CN112470007A - 治疗性物质，其制备和诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以允许鉴别可能对使用MSC的免疫抑制治疗有应答的患者的方式使用活的间充质基质细胞(MSC)的方法。该方法包括使来自所述患者的样品与活MSC体外接触，并确定该样品是否能够诱导活MSC体外发生至少一些凋亡，或检测前列腺素E2(PGE2)升高的水平。样品诱导所述凋亡和/或PGE2水平升高的能力表明所述患者对所述免疫抑制治疗的应答性和/或表明恢复健康。本发明还提供了凋亡MSC，其用于治疗免疫介导的疾病或病症，例如同种异体免疫或自身免疫疾病，或用于预防或治疗移植器官的排斥；或用于再生医学以刺激组织修复。还描述并要求保护制备包含凋亡MSC的药物组合物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别能够对使用活的间充质基质细胞(mesenchymalstromal cells，MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者的方法，以及有应答和无应答患者可用的治疗选项，和用于制备用于该方法的药剂的方法。
背景技术
炎性疾病给全世界健康服务带来了巨大的负担。尽管生物制品已经产生了积极的影响，但是它们不是治愈性的并且带有显著毒性。在临床环境获得的令人鼓舞的结果的支持下，基于细胞的免疫调节代表着一种新的机会。间充质基质细胞(MSC)可能是最有希望的方法之一。一些研究已经表明，MSC控制炎症并因此通过促进残余宿主组织修复活性来调节组织稳态。MSC介导的免疫抑制实际上影响着任何类型的免疫细胞，并且不需要产生与靶细胞的任何组织相容性。因此，这些性质和它们的多功能性吸引了许多关注，以便有机会利用MSC治疗免疫介导的疾病。MSC在移植物抗宿主病(GvHD)中具有有益作用的概念证明已经存在。GvHD是潜在的致死性并发症，影响约40％的经历同种异体造血干细胞移植(HSCT)的患者。当该疾病不对类固醇响应时-这发生在约10-20％的病例中-患者通常死亡。早期的II期研究已报道，约半数患有严重类固醇难治性GvHD的患者在MSC输注后经历临床应答。也有最初的证据表明，MSC治疗可成功地用于控制移植器官的排斥，改善自身免疫疾病如多发性硬化、克罗恩病、某些形式的关节炎和严重急性炎症如急性呼吸窘迫综合征。
然而，所描述的临床结果可变且效力的证据并不确定。这是因为缺乏能够提供标准来选择最有效的细胞制备物的效力测定方法，而迄今为止对支持MSC治疗效果的机制的有限理解阻止了这个方向上的任何进展。事情的另一方面是患者选择。可用的数据-由临床前研究强烈支持-表明，选择MSC输注的适当时机是临床功效的根本，而这很大程度上与细胞制备无关。时机选择似乎未必与疾病的严重性相关，但与疾病的炎症特征相关。事实上，MSC不是组成型免疫抑制性的，但它们仅在暴露于"许可"其性质的炎性环境后才能如此。疾病中引发MSC治疗活性的分子线索的谱图仍然是未得到解答的问题，如果正确地解决，则其可能能够鉴别哪些患者更有可能受益于MSC治疗。迄今为止，来自动物模型和体外系统的唯一证据暗示了干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)在MSC"许可"中的作用，但是这些分子中没有一个在临床环境中得到证实。因此，MSC治疗中可能未满足的最迫切需要是了解哪些患者更可能对治疗有应答。鉴别与MSC应答者相关的特征将允许告知患者分层，设计高度有力的临床试验，并最终使已经有希望的基于MSC的治疗策略最大化。
MSC治疗领域中最令人困惑的观察结果之一是，输注的大多数细胞在输注后立即几乎瞬态驻留在肺中，之后在几小时内变得不可检测。目前的知识不能提供对这种矛盾的解释，因此为了使其应用最大化，需要更好地理解MSC治疗活性的机制。
申请人在这方面取得了显著的进展，从而可以选择患者，并且可以鉴别和拓宽所有患者的治疗选项。
发明概述
申请人已经观察到，如果将MSC注射至携带具有细胞毒性功能的活化的免疫细胞的接受者中，它们迅速经历凋亡性细胞死亡。这种细胞死亡不发生在健康接受者或其中的炎症不含细胞毒性细胞的接受者中。矛盾的是，治疗效果仅可在含有细胞毒性细胞并杀死输注的MSC的接受者中递送。解释这种明显矛盾的机制是，特异性凋亡的MSC能够在接受者中触发免疫抑制活性，而该免疫抑制活性受吲哚胺脱氧酶(IDO)大幅影响。
因此，这一发现提供了患者分层的明确基础。
根据本发明的第一方面，提供了用于鉴别可能对使用活的间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者的方法，所述方法包括确定来自所述患者的样品是否能够体外诱导活MSC发生至少一些凋亡，并且其中样品诱导凋亡的能力指示该患者对免疫抑制治疗的应答性。
用于本发明方法的合适患者样品是含有免疫细胞如外周血单核细胞的样品。因此，合适的样品是血液或血清样品，但也可以使用其它样品，例如活检样品或脑脊液(CSF)样品。如果需要，样品可以在使用之前铺板以浓缩免疫细胞。
在本发明第一方面的方法的一个具体实施方案中，通过将所述样品与活MSC一起孵育，然后检测孵育物中凋亡MSC的存在来确定样品引起MSC凋亡的能力。适当地，当所加入的MSC在孵育后至少11％、任选12.5％凋亡时，患者将被认为对使用活MSC的治疗"有应答"。在一个具体实施方案中，指示"有应答"宿主的MSC凋亡阈值为11.5％、或12.5％、或13.5％。
在测定中使用的患者细胞如PBMC的数目将根据如样品大小和检测方法等因素而变化。然而，通常混合在一起孵育的免疫细胞：MSC的比率将在1:1至60:1的范围内，例如2:1至40:1。合适地，这些MSC将来自任何健康供体或来源。
合适地，孵育进行的时间足以允许确定有效的结果，但足够快以允许快速探索治疗选项，即使在严重疾病状况的情况下。通常，这将在1-24小时，或2-24小时，例如1-6小时，或1-5小时，或2-6小时，尤其3-5小时的范围内，如约4小时。
孵育物中凋亡MSC的存在和数量可以通过任何合适的测定或方法来确定。这些方法可包括共聚焦显微术、流式细胞术、质谱细胞术、其它基于抗体的检测方法、DNA扩增和/或检测如聚合酶链式反应、免疫测定方法如ELISA或免疫酶测定或代谢测定。可以使用这些方法检测的凋亡细胞的合适标记可以基于膜联蛋白-V结合或胱天蛋白酶活性。显微镜方法可包括染色，例如线粒体或DNA染色可分别检测早期凋亡(此时活性线粒体被破坏)，或晚期凋亡(此时发生DNA片段化)。
然而，申请人现在已经确定前列腺素E2(PGE2)是在与MSC物理接触后由患者PBMC诱导的分子标记，并且该活性与PBMC诱导MSC凋亡的能力相关。特别地，似乎MSC在与患者PBMC接触时以胱天蛋白酶依赖性方式被诱导分泌高水平的PGE2。结果，这提供了一种用于检测患者体外诱导MSC凋亡的能力的方法，因为PGE2的水平可以由独立的操作者更简单和客观地测量，例如使用市售的ELISA试剂盒。
因此，在本发明的一个具体实施方案中，通过将所述样品与活MSC一起孵育，检测孵育物或从其获得的上清液中前列腺素E2(PGE2)的水平，并将该水平与所述患者对所述免疫抑制治疗的应答性相关联，来确定样品在MSC中引起凋亡的能力。如下文所述，孵育物上清液中PGE2的水平超过4000pg/ml通常表明，患者对使用活MSC的免疫抑制治疗具有应答性。这些水平可以用任何常规方法如免疫测定法来测定，但特别方便的方法包括使用定量ELISA。为此目的，各种试剂盒可商购获得。
通过使用本发明的方法，可以鉴别最可能应答MSC疗法的患者。由此，这些患者可以被开出最合适的治疗处方，实际的期望是该治疗将更成功。
本发明的方法提供了一种高灵敏性的测试，能够准确地鉴别出MSC疗法的"应答者"和"无应答者"。已经表明在试验中实现了100％的灵敏度，在临床研究中实现了92％的灵敏度。此外，该测试具有高特异性，因为在90％的治疗患者中已经发现临床应答。
该方法提供了体外使用MSC的手段。因此，在第二方面，本发明提供了体外使用活的间充质基质细胞(MSC)的方法，所述方法包括使活MSC与来自患者的生物样品体外接触，并且体外检测活MSC中凋亡MSC的存在，或者检测混合物中PGE2升高的水平，其中体外活MSC中凋亡MSC的存在或者PGE2升高的水平指示患者对使用活MSC的免疫抑制治疗的应答性。
合适地，第二方面的方法使用活MSC的多个样品体外进行，每个样品与来自多个患者中的不同患者的生物样品接触，并且体外检测活MSC的每个样品中凋亡MSC的存在或PGE2升高的水平。这样，可以鉴别应答者和无应答者，并且可以鉴别适合有效的MSC。
因此，本发明第二方面的方法也能够鉴别适合有效的MSC，其能够被最高程度地诱导经历凋亡和/或产生PGE2，从而允许本发明的方法也用作效力测定。效力测定是特别有利的，因为已经显示不同来源的MSC表现出对经历凋亡的不同敏感性(参见图19)。此外，获得多个不同效力的MSC样品或批次可以有助于质量控制并且允许确定批次之间的一致性。
在每种情况下，合适地，接触步骤包括将生物样品与活MSC一起孵育，并且合适地，检测步骤包括检测孵育物中凋亡MSC的存在，或检测孵育物上清液中PGE2升高的水平。合适的样品、检测水平等类似于本发明第一方面中使用的那些。
如下所述，申请人使用移植物抗宿主病(GvHD)模型研究了MSC活性的机制，因为有原理证据证明MSC在这种情况下有效。经证明，包含在GvHD小鼠中的活化细胞毒性细胞在输注的MSC中快速诱导广泛的体内胱天蛋白酶活化。MSC接受者中存在的活化的细胞毒性细胞是诱导MSC凋亡所必需的，并因此是引发MSC免疫抑制作用所必需的。
这些发现不仅解释了输注MSC的快速清除，而且机制上协调了MSC消失与其免疫调节活性。通过GvHD患者中针对MSC的高水平细胞毒性活性和临床应答之间的相关性，证实了细胞毒性细胞活性、MSC凋亡和免疫抑制之间的联系。因此，接受者介导的MSC杀伤可以被认为是用于患者分层的第一种基于机制的生物标志。
引人注目的是，如下所述，他们还发现离体产生的凋亡MSC表现出强效免疫抑制作用，该作用依赖于吞噬细胞来源的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)活性，并且绕过了接受者对细胞毒性细胞的需要。因此，对MSC无应答患者可以用凋亡MSC代替进行治疗。
此外，该发现提供了在用合适的MSC或凋亡MSC治疗后确认患者应答的方法。特别地，患者应答可通过分析样品如血液或血清样品中吞噬细胞和/或IDO的存在来确定，其中吞噬细胞和/或IDO作为生物标志物以指示治疗是否有效。
合适的吞噬作用测定法是本领域已知的。例如，吞噬作用可以通过测量细胞底物的吞入来测定，所述细胞底物例如使用血清或IgG调理的红细胞、酵母聚糖等酵母颗粒或其它颗粒例如金属珠。将样品与底物一起孵育以允许发生吞入。此后，在对吞噬细胞进行抗体染色(例如抗CD14或抗CD16)之后使用细胞荧光测定法对吞噬细胞进行成像并检测细胞质内底物/颗粒的存在。或者，可以进行功能性测定，在该测定中除去任何游离底物，并裂解样品中的吞噬细胞以释放吞没的底物用于检测。
或者，IDO可以作为治疗功效的方便的生物标志物。这可以使用各种常规方法来确定，包括RNA检测、IDO蛋白检测，例如使用免疫测定技术如ELISA，或通过测定酶活性，如例如Braun等人Blood，2005，106(7)：2375-2381。另一种方法包括通过色谱法对犬尿氨酸途径代谢物进行生化定量。体内IDO活性也可以在正电子发射断层摄影术中用色氨酸示踪剂成像，如Bosnyak等，2015，Neuro Oncol 17(9)：1284-1292。
因此，使用本发明第一或第二方面的方法确定对使用活MSC的免疫抑制治疗有应答的患者可以用MSC治疗。然而，此外，被确定对所述免疫抑制治疗无应答的患者可以用凋亡MSC治疗。此后，如上所述可以通过检测吞噬细胞或IDO来监测患者对治疗的应答。
因此，本发明的第三方面提供了一种针对用MSC免疫抑制疗法的治疗对患者进行分层的方法，所述方法包括实施本发明第一和/或第二方面的方法，鉴别可能对使用活的间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者，使用活的MSC治疗，以及鉴别那些对所述免疫抑制治疗不可能有应答的患者，使用凋亡的MSC治疗。
