytométrie en flux grâce à l'utilisation d'un panel d'anticorps spécifique de chaque marqueur (p.ex CD105 ; CD44 ; CD90 ; CD166 ; CD73...). L'absence d'expression des marqueurs typiques du lignage hématopoïétique est également vérifiée (p.ex CD45 ; CD34 ; etc...) Différenciation. La capacité de différenciation des CSM dans les trois voies de différenciation 15 caractéristiques des CSM (adipocytaire, chondrogénique et ostéogénique) est vérifiée. Cela se fait par l'incubation des cellules avec 3 milieux de différenciation spécifique de chaque voie de différenciation. Voie adipocytaire avec une alternance d'incubation pendant 3 jours avec du milieu de culture de base contenant de l'insuline (1-100 µg/ml), 3-isobutyl-méthylxanthine (0,1-2 20 mM) et de l'indométhacine (0,05-0,5 mM) et 1-2 jours de milieu de maintenance avec du milieu de culture de base contenant uniquement de l'insuline. Voie chondrogénique. Le milieu de différenciation chondrogénique est basé sur du DMEM 4,5 g/1 de glucose sans sérum et additionné de TGF-b3, acide ascorbique, dexaméthasone . Voie ostéogénique avec un milieu de culture contenant un corticostéroide (typiquement 25 Dexaméthasone 0,1-1µM), un agent réducteur typiquement de l'Acide Ascorbique -2P (entre 0,5 et 0,5 mM) et du beta-glycérophosphate (0-50 mM). De la BMP-2 peut par exemple remplacer la dexaméthasone. Congélation 30 Elle peut se fait avant ou après amplification Méthode biochimique (Lidocaïne/EDTA p.ex) - Méthode préférée Méthode enzymatique (Trypsine/EDTA pas recommandée) Méthode physique (scrapper si dissociation cellulaire bonne) Avec 0-20% Sérum 35 Décongélation Milieu d'Isolement /Culture/ Expansion / Resuspension Préférentiellement du plasma ou sérum de sang placentaire (Apparié ou non) Autre milieu biologique avec ou sans fonction anabolique Plasma ou sérum de sang périphérique autologue/allogénique Induction de l'apoptose L'induction de l'apoptose est effectuée sur les cellules en fin de période d'expansion préférentiellement et après décongélation préférentiellement mais également avant congélation si nécessaire.

Elle peut se faire également directement sur les cellules adhérentes ou préférentiellement après remise en suspension par voie enzymatique ou biochimique. Plusieurs méthodes d'induction de l'apoptose peuvent être utilisées (Bittencourt et al. 2001). - Déprivation en sérum. - Physique - Incubation des cellules avec un intercalant par exemple le 8-MOP (8-méthoxypsoralène) suivi d'une irradiation par UVA (Maeda et al. 2005; Gatza et al. 2008) - Alternativement une irradiation des cellules par UVB (200 J/m2 UVB) peut être effectuée 20 (Sankyo Denky, Japan) - Selon la possibilité d'accès à une source de rayonnement gamma, une irradiation à 40 Gy (Bittencourt et al. 2001) ou 1500 rad (Perruche et al. 2009) permet d'induire l'apoptose. On vérifie ensuite que les cellules sont unicellulaires (absence d'agrégats) 25 Contrôle qualité Une quantification du pourcentage de cellules apoptotiques parmi la population cellulaire induite peut être réalisée par un marquage par Annexin V/7AAD ou Iodure de Propidium par exemple. Typiquement, au moins 50% doivent être apoptotiques (cellules Annexin V 30 positif / 7 AAD négatif). D'autres méthodes peuvent être utilisées pour évaluer l'apoptose. Idéalement la suspension de cellules irradiées devrait contenir moins de 10% des cellules en phase tardive (marquées au bleu trypan ou au 7AAD ou Iodure de Propidium) Les cellules doivent idéalement être en phase précoce d'apoptose (6h post irradiation) 35 cette étape peut être ralentie jusqu'à 24h par un maintien à 4°C. Les cellules apoptotiques sont conservées à 4°C et doivent être utilisées dans les 24h-48h suivant l'induction de l'apoptose.

Effet anti-inflammatoire Pour induire un contexte se rapprochant d'un environnement inflammatoire, des PBMC isolés à partir du sang périphérique sont stimulés par exemple par une endoxine LPS (10 5 ng/ml - 1 µg/m1). La co-incubation des cellules PBMC avec des CSM apoptotiques (autologue ou hétérologues) à un ratio 1/1 permet d'induire une baisse de plus de 20% de la sécrétion d'IL113 et de TNFx en réponse au LPS et une augmentation de plus de 20% de la sécrétion 10 d'IL10 et TGFI3. Des CSM viables en culture à 50% de confluence sont co-incubées avec 106 PBMC stimulés par LPS en présence ou non d'un nombre équivalent de cellules apoptotiques. Après 24-72 h d'incubation, les CSM sont obtenues et leur fonctionnalité des CSM viables 15 post incubation est vérifiée selon le protocole décrit ci-dessus. La différenciation ostéoblastique et chondrocytaire des CSM est réduite en l'absence des cellules apoptotiques. Bibliographie : 20 Abukawa, H., M. Phelps, et al. (2009). "Effect of ibuprofen on osteoblast differentiation of porcine bone marrow-derived progenitor cells." J Oral Maxillofac Surg 67(11): 2412-7. 25 Bernardo, M. E., M. A. Avanzini, et al. (2007). "Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute." J Cell Physiol 211(1): 12130. 30 Bittencourt, M. C., S. Perruche, et al. (2001). "Intravenous injection of apoptotic leukocytes enhances bone marrow engraftment across major histocompatibility barriers." Blood 98(1): 224-30. Brandt KD (1987). "Effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on chondrocyte 35 metabolism in vitro and in vivo." Am J Med. 83(5A):29-34. Briquet, A., S. Dubois, et al. "Prolonged ex vivo culture of human bone marrow mesenchymal stem cells influences their supportive activity toward NOD/SCID- repopulating cells and committed progenitor cells of B lymphoid and myeloid lineages." Haematologica 95(1): 47-56. Buron, F., E. Morelon, et al. (2009). "Mesenchymal stem cell and immunosuppressive drug interactions." Transplantation 87(12): 1899-900; discussion 1900-1. Céleste C, Ionescu M, et al (2005). "Repeated intraarticular injections of triamcinolone acetonide alter cartilage matrix metabolism measured by biomarkers in synovial fluid." J Orthop Res. 23(3):602-10.

