WO2007136044A1

WO2007136044A1 - ステロイド産生細胞

Info

Publication number: WO2007136044A1
Application number: PCT/JP2007/060394
Authority: WO
Inventors: Shigeki Gondo; Toshihiko Yanase; Taijirou Okabe; Hajime Nawata; Tomoko Tanaka; Hidetaka Morinaga
Original assignee: Kyushu University, National University Corporation
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2007-11-29

Abstract

【課題】　移植等によりステロイドホルモン欠損症等のステロイドホルモン分泌異常の治療に利用できる新規ステロイド産生細胞を提供する。【解決手段】　脂肪由来間葉系幹細胞中に、ステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子を導入することにより前記細胞から分化させたことを特徴とするステロイド産生細胞が提供される。また、当該ステロイド産生細胞の製造方法、使用、その細胞から分泌されたホルモンを用いた薬剤組成物、その細胞を用いた様々な疾患に対する治療方法が提供される。

Description

明細書

ステロイド産生細胞

技術分野

[0001] 本発明はステロイド産生細胞の生成に関するものであり、より具体的には、それにより生成された新規ステロイド産生細胞、その製造方法に関するものである。またこの発明は、そのようにして生産された細胞の使用にも関するものである。

背景技術

[0002] ヒトを含む哺乳動物の主要なステロイドホルモン産生組織は、副腎と生殖腺であり、これらで産生されるステロイドホルモンは、生体維持に非常に重要な役割を果たすことが知られている。生体内におけるステロイドホルモンの産生が不足すると、ブドウ糖の調節維持、 Na'Kバランスの調節、タンパク質の合成促進、炎症反応'免疫応答の制御、性的発達、生殖機能等が低下する。このステロイドホルモンが様々な理由により欠落、低下した場合、「ステロイドホルモン欠損症」と呼ばれる病態が引き起こされる

[0003] このステロイドホルモン欠損症の一つに副腎皮質機能不全がある。この副腎皮質機能不全は、副腎ステロイドホルモンの欠落のために起こるものであり、具体的な症状としては、ストレス対応ホルモンである糖質コルチコイドのコルチゾールの分泌欠落のために全身倦怠感が非常に強くなり、医学的な所見として低血圧、低血糖、低 Na血症、高 K血症、色素沈着などが見られることがある。副腎ステロイドホルモンの絶対的不足や、感染などのストレスを契機に必要量が急増することにより、最悪の場合、急性副腎不全となり死に至る場合がある。副腎皮質機能不全症では多くの場合鉱質コルチコイドホルモンであるアルドステロンの分泌も悪いため、低 Na血症、高 K血症がさらに助長される。

[0004] 他のステロイドホルモン欠損症としては、性腺機能不全が挙げられる。性腺機能不全は、様々な病因、例えば遺伝的要因、腫瘍、炎症、手術、放射線照射などによつて性腺 (男性であれば睾丸、女性であれば卵巣)力の性腺ステロイドホルモンの分泌が低下する病態を指す。基本的には命を左右する問題ではないが、 10〜20代といった若い人に生じた場合、二次性徴が障害され「男らしさ'女らしさ」の欠如カもコンプレックスの問題が生じる可能性がある。またこれと同時に、将来の生殖能力に影響を及ぼす問題となり得る。またこのような生殖系への影響だけでなぐ性腺系ホルモンが長期間欠落することによって、骨粗鬆症や動脈硬化を起こしやすくなるという問題もある。

[0005] これらステロイドホルモン欠損症に対する現在の治療法としてステロイドホルモン補充療法が確立されており、例えば非特許文献 1に記載されて、るように多くの利益を供与している。しかし特に副腎皮質機能不全の場合、一生涯補充を継続する必要がある。一般的には糖質コルチコイドが補充されるが、それだけでは電解質失調が是正されない場合、鉱質コルチコイドも追加される。患者によってはそれのみでは定量内服投与となり、感染症などでステロイド必要量が急増した場合などの対応が難しぐまたステロイド過剰が続けば様々な副作用の可能性がある。

[0006] これらの問題を解決するために、新たな治療法の開発が求められて、る。その治療法候補の 1つは再生医療技術を用いたものであるが、副腎や性腺の領域では現在のところ、再生医療として実際の臨床の場で実用化されているものは皆無である。しかし、これらの器官における発生 ·分化機構は急速に解明されつつあり、また、これらの組織における遺伝子治療の試みや再生研究が少しずつ報告されてきている。

