CN115058390B

CN115058390B - 肾源干细胞的制备方法

Info

Publication number: CN115058390B
Application number: CN202210823125.9A
Authority: CN
Inventors: 董明珠; 毛建平; 贾元新; 帅领
Original assignee: Beijing Zhongling Cell Culture Technology Co ltd; Beijing Zhongke Cell Holding Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongling Cell Culture Technology Co ltd; Beijing Zhongke Cell Holding Co ltd
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-07-14
Also published as: CN115058390A

Abstract

本发明提供了一种肾源干细胞的制备方法，涉及干细胞制备技术领域，包括采集尿液、细胞分离、细胞培养、传代、接种、细胞冻存、保存等步骤，本发明可以实现全流程样本的无创收集，并通过对尿液保护液、肾源干细胞分离液、肾源干细胞培养基以及冻存方法的改进，对样本损伤小、干细胞增殖能力强，所制备的干细胞的纯度可达99.2%。

Description

肾源干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞制备技术领域，尤其是涉及一种肾源干细胞（尿液源干细胞）的制备方法。

背景技术

依据人体组织细胞来源及获取方式的不同，细胞存储可以分为有创存储和无创存储两大类；有创存储如新生儿脐带脐血的细胞存储、以抽脂方式获取脂肪来源的干细胞存储、通过智齿拔牙方式获取牙髓干细胞的存储、以及抽骨髓的方式获得的骨髓造血干细胞的存储等等。由于受到干细胞提取时间、获取方式以及获取场景等诸多条件的限制及制约，使得受众人群受到了很大的限制，而且能够提取到的细胞数量也很有限，难以满足未来临床治疗的实际需求。

无创存储是指从人体自然排出物中分离获取干细胞的最新高科技技术。无创存储可以利用人体排出的尿液来分离制备高活性的多功能干细胞，采集过程简单快捷，对身体无创无害无风险，从而排除了干细胞样本获取时间、获取地点及场景等诸多因素的限制，采集对象可以利用无创存储采集套装随时随地进行细胞样本的收集，获取的干细胞因为采集全过程无创，对细胞的损伤极小，这样最终提取到的干细胞的活性及质量均可达到临床应用标准。无创存储技术的诞生及成熟会成为未来干细胞抗衰及临床疾病治疗的主要细胞来源。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肾源干细胞的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种肾源干细胞的制备方法，包括以下步骤：

（a）使用尿液采集套装采集尿液，所述尿液采集套装包括保温箱、集尿袋、尿液保护液、采尿器及冰盒；将采尿器与集尿袋连接，先将尿液保护液倒入集尿袋，然后收集新鲜尿液；尿液收集结束后，拔掉采尿器，集尿袋密封；将冷冻好的冰盒按原位放入采集套装内，然后将装有尿液样本的集尿袋、填写完整的采集信息卡一并放入尿液采集套装中；随后运至实验室；

其中，所述尿液保护液以αMEM培养基为基础，含有10~50μg/ml 抑菌肽、100~200U/ml庆大霉素、0.1~0.5nM达沙替尼和1~10ng/ml表皮生长因子；

（b）收到尿液样本后，离心5min，弃上清，用肾源干细胞分离液重悬沉淀，静置，离心；

其中，所述肾源干细胞分离液以αMEM为基础，含有1×10^-5~9×10^-5 mol/L腺嘌呤、0.1~0.5nM达沙替尼及1~5μg/mL两性霉素B；

（c）步骤（b）离心后弃上清，加入0.5ml所述肾源干细胞培养基重悬细胞，接种至24孔板内，放置于37~38℃、5~6%二氧化碳恒温恒湿培养箱中培养，每2~3天换一次液，待细胞聚合度达到80~90%进行细胞传代；

所述肾源干细胞培养基以85~95% αMEM和5~15%血清为基础，含有5~10 μg/mL 转铁蛋白、1~10ng/ml 血管内皮生长因子、0.1~0.5nM达沙替尼、1~5μM TA-02及1~5μg/mL 两性霉素B；