本发明第一和/或第二方面的方法也可用于对其它类型的患者或受试者，例如受伤的患者或患有其它炎性病症的患者进行分层。图20显示在其它炎性病症中存在针对基质细胞的细胞毒性细胞。
本发明的方法还可用作定量患者不依赖于MSC输注控制炎症的能力的测定。图21显示来自皮肤的成纤维细胞，一种与MSC有关联的细胞类型，也可被活化的细胞毒性细胞杀死。这表明，组织中细胞毒性细胞的形成，作为损伤后的频发事件，可诱导基质细胞经历凋亡并启动抗炎活性，并因此启动组织修复。因此，考虑到损伤后产生的细胞毒性细胞可以诱导凋亡并启动促进组织再生所需的免疫调节，本发明方法的生物标志物的检测可以因此用于检测再生的适应性(fitness)。
因此，根据本发明，提供了一种鉴别受试者从组织损伤恢复的适应性的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的样品是否能够体外诱导活MSC发生至少一些凋亡，和/或检测PGE2升高的水平，并且其中样品诱导所述凋亡的能力，或升高水平的PGE2的存在，是所述患者恢复能力的指示。
根据上文所述的任何合适的测定或方法，通过检测孵育物中凋亡MSC的存在和数量和/或检测PGE2升高的水平，可以定量从组织损伤恢复的能力。
通过使用本发明的方法，可以鉴别最可能从组织损伤恢复的受试者，即具有相对高的MSC杀伤细胞水平的那些受试者。相反，可以鉴别组织损伤恢复可能性降低的受试者，并开出最合适的治疗处方以促进组织恢复。
凋亡MSC(ApoMSC)先前已经用于治疗疾病，例如心肌梗塞(Thum等人，2005JACCVolume 46，第10期，2005年11月15日，第1799-1802页)或脓毒症或脓毒症诱导的肺、肾或肝损伤(Chang等人，J Transl Med2012，10:244；Chang等人，Am J Transl Res 2014，6:439；Chen等人，JPineal Res 2014，57:16)。细胞通常与褪黑激素结合，并且在这些情况下可以显示出比活MSC更好的效果。然而，先前没有迹象表明在不同的患者群体中效果会不同。
凋亡MSC的产生是相对复杂的过程，并且在生产和储存中更加复杂，使得它们作为产品不如MSC具有吸引力。使用本发明第三方面的分层方法的特别优点是可以鉴别将最受益于ApoMSC治疗而非MSC治疗的那些患者。
此外，通过确定MSC的作用机制，并通过鉴别对凋亡的需要以及使用ApoMSC在治疗免疫性疾病中的益处，申请人已经鉴别出这些细胞可以用于治疗广泛的免疫性疾病。如上所述，凋亡细胞已显示在脓毒症中潜在有用。尽管这种疾病可能具有免疫成分，但其特征在于对外部刺激(如感染)极强的不受控的炎症反应。通过了解MSC的作用机制，申请人已经使得使用ApoMSC可治疗的疾病范围扩大到包括同种异体免疫疾病(如GVHD或实体器官移植)、自身免疫性疾病，它们是主要原因在于宿主免疫系统固有问题的疾病。此外，通过对机制鉴别，可以推断ApoMSC可以对除脓毒症以外的极强的不受控的炎性病症(包括急性呼吸窘迫综合征)具有作用。
作为该工作的结果，申请人已经发现凋亡的MSC可用于治疗上文列出的疾病或病症。这些疾病或病症将包括移植物抗宿主病，以预防或治疗移植器官如移植的肝或肾或心脏的排斥；以及自身免疫性疾病如多发性硬化和其它神经变性病症、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、一些形式的关节炎(如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎)和急性呼吸窘迫综合征。另外，凋亡的MSC可以通过刺激组织修复而在再生医学中产生治疗益处。
在这种情况下，患者分层可能不是必需的，因为ApoMSC的存在可能对应答性患者具有与非应答性患者相似的作用。然而，也有可能的是，使用活MSC在应答性患者中具有优势，且分层将仍然有益。
此外，ApoMSC先前已经通过包括使用缺氧或使用无血清培养基进行培养的方法或通过使用过氧化氢而制备。这些条件导致细胞质量差和/或不均一，包括坏死细胞，这意味着它们可能不能被临床应用所接受。特别地，坏死细胞的存在可能促进炎症而不是抑制炎症，因此这些细胞可能恶化而不是治疗免疫疾病。
WO2017/051421描述了一种方法，其中活MSC的繁殖通过添加低水平的凋亡诱导剂而增强，所述诱导剂在至少3天的延长的时间段内被添加到培养物中。尽管获得的组合物可能含有凋亡细胞，但发现这些凋亡细胞是"漂浮的"细胞，而不是靶集落的一部分。所述处理增加了活MSC的数量和/或改变了获得的集落形成单位的大小。
申请人已经开发了一种方法，通过该方法可以使ApoMSC以允许其治疗性使用的方式制备。
具体而言，通过包括将活MSC与药学上可接受的凋亡诱导剂孵育足以形成细胞培养物的一段时间的方法产生凋亡MSC用于免疫抑制疗法，其中在所述细胞培养物中至少30％的MSC在小于24小时的时间段内凋亡。在一个具体实施方式中，所述方法导致细胞培养物中存在的至少50％，例如至少60％、70％或80％的MSC凋亡。
如本文所用，表述"细胞培养物"是指生长的培养物，例如可以在常规培养板或孔上发现的生长的培养物。
在细胞中诱导凋亡的药剂是本领域已知的，并且包括化学和生物药剂。本发明第四方面的药学上可接受的药剂将允许该药剂直接用于临床或药物应用。在一个具体的实施方案中，所述药学上可接受的凋亡诱导剂是药学上可接受的生物学药剂。这种药剂的实例可以包括丝氨酸蛋白酶和/或抗FAS抗体，以及补骨脂素，其可以与UV一起诱导凋亡。特别有用的丝氨酸蛋白酶是人颗粒酶B(GrB)，并且其适合与GrB和抗Fas抗体组合使用。其它药剂包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和免疫系统用来在靶细胞中诱导凋亡的任何其它分子。
凋亡诱导剂适合与活MSC一起孵育足以诱导所需水平的凋亡的时间。这将根据诸如所用药剂的性质和细胞体积的因素而变化，但通常在15分钟至25小时的范围内，例如约18小时。在这段时间之后，细胞变得坏死，并因此由于上述原因将不再适于在免疫疾病治疗中的治疗性应用。这也意味着ApoMSC适合在其产生的24小时内使用，并且适合在1小时内使用，特别是直接地或在产生后立即使用。
药剂的浓度也将根据类似的因素而变化，但是在大多数情况下，1ng/ml至50μg/ml的浓度，例如5-20μg/ml，诸如约10μg/ml，可能是合适的。在一些实施方案中，当所用药剂是抗Fas抗体或(FASL)时，浓度将超过100ng/ml。
包含使用该方法可获得的凋亡MSC的组合物可用于治疗，特别是免疫抑制治疗。
在这种情况下，可以提供包含如上所述的凋亡MSC以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。合适的载体是本领域公知的，包括液体载体，例如水或盐水。具体的载体将取决于施用模式，但这通常是注射或输注，例如静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p)、肌内(i.m.)、器官内或皮下注射或输注。在一个具体实施方案中，组合物将通过腹膜内(i.p.)或皮下(s.c)或通过静脉内(i.v.)施用。
所述组合物还可包含一些活MSC。这些活细胞在"有应答"患者的情况下将有助于治疗效果，但在无应答患者的情况下可能不太有用或无效。然而，它们将是无害的，并且它们的存在将避免在施用之前将凋亡细胞与活MSC分离的需要。
组合物中的MSC可以被遗传工程化以并入自杀基因，从而更好地控制它们的体内凋亡。这提供了一种选择性方法，通过该方法，不依赖于患者中存在MSC杀伤物，仅当工程化的MSC运输至它们被天然地化学吸引的炎症部位时，它们才会被诱导经历体内凋亡。与抗FasL方法相比，这种方法的优点在于，可以体内选择性地在组织损伤和炎症部位进行凋亡。
因此，根据本发明，提供了包含如上所述的凋亡MSC和/或活MSC的组合物，所述MSC包含自杀机制。自杀机制可以包括自杀基因，特别是胱天蛋白酶诱导基因，例如胱天蛋白酶9或胱天蛋白酶3。
组合物还可以包含培养基的成分，用于支持MSC生长，条件是这些成分是药学上可接受的。这样的培养基是本领域已知的，并且在下文中举例说明。
在另一方面，本发明提供了在有此需要的患者中产生免疫抑制作用的方法，包括向所述患者施用有效量的凋亡MSC。作为预备步骤，所述方法可包括，通过检测来自所述患者的样品是否能够体外诱导活MSC发生至少一些凋亡来确定所述患者是否可能对使用活间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答，并且在所述样品能够如此的情况下，向所述患者施用有效量的活MSC，并且在所述样品不诱导所述凋亡的情况下，向所述患者施用有效量的凋亡MSC。
可能需要免疫抑制并且可以使用该方法治疗的病症或疾病包括上文所述的疾病和病症。这些将包括移植物抗宿主病、预防或治疗移植器官的排斥，例如移植的肝或肾或心脏，以及自身免疫疾病，如多发性硬化和其它神经变性病症、炎性肠病(克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、一些形式的关节炎(如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎)。最后，凋亡的MSC可以通过刺激组织修复在再生医学中产生治疗益处。
此外，如上所述，患者治疗的功效可以通过检测样品中吞噬细胞或IDO的存在来监测，所述样品例如血液或血清样品，其在施用MSC后，例如在施用MSC或ApoMSC后1小时至3天的时间后从患者采集。
如果需要，可以提供试剂盒以实施一种或多种上述方法，并且在一些情况下，这些试剂盒可以形成本发明的另一方面。试剂盒可以包括，例如，用于检测凋亡MSC的手段，例如如上所述的染料或染色剂或标记，和/或用于以药学上可接受的方式形成凋亡MSC的手段，例如如上所述的生物试剂，和/或用于在患者监测步骤中分析吞噬细胞或IDO的手段。
因此，总之，申请人能够通过鉴别解释本领域若干未解决问题的关键机制来阐明MSC治疗剂的争议性主题。第一个惊人的信息为迄今为止的矛盾即MSC尽管缺乏移植但在治疗上有效提供了解决方案。申请人已经证明，在细胞毒性细胞存在下，MSC在输注后经历广泛的胱天蛋白酶活化和凋亡，并且这是它们的免疫抑制功能的要求。尽管其它接受者依赖性应答已被描述为介导体外MSC裂解和体内MSC清除，但这是体内MSC凋亡在输注后递送免疫抑制中的有用角色的首个指标。此外，尽管一些研究报道了凋亡细胞调节免疫应答的能力，但是申请人已经显示体内天然发生的细胞死亡驱动了免疫抑制。
MSC凋亡需要接受者细胞毒性细胞中所含的细胞毒性颗粒并受其影响，所述细胞毒性细胞也介导小鼠接受者中的GvHD(图1的A和B，图2的C和D，下文)。重要的是，抗MSC的细胞毒性活性也可以在GvHD患者的PBMC中检测，并且其可以预测临床应答。表现出高细胞毒性的患者对MSC有应答，而那些具有低或没有细胞毒性活性的患者在MSC输注后没有改善(图3的A和B)。因此，接受者产生凋亡MSC的能力似乎是治疗功效的要求，并且使得将其自身用作潜在的生物标志物，以针对MSC输注对患者进行分层。
细胞毒性细胞的MSC鉴别不是抗原特异性的，原因是既不需要HLA参与也不是同种异体反应性排斥的结果，由此支持了目前使用第三方MSC的实践。MSC必须与活化的细胞毒性细胞物理接触以经历凋亡，尽管免疫突触不是必需的。
本文报道的数据提出了MSC治疗的方法，其突出了MSC接受者协调和决定MSC效应物功能的关键作用。不仅需要接受者中的细胞毒性细胞在输注的MSC中引发凋亡，而且还需要吞噬细胞，所述吞噬细胞通过吞入凋亡的MSC并产生IDO，最终递送MSC免疫抑制活性。已经描述了类似的机制来解释在体外产生的不同谱系的凋亡细胞如何在GvHD中诱导免疫调节和在其它系统性自身免疫疾病中诱导巨噬细胞IDO的产生。这也与所述MSC刺激接受者免疫耐受网络如调节性T细胞和巨噬细胞的能力一致。
接受者巨噬细胞的耗竭或IDO活性的抑制也损害活MSC的治疗活性，从而使体内MSC凋亡与免疫抑制相联系。任何特定的吞噬细胞群(巨噬细胞或树突细胞)都不太可能选择性地参与吞入apoMSC，因为它们在体内类似地显示这种活性。