[0007] 例えば、非特許文献 2には胚性幹細胞 (ES細胞）〖こステロイド合成酵素の普遍的転写調節因子である SF— 1 (Steroidogeni factor- 1)タンパク質を恒常的に発現させることによりステロイド産生能を獲得し、 cAMP及びレチノイン酸依存性に P45 Osccが誘導され、プロゲステロンを産生することが記載されている。しかし、そのステロイド産生能はプロゲステロンのみに留まり、またミトコンドリア外膜透過性外来基質である 20 α— hydroxycholesterolの添カ卩を必要としたことから、 de novoのステロイド合成ではなかった。

[0008] また、再生医療を目的に ES細胞を使用することには倫理的な問題がある。さらに、 ES細胞を移植した場合奇形腫などの発ガン性が高ぐ免疫学的に拒絶反応が予想されるため、臨床の場で実用化することは困難であると考えられる。

[0009] そこで最近、注目魏めて、るのが体性幹細胞である。体性幹細胞とは、組織を新しく作り直す (組織再生)ために機能してヽる未分化な (特定の形質を発現して!/ヽない）細胞を指し、元来、存在する組織の細胞にのみ分化すると考えられてきた。し力し、近年の研究で体性幹細胞は由来組織以外の細胞にも分ィ匕しうることが報告されている。

[0010」非特 s午文献 1 :Laureti, S. , Falorni, A. , and Santeusanio, F. Improveme nt of treatment of primary adrenal insufficiency by administration of cortisone acetate in three daily doses.〃J Endocrinol Invest. 20 03 (11) : 1071~1075.

非特許文献 2 : CRAWFORD PA et al. "Nuclear Receptor Steroidogenic Factor 1 Directs Embryonic Stem Cells toward the Steroidogenic Lineage. " Mol Cell Biol. , 1997, Vol. 17, No7, p. 3997—4006.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、ステロイドホルモン欠損症等のステロイドホルモン分泌異常の治療に利用できる体性幹細胞由来のステロイド産生細胞を提供することを目的とするものであり、具体的には、生理的に多様なステロイドホルモンを分泌できるステロイド産生細胞、その製造方法とその使用、その細胞力も分泌されたホルモンを用いた薬剤組成物をその目的とするものである。

課題を解決するための手段

[0012] 脂肪由来間葉系幹細胞 (adipose derived stem cell: ASC)は、脂肪組織中に含まれる体性幹細胞であり、いわゆる間葉系幹細胞に属すると考えられている。 A SCは多分化能を有することが知られており、組織中に大量に存在する。さらに、他の間葉系幹細胞 (特に骨髄由来間葉系幹細胞)を採取する場合と比較して採取が容易であり、採取者への侵襲度が低い等のメリットが考えられるため、再生医療の分野で近年注目を集めている。脂肪幹細胞は、脂肪、軟骨、骨、骨格筋、心筋、腱、神経、血管などへ分ィ匕誘導できる可能性が示されているが、本発明以前には脂肪由来間葉系幹細胞がステロイド産生細胞に分ィ匕することは知られて、な力つた。しかし本発明者らは、脂肪間葉系幹細胞が副腎皮質 ·性腺と同じく間葉系細胞である筋や脂肪等に分ィ匕できることに着目し、脂肪間葉系幹細胞からステロイド産生細胞を分化させるという新しい知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、ステロイド産生細胞の生成に成功したものである。

[0013] すなわち、本発明の第 1の主要な観点によれば、脂肪由来間葉系幹細胞にステロイド合成酵素の転写調節因子を導入することで前記脂肪由来間葉系幹細胞力分ィ匕させたことを特徴とするステロイド産生細胞が提供される。

[0014] このような構成によれば、移植等によりステロイドホルモン欠損症等のステロイドホルモン分泌異常の治療に利用できる新規ステロイドホルモン産生細胞を得ることができる。

[0015] ここで、前記脂肪幹細胞は、これに限定されるものではないが、内臓脂肪糸且織由来の脂肪幹細胞である。

[0016] 前記ステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子は、これに限定されるものではないが、 Steroidogenic factor 1 (SF—l)タンパク質である。