细胞传代：弃掉旧的肾源干细胞培养基，加入PBS冲洗，然后加入0.25~0.3%胰酶-EDTA消化1~2min，加入2~3倍体积的所述肾源干细胞培养基终止消化后，转移至离心管内，离心，弃上清，加入PBS吹打成细胞悬液，离心，弃上清，加入所述肾源干细胞培养基重悬沉淀，吹打形成单细胞悬液；

细胞接种：根据传代接种的数量，将细胞吹打均匀后分别接种到新的培养瓶内，十字摇匀后放入37~38℃、5~6%二氧化碳恒温恒湿培养箱内培养，直到细胞融合度达到80~90%；

（d）细胞冻存：当细胞聚合度达到85~90%时，弃掉旧的肾源干细胞培养基，加入PBS冲洗，然后加入0.25~0.3%胰酶-EDTA消化1~2min，加入2~3倍体积的肾源干细胞培养基终止消化后，转移至离心管内，离心，弃上清，加入PBS吹打成细胞悬液，离心，弃上清，用肾源干细胞冷冻保护液重悬沉淀；将细胞悬液分装于冻存管内；

（e）冻存入库：对含细胞的冻存管进行保存。

下面对各步骤进行详细说明。

（a）采集尿液

尿液采集套装由保温箱、集尿袋、尿液保护液、采尿器及冰盒等构成，此套装可保证样本在采集后24-48小时内始终处于冷藏温度（2-8℃）。

所述尿液保护液以αMEM为基础，含有10~50μg/ml 抑菌肽、100~200U/ml庆大霉素、0.1~0.5nM达沙替尼和1~10ng/ml表皮生长因子（EGF）；

尿液保护液

抑菌肽含量占αMEM的典型但非限制性的例如为10、20、30、40、50μg/ml。

庆大霉素含量占αMEM典型但非限制性的例如为100、120、140、160、180、200U/ml。

达沙替尼含量占αMEM典型但非限制性的例如为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5nM。

表皮生长因子（EGF）含量占αMEM典型但非限制性的例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ng/ml。

尿液保护液的功能是在长途运输中保证样本不污染及生物活性不损失。

进一步的，步骤（a）中，每200~300mL尿液加入250mL尿液保护液，优选体积比1：1。

（b）细胞分离

所述肾源干细胞分离液以αMEM为基础，含有1×10^-5~9×10^-5 mol/L腺嘌呤、0.1~0.5nM达沙替尼及1~5μg/mL 两性霉素B；

腺嘌呤含量占αMEM的典型但非限制性的例如为1×10^-5、2×10^-5 、3×10^-5 、4×10^-5 、5×10^-5 、6×10^-5 、7×10^-5 、8×10^-5 、9×10^-5 mol/L。

两性霉素B含量占αMEM的典型但非限制性的例如为1、2、3、4、5μg/mL。

肾源干细胞分离液的作用是将尿液内肾小管来源的间充质干细胞分解游离出来，进行收集，回收细胞活率在80%-95%之间。

（c）细胞增殖

肾源干细胞培养基

转铁蛋白含量占αMEM+血清的典型但非限制性的例如为5、6、7、8、9、10 μg/mL。

血管内皮生长因子含量占αMEM+血清的典型但非限制性的例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ng/mL。

达沙替尼含量占αMEM+血清的典型但非限制性的例如为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5nM。

TA-02（p38MAPK抑制剂）含量占αMEM+血清的典型但非限制性的例如为1、2、3、4、5μM。

两性霉素B含量占αMEM+血清的典型但非限制性的例如为1、2、3、4、5μg/mL。

人体尿液形成，首先需要通过肾小球滤过作用形成原尿，然后原尿再通过肾小管重吸收作用，最终变成尿液。在肾小管重吸收过程中，部分肾小管上皮来源的间充质干细胞会自然脱落到尿液里，进而随着尿液排出到体外，故称这些细胞为肾源干细胞。我们利用特殊研制的肾源干细胞培养基，能够特异性地富集尿液里的间充质干细胞，使其不断分裂增殖。经细胞增殖实验检测，肾源干细胞平均倍增一次所需时间在16-20h之间。