本发明的影响之一在于，尽管MSC仍然是治疗性免疫抑制的必要起点，但来源于患者的细胞在递送这种免疫抑制中起关键作用。因此，旨在鉴别临床最有效的MSC亚群的努力以及验证这样的选择的效力测定法可能证明是无效的。支持该概念的进一步证据是，在Th2炎性模型中给予离体产生的apoMSC可避免对细胞毒性细胞的需求(图6D)，并且apoMSC可有效抑制GvHD效应细胞的扩增/浸润。有趣的是，apoMSC仅在i.p.给药时在GvHD模型中最有效(图7的A、B、C和D)。尽管被吞噬，i.v.注射的apoMSC不诱导IDO产生(图7的J和K)，因此提示可能通过与吞噬细胞亚群的结合，发生MSC凋亡的位点可能影响免疫抑制功能。
本发明代表了MSC治疗的模式转变，由此它们的凋亡性死亡是MSC所产生的免疫抑制的效应机制中的关键步骤。本发明的进一步影响是，支持该机制的原理可用于预测对MSC的临床应答，并因此针对MSC治疗对GvHD患者分级。
如本文所述的患者分层可以帮助确保患者接受可获得的最有效治疗，在一些情况下，所述治疗可以是MSC而不是ApoMSC。
本发明表明，下一代临床试验应当从选择最佳MSC群转到选择最可能应答的患者。此外，apoMSC可能在MSC难治的患者中有效这一发现，为MSC制造铺平了新途径。
发明详述
条目
现在将参考以下项描述本发明，其中：
1.一种用于鉴别可能对使用活的间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者的方法，所述方法包括确定来自所述患者的样品是否能够诱导体外活MSC发生至少一些凋亡，并且其中所述样品诱导细胞凋亡的能力指示所述患者对所述免疫抑制治疗的应答性。
2.根据项1的方法，其中通过将所述样品与活MSC一起孵育，然后检测孵育物中凋亡MSC的存在，来确定样品在MSC中引起凋亡的能力。
3.根据前述项中任一项的方法，其中，发现加入到样品中的MSC在孵育后有至少11％凋亡则指示，所述患者对所述免疫抑制治疗具有应答性。
4.根据项1的方法，其中通过将所述样品与活MSC一起孵育，检测孵育物或从其获得的上清液中前列腺素E2(PGE2)的水平，并将该水平与所述患者对所述免疫抑制治疗的应答性相关联，来确定样品在MSC中引起凋亡的能力。
5.根据项5的方法，其中PGE2的水平超过4000pg/ml指示所述患者对所述免疫抑制治疗具有应答性。
6.根据项4或项5的方法，其中PGE2的水平利用定量ELISA法测定。
7.根据前述项中任一项的方法，其中，被确定为对使用活MSC的免疫抑制治疗有应答的患者被开具用MSC治疗的处方，并且其中，被确定为对所述免疫抑制治疗无应答的患者被开具用凋亡MSC治疗的处方。
8.一种体外使用活的间充质基质细胞(MSC)的方法，该方法包括使所述活MSC与来自患者的生物样品体外接触，并且检测体外活MSC中凋亡MSC的存在或样品中升高水平的前列腺素E2(PGE2)的存在，其中体外活MSC中凋亡MSC的存在或升高水平的PGE2的存在指示，所述患者对使用活MSC的免疫抑制治疗的应答性。
9.根据项8的方法，还包括使多个活MSC样品与来自多个患者中的不同患者的生物样品在体外接触，并在体外检测每个活MSC样品中凋亡MSC的存在。
10.根据项8或项9的方法，其中该接触步骤或每个接触步骤包括将所述生物样品与活MSC一起孵育，并且其中该检测步骤或每个检测步骤包括检测孵育物中凋亡MSC的存在和/或确定凋亡MSC的效力(potency)。
11.根据项8至10中任一项的方法，其中发现活MSC有至少11％在与所述样品体外接触后凋亡，或者上清液中前列腺素E2水平超过4000pg/ml则指示，患者对免疫抑制治疗具有应答性。
12.根据项8至11中任一项的方法，其中如果检测到体外活MSC中凋亡MSC的存在和/或PGE2水平升高，则用活MSC治疗患者，其中如果未检测到体外活MSC中凋亡MSC的存在，则用凋亡MSC治疗患者。
13.根据前述项中任一项的方法，其中所述样品是血液或血清样品。
14.根据前述项中任一项的方法，其中通过共聚焦显微镜或流式细胞术测定凋亡MSC的存在。
15.一种针对利用MSC免疫抑制疗法的治疗对患者进行分层的方法，所述方法包括进行项1至14中任一项的方法，鉴别可能对使用活的间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者，用于利用活MSC的治疗，以及鉴别对所述免疫抑制治疗可能无应答的患者，用于利用凋亡MSC的治疗。
16.一种用于鉴别受试者从组织损伤恢复的适应性(fitness)的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的样品是否能够诱导体外活MSC发生至少一些凋亡，和/或检测PGE2的升高水平，并且其中所述样品诱导所述凋亡的能力或PGE2升高水平的存在指示所述患者的恢复能力。
17.一种用于在有需要的患者中产生免疫抑制作用的方法，所述方法包括通过检测在体外与来自所述患者的生物样品接触的活MSC中至少一些凋亡的存在来确定所述患者是否可能对使用活间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答，当检测到体外活MSC中凋亡的存在时，向所述患者施用有效量的活MSC，并且当未检测到体外活MSC中凋亡的存在时，向所述患者施用有效量的凋亡MSC。
18.根据项17的方法，其中所述患者患有免疫介导的疾病或病症或需要再生医学(医药)以刺激组织修复。
19.根据项17或项18的方法，其中所述疾病或病症是同种异体免疫疾病或自身免疫疾病，或者用于预防或治疗移植器官的排斥。
20.根据项19的方法，其中所述疾病为移植物抗宿主病、多发性硬化、炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、关节炎如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或银屑病性关节炎，和急性呼吸窘迫综合征。
21.根据项15至20中任一项的方法，其中通过检测施用MSC后从患者采集的样品中吞噬细胞或IDO的存在，来监测患者的治疗功效。
22.一种试剂盒，其包含实施项1至12中任一项的方法所需的组分。
23.一种凋亡的MSC，其用于治疗免疫介导的疾病或病症或用于再生医学(医药)中以刺激组织修复。
24.一种凋亡的MSC，其用于项7、12、15、17-20中任一项的方法中。
25.根据项23或24的凋亡的MSC，其中所述疾病是同种异体免疫或自身免疫疾病，或者用于预防或治疗移植器官的排斥。
26.根据项25的凋亡的MSC，其中所述疾病是移植物抗宿主病、多发性硬化、炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、关节炎如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或银屑病性关节炎，和急性呼吸窘迫综合征。
27.一种产生用于免疫抑制疗法的凋亡MSC的方法，所述方法包括将活MSC与药学上可接受的凋亡诱导剂一起孵育足以形成细胞培养物的一段时间，在所述细胞培养物中至少30％的MSC在小于24小时的时间内凋亡。
28.根据项27的方法，其中药学上可接受的凋亡诱导剂是生物学药剂。
29.根据项28的方法，其中所述生物学药剂是丝氨酸蛋白酶和/或抗FAS抗体。
30.根据项29的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是人颗粒酶B(GrB)。
31.根据项27至30中任一项的方法，其中药学上可接受的凋亡诱导剂包括GrB和抗Fas抗体的组合。
32.一种凋亡的MSC，其可使用项27至31中任一项的方法获得。
33.根据项32的凋亡的MSC，用于免疫抑制治疗中。
34.根据项32或33的凋亡的MSC，其包含自杀机制，任选地以自杀基因，特别是胱天蛋白酶诱导基因，例如胱天蛋白酶9或胱天蛋白酶3的形式。
35.一种药物组合物，其包含项31至33中任一项的凋亡的MSC。
36.根据项35的组合物，其还包含活MSC。
37.一种在有需要的患者中产生免疫抑制作用的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的凋亡的MSC。
38.根据项37的方法，其中，所述患者患有免疫介导的疾病或病症或需要再生医学(医药)以刺激组织修复。
39.根据项37或项38的方法，其中所述疾病或病症是同种异体免疫疾病或自身免疫疾病，或者用于预防或治疗移植器官的排斥。
40.根据项39的方法，其中疾病是移植物抗宿主病、多发性硬化、炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、关节炎如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或银屑病性关节炎，和急性呼吸窘迫综合征。
41.根据项37至40中任一项的方法，其中通过检测施用MSC后从患者采集的样品中吞噬细胞或IDO的存在，来监测患者中治疗的功效。
42.前列腺素E2(PGE2)和/或凋亡的MSC作为生物标志物用于确定患者恢复的适应性和/或对免疫抑制治疗的应答性的用途。
43.根据项42的用途，包括检测来自所述患者的样品中凋亡MSC的存在和量和/或检测PGE2的升高水平。
附图
现在将参照以下概括的附图通过示例来具体描述本发明。
图1.MSC在输注后经历体内凋亡而不影响免疫抑制的递送。
A：移植3天后将luc-MSC静脉内注射到幼稚、BM和GvHD小鼠中。然后将DEVD-氨基萤光素腹膜内注射所有动物，1小时后成像。N：每组6只小鼠，来自3个独立实验的分组。白线将最终图像中组合的多个照片分开。B：从图1A中的小鼠图像测定TLS，并显示为平均值±SD。C，D：在注射MSC 4天后，GvHD效应细胞(CD8+Vβ8.3+)在GvHD小鼠(黑色圆圈)和用MSC处理的GvHD小鼠(黑色方块)的脾(C)和肺(D)中的浸润。N：15只(GvHD)和13只(GvHD+MSC)小鼠，来自4个独立实验的分组；显示的是平均值±SD。B中的统计数据：单向ANOVA，与Tukey's多重比较检验。**：p<.01，***：p<.001，ns：不显著。在C和D中：未配对t检验。**：p<.01。
图2.MSC凋亡对于免疫抑制是不可缺少的，并且需要接受者中功能性活化的细胞毒性细胞。
A：分析淋巴细胞群中CD8+Vβ8.3+细胞在幼稚C57BL/6雄性、BM或GvHD小鼠的肺细胞悬浮液中的百分比；显示的是平均值±SD。N：12只(GvHD)、3只(BM)和(3只(幼稚)小鼠，来自3个独立实验的分组；B：移植7天后，从幼稚雌性Mh(灰色柱)或GvHD小鼠(白色柱)的肺和脾中分选CD8+细胞，并测试它们体外诱导MSC凋亡的能力。结果显示在3个独立实验中的膜联蛋白-V+/7-AAD-MSC(平均值±SD)(每组N＝10)，黑色柱表示单独培养用作对照的MSC中的凋亡水平(N：3)；C：在三个独立实验中，在移植3天后，GvHD(N＝7)和GvHDPerf-/-(N＝7)小鼠中注入luc-MSC。1小时后，给小鼠注射DEVD氨基萤光素并成像。白线将最终图像中组合的多张照片分开D：从图2C获得TLS，并表示为平均值±SD。E、F：在未经处理的GvHDPerf-/-(N＝16)和用MSC处理的GvHDPerf-/-(N＝17)小鼠的脾(E)和肺(F)中的效应GvHD细胞(CD8+Vβ8.3+)的浸润(4次独立实验的平均值±SD)。A和B中的统计数据：单向ANOVA和Tukey's多重比较检验。*：p<.05；***：p<.001。在D、E和F中：未配对t检验。***：p<.001。ns：不显著。
图3.针对MSC的细胞毒性活性预测GvHD患者对MSC的临床应答。
A、B：将从接受MSC的健康对照(HC)或GvHD患者获得的PBMC在接下来的24小时内在24孔板中以20/1PBMC/MSC比率与MSC一起孵育4小时。通过流式细胞术评估膜联蛋白-V/7-AAD的水平，测定MSC中的凋亡水平。(A)HC、临床应答者(R)和无应答者(NR)的代表图。(B)在HC(圆形，N＝5)、R(三角形；N＝5)和NR(正方形；N＝12)之间比较凋亡水平。统计数据：单向ANOVA和Tukey's多重比较检验。***：p<.0001。ns：不显著。