[0017] 本発明の 1実施形態によれば、前記ステロイド産生細胞において産生されるステロイドホルモンは、プレダネノロン、プロゲステロン、デォキシコルチコステロン、コルチコステロン、アルドステロン、 17 α—OH プレダネノロン、 17 α—OH プロゲステロン、 11ーデォキシコルチゾール、コルチゾール、 DHEA、アンドロステンジオン、テストステロン、エストロン、エストラジオールから成るステロイドホルモンのうち 1若しくはそれ以上である。

[0018] このようなステロイド産生細胞を臨床で応用するためには、副腎ステロイドのみ、若しくは性腺ステロイドのみをそれぞれ分泌するステロイド産生細胞が必要とされる。なぜなら、性腺ステロイドのみが必要な患者の場合、移植細胞により性腺ステロイドが適切に補われたとしても、同時に副腎ステロイドも多量に分泌されるならば、副腎ステロイド過剰による様々な合併症を発症するため使用が困難と考えられるからである。また、逆もまた同様に使用困難と考えられる。しかしそのようなステロイド産生細胞は現在のところ開発されて!ヽな、。

[0019] これに対し、本発明の 1実施形態によれば、前記脂肪由来間葉系幹細胞は、 SF- 1タンパク質の発現強度を調節すること、例えば SF— 1遺伝子を組み込んだウィルスベクターを含むウィルスの感染価（MOI : Multiplicity of infection)を増加させることにより分ィ匕誘導されるステロイド産生細胞を選択することが可能となるものである。

[0020] さらに、別の 1実施形態によれば、前記脂肪由来間葉系幹細胞は、 SF— 1タンパク質を過剰発現させること、副腎系ステロイド産生細胞を分化誘導することが可能となるものである。すなわち、本発明の脂肪由来間葉系幹細胞は、ステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子、特に SF— lZAd4BPの発現が強いほど本発明の脂肪由来間葉系幹細胞は副腎系ステロイド産生傾向が強まるものである。

[0021] また、本発明の別の実施形態によれば、本発明のステロイド産生細胞は、レチノィン酸含有培地で培養することによって、副腎系ステロイドを産生する傾向が更に強まるものである。

[0022] このような構成によれば、レチノイン酸を添加することによって生体内において本発明のステロイド産生細胞力産生されるステロイドのプロファイルを変更し、副腎系ステロイドを産生するように調節することができる、すなわちステロイド分泌傾向を調製することが可能となり、副作用が少なく患者の症状に合わせて使用することができる。

[0023] また、本発明の第 2の主要な観点によれば、 (a)内臓脂肪組織より脂肪由来間葉系幹細胞を単離する工程と、 (b)前記脂肪由来間葉系幹細胞を長期培養する工程と、 (c)前記長期培養脂肪由来間葉系幹細胞に、ステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子を導入する工程とを有することを特徴とする、ステロイド産生細胞の生成方法が提供される。このことで、治療に有効な多様なステロイドホルモンを分泌できるステロイド産生細胞を製造することが可能になる。

[0024] 本発明の 1実施形態によれば、前記方法はさらに、（e)前記脂肪由来間葉系幹細胞の SF— 1タンパク質の発現強度を調節する工程を有し、分化誘導されるステロイド産生細胞を選択することが可能となることを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法である。

[0025] 本発明の好ましい実施形態によれば、前記方法はさらに、（f)前記ステロイド産生細胞をレチノイン酸含有培地で培養する工程をさらに有し、副腎系ステロイド産生細胞に分化誘導することを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法である。

[0026] 本発明の第 3の主要な観点によれば、前記ステロイド産生細胞力分泌された生理的に多様なステロイドホルモンと、薬学的に許容される担体からなる薬剤組成物が提供される。このようにして得られた薬剤組成物によれば、ステロイドホルモン欠損症等のステロイドホルモン分泌異常、各種自己免患などを有効に治療することが可能になる。