（d）细胞冻存

在一种优选的实施方式中，肾源干细胞冷冻保护液的组分包括90~95%上述肾源干细胞培养基和5~10%二甲基亚砜。

冷冻保护液的目的是防止降温冻存过程中冰晶形成以避免细胞破损死亡。

（e）冻存入库

在一种优选的实施方式中，步骤（e）包括：先把含细胞的冻存管放入4~5℃ 冰箱中预冷20~30min；然后把含细胞的冻存管放入预冷的异丙醇降温盒内，转移到-70~-80℃ 超低温冰箱中，放置8~10个小时；次日将含细胞的冻存管转移至气相液氮罐内，长期保存。

细胞冻存，即“肾源干细胞程序降温法”，利用异丙醇降温盒将细胞从4℃降到-80℃仅需8.4小时，即以每6分钟降一摄氏度的速度匀速降温。干细胞冻存及复苏效率均可达90%以上。

本发明至少具有如下有益效果：

本发明从尿液来源的脱落组织内获得肾源干细胞，取材方便，不需要专业人士的帮助，从样本接收、组织接种、扩增培养及冻存入库等多个步骤，成功建立了完整高效技术体系，可以实现全流程样本的无创收集，并通过对尿液保护液、肾源干细胞分离液、肾源干细胞培养基以及冻存方法的改进，对样本损伤小、干细胞增殖能力强（平均每18小时左右扩增一倍），所制备的肾源干细胞的纯度可达99.2%。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1细胞倍增实验检测肾源干细胞扩增一倍所需要的实际时间。

图2为本发明实施例1流式细胞仪检测肾源干细胞的细胞纯度原始数据图，其中a为干细胞群，b为CD90-CD105-空白对照，c为CD90-CD34-CD105-CN73-，d为CD73+CD105+，e为CD73+CD90+，f为CD90+CD34-，g为同型对照组，h为HLA-DR-。

图3为本发明实施例1肾源干细胞分化能力测试结果，其中左侧为成骨分化结果图（100×），中间为成软骨分化结果图（100×），右侧为成脂分化结果图（100×）。

图4为本发明实施例1肾源干细胞增殖能力测试结果。

图5为本发明对比例5流式细胞仪检测肾源干细胞的细胞纯度原始数据图，其中a为干细胞群，b为CD90-CD105-空白对照，c为CD90-CD34-CD105-CN73-，d为CD90+CD105+，e为CD73+CD90+，f为CD105+CD34-，g为同型对照组，h为HLA-DR-。

图6为本发明对比例6细胞倍增实验检测肾源干细胞扩增一倍所需要的实际时间。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1

实施例1中所用的试剂组成及含量如下：

肾源干细胞培养基以95%αMEM和5%血清为基础，含有10 μg/mL 转铁蛋白、10ng/ml血管内皮生长因子、0.25nM 达沙替尼、3μM TA-02及5μg/mL 两性霉素B；

尿液保护液以αMEM为基础，含有10μg/ml 抑菌肽、150U/ml庆大霉素、0.25nM 达沙替尼和10ng/ml表皮生长因子；

肾源干细胞分离液以αMEM为基础，含有9×10^-5 mol/L腺嘌呤、0.25nM 达沙替尼及5μg/mL 两性霉素B；

肾源干细胞冷冻保护液包括90%肾源干细胞培养基和10%二甲基亚砜。

1. 尿液采集套装使用方法：

（1）冻冰和暂存尿液保护液：收到采集套装后，将冰盒放入冰箱冷冻（-18℃）保存24小时以上；尿液保护液放入冰箱冷藏（4℃）保存。余下物品和箱体室温妥善保存待用。

（2）排出陈尿，大量饮水，憋尿。

（3）采集尿液：将采尿器与集尿袋连接，先倒入将尿液保护液，然后收集新鲜尿200~300毫升；尿液收集结束后，拔掉采尿器，集尿袋密封。

（4）填写采集信息卡：详细填写个人资料和尿液采集信息。

（5）装箱：将冷冻好的冰盒按原位放入采集套装内，然后将装有尿液样本的集尿袋、填写完整的采集信息卡一并放入尿液采集套装中。

（6）交接：采集完成后由冷链物流上门接收尿液样本邮寄至细胞制备工程中心进行干细胞的制备及存储。

2.肾源干细胞存储：

（1）收到尿液样本后，1000rpm离心5min。弃上清，用肾源干细胞分离液重悬沉淀，静置10-15分钟，1000rpm离心5min。

【细胞活率测试】

活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。测试方法：将离心后的重悬的单细胞悬液与台盼蓝溶液以9:1的比例混匀，取10µl滴到细胞计数板，计数活细胞和死细胞，然后统计细胞活率：活细胞率（%）=