图4.MSC凋亡由活化的CD8+和CD56+细胞毒性细胞介导，并且是旁观者效应的结果。
A：使用植物血凝素(PHA)(PHA-aPBMC)或MLR(MLR-aPBMC)活化来自健康供体的PBMC。将静息(浅灰色柱)、PHAaPBMC(黑色柱)或MLR-aPBMC(深灰色柱)与MSC按指定的比率孵育4小时。ND：不进行。B、E、F、I：MLR-aPBMC或PHA-aPBMC与MSC一起培养，培养条件为存在或不存在泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(10μM)(B)、GrB抑制剂Z-AAD-CMK(300μM)、穿孔素抑制剂乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)(4mM)(E)、中和浓度的FAS-LmAb抗-CD178(F)或剂量递增(10-75μM)的PKCζ-PS(I)。H：MLR-aPBMC与MSC直接接触培养或通过
分开。C、D：使用未分级的、对CD11b+、CD4+、CD8+或CD56+细胞阳性选择的(C)，或耗尽CD56+、CD8+或两者的(D)MLR-aPBMC。G：在存在或不存在中和剂量的抗HLA-A-B-C或抗HLA-DR抗体的情况下，用自体(黑色柱)或同种异体(灰色柱)PHA-aPBMC培养后，MSC中的凋亡。在B-I中：PBMC/MSC的比率为20/1。结果代表3或6次(H)独立实验的平均值±SD。统计数据：单向ANOVA和Tukey's多重比较检验。*：p<0.5。**：p<.01。***：p<.001。ns：不显著。
图5.MSC凋亡不干扰抗原特异性细胞毒性细胞对同源靶标的识别。
A：与4D8细胞以20/1的4D8：T2比率一起培养后T2细胞的凋亡。如所示，加入了递增浓度的MSC(用作冷靶)。凋亡的T2细胞被鉴别为膜联蛋白-V+/7-AAD+细胞。B：与NK细胞一起培养的K562的凋亡(NK：K562比率为20/1)。如所示，加入了递增浓度的MSC(用作冷靶)。C：与4D8细胞一起培养的MSC的凋亡(4D8：MSC比率为20/1)。如所示，加入了递增浓度的T2细胞(用作冷靶)。D：按20/1的NK：MSC比率与NK细胞一起培养的MSC的凋亡。如所示，加入了递增的K562稀释液(用作冷靶)。在所有实验中，在共培养4小时后通过流式细胞术评估MSC、T2或K562细胞凋亡的水平。结果表示3次独立实验的平均值±SD。A、B、C和D中的统计数据：未配对T检验。*：p<.05。ns：不显著。
图6.在不存在细胞毒性细胞下，凋亡MSC在Th2型炎症模型中发挥体内免疫抑制作用。
A：在最后一次激发后1小时，将luc-MSC注射到幼稚(N＝3)和OVA+MSC(N＝6)小鼠中。1小时后，在3个独立的实验中小鼠接受DEVD氨基萤光素并成像。白线将最终图像中组合的多张照片分开。B：从图6A测量TLS(平均值±SD)。C：MSC输注后18小时，在两次独立实验中评估幼稚(N＝3)、输注MSC的幼稚(N＝3)、OVA(N＝6)和OVA+MSC(N＝6)小鼠的BAL中的嗜酸性粒细胞浸润，并显示平均值±SD。D：ApoMSC处理的OVA致敏小鼠的BAL中的嗜酸性粒细胞浸润(平均值±SD)。分组为：无ApoMSC的OVA(N＝6)，以1x106个ApoMSC处理的OVA(N＝7)；和接受1x106(N＝2)ApoMSC的幼稚小鼠。结果表示为3次独立实验的平均值±SD。B中的统计数据：未配对t检验。ns：不显著。C和D中的统计数据：单向ANOVA和Tukey's多重比较检验。*：p<.05。ns：不显著。
图7.ApoMSC在GvHD中发挥免疫抑制活性，并被接受者的吞噬细胞吞入，它们在此引发IDO产生。
A-D：在GvHD小鼠(黑色圆圈)和用ApoMSC处理的GvHD小鼠(黑色方块)的脾(A，C)和肺(B，D)中评估GvHD效应细胞的浸润。ApoMSC经i.p.输注(GvHD小鼠N＝10，GvHD+ApoMSC小鼠N＝8)(A、B)，或经i.v.输注(GvHD小鼠N＝9，GvHD+ApoMSC小鼠N＝7)(C、D)。结果为3次独立实验的平均值±SD。统计数据：未配对t检验。*：p<.05；**：p<.01。ns：不显著。E-K：MSC用CellTraceTM Violet标记，并用GrB/FAS-L(分别为5μg/ml和10μg/ml)进行凋亡诱导。移植3天后，ApoMSC经i.p.(E、F和J)或i.v.(G、H、I和K)注射入GvHD小鼠。2小时后，处死动物，收获肠系膜淋巴结(E、F和J)或肺(G、H、I和K)。吞入ApoMSC的细胞被鉴别为CD11b+(E)、CD11c+(F)、CD11b高CD11cint(G)、CD11c+CD11b-(H)和CD11b高CD11c-(I)亚群内的Violet+细胞。在未接受violet-标记的ApoMSC的GvHD小鼠中，对相应的亚群进行门控。J和K：在CellTraceTM Violet阳性(吞入apoMSC)的CD11c+和CD11b+(J)或CD11b高CD11cint、CD11c+CD11b-和CD11b高CD11c-(K)细胞中评估IDO表达，并与未接受ApoMSC的GvHD小鼠中的相应群进行比较。数据为在2个独立实验中从三只小鼠获得的类似结果的代表数据。
图8.GvHD中的MSC免疫抑制活性需要接受者吞噬细胞和IDO产生。
A、B：GvHD小鼠在移植后10分钟用脂质体氯膦酸盐处理。如所示，3天后输注MSC。再过4天，对脾和肺中GvHD效应细胞(CD8+Vβ8.3+)在脾(A)或肺(B)中的浸润进行定量。通过以每组N：12(GvHD)和10(GvHD+MSC)只小鼠将三个独立实验分组来获得平均值±SD。C，D：在用IDO-抑制剂1-DMT处理的GvHD小鼠的脾(C)和肺(D)中研究了GvHD效应细胞浸润。在处理的小鼠中，移植后3天输注MSC(N＝11)。对照由不接受MSC的GvHD小鼠组成(N＝9)。结果是指3次独立实验的平均值±SD。统计数据：未配对t检验。*：p<.05；**：p<.01。ns：不显著。
图9.MSC可以在输注后在小鼠肺中追踪。
A：对经致死辐照的C57BL/6雄性小鼠移植来自雌性同基因(syngeneic)供者的骨髓(BM)和CD4+纯化的细胞，以及使用或没有使用从mh小鼠(CD8+Vβ8.3+)纯化的CD8+细胞(分别为GvHD和BM组)。在移植后第3天，输注luc-MSC，1小时后对小鼠进行成像，用于分析i.p.注射DEVD-氨基萤光素后胱天蛋白酶3的活化。在移植后第7天，处死小鼠，通过流式细胞术分析GvHD效应细胞(CD8+Vβ8.3+)在肺和脾中的浸润。B：为了确认在所有输注MSC的小鼠组的肺中都存在luc-MSC，将图1A中成像的相同小鼠注射D-萤光素。白线将最终图像中组合的多张照片分开。C：从图9B中的小鼠图像测量TLS，并显示为平均值±SD。统计数据：单向ANOVA，和Tukey's多重比较检验。ns：不显著。
图10.人MSC免疫抑制未被鼠细胞因子“许可”。
A：如所示，单独，或在hIFN-γ/hTNF-α(各20ng/ml)或mIFN-γ/mTNF-α(各20ng/ml)存在下，或从PHA-aPBMC(72小时)，或用ConA活化的mSpl(ConA-aSpl)(72小时)获得的上清液中，将人MSC以系列稀释液铺板过夜。然后测试MSC抑制用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯染料标记的ConA刺激的mSpl增殖的能力。72小时后通过流式细胞术测定增殖。曲线是通过对相应MSC/mSpl比率与抑制百分比绘图而获得的。B、C：如所示，将未处理或者暴露于hIFN-γ/hTNF-α(各20ng/ml)的人MSC铺板过夜，然后以1:10MSC/mSpl比率测试抑制mSpl增殖的能力。柱状图(B)代表3个独立实验，而柱(C)代表3个独立实验的平均值±SD。统计数据：单向ANOVA和Tukey's多重比较检验。***：p<.001。ns：不显著。D：单独，或在hIFN-γ/hTNF-α(各20ng/ml)、mIFN-γ/mTNF-α(各20ng/ml)存在下，在从PHA-aPBMC或ConA-aSpl获得的上清液中，孵育人MSC。24小时后，通过实时PCR评价IDO、TSG6和PTSG2表达，并计算为与未处理的MSC相比的相对表达。显示了三个独立实验的代表性结果。
图11.MSC凋亡被细胞毒性细胞以非抗原特异性方式激活。
A：从幼稚雌性Mh小鼠分离的CD8+细胞用抗CD3/CD28珠刺激3天，并以20/1的Mh T细胞：MSC比率与MSC一起培养。4小时后，通过膜联蛋白-V/7AAD染色评估MSC中的凋亡水平。结果代表3次独立实验的平均值±SD。统计数据：单向ANOVA，和Tukey's多重比较检验。***：p<.001。B：为了确认luc-MSC在所有输注MSC的小鼠组的肺中的存在，向图2C中成像的相同小鼠注射D-萤光素。白线将最终图像中组合的多张照片分开。C：从图11B中的小鼠图像测定TLS，并显示为平均值±SD。统计数据：未配对的t检验。ns：不显著。
图12.针对MSC的细胞毒性在PBMC供者中有所不同，但不依赖于GvHD患者中CD8+或CD56+的百分比。
A：测试了从2名不同GvHD患者(患者1和患者2)获得的PBMC对来自两个不同供者(MSC1和MSC2)的MSC的细胞毒性活性。B：在与来自四种不同MLR应答者/刺激物组合(MLR1、MLR2、MLR3、MLR4)的PBMC孵育后，从不同供者(MSC1、MSC2和MSC3)获得的MSC中的凋亡。在A和B中，共培养4小时后通过流式细胞术评估凋亡水平。C，D：分析从11名GvHD患者(R：3，NR：8)获得的PBMC的CD8+(C)和CD56+(D)细胞的百分比。统计数据：未配对t检验。ns：不显著。
图13.MSC杀伤由胱天蛋白酶3介导，并受GrB和穿孔素影响。
A：将PHA-aPBMC与MSC以递增的PBMC/MSC比率进行孵育。通过流式细胞术在不同时间点通过膜联蛋白-V/7-AAD评估MSC凋亡。结果代表3次独立实验的平均值±SD。B、C：用pECFP-DEVDR-Venus载体转染MSC(FRET-MSC)，通过流式细胞术研究pECFP和Venus-YFPFRET之间的FRET，并计算CAf。FRET-MSC单独培养，与PHA-aPBMC或PHAaPBMC在Z-VAD-FMK(50μM)(B)、GrB抑制剂Z-AAD-CMK(300μM)或穿孔素抑制剂EGTA(4mM)(C)存在下培养。显示了5(B)或3(C)次独立实验的结果。当PBMC存在时，PBMC：MSC比为40/1。统计数据：单向ANOVA和Tukey's多重比较检验。**：p>.01。***：P>.001。ns：不显著。D：将MLR-aPBMC与MSC(20/1比率)一起培养，并且在4小时后通过流式细胞术评价凋亡。如所示，TNF-α抑制剂依那西普(Etanercept)或抗TRAIL mAb以10μg/ml或100μg/ml使用。结果代表3次独立实验的平均值±SD。
图14.输注的MSC可以在患有Th2型肺部炎症的小鼠的肺部成像。
A：在第0和7天利用OVA经i.p.对Balb/C小鼠进行免疫，随后在第14、15和16天通过气雾剂用OVA进行激发(OVA组)。最后一次激发后1小时用MSC处理实验组(OVA+MSC)。当使用luc-MSC时，在输注后1小时对小鼠成像，以分析i.p.注射DEVD-氨基萤光素后胱天蛋白酶3的活化。处理18小时后，评价了BAL中嗜酸性粒细胞的浸润。B-E：在幼稚(有柱)(N＝3)和OVA致敏的(黑柱)(N＝3)小鼠的BAL(B、C)和肺(D、E)中不同细胞类型的百分比(B、D)和绝对数(C、E)。结果代表3次独立实验的平均值±SD。在OVA致敏的小鼠中，在最后一次气雾激发后1小时进行分析。F：为了确认在所有输注MSC的小鼠组的肺中luc-MSC的存在，对图6A中成像的相同小鼠注射D-萤光素。白线将最终图像中组合的多张照片分开。G：从图14F中的小鼠图像测量TLS，并显示为平均值±SD。统计数据：未配对t检验。ns：不显著。