[0027] この発明の更なる特徴及び顕著な効果は、次に記載する発明の実施の形態の項にある記載から当業者にとって明らかになるものである。

発明を実施するための最良の形態

[0028] 以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。

[0029] m^^ ^ M ,

脂肪由来間葉系幹細胞 (adipose derived stem cell: ASC)は、脂肪組織中に含まれる体性幹細胞であり、いわゆる間葉系幹細胞に属すると考えられている。 A SCは多分化能を有することが知られており、組織中に大量に存在する。さらに、他の間葉系幹細胞 (特に骨髄由来間葉系幹細胞)を採取する場合と比較して採取が容易であり、採取者への侵襲度が低い等のメリットが考えられるため、再生医療の分野で近年注目を集めている。脂肪幹細胞は、脂肪、軟骨、骨、骨格筋、心筋、腱、神経、血管などへ分ィ匕誘導できる可能性が示されて、る。

[0030] ここで、脂肪由来間葉系幹細胞は、ステロイド産生細胞に分ィ匕できるものであれば良ぐ人やマウス等の哺乳類に限定されるものではない。また前記細胞の採取方法は、公知の方法でよい。

[0031] ステロイド合成酵素の転写調節闵子の導入

脂肪由来間葉系幹細胞をステロイド産生細胞に分化させるには、ステロイド合成酵素の転写調節因子を導入してステロイドホルモンを合成させる必要があると考えられる。

[0032] ここで、ステロイドホルモン合成酵素の組織特異的転写因子である SF— 1タンパク質、別名 adrenal 4 binding protein (Ad4BP)は、ステロイド合成及び副腎 '性腺分ィ匕に必須の核内レセプタースーパーファミリーに属し、多くのステロイド産生遺伝子に関与すると報告されている。この SF— 1遺伝子のノックアウトマウスにおいて副腎と性腺の完全な欠如が観察されたため、 SF— 1タンパク質はステロイド産生及びステロイド産生組織成長に特に重要であると考えられている。

[0033] 本発明者らは SF— 1遺伝子の脂肪由来間葉系幹細胞への導入によりステロイド産生細胞が生成されるかを検証するために、ゥシ SF— 1遺伝子を有するアデノウイルス (Adx-bSF- 1)を作成し、マウス由来の脂肪由来間葉系幹細胞に Adx— bSF— 1 を感染させると、著明な量の多様なステロイドが産生されることを明らかにした。

[0034] ただし、本発明においては、前記転写調節因子は、 Steroidogenic factor 1 (S F- l)に限定されるものではなぐ前記細胞中でステロイドホルモン合成酵素の転写を調節するために必要である因子であればょ、。

[0035] また、本発明において脂肪由来間葉系幹細胞中で目的遺伝子を導入 ·強制発現させる方法としては、本発明の 1実施例に従うと、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター、 HIVベクタ一などのベクターを用いて行われる。し力し、このようなウィルス由来などのベクターを用いた方法だけでなぐエレクト口ポレーシヨン、タンパク質直接導入法などの公知技術を用いて行われ得るものである。

[0036] 亲斤親ステロイド、糸田胞、その ^及びその

本発明の新規ステロイド産生細胞によれば、プレダネノロン、プロゲステロン、デォキシコルチコステロン、コルチコステロン、アルドステロン、 17 α— ΟΗ プレダネノロン、 17 α— ΟΗ プロゲステロン、 11—デォキシコルチゾール、コルチゾール、 DHE Α、アンドロステンジオン、テストステロン、エストロン、エストラジオールから成るステロイドホルモンの少なくとも 1以上が産生される。

[0037] 本発明の好ま、実施形態によれば、前記ステロイド産生細胞にぉ、て産生されるステロイドホルモンは、特に副腎系ステロイドであり、これはこれに限定されるものではないが、デォキシコルチコステロン、コルチコステロン、アルドステロン、 11ーデォキシコルチゾール、コルチゾールから成るステロイドホルモンのうち 1つ若しくはそれ以上を含むものである。

[0038] 本発明者らは、導入されたステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子の感染効率 (ΜΟΙ)がステロイド産生能にどのような影響を及ぼす力検討した。実験の結果、前記脂肪由来間葉系幹細胞においてステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子、特に SF— lZAd4BPの発現が強いほど本発明のステロイド産生細胞は副腎系ステロイド産生傾向が強まることを見出した。この点においても本発明で得られたステロイド産生細胞は有益であると考えられる。例えば、副腎ステロイドのみが必要な患者の場合、移植細胞により副腎ステロイドが適切に補われたとしても、同時に性腺ステロイドも多量に分泌されるならば、性腺ステロイド過剰による様々な合併症を発症するため使用が困難と考えられるため、副腎ステロイドを有意に分泌するステロイド産生細胞が臨床の現場では必要となるからである。