测试结果：细胞活率为95.06±0.76%。（如表1所示）

（2）离心后，弃上清，加入0.5ml肾源干细胞培养基重悬细胞，接种至24孔板内，然后放置37℃、5%二氧化碳恒温恒湿培养箱中培养。每两天换一次液。待细胞聚合度达到80%~90%的时候即可进行细胞传代。

（3）细胞传代：弃掉旧的细胞培养基，加入PBS冲洗两遍，然后加入0.25%胰酶-EDTA消化1~2min，加入2倍体积的培养基终止消化后，用移液管转移至离心管内，1000 rpm离心5min，弃上清，加入PBS吹打成细胞悬液，1000rpm离心5min后，弃上清液，加入适量肾源干细胞培养基重悬沉淀，吹打形成单细胞悬液。

【细胞倍增时间测试】

测试方法：

细胞传代培养后，分别取0h,2h,4h,6h,8h,10h,12h,14h,16h,18h,20h,22h, 24h,28h,36h,48h各个时间点进行细胞计数，统计分析细胞扩增一倍所需的时间。

测试结果：

如图1所示，肾源干细胞平均倍增一次所需时间为18小时。

（4）细胞接种：根据传代接种的数量，将细胞吹打均匀后分别接种到新的培养瓶内，十字摇匀后放入37℃、5%二氧化碳恒温恒湿培养箱内培养，直到细胞融合度达到80~90%。

【肾源干细胞的纯度测试】

测试方法：

细胞纯度可以通过流式细胞仪进行检测，方法是用干细胞特异性的标记分子，如CD73、CD90、CD105等，对干细胞进行染色标记，然后上机，利用流式细胞仪分析同时表达上述干细胞特异标记分子的实际细胞比例，从而得出干细胞的纯度数值。具体步骤包括：将培养中的干细胞解离消化成细胞悬液(1×10⁶/mL)，PBS洗2遍后，加入干细胞特异性标记分子CD73-APC（5μL）、CD90-FITC（5μL）、CD105-Percp（5μL）以及阴性对照CD34-PE（5μL），室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次后，加300μL PBS重悬，流式细胞仪上机检测即可。

测试结果：

经流式细胞仪检测，肾源干细胞的细胞纯度为99.2%。

流式分析原始数据如图2所示。

【肾源干细胞分化能力测试】

测试方法：

干细胞成骨分化：取 P6代肾源干细胞，以1~2×10⁶/孔接种于6孔培养板中，当细胞融合度达到50%~60%融合时，将肾源干细胞培养基更换成成骨诱导培养基，即含有10%~15%血清的 DMEM/F12培养基中加入地塞米松0.1~1µM、β-甘油磷酸钠10~20mM、抗坏血酸50~100µg/ml。每隔3d换液一次。成骨诱导3周后，4%多聚甲醛固定，用冯库萨染色鉴定成骨细胞。

干细胞成软骨分化：取 P6代肾源干细胞，以2~3×10⁵/管接种于15ml离心管中，1500rpm 离心10 min，去上清，加入成软骨诱导培养基，即DMEM/F12培养基内加入地塞米松0.1~1µM、抗坏血酸50~100µg/ml、牛血清白蛋白125~150µg/ml、转铁蛋白6.25~7.5µg/ml、丙酮酸钠1~5mM、亚油酸5.35~6.5µg/ml。每隔3d换液一次。成软骨诱导3周后，4%多聚甲醛固定软骨细胞团后冰冻切片，用阿尔法蓝染色鉴定细胞。