图15是系列图表，显示(A)使用不同浓度FasL(抗Fas抗体)获得的ApoMSC的百分比，和(B)在不同时间内使用不同浓度FasL(抗Fas抗体)获得的ApoMSC的百分比。
图16是显示患有炎性肠病(IBD)的患者的PBMC如何离体诱导MSC凋亡的图。来自IBD患者(IBD，n＝82)或健康对照(HC，n＝8)的PBMC以20:1的PBMC:MSC的比率与MSC一起共培养4小时，并通过流式细胞术通过膜联蛋白-V/7-AAD染色来评估MSC凋亡。统计数据：未配对T检验。***p<0.001。
图17是显示IBD患者如何在MSC中诱导PGE2上调并与膜联蛋白V+MSC的比例相关联的系列图。(A)将MSC(5×104)和患者PBMC(1×106)共培养24小时，然后收集上清液，通过ELISA测定PGE2。细胞未经处理或者用泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(50μM)预处理。统计数据：配对T-检验。*p<0.05。(B)上清液中膜联蛋白-V+MSC与PGE2水平之间的相关性。
图18的系列图显示了患者PBMC诱导MSC经历凋亡的能力预示了对GvHD中MSC输注的临床应答。对32例受类固醇抗性GvHD影响的患者用静脉内MSC(1-3×106细胞/Kg)治疗(A)。治疗前，将它们的外周血单核细胞(PBMC)与MSC一起孵育4小时，并通过膜联蛋白V染色评估MSC凋亡。该图报告了在应答者和无应答者中膜联蛋白V+MSC的比例(B)。根据患者PBMC的11.5％MSC杀伤(膜联蛋白V+MSC)计算ROC(C)。在应答者和无应答者中MSC后患者的总体存活率。在所研究的潜在因素中，细胞毒性(11.5％阈值)是多变量分析中影响临床应答的唯一因素。
图19显示了不同来源的MSC对凋亡表现出不同的敏感性。将从骨髓(BM)或脐带(UC)分离的不同批次的MSC与来自健康个体的PHA活化的PBMC一起孵育。4小时后，评估MSC的凋亡(膜联蛋白V+7-AAD-)。
图20显示来自具有其它炎性病症的患者的PBMC含有抗MSC细胞毒性细胞。PBMC从患有活动性炎性肠病(IBD)的患者或经历肝移植(Ltx)的患者新鲜分离，并与骨髓源MSC(20:1比率)共培养4小时，然后进行FACS分析。通过不成对t检验进行统计分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图21显示皮肤成纤维细胞在暴露于细胞毒性细胞时也易于凋亡。用PHA将从健康供者分离的PBMC活化3天，然后以不同比例与皮肤成纤维细胞共培养。在4小时后通过FACS分析定量鉴别为膜联蛋白V+7AAD-细胞的凋亡细胞。
实施例1
MSC在GvHD动物接受者中经历凋亡。
为了解释注射后MSC快速清除的机制，申请人在GvHD小鼠模型中测试了MSC经历凋亡的假说。
C57BL/6(H2b)小鼠购自Harlan Laboratories(Bicester，UK)。Mh(C57Bl/6背景，CD8+Tg，H-2b，CD45.2+，H-2Db-限制性)小鼠针对特异于在H-Db背景中提呈的雄性抗原UTY的T细胞受体是转基因的，并且在室内繁殖。所有小鼠在6周龄和12周龄之间使用。
如前所述诱导急性GvHD(T.Toubai等人，Blood，119，3844-3853(2012))。简言之，在致死性辐照(11Gy)后，对C57BL/6雄性小鼠接受者移植来自雌性Mh小鼠的1×106个纯化的CD8+细胞作为GvHD效应物(该细胞针对特异于雄性HY-抗原Uty(Matahari，mh)的T-细胞受体是转基因)(图9A)、5×106个未分级的骨髓(BM)和2×106个纯化的来自雌性同基因供体(C57BL/6野生型供体)的多克隆CD4+细胞。对照组仅接受BM和纯化的CD4+细胞。使用磁珠(Miltenyi Biotec Ltd，Bisley，UK)通过阳性选择获得CD4+和CD8+ T细胞。在第3天i.v.注射活的MSC(1×106)，同时在自移植的第1、3和6天i.v.或i.p.给予apoMSC(1×106)。除非另有说明，在第7天将动物安乐死用于分析。GvHD效应细胞的浸润通过流式细胞术评估，百分比表示为基于细胞物理特征的淋巴细胞门中细胞的比例。
在该模型中，可以精确地计算影响GvHD的T细胞(CD8+Vβ8.3+)的扩增。
使用转染有表达萤火虫萤光素酶(Luc+)的pGL3对照载体的MSC(luc-MSC)，评价体内MSC胱天蛋白酶的活化。用DEVD-氨基萤光素，以萤光素酶活性测量胱天蛋白酶的活化。在该系统中，由于DEVD在胱天蛋白酶3活化时被切割，从而导致氨基萤光素的释放，而氨基萤光素又可以被MSC中表达的萤火虫萤光素酶代谢，因此可以基于发射光来定量胱天蛋白酶3的活化。将Luc-MSC注射到带有CD8+Mh T细胞的BM移植接受者中(GvHD组)，1小时后以总发光信号(TLS)测量胱天蛋白酶活性。对照小鼠由幼稚雄性(幼稚组)和接受辐照并接受CD4+和BM细胞(BM组)而没有转基因T细胞的小鼠组构成，以在没有活化的细胞毒性T细胞的情况下再现MSC输注条件(图9A)。仅在注射到GvHD小鼠中的MSC中观察到高的胱天蛋白酶活性(图1的A和B)。当使用对照D-萤光素(萤火虫萤光素酶底物)时，可以从所有动物的肺中检测到高信号(图9的B和C)，因此证实当不能检测到胱天蛋白酶活性时，也可以在肺中跟踪到luc-MSC。
输注后MSC经历凋亡的证据提出一个问题：它们是否仍能够抑制抗原驱动的T细胞扩增。因此，通过计数MSC处理或未处理的GvHD小鼠中的CD8+Vβ8.3+Mh T细胞(GvHD效应细胞)，来分析它们的免疫抑制作用。MSC使GvHD效应细胞在脾和肺中的浸润显著减少(图1的C和D)。这些结果表明，尽管输注后存在MSC凋亡(图1的A和B)，但MSC免疫抑制仍然发生。
可以排除观察到的免疫抑制活性可能是接受者炎性细胞因子的结果的可能性，因为在我们的异种组合中，鼠炎性细胞因子将不与相应的人受体交叉反应，并且将不活化人MSC中的免疫抑制分子，同时保留了扩增介导GvHD的鼠效应细胞的能力。因此，除非被人细胞因子预活化，否则人MSC不能抑制伴刀豆球蛋白-A(ConA)诱导的鼠脾细胞(mSpl)增殖(图10的A，B和C)。此外，人MSC暴露于鼠炎性细胞因子不上调IDO、TNF刺激基因6蛋白(TSG-6)或前列腺素内过氧化物合酶-2(PTSG2)，这些被认为是人MSC介导的体外免疫抑制的主要效应物(图10D)。
实施例2
体内MSC凋亡依赖于活化的接受者GvHD效应细胞
我们的结果显示，输注后MSC迅速经历凋亡，为移植的MSC在接受者中的快速清除提供了长期寻求的解释。在幼稚和BM小鼠体内缺乏MSC凋亡清楚地证明了，MSC凋亡不是人MSC异种识别的结果，因为它仅在GvHD小鼠中被检测到。当我们计算小鼠肺中发生MSC凋亡的GvHD效应细胞浸润(CD8+Vβ8.3+)时，我们发现只有GvHD的肺而非幼稚和BM小鼠的肺含有大比例的CD8+Vβ8.3+细胞(图2A)，这因此证实了MSC中胱天蛋白酶的活化与GvHD效应细胞的存在之间的相关性。
为了检验GvHD效应细胞负责MSC凋亡的假说，将MSC与从GvHD(体内活化)或幼稚Mh(体内静息)小鼠的肺或脾中纯化的CD8+ T细胞一起培养。活化的但不是静息的Mh CD8+细胞诱导MSC凋亡(图2B)。作为杀伤活性的诱导缺乏抗原特异性的进一步证据，通过CD3/CD28珠体外刺激的幼稚MhCD8+细胞可以引发高水平的细胞毒性(图11A)。
使用Mh/穿孔素敲除小鼠(Mh/Perf-/-)作为缺陷细胞毒性GvHD效应细胞(GvHDPerf-/-组)的供者，评价MSC凋亡诱导和随之产生的免疫抑制对细胞毒性细胞的需求。C57BL/6-Prf1tm1Sdz/J(穿孔素-/-)小鼠购自J Jackson实验室，与Matahari Rag2-/-小鼠一起饲养，所得后代杂交2代，获得MhRag2-/-.Perf KO F3小鼠。
将Luc-MSC输注到已接受Mh CD8+ T细胞的GvHDPerf-/-或对照GvHD小鼠中。1小时后对小鼠成像，并如前所述测量胱天蛋白酶活化。我们观察到与GvHD对照相比，GvHDPerf-/-小鼠中的胱天蛋白酶活性要低得多(图2的C和D)。当使用对照D-萤光素时，在所有动物的肺中检测到高信号(图11的B和C)，因此证实当无法检测到胱天蛋白酶活性时，luc-MSC也存在于肺中。重要的是，在接受MSC的GvHDPerf-/-中，接受MSC的小鼠的脾和肺中的GvHD效应细胞浸润没有减少(图2的E和F)。我们得出结论，MSC凋亡对于免疫抑制是不可缺少的，并且需要接受者中功能性活化的细胞毒性细胞。
实施例3
针对MSC的细胞毒性活性是预测GvHD患者对MSC的临床反应的生物标志物
基于这些发现，我们推断接受者中细胞毒性细胞的存在可以预测MSC的治疗活性。
多年来，在多家医院使用MSC治疗了患有严重类固醇耐药3-4级GvHD的16名患者(平均年龄40.5岁(范围：10-69岁)。施用MSC用于同情使用(根据Regulation(EC)No 1394/2007)。患者在造血干细胞移植前已接受清髓性预处理或低强度性预处理。所有患者接受3或4剂甲氨蝶呤联合环孢菌素的GvHD预防。在英国中心的移植的所有成年患者中均进行了利用阿仑单抗(alemtuzumab)或ATG的T细胞耗竭。在本研究中包括的16名患者中，13名在造血干细胞移植后发展为GVHD，剩余3名患者在DLI后发展为GVHD。急性GvHD感染12例，晚期GvHD发作3例，慢性GvHD1例。GvHD的诊断根据组织学标准进行，GvHD分期根据标准规范进行。在以下情况下，患者被视为类固醇难治性：(a)患有aGVHD的患者在6天后对高剂量的甲基泼尼松龙(methylprednisolone)没有应答；(b)患有cGVHD的患者在2-4周后对高剂量类固醇无反应，其中分别在第1和第4周加入了霉酚酸酯(Mycophenol MycophenolateMofetil，MMF)和环孢素。在MSC输注1周后评估了对MSC的临床反应，定义为至少一个受GvHD影响的器官中至少改善了50％。患者特征总结在下表1中。
如前所述，对MSC的临床应答定义为至少1个受GvHD影响的器官中至少50％的改善。五名患者获得临床应答。
在MSC输注前的24小时内新鲜收集外周血单核细胞(PBMC)，并在4小时细胞毒性测定中直接测试它们离体诱导MSC凋亡的能力(见下文)。一个患者接受两剂MSC，并且在每剂之前独立地进行细胞毒性测定。MSC来源于用于输注的相同供者(N＝8)或来源于不同的供者(N＝9)。在进行测定和细胞荧光分析时，操作者对患者的临床细节是不知道的。来自健康供者(N＝5)的PBMC用作对照。
总之，GvHD患者的PBMC表现出的抗MSC的平均细胞毒活性高于对照PBMC中所检测到的，但没有达到显著差异(平均值±SD分别为：10.63±8.76％和3.82±2.50％；p＝.10)。然而，MSC的临床应答者和无应答者之间的细胞毒性水平明显不同，凋亡MSC(膜联蛋白-V+/7AAD-)的比例表现出四倍的差异(图3的A和B)。使用接受者操作特征曲线计算的应答者和无应答者之间凋亡MSC的辨别阈值揭示，14.85％的截断值预示着具有最高灵敏度和特异性的临床应答。细胞毒性水平在MSC制备物之间没有变化，因为当我们与从无关供者获得的另一种制备物相比，测试针对用于输注的MSC患者的PBMC时，没有检测到凋亡诱导的差异(图12A)。为了进一步证实特定MSC制备物的不相关性，我们评价了源自不同不相关供者的MSC被4种不同的混合淋巴细胞反应(MLR)组合杀死的易感性。当测试相同的MLR时，凋亡MSC的比例在不同MSC制备物中是相似的。相反，针对相同MSC的细胞毒性活性在不同MLR之间不同(图12的B)。
最后，我们排除了不同比例的CD8+和CD56+细胞可能解释不同的细胞毒活性的可能性，因为在应答者和无应答者的PBMC中的平均频率是相似的(图12的C和D)。因此，我们推断接受者中存在活化的细胞毒性细胞预示着MSC的治疗活性。
实施例4
细胞毒性细胞诱导的MSC凋亡是旁观者效应的结果