[0039] 本発明者らはさらに、本新規ステロイド産生細胞が培養条件によってどのような影響を受けるかを検討した。実験の結果、前記ステロイド産生細胞は、レチノイン酸含有培地で培養することにより、副腎系ステロイドの産生傾向が更に強まることを明らかにした。この点においても本発明で得られたステロイド産生細胞は上述と同様の理由で有益であると考えられる。また、従来技術として、レチノイン酸が副腎ホルモン (コルチコステロン)産生を誘導することは知られて、たが、ステロイド産生プロファイルに影響を及ぼすことは知られていなカゝつた。これに対し本発明によると、レチノイン酸を添加することによって生体内において本発明のステロイド産生細胞力産生されるステロイドのプロファイルを変更し、副腎系ステロイドを産生するように調節することができる、すなわちステロイド分泌傾向を調製することが可能となり、副作用が少なく患者の症状に合わせて使用することができる。

[0040] また本発明で得られたステロイド産生細胞は、移植した場合、生体内でステロイドを移植局所高濃度に分泌できると推測される。すなわち必要な部位で必要なだけステロイドが分泌され、なおかつ全身的にステロイド過剰にならないので、重大な副作用を起こすことがな、と考えられる。

[0041] 以上の知見に基づくと、本発明で得られたステロイド産生細胞を自己細胞移植などの手段を用、て使用することにより、ステロイドホルモン欠損症等のステロイドホルモン分泌異常へのステロイド細胞移植、アレルギー Z自己免疫疾患治療、移植臓器の拒絶予防などへの応用といった新しい治療法を提供すると考えられる。すなわち、本発明によれば、上記新規ステロイド産生細胞を生体内の目的箇所に移植することによるステロイドホルモン欠損症等のステロイドホルモン分泌異常、自己免疫疾患、移植臓器の拒絶予防等の治療方法が提供される。

[0042] さらに、各組織由来間葉系幹細胞の相違が検討されつつあるが、本発明で使用された方法等を用いて SF— 1遺伝子を導入したステロイドプロファイルの検討はその一手段として有用であると推測される。

[0043] 次に、以下の実施例において本発明に係る新規ステロイド産生細胞の生成の一例を説明する。

実施例 1

[0044] 本発明者らは SF— 1遺伝子の脂肪由来間葉系幹細胞への導入によりステロイド産生細胞が生成されるかを検証するために、まず、ゥシ SF— 1を有するアデノウイルス（ Adx— bSF— 1)を作成し、長期培養脂肪由来間葉系幹細胞に Adx— bSF— 1を感染させた。また、同一個体由来の間葉系幹細胞でも由来組織が異なることによってどのような影響があるの力検討するために、間葉系幹細胞の 1つである骨髄由来間葉系幹細胞を同条件で培養 ·感染させ、比較した。本発明者らは、 SF— lZAd4BPの強制発現により、マウス初代培養骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs)が ACTH依存性に各種ステロイドを産生する細胞に形質転換されることを以前明らかにしていた (G enes to cells. 2004)。実験の結果、脂肪由来間葉系幹細胞力も著明な量の多様なステロイドが産生され、ステロイド産生細胞が生成されたことを明らかにした。以下、この検証工程を詳しく説明する。

[0045] (1)実験方法と材料

SF- 1遣伝子を含むアデノウイルスベクターの作製

Adenovirus Expression Vector Kit (Takara、 Osaka、 Japan) 用いてヒト型 5—アデノウイルスベクターから由来したリコンビナント (組換え)ベクターを作製した。

[0046] ゥシ SF—lZAd4BP cDNA (岡崎国立共同研究機構基礎生物学研究所、諸橋憲一郎教授より分与）を BamHI及び EcoRI消化し、 CAGプロモーターを有するリコンビナントコスミドベクター pAxCAwt (Takara)の Swalサイトに挿入した。前記リコンビナントウシ SF— 1アデノウイルスベクター（Adx— bSF— 1)は Miyakeら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 132, 1996参照）の報告【こ基づ!/ヽた製造方法【こ従!ヽ作製した。