干细胞成脂分化：取 P6代肾源干细胞，以1~2×10⁶/孔接种于6孔培养板中，当细胞融合度达到50%~60%融合时，将肾源干细胞培养基更换成成脂诱导培养基，即含有10%~15%血清的 DMEM/F12培养基中加入地塞米松1~3µM、IBMXO 5~10mM、及吲哚美辛 100~200µM。每隔3d换液一次。成脂诱导3周后用油红O染色鉴定。

测试结果：

如图3所示，肾源干细胞具备间充质干细胞的生物特性，能够向骨、软骨及脂肪等定向分化。

（5）细胞冻存：当细胞聚合度达到85~90%时，弃掉旧的细胞培养基，加入PBS冲洗两遍，然后加入0.25%胰酶-EDTA消化1~2min，加入2倍体积的培养基终止消化后，用移液管转移至离心管内，1000 rpm离心5min，弃上清，加入PBS吹打成细胞悬液，1000rpm离心5min后，弃上清液，用肾源干细胞冷冻保护液重悬离心后的细胞沉淀。将细胞悬液按每支冻存管10⁶/1ml的规格标准分装于冻存管内。将分装后的冻存管贴上冻存细胞编码标签。

（6）冻存入库：首先把含细胞的冻存管放入4℃ 冰箱中预冷20min；然后把含细胞的冻存管放入事先预冷的异丙醇降温盒内，转移到-80℃ 超低温冰箱中，放置9个小时；次日将含细胞的冻存管转移至气相液氮罐内，长期保存。

【细胞增殖能力测试】

测试方法：

对比分析冷冻保护液（冻存液）保存后与非冷冻保护液保存后的肾源干细胞增殖能力，分别取0h,2h,6h,10h,16h,24h,48h各个时间点进行细胞计数，从而分析其体外培养过程的细胞扩增能力。如图4所示，通过实验发现，相比于采用非冷冻保护液保存的方式，用冷冻保护液保存后的肾源干细胞具备较强的增殖能力，二者差异显著。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，尿液保护液替换为：以αMEM为基础，含有20μg/ml抑菌肽、100U/ml庆大霉素、0.5nM 达沙替尼和10ng/ml表皮生长因子。

【细胞活率测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：细胞活率为92.18±0.13%。（如表1所示）

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，肾源干细胞分离液以αMEM为基础，含有5×10^-5mol/L腺嘌呤、0.1nM 达沙替尼及5μg/mL 两性霉素B。

【细胞活率测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：细胞活率为92.23±1.00%。（如表1所示）

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，尿液保护液替换为：以αMEM为基础，含有10μg/ml 抑菌肽、100U/ml庆大霉素和10ng/ml表皮生长因子。

【细胞活率测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：细胞活率为56.88±0.83%。（如表1所示）

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，尿液保护液替换为：以αMEM为基础，含有10μg/ml抑菌肽、100U/ml庆大霉素、0.01nM 达沙替尼和5ng/ml表皮生长因子。

【细胞活率测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：细胞活率为71.52±1.65%。（如表1所示）

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，肾源干细胞分离液以αMEM为基础，含有9×10^-5mol/L腺嘌呤及5μg/mL 两性霉素B。

【细胞活率测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：细胞活率为61.62±0.78%。（如表1所示）

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于，肾源干细胞分离液以αMEM为基础，含有9×10^-5mol/L腺嘌呤、0.01nM 达沙替尼及5μg/mL 两性霉素B。

【细胞活率测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：细胞活率为75.43±1.63%。（如表1所示）

对比例5

本对比例与实施例1的区别在于，肾源干细胞培养基以95%αMEM和5%血清为基础，含有10 μg/mL 转铁蛋白、10ng/ml 血管内皮生长因子及5μg/mL 两性霉素B。

【细胞纯度测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：

经流式细胞仪检测，肾源干细胞的细胞纯度为9.07%。

流式分析原始数据如图5所示。

对比例6

本对比例与实施例1的区别在于，肾源干细胞培养基以95%αMEM和5%血清为基础，含有10μg/mL 转铁蛋白、10ng/ml 血管内皮生长因子、0.01nM 达沙替尼及5μg/mL 两性霉素B。