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Claims (16)

1. REVENDICATIONS1. Procédé in vitro d'obtention d'un produit de thérapie cellulaire, ledit procédé comprenant : a. la fourniture d'un ou plusieurs échantillons biologiques comprenant des cellules souches mésenchymateuses, le ou les échantillons biologiques ayant été préalablement obtenus d'un ou plusieurs individus, b. l'extraction et, le cas échéant l'amplification ex vivo des cellules souches mésenchymateuses présentes dans les échantillons biologiques, c. la préparation d'une composition de cellules apoptotiques, de préférence de même génotype que les cellules souches mésenchymateuses amplifiées à l'étape b), d. la préparation du produit de thérapie cellulaire comprenant une quantité efficace de cellules souches mésenchymateuses non apoptotiques issue de l'étape b) et de cellules apoptotiques issue de l'étape c), lesdites cellules étant en suspension dans un milieu de suspension pharmaceutiquement acceptable.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules apoptotiques sont obtenues par induction d'une partie des cellules souches mésenchymateuses extraites 20 et le cas échéant amplifiées à l'étape b.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le ou les échantillons biologiques fournis à l'étape a) proviennent de la moelle osseuse ou de sang de cordon ombilical chez le mammifère, par exemple, l'homme, le chien ou le cheval. 25
4. 4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le ou les échantillons biologiques proviennent d'un même individu.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que au 30 moins 25% des cellules amplifiées à l'étape b), par exemple environ 50% des cellules, sont isolées puis traitées pour l'induction de l'apoptose afin de constituer un lot de cellules apoptotiques, le reste des cellules amplifiées constituant un lot de cellules nonapoptotiques, ledit produit de thérapie cellulaire étant constitué par la combinaison des deux lots, lesdits lots étant aptes à être administrés ensemble ou séparément à un individu 35 en attente de traitement par thérapie cellulaire.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, à l'issue de l'étape c) d'induction de l'apoptose, au moins 50% des cellules expriment un ou plusieursmarqueurs caractéristiques des cellules apoptotiques, par exemple au moins 50% des cellules sont positives pour l'annexine V et négative pour le marqueur 7 AAD.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 5 que la préparation du produit de thérapie cellulaire à l'étape d) comprend la resuspension des cellules dans un milieu de suspension choisi dans le groupe constitué par une solution saline, du sérum de sang et/ou du surnageant de moelle osseuse.
8. 8. Produit de thérapie cellulaire, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une 10 quelconque des revendications 1 à 7.
9. 9. Produit de thérapie cellulaire selon la revendication 8, pour son utilisation dans un traitement de thérapie cellulaire allogénique chez le mammifère. 15
10. 10. Produit de thérapie cellulaire selon la revendication 8 ou 9, pour son utilisation dans le traitement des lésions ostéo-articulaires chez l'homme, le chien ou le cheval.
11. 11. Composition comprenant des cellules souches mésenchymateuses, comprenant au moins 106 cellules souches mésenchymateuses apoptotiques, et au moins 107 cellules 20 souches mésenchymateuses non apoptotiques.
12. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que toutes les cellules ont essentiellement le même génotype. 25
13. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée ce que les cellules souches mésenchymateuses sont issues de la moelle osseuse ou de sang de cordon ombilical de mammifère, notamment humain, canin ou équin.
14. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce 30 que les cellules sont en suspension dans un milieu de suspension choisi dans le groupe constitué par une solution saline, du sérum, notamment du sérum de sang de cordon ombilical, ou du surnageant de moelle osseuse.
15. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisée en ce 35 que les cellules souches mésenchymateuses et le milieu de suspension sont issus du même individu.
16. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, pour son utilisation comme médicament, par exemple pour le traitement, chez l'homme, le chien ou le cheval : a) des lésions ostéo-articulaires, b) de l'ostéochondrose, c) de l'ostéonécrose, d) des lésions cartilagineuses, e) des maladies autoimmunes et inflammatoires, et notamment la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, le diabète de type I, f) des affections inflammatoires pulmonaires, par exemple, la bronchopathie pulmonaire chronique obstructive, l'asthme, ou encore, g) des maladies cardiovasculaires, et notamment l'ischémie du myocarde.