[0047] 陰性対照として、 j8—ガラクトシダーゼ遺伝子のみを移入するアデノウイルスベクタ一を構築した。このベクターを Adx— LacZとした。

[0048] マウス ¾1ィ弋焙着)！旨 fl方 ώ 糸田 (mASCs) びマウス ¾1ィ弋焙着^^ tfe

^ m (mBMCs)の調整

4ヶ月齢の雄 B6マウス 1匹より、 V、くつかの調整を加えた従来技術（24)を用いて上記両細胞を培養した。簡潔には、内臓脂肪をコラゲナーゼ処理によりバラバラにし、付着細胞を培養液 Aで長期培養することによって脂肪由来間葉系幹細胞を調製した。また、マウス大腿骨から前記骨髄由来間葉系幹細胞を培養液中に流し出し、付着細胞を培養液 Aで長期培養することによって骨髄由来間葉系幹細胞を調整した。培養液 Aは、 2mML—グルタミン、 lOOU/mlペニシリン、 100

シン、 0. 0125 /z g/mlアンホテリシン B (Sigma— aldrich、 Irvine, UK)、 10— 7 Mヒドロコルチゾン (Nikkenkayaku, Japan)及び 20%ゥマ血清（Sigma)を含有する a MEMを含む。培養は 33° C、 5% COの下で行われ、培養期間は 120

2 〜1

80日間 (継代数 12〜18)であった。これらの細胞集団から 1X10⁴細胞を GIT培地（和光純薬、 Japan)を用いて 12wellコラーゲンコーティングプレート（IWAKI、 Japan )に播種した。細胞付着を確認した後、リコンビナントアデノウイルス (Adx— bSFl)を感染させ SF—1タンパク質を強制発現した。全ての実験の対照として、 β—ガラタトシダーゼを発現するリコンビナントアデノウイルス (Adx-LacZ)を前記両細胞に感染した。

[0049] 前記 mBMCs及び mASCsから分泌された培着液中のステロイド含有量の測定

培養液中に分泌された以下のホルモン：プロゲステロン（P4)、デォキシコルチコステロン（DOC)、コルチコステロン（Β)、 17 α ヒドロキシプロゲステロン（17 α— OH P4)、 11 デォキシコルチゾール（S)、デヒドロェピアンドロステロン（DHEA)、 Δ 4 —アンドロステンジオン（Δ 4— A)、及びテストステロン (T)の含有量を、市販の RIA kit (Diagnostic Products Corp.、 LA)を用いて SRL Co. Ltd. (Tokyo, Ja pan)と共同研究で測定した (各特異的な RIAシステムは SRLによって開発された)。培養液中への前記 P4及び DOCの分泌量は、合成 1 24ACTH (Shionogi Co. 、 Osaka、 Japan)の存在下 Z非存在下でも確認された。 DOC、 Β、 17 α— OHP4、 S、 DHEA、 Δ 4— A、及び Tのそれぞれの検出限界は、 0. lng/ml、 0. 02ng/m 1、 20. Ong/ml、 0. lng/ml, 0. 04ngZml、 0. 2ng/ml, 0. lng/mU及び 0 . 05ngZml以下である。

[0050] リアルタイム PCR定量

StAR、 ACTH受容体 (ACTH— R)、及び P450scc、 P450cl7、 P450C11、 P4 50C21、 P450ald、 3 j8— HSD、及び 17 j8—HSDタイプ 3を含む様々なステロイド産生酵素の定量分析を LightCycler (Poche Diagnostics GmbH、 Mannheim 、 Germany)を用いたリアルタイム PCRによって行った。前記培養 mASCs、 mBMC s及び Y—l細胞からは RNasy mini kit (Qiagen)を用いて、及びマウス精巣、畐 ij ^ り i3Jsogen(Wako Pure し hemical Industries、 usaka、 Japanノ用ヽて総 RNAを単離した。テンプレートとして 5 μ gの総 RNAを用いて第一鎖（First—stra nd)相補 DNAを合成し、製造取扱説明書に従って LightCyclerにお、て PCRを実行した。用いたセンス/アンチセンスプライマーは Mukaiらによって報告されたもので (Conditionally immortalized adrenocortical cell lines at undiffe rentiated states exhibit inducible Expression of glucocorticoid— synt hesizing genes ; Eur. J. Biochem. 269, 69〜81, 2002)。 PCR条件は要望に応じて利用できる。 LightCycler Software Ver. 3. 5で決定された蛍光強度が増幅の幾何学位相にある時に、閾値が測定された。産物は 2%ァガロースゲルに供された。各 PCR産物のヌクレオチド配列を適切なプライマーを用いてダイレクトシークエンスで確認した。前記 mRNAの相対的な発現レベルは、それらの |8—ァクチンに対して、及び対照であるマウス副腎皮質性 Y— 1細胞、若しくはマウス精巣若しくは副腎に対するその割合で較正された。