为了定义驱动MSC凋亡的机制，我们使用体外活化的PBMC作为效应细胞。我们发现，活化的而非静息的PBMC诱导MSC中的广泛的早期凋亡(膜联蛋白-V+/7AAD-)(图4A)，其在4小时达到峰值，并在24小时后向晚期凋亡(膜联蛋白-V+/7AAD+)转移(图13的A)。根据我们的体内观察(图1的A和B)，仅活化的PBMC在MSC中诱导胱天蛋白酶活化，在90分钟时到达峰值，并且这被泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK完全消除(图4B和图13B)。
为了鉴别诱导MSC凋亡的细胞，我们在活化的PBMC中进行了选择性富集和消耗实验。我们发现，CD56+自然杀伤(NK)和CD8+细胞群是唯一负责启动MSC凋亡的细胞(图4的C和D)。为了表征介导由活化的细胞毒性细胞诱导的MSC凋亡的机制，我们研究了参与胱天蛋白酶3活化的潜在因素。颗粒酶B(GrB)或穿孔素的抑制完全消除了活化的PBMC杀死MSC(图4E)和活化胱天蛋白酶3(图13C)的能力。我们还观察到，当中和CD95配体(CD95L，也称为FasL或APO-1L)时，PBMC介导的细胞毒性降低(图4F)，但当肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)被抑制，即使在非常高浓度的它们各自的抑制剂存在下，PBMC介导的细胞毒性也不降低(图13D)。
然后我们研究了MSC-细胞毒性细胞相互作用的性质。我们观察到，凋亡不受抗HLAI类或抗HLA II类中和抗体的存在的影响。一致地，活化的PBMC对自体或同种异体MSC的细胞毒性活性没有区别(图4G)。然而，尽管PBMC需要与MSC物理接触以诱导凋亡(图4H)，但通过抑制微管组织中心的极化来阻断免疫突触形成(图4I)并没有效果。这些结果证明，活化的细胞毒性细胞杀死MSC是一种不涉及免疫突触的旁观者效应。
实施例5
MSC凋亡不干扰细胞毒性细胞对特异性靶标的识别
已经确定由细胞毒性细胞诱导的MSC凋亡不依赖于MHC且不是抗原特异性的，我们的疑问是，MSC是否可以通过竞争和拮抗抗原特异性识别来发挥其免疫抑制作用。将NY-ESO1-特异性CD8+ T细胞克隆(4D8)或IL2活化的多克隆CD56+纯化的NK细胞分别用作针对NY-ESO-1肽脉冲的T2或K562细胞的效应细胞。进行两组不同的实验。在第一组中，在用作冷靶标的数量递增的MSC存在下，针对固定数目的推定(易感)靶细胞测试4D8或NK细胞。替代条件包括在存在固定数目的MSC时，递增现在用作冷靶标的推定的靶标细胞的数目，然后将其视为易感靶标。MSC不与抗原特异性T细胞的细胞毒性竞争，因为MSC的存在不影响肽脉冲的T2细胞的杀伤(图5A)。使用NK细胞获得了相同的结果(图5B)。相反，在两种系统中，推定的靶细胞的存在以剂量依赖性方式显著降低了MSC杀伤(图5的C和D)。我们的数据显示MSC杀伤不干扰同源抗原的初级识别。
实施例6
凋亡MSC在Th2型炎症模型中是免疫抑制的
我们的数据暗示，由于MSC杀伤不干扰同种型(cognate)抗原的初次识别，所以凋亡的诱导必须显著地参与免疫抑制活性。
因此，在所述GvHD模型中，免疫抑制需要接受者细胞毒性细胞产生的MSC凋亡。因此，我们的疑问是，这种因果关系在与非细胞毒性Th2型炎症相关的不同疾病模型中是否仍然有效。我们选择了图14A中总结的卵清蛋白(OVA)诱导的变应性气道炎症的模型。
如前所述诱导OVA诱导的气道炎症(Y.Riffo-Vasquez等，2012，Am J.Respir.MolBiol 47，245-252)。简言之，在第0和7天，给雌性Balb/C小鼠(Harlan Laboratories，Bicester，UK)腹膜内注射30μg鸡卵白蛋白(OVA V型)(Sigma-Aldrich Company Ltd，Dorset，UK)。对照仅接受载体(氢氧化铝)。在第14天，用OVA(3％)的气雾化溶液激发15和16只动物25分钟。在最后一次激发后1小时注射MSC或ApoMSC。在另外18小时后，小鼠进行末端麻醉，将插管插入暴露的气管中，并将三份无菌盐水注射到肺中。对灌洗液中的细胞总数进行计数。对于差异细胞计数，用Diff Quick(DADE Behring，德国)对细胞离心制备物进行染色，并使用标准形态学规范对细胞计数。
尽管细胞毒性免疫细胞参与该病症的诱导，但是当输注MSC时，浸润支气管肺泡灌洗液(BAL)和肺组织的CD8+和NK1.1+细胞在最后一次激发后1小时少于2％(图14的B，C，D和E)。为了证实不存在MSC杀伤，小鼠接受luc-MSC以评估输注后的胱天蛋白酶活化，并在1小时后成像。在任何小鼠中都没有检测到胱天蛋白酶的活化(图6的A和B)。
在接受对照D-萤光素的所有动物中都可以检测到高信号(图14的F和G)。通过定量BAL中嗜酸性粒细胞浸润评价的治疗活性表明，MSC处理和未处理小鼠之间没有差异(图6C)。总之，这些结果表明，在该模型中MSC免疫抑制也依赖于介导MSC凋亡的接受者细胞毒性细胞的存在。
因此，我们决定测试体外产生的凋亡MSC(apoMSC)是否可以绕过对细胞毒性细胞的需要并改善嗜酸性粒细胞浸润。
研究细胞培养物含有显著(＞30％)数目的凋亡细胞的条件。在存在合成人GrB(5μg/ml)(Enzo Life Sciences，Exeter，UK)和各种浓度的抗FAS人(活化，克隆CH11)的情况下，将MSC以5×105细胞/孔的浓度铺板于96孔圆底板中，保持15分钟至24小时。之后，使用膜联蛋白V染色通过流式细胞术测定凋亡细胞的百分比。结果总结在图9中。
然后，在存在合成人GrB(5μg/ml)(Enzo Life Sciences，Exeter，UK)和抗FAS人(活化性，克隆CH11)(10μg/ml)(Merk Millipore，Watford，UK)的情况下，将ApoMSC以每孔5×105个细胞铺板于96孔圆底板完全RPMI中24小时，获得用于测试的ApoMSC。选择GrB和FasL的浓度以产生至少80％的MSC凋亡。
当将apoMSC施用于小鼠接受者时，观察到BAL中嗜酸性粒细胞浸润的显著降低(图6D)。
实施例7
输注于GvHD中的凋亡MSC是免疫抑制性的，并诱导接受者吞噬细胞中IDO的产生
我们随后研究了apoMSC是否在GvHD模型中也能是免疫抑制性的。ApoMSC通过静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)施用，并评估CD8+Vβ8.3+Mh T细胞的浸润，并与未处理的GvHD小鼠比较。ApoMSC在脾和肺中产生GvHD效应细胞浸润的显著减少，但这仅在用i.p.输注的ApoMSC处理的那些小鼠中观察到(图7的A、B、C和D)。据报道，将经照射的胸腺细胞注射到动物中导致它们被接受者巨噬细胞的吞噬作用和IDO的诱导。
因此，我们通过由接受者吞噬细胞引发体内的胞葬作用并诱导IDO产生来测试apoMSC是否遵循相同的结果。为此，注射后在接受者吞噬细胞中追踪标记的apoMSC。
具体地，MSC首先使用CellTraceTM Violet标记(ThermoFisherScientific，Paisley，UK)以5μM的终浓度进行标记，然后如上所述使用合成人GrB(5μg/ml)和抗FAS人(10μg/ml)24小时进行凋亡(ApoMSC)。然后腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)注射10×106标记的apoMSC，注射后2小时后处死小鼠。收集脾、肺、气管周围、脊柱旁、心包、肠系膜、门静脉周和腹腔淋巴结，并通过流式细胞术分析。CellTraceTM Violet阳性作为吞噬细胞的CD11b+和CD11c+门控亚群中ApoMSC吞入的量度来评估。然后评估CellTraceTM Violet阳性的细胞的IDO表达。
i.p.给药后，apoMSC主要在腹膜引流淋巴结中的CD11b+(图7E)和CD11c+(图7F)吞噬细胞内被鉴别(图7E)，但在肺和脾中寻找时不存在。当使用i.v.注射途径时，在所研究的几种吞噬细胞群体中，CD11b高CD11cint、CD11b高CD11c-和CD11b-CD11c+被检测为肺中吞入apoMSC(分别见图7的G、H和I)。i.v.和i.p.组中吞入ApoMSC的吞噬细胞中IDO表达的分析揭示，与未处理GvHD小鼠中的相应吞噬细胞相比，仅i.p.组中的吞噬细胞能够以显著更高的水平增加IDO表达(图7的J和K)。这些发现强烈提示apoMSC的免疫抑制作用涉及作为关键效应器机制的接受者吞噬细胞和IDO。
实施例8
接受者来源的产生IDO的吞噬细胞对于GvHD中的MSC免疫抑制是不可缺少的
为了直接测试接受者来源的吞噬细胞和接受者产生的IDO在MSC免疫抑制活性中的重要性，我们在MSC治疗前在GvHD小鼠中耗尽了吞噬细胞并抑制了IDO活性，并评估了活MSC对GvHD效应物扩增的影响。为了耗尽吞噬细胞，在MSC注射前72小时给予小鼠脂质体氯膦酸盐(1mg)。治疗显著地削弱了MSC抑制Mh T细胞浸润的能力(图8的A和B)。
最后，在MSC注射前6天开始，在饮用水中给予动物IDO抑制剂1-甲基-D-色氨酸(1-DMT)(2mg/ml)，直至动物死亡。同样在这种情况下，与对照相比，接受1-DMT的小鼠中MSC对Mh T细胞浸润的有益效果大大降低(图8的C和D)。因此，我们推断MSC的免疫抑制作用需要接受者吞噬细胞的存在或IDO的产生。
实施例9
来自炎性肠病(IBD)患者(IBD，n＝82)或健康对照(HC，n＝8)的PBMC与MSC以20:1的PBMC：MSC比率共培养4小时，并通过流式细胞术利用膜联蛋白-V/7-AAD染色来评估MSC凋亡。结果示于图16中。
很明显，在受IBD影响的患者中，有一组高杀手和低杀手。与GvHD患者观察到的相似，13％的截断值似乎区分这2组患者。
对差异的分子基础进行进一步研究。
具体地，MSC(5×104)和患者PBMC(1×106)共培养24小时，加入或不加入泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(50μM)。收集上清液，通过ELISA测定PGE2水平。结果示于图17中。
这些结果显示，在与患者的PBMC物理接触后，诱导MSC分泌高水平的前列腺素E2(PGE2)。PGE2的诱导完全依赖于胱天蛋白酶，因为在培养物中添加胱天蛋白酶抑制剂大大降低了PGE2水平(图17A)。因此，这表明该活性与PBMC诱导MSC凋亡的能力相关。所述水平显示与那些样品中膜联蛋白V+细胞的诱导具有良好的相关性(参见图17B)。
因此PGE2提供了PBMC对MSC的凋亡诱导活性的良好标志，其可以用作膜联蛋白V+细胞检测的替代。该标志物的优点在于，它可以由独立的操作者使用例如简单的ELISA方法更简单和客观地测量。
材料和方法
该研究旨在验证MSC在输注后是否经历凋亡，并测试MSC凋亡在接受者来源的致耐受性免疫应答的起始中所起的作用。
选择GvHD小鼠模型，该模型中的疾病是由接受者中Mh CD8+细胞的扩增和活化介导的，这有三个重要原因：它概括了供者和接受者之间的微小错配；可以精确地计数影响GvHD的T细胞；有证据表明MSC对GvHD有治疗作用。此外，使用人MSC以避免接受者细胞因子对MSC免疫调节功能的混淆作用。在该系统中，鼠炎性细胞因子将不与相应的人受体交叉反应，并且将不活化人MSC中的免疫抑制分子，同时保留扩增介导GvHD的鼠效应细胞的能力。吞噬细胞的耗尽和IDO产生的抑制作为功能丧失实验用以评估MSC凋亡依赖性免疫抑制的递送对这些因子的需求。
卵清蛋白(OVA)诱导的变应性气道炎症的小鼠模型用于评估在MSC免疫抑制的递送中细胞毒性细胞和MSC凋亡之间的因果关系在Th2型炎症相关疾病中是否有效。
没有使用随机化方法。在所有实验中，将动物随机分配至对照组或实验组。不采用盲法。没有使用统计学方法来预先确定样品量，而是利用测定灵敏度根据以前的经验和不同的动物模型来评估。除非另有说明，进行三次独立的重复实验。
为了证明GvHD患者中抗MSC的细胞毒性细胞的存在可以预测MSC治疗活性，收集来自GvHD患者的样品并在MSC输注前24小时内在细胞毒性测定法中测试它们诱导MSC凋亡的能力。在进行测定和细胞荧光分析时，操作者对患者的临床细节是不知道的。所有患者都受类固醇抗性GvHD的影响，并接受MSC同情使用。来自健康供体的PBMC用作对照。在根据当地伦理委员会要求获得知情同意后收集所有样品。