【细胞倍增时间测试】

测试方法同实施例1；

测试结果：

如图6所示，肾源干细胞平均倍增一次所需时间为28小时。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种肾源干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)使用尿液采集套装采集尿液，所述尿液采集套装包括保温箱、集尿袋、尿液保护液、采尿器及冰盒；将采尿器与集尿袋连接，先将尿液保护液倒入集尿袋，然后收集新鲜尿液；尿液收集结束后，拔掉采尿器，集尿袋密封；将冷冻好的冰盒按原位放入采集套装内，然后将装有尿液样本的集尿袋、填写完整的采集信息卡一并放入尿液采集套装中；随后运至实验室；

其中，所述尿液保护液以αMEM培养基为基础，含有10～50μg/ml抑菌肽、100～200U/ml庆大霉素、0.1～0.5nM达沙替尼和1～10ng/ml表皮生长因子；

(b)收到尿液样本后，离心5min，弃上清，用肾源干细胞分离液重悬沉淀，静置，离心；

其中，所述肾源干细胞分离液以αMEM培养基为基础，含有1×10^-5～9×10^-5mol/L腺嘌呤、0.1～0.5nM达沙替尼及1～5μg/mL两性霉素B；

(c)步骤(b)离心后弃上清，加入肾源干细胞培养基重悬细胞，接种至24孔板内，放置于37～38℃、5～6％二氧化碳恒温恒湿培养箱中培养，每2～3天换一次液，待细胞聚合度达到80～90％进行细胞传代；

所述肾源干细胞培养基以85～95％αMEM培养基和5～15％血清为基础，含有5～10μg/mL转铁蛋白、1～10ng/ml血管内皮生长因子、0.1～0.5nM达沙替尼、1～5μM TA-02及1～5μg/mL两性霉素B；

细胞传代：弃掉旧的肾源干细胞培养基，加入PBS冲洗，然后加入0.25～0.3wt％胰酶-EDTA消化1～2min，加入2～3倍相对于胰酶-EDTA体积的所述肾源干细胞培养基终止消化后，转移至离心管内，离心，弃上清，加入PBS吹打成细胞悬液，离心，弃上清，加入所述肾源干细胞培养基重悬沉淀，吹打形成单细胞悬液；

细胞接种：根据传代接种的数量，将细胞吹打均匀后分别接种到新的培养瓶内，十字摇匀后放入37～38℃、5～6％二氧化碳恒温恒湿培养箱内培养，直到细胞融合度达到80～90％；

(d)细胞冻存：当细胞聚合度达到85～90％时，弃掉旧的肾源干细胞培养基，加入PBS冲洗，然后加入0.25～0.3％胰酶-EDTA消化1～2min，加入2～3倍体积的肾源干细胞培养基终止消化后，转移至离心管内，离心，弃上清，加入PBS吹打成细胞悬液，离心，弃上清，用肾源干细胞冷冻保护液重悬沉淀；将细胞悬液分装于冻存管内；

(e)冻存入库：对含细胞的冻存管进行保存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述尿液保护液以αMEM培养基为基础，含有10μg/ml抑菌肽、150U/ml庆大霉素、0.25nM达沙替尼和10ng/ml表皮生长因子；

所述肾源干细胞培养基以95％αMEM培养基和5％血清为基础，含有10μg/mL转铁蛋白、10ng/ml血管内皮生长因子、0.25nM达沙替尼、3μMTA-02及5μg/mL两性霉素B；

所述肾源干细胞分离液以αMEM培养基为基础，含有9×10^-5mol/L腺嘌呤、0.25nM达沙替尼及5μg/mL两性霉素B。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肾源干细胞冷冻保护液包括90～95％所述肾源干细胞培养基和5～10％二甲基亚砜。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述肾源干细胞冷冻保护液包括90％所述肾源干细胞培养基和10％二甲基亚砜。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)包括：先把含细胞的冻存管放入4～5℃冰箱中预冷20～30min；然后把含细胞的冻存管放入预冷的异丙醇降温盒内，转移到-70～-80℃超低温冰箱中，放置8～10个小时；次日将含细胞的冻存管转移至气相液氮罐内，长期保存。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，每200～300mL尿液加入250mL尿液保护液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，尿液和尿液保护液的体积比为1：1。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，肾源干细胞分离液的加入体积量与尿液和尿液保护液总体积量之比为1：1。