[0051] 腿

1 factor (l因子) ANOVA (分散分析）が統計評価のために用いられた。 P〈0. 0 5は統計的に有意であるとみなされた。

[0052] (2)実験結果

マウス ¾1ィ弋焙着方 ώ 纏びにマウス ¾1ィ弋焙着^^ tfe 細胞への Adx— bSF— 1の感染

(l) mASCs及び mBMCsから分泌された培養液中のステロイド含有量の測定本発明者らは SF— 1遺伝子の脂肪幹細胞への導入によりステロイド産生細胞が生成されるかを検証するために、上記の方法を用いてゥシ SF— 1遺伝子を有するアデノウィルス (Adx— bSF— 1)を作成した。実験の結果、本発明者らは長期培養脂肪由来間葉系幹細胞並びに骨髄由来間葉系幹細胞に Adx— bSF—1を感染させると、多様なステロイドが産生されることを明らかにした。

[0053] マウスの長期培養脂肪幹細胞並びに骨髄由来間葉系幹細胞に Adx— bSF— 1若しくは対照として Adx— LacZを感染させ、 14日間培養した。その後 4日間培養した培養液中のステロイド量を測定した。この結果を図 1に示す。

[0054] それぞれ B16マウスからの mASCsの培養液中へのプロゲステロン（P4)、デォキシコルチコステロン（DOC)、及びテストステロン (T)、コルチコステロン（B)の基礎分泌量を示している。図中の値は平均値士 SD (n= 3)で示された。 S、及び Lはそれぞれ Adx— bSF— 1タンパク質で形質移入された mASCs、及び Adx— LacZで形質移入された mASCsを示す。図 Xに示すように、 Adx— bSF—1タンパク質感染 mASCs は著明な量のプロゲステロン（P4)、コルチコステロン（B)、及びテストステロン (T)を生成した力 Adx— LacZ感染細胞は生成しなかった。

[0055] また、対照細胞である Adx— bSF—1タンパク質感染 mBMCsでも著明な量のプロゲステロン（P4)、コルチコステロン（B)、及びテストステロン (T)を産生したが、 Adx LacZ感染細胞は生成しなかった。

[0056] コルチコステロン、テストステロンは各々副腎ステロイド、性腺ステロイドを代表しており、また、両者が分泌していれば、ステロイドマップから、少なくともプレダネノロン、プロゲステロン、デォキシコルチコステロン、 17 α— OH プレダネノロン、 17 α—Ο Η プロゲステロン、 DHEA、アンドロステンジオンは分泌していると考えてよい。

[0057] なお、図 1では mASCsでコルチコステロン（B)が分泌されていないが、以降の実験では mASCsにお!/、てコルチコステロンの分泌が確認されて!、る。図 1の実験におヽて、条件検討を含む予備的な実験であったため MOIが低く副腎皮質ホルモンの分泌量が感度以下だったと示唆された。 [0058] 以上の結果より、 SF— lZAd4BPは脂肪由来間葉系幹細胞も、骨髄由来間葉系幹細胞と同じようにステロイド産生細胞に形質転換することが明らかとなった。

[0059] tft言 PJ旨! I方糸田びに^^ tfe 糸田における Adx— bSF— 1 現.のステロイドホルモン合成酵素への影響

(1)RT— PCRによる測定 (mRNA発現に対する効果）

次に、上記実験で用いられた細胞の Real— time reverse transcriptase— pol ymerase chain reaction (RT— PCR)を? Tつた。

[0060] また、本実験ではより厳密に比較するため、一匹のマウス個体力も mBMCsと mAS Csを同条件で作成し、 StAR、 P450scc, 3 j8 -HSD, P450cl l, P450cl7, 17 β— HSDタイプ 3及び ACTH