MSC制备
临床级的BM来源的人MSC由从健康供者的髂嵴收集的BM抽吸物产生。简言之，将2ml BM抽出物收集在含有100μl无防腐剂肝素的管中。用Alpha Modified Eagle’s培养基(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)、无保守性肝素(conservative-free heparin，1UI/ml)(Wockhardt UK Limited，Wrexham，UK)和5％血小板裂解物将细胞以1-2.5千万/636cm2的密度在24小时内铺板，然后在37℃和5％CO2环境下孵育3天。使用磷酸盐缓冲盐水(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)弃去非粘附细胞。当细胞汇合达到90-100％时，用胰蛋白酶-EDTA(0.05％胰蛋白酶，0.5γmM EDTA·4Na)(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)分离细胞(并以5000细胞/cm2的密度再接种。在第2代使用MSC用于所有体内实验，而它们在第8代前用于体外实验。在后一种情况下，我们没有观察到不同传代之间凋亡敏感性的任何差异。释放标准基于CD105、CD90、CD73的阳性(＞80％)，CD3、CD14、CD19、CD31、CD45的阴性(＜2％)。
小鼠和疾病模型
没有使用随机化方法。在所有实验中，将动物随机分配至对照组或实验组。不采用盲法。
细胞制备物和培养基
在含有GlutaMAXTM、HEPES(25mM)、青霉素5000U/ml和链霉素5000μg/ml(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)、胎牛血清10％(Labtech.com，Uckfield，UK)的完全RPMI 1640培养基中进行培养。
来自健康供者的人外周血样品由国家血液服务(Colindale，UK)作为白细胞锥形杯获得。在MSC注射前24小时内收集来自GvHD患者的样品。PBMC通过在Histopaque-1077(Sigma-Aldrich Company Ltd，Dorset，UK)上密度梯度分离而分离。通过细胞过滤器(BDFalcon，Oxford，UK)分离mSpl，同时将肺切成小块并与IV型胶原酶(250U/ml)(LorneLaboratories，Reading，UK)、来自牛胰的DNAse I(250U/ml)(Merk Millipor，Watford，UK)和胎牛血清6.25％在37℃孵育1小时。
MSC的成像
使用电穿孔(Gene Pulser Xcell，BioRad，Kidlington，UK)，用含有表达Luc+用的SV40启动子的pGL3-对照载体(Promega，Southampton，UK)或pECFPDEVDR-Venus(Addgene，Teddington，UK)转染Luc-MSC。将细胞悬浮在总体积250μl的缓冲液中，并在250伏特和950F下使用10μgDNA在0.4cm间隙的比色皿中电穿孔。当使用pECFP-DEVDR-Venus时，供体荧光团pECFP和受体Venus-YFP通过柔性接头DEVDR连接，该接头被胱天蛋白酶3的活性形式鉴别和切割。在该系统中，可通过分析pECFP和Venus-YFP之间的
共振能量转移(FRET)来监测胱天蛋白酶3活性。当胱天蛋白酶3不活化时，柔性接头DEVDR保持完整，允许能量从pECFP转移，同时发射YFP信号。相反，在胱天蛋白酶3活化作用的存在下，DEVDR被切割，因此能量转移丧失，pECFP信号增加。
为了共焦成像，将pECFP-DEVDR-Venus转染的MSC在30mm×10mm培养皿(Corning，Flintshire，UK)中以1×105个细胞的浓度铺板于完全RPMI中，并使其粘附过夜。第二天，在PBMC中加入PHA-aPBMC，aPBMC：MSC的比率为40/1。如所示，使用泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(50μM)、穿孔素抑制剂EGTA(4mM)、GrB抑制剂Z-AAD-CMK(300μM)。
使用Leica TCS SP5 II共聚焦显微镜，用488nm和407nm激光器，每3分钟获得活细胞成像，共180分钟。通过使用软件"R"和EBImage包处理和分析图像。在GvHD模型中，在移植3天后，将1x106 luc-MSC i.v.注射入幼稚C57BL/6、BM或GvHD小鼠中进行体内成像。在气道炎症模型中，在最后一次OVA激发后1小时，在幼稚Balb/C或OVA处理的小鼠中i.v.输注luc-MSC。再过1小时后，用异氟烷(1.5％异氟烷，98.5％Oxigen)麻醉小鼠，i.p.注射3mgVivoGloTM Casp 3/7底物Z-DEVD氨基荧光素(Promega，Southampton，英国)，并使用
Lumina III(PerkinElmer，Waltham，USA)系统成像，总时间为5分钟。通过使用软件"R"和EBImage包分析图像以获得平均TLS。转染的MSC的存在的确认是通过用VivoGloTM萤光素(Promega，Southampton，UK)注射小鼠获得的。
人PBMC和鼠CD8+细胞的预活化
在24孔板中，在PHA(5μg/ml)(Sigma-Aldrich Company Ltd，Dorset，UK)的存在下，将5×106人PBMC铺板于2ml终体积的完全RPMI中72小时，获得PHA-aPBMC。使用单向MLR获得MLR-aPBMC，其中来自一个供者的PBMC(刺激物)被照射(30Gy)并以0.75×106细胞/cm2的密度在完全培养基中以1/1的刺激物：应答者比率与无关供者的PBMC(应答者)共培养。然后在37℃、5％CO2下培养细胞5天。通过从健康供体PBMC(Miltenyi Biotec Ltd，Bisley，UK)阳性选择CD56+细胞来纯化NK细胞，并用重组人IL-2(1000U/ml)活化。NY-ESO1特异性CD8+ T细胞克隆(克隆4D8)由Vincenzo Cerundolo教授(分子医学研究所，牛津大学，UK)提供。在含有丙酮酸钠(1mM)、2-巯基乙醇(0.05mM)(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)、重组人IL-2(400U/ml)(Peprotec EC Ltd，London，UK)和PHA(5μg/ml)(Sigma-AldrichCompany Ltd，Dorset，UK)的完全RPMI 1640中扩增克隆。
使用以下方案刺激Mh CD8+：在CD3/CD28包被的珠
(ThermoFisherScientific，Paisley，UK)存在下，将5×106个纯化的CD8+Mh细胞铺板于24孔板中，最终体积为2ml完全RPMI，并孵育72小时。
免疫抑制试验
将人MSC的系列稀释液铺板于平底96孔板中，并使其在100μl完全RPMI中粘附过夜。如所示，将MSC培养物暴露于人干扰素-γ(hIFN-γ)和人TNF-α(hTNF-α)、鼠IFN-γ(mIFN-γ)和鼠TNF-α(mTNF-α)(各20ng/ml)(所有细胞因子来自Peprotec EC Ltd，London，UK)、来自PHA-aPBMC的上清液或来自ConA-aSpl的上清液。第二天，用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯染料(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)标记5×105Balb/C mSpl，并以递增的MSC/mSpl比率与MSC铺板。培养对照由在存在(阳性对照)或不存在ConA(阴性对照)的情况下在没有MSC的情况下铺板的mSpl组成。72小时后通过流式细胞术评估mSpl的增殖，并表示为在各MSC/mSpl稀释液中获得的增殖与阳性对照培养物中获得的增殖相比的百分比。结果表示为抑制百分比。
细胞毒性测定
将1×105MSC以500μl的总体积铺板过夜。预活化后的那天，将免疫细胞以不同浓度(2.5至40/1的效应细胞：MSC比率)铺板。然后使用流式细胞术或共聚焦显微镜分析在不同时间点检测MSC凋亡。最后，在绝大多数情况下，测定进行4小时。在流式细胞术中，MSC被鉴别为CD45-细胞。
使用用浓度为0.1μM的NY-ESO-1抗原(表位SLLMWITQC)脉冲1小时的T2细胞，测试克隆4D8的抗原特异性细胞毒性活性。在竞争性试验中，通过CellTraceTM Violet标记将T2(来自Hans Stauss，UniversityCollege London)和K562细胞(来自Junia Melo，ImperialCollege London)与效应细胞区分开来。对T2(1μM)和K562(2.5μM)细胞的示踪剂浓度进行优化。在使用前测试细胞系的支原体污染。
当使用流式细胞术时，使用PE膜联蛋白-V凋亡检测试剂盒(BDBiosciences，Oxford，UK)评估凋亡水平。除非另有说明，凋亡细胞被鉴别为膜联蛋白-V+/7-AAD-细胞。
抑制剂
如所示，向培养物中补充泛-胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(在流式细胞术实验中为10μM，或在共聚焦实验中为50μM)(R&D System，Oxon，UK)、穿孔素抑制剂EGTA(4mM)(Sigma-Aldrich Company Ltd，Dorset，UK)、GrB抑制剂Z-AAD-CMK(300μM)(MerkMillipor，Watford，UK)、针对HLA-DR的中和抗体(克隆L243)(50μg/ml)、人HLA-A,B,C(克隆W6/32)(100μg/ml)(BD Biosciences，Oxford，UK)、TNF-α拮抗剂依那西普
(10μg/ml或100μg/ml)(Amgen，Cambridge，UK)。在用效应杀伤细胞培养1小时之前，将每种试剂与MSC一起孵育。在所有情况下，在细胞毒性测定的持续时间内保持相应抑制剂的浓度。
中和抗-CD178(克隆NOK-1)(10μg/ml或100μg/ml)(BD Biosciences，Oxford，UK)、抗-TRAIL(克隆2E2)(10μg/ml或100μg/ml)(Enzo LifeSciences，Exeter，UK)抗体、MYR蛋白激酶-Cζ假底物(PKCζ-PS)(10μM、25μM或75μM)(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)和依那西普(10μg/ml或100μg/ml)与效应细胞一起孵育2小时，然后用MSC培养。在所有情况下，在细胞毒性试验期间保持相应抑制剂的浓度。
流式细胞术
使用下列对鼠分子特异的抗体：抗-CD45(FITC，克隆30-F11)(eBiosciences Ltd，Hatfield，UK)，抗-Vβ8.3(FITC，克隆1B3.3)，抗-CD8(APC，克隆53-6.7)，抗-CD4(PE，克隆H129.19)，抗-CD19(APC-H7，克隆1D3)，抗-NK1.1(PerCP-Cy5.5，克隆PK136)(BDBiosciences，Oxford，UK)，抗-CD11B(PerCP-Cy5.5，克隆M1/70)，抗-CD11c(APC-Cy7，克隆n418)，抗-Ido1(Alexa Fluo647，克隆2e2)(BioLegend，London，UK)。对于人特异性分子，使用以下抗体：抗CD45(FITC，克隆2D1)、抗CD8(APC，克隆SK1)、抗CD4(PE，克隆SK3)、抗CD11b(PerCP-Cy5.5，克隆M1/70)、抗CD56(FITC，克隆HCD56)(BD Biosciences，Oxford，UK)。所有样品都是使用BD FACS Canto II使用FACS Diva软件获得的，并用Flow-jo软件分析。如前所述(He等人，AM J.Pathol 164,1901-1913(2004))，通过流式细胞术评估FRET和胱天蛋白酶活性(CAf)。
实时定量PCR
MSC RNA从
(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)裂解物中获得，并使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Manchester，UK)提取。按照
RNA-to-CTTM1-Step试剂盒说明(ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)进行实时定量PCR(qRT-PCR)，每个反应使用20ng RNA模板。使用TaqMan引物(均购自ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)在StepOnePlus RT PCR系统热循环仪(Applied Biosystem，UK)上重复进行测定。使用的人引物如下：IDO2(Hs01589373_m1)，TSG6(Hs01113602_m1)和PTSG2(Hs00153133_m1)和HPRT1(Hs02800695_m1)作为管家基因。然后，使用2.1版StepOneTM软件分析数据，并以ΔΔCt方法获得相对定量，以未经处理的MSC为参考。
统计数据
结果表示为平均值±SD。进行非配对的Student t检验以比较2个平均值。使用单向ANOVA和Tukey's多重比较检验来比较3个或更多个平均值。零假设概率小于5％(p>.05，双侧)被认为是统计学显著的。没有使用统计学方法来预先确定样品大小，这仅根据以前测定灵敏度的经验和不同的动物模型来估计。
表1.GvHD患者的临床特征
*：供者淋巴细胞输注后的GvHD
AML：急性髓性白血病；CML：慢性粒细胞白血病；CLL：慢性淋巴细胞性白血病；CSA：环孢霉素；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；FL：滤泡性淋巴瘤；HL：霍奇金淋巴瘤；NR：无应答；MM：多发性骨髓瘤；MMF：霉酚酸酯；R：应答；SIB：HLA相合同胞；VUD：志愿者的无关供者。
Claims (43)
1.一种用于鉴别可能对使用活的间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者的方法，所述方法包括确定来自所述患者的样品是否能够诱导体外活MSC发生至少一些凋亡，并且其中所述样品诱导凋亡的能力指示所述患者对所述免疫抑制治疗的应答性。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过将所述样品与活MSC一起孵育，然后检测孵育物中凋亡MSC的存在，来确定样品在MSC中引起凋亡的能力。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，发现加入到所述样品中的MSC在孵育后有至少11％凋亡则指示，所述患者对所述免疫抑制治疗具有应答性。
4.如权利要求1所述的方法，其中，通过将所述样品与活MSC一起孵育，检测孵育物或从其获得的上清液中前列腺素E2(PGE2)的水平，并将所述水平与所述患者对所述免疫抑制治疗的应答性相关联，来确定样品在MSC中引起凋亡的能力。
5.如权利要求5所述的方法，其中PGE2的水平超过4000pg/ml指示所述患者对所述免疫抑制治疗具有应答性。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中PGE2的水平利用定量ELISA法来测定。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中被确定为对使用活MSC的免疫抑制治疗有应答的患者被开具用MSC治疗的处方，并且其中被确定为对所述免疫抑制治疗无应答的患者被开具用凋亡MSC治疗的处方。
8.一种体外使用活的间充质基质细胞(MSC)的方法，所述方法包括使所述活MSC与来自患者的生物样品体外接触，并且检测体外所述活MSC中凋亡MSC的存在或所述样品中升高水平的前列腺素E2(PGE2)的存在，其中体外所述活MSC中凋亡MSC的存在或升高水平的PGE2的存在指示，所述患者对使用活MSC的免疫抑制治疗的应答性。
9.如权利要求8所述的方法，其还包括使多个活MSC样品与来自多个患者中不同患者的生物样品在体外接触，并在体外检测每个活MSC样品中凋亡MSC的存在。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述接触步骤或每个接触步骤包括将所述生物样品与活MSC一起孵育，并且其中所述检测步骤或每个检测步骤包括检测孵育物中凋亡MSC的存在和/或确定凋亡MSC的效力。
11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，发现所述活MSC有至少11％在与所述样品体外接触后凋亡，或者上清液中前列腺素E2的水平超过4000pg/ml则指示，所述患者对所述免疫抑制治疗具有应答性。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中如果检测到体外活MSC中凋亡MSC的存在和/或PGE2水平升高，则用活MSC治疗所述患者，并且其中如果未检测到体外活MSC中凋亡MSC的存在，则用凋亡MSC治疗所述患者。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血液或血清样品。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过共聚焦显微镜或流式细胞术测定凋亡MSC的存在。
15.一种针对利用MSC免疫抑制疗法的治疗对患者进行分层的方法，所述方法包括进行权利要求1至14中任一项所述的方法，鉴别可能对使用活的间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答的患者，用于利用活MSC的治疗，以及鉴别对所述免疫抑制治疗可能无应答的患者，用于利用凋亡MSC的治疗。
16.一种用于鉴别受试者从组织损伤恢复的适应性的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的样品是否能够诱导体外活MSC发生至少一些凋亡，和/或检测PGE2的升高水平，并且其中所述样品诱导所述凋亡的能力或PGE2升高水平的存在指示所述患者的恢复能力。
17.一种用于在有需要的患者中产生免疫抑制作用的方法，所述方法包括通过检测在体外与来自患者的生物样品接触的活MSC中至少一些凋亡的存在来确定所述患者是否可能对使用活间充质基质细胞(MSC)的免疫抑制治疗有应答，当检测到体外活MSC中凋亡的存在时，向所述患者施用有效量的活MSC，并且当未检测到体外活MSC中凋亡的存在时，向所述患者施用有效量的凋亡MSC。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述患者患有免疫介导的疾病或病症或需要再生医学以刺激组织修复。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述疾病或病症是同种异体免疫疾病或自身免疫疾病，或者用于预防或治疗移植器官的排斥。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述疾病为移植物抗宿主病、多发性硬化、炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、关节炎如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或银屑病性关节炎，和急性呼吸窘迫综合征。
21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中通过检测给予MSC后从患者采集的样品中吞噬细胞或IDO的存在，来监测患者的治疗功效。
22.一种试剂盒，其包含实施权利要求1至12中任一项所述的方法所需的组分。
23.一种凋亡的MSC，其用于治疗免疫介导的疾病或病症或用于再生医学中以刺激组织修复。
24.一种凋亡的MSC，其用于权利要求7、12、15、17-20中任一项所述的方法中。
25.如权利要求23或24所述的凋亡的MSC，其中所述疾病是同种异体免疫或自身免疫疾病，或者用于预防或治疗移植器官的排斥。
26.如权利要求25所述的凋亡的MSC，其中所述疾病是移植物抗宿主病、多发性硬化、炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、关节炎如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或银屑病性关节炎，和急性呼吸窘迫综合征。
27.一种产生用于免疫抑制疗法的凋亡MSC的方法，所述方法包括将活MSC与药学上可接受的凋亡诱导剂一起孵育足以形成细胞培养物的一段时间，在所述细胞培养物中至少30％的MSC在小于24小时的时间内凋亡。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述药学上可接受的凋亡诱导剂是生物学药物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述生物学药剂是丝氨酸蛋白酶和/或抗FAS抗体。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是人颗粒酶B(GrB)。
31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其中，所述药学上可接受的凋亡诱导剂包括GrB和抗Fas抗体的组合。
32.一种凋亡的MSC，其可使用权利要求27至31中任一项所述的方法获得。
33.如权利要求32所述的凋亡的MSC，用于免疫抑制治疗中。
34.如权利要求32或33所述的凋亡的MSC，其包含自杀机制，任选地为自杀基因，特别是胱天蛋白酶诱导基因，例如胱天蛋白酶9或胱天蛋白酶3的形式。
35.一种药物组合物，其包含权利要求31至33中任一项所述的凋亡的MSC。
36.如权利要求35所述的组合物，其还包含活MSC。
37.一种在有需要的患者中产生免疫抑制作用的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的凋亡的MSC。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述患者患有免疫介导的疾病或病症或需要再生医学以刺激组织修复。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述疾病或病症是同种异体免疫疾病或自身免疫疾病，或者用于预防或治疗移植器官的排斥。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病为移植物抗宿主病、多发性硬化、炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、关节炎如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或银屑病性关节炎，和急性呼吸窘迫综合征。
41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中通过检测施用MSC后从所述患者采集的样品中吞噬细胞或IDO的存在，来监测患者的治疗功效。
42.前列腺素E2(PGE2)和/或凋亡MSC作为生物标志物用于确定患者恢复的适应性和/或对免疫抑制治疗的应答性的用途。
43.如权利要求42所述的用途，包括检测来自所述患者的样品中凋亡MSC的存在及其量和/或检测PGE2的升高水平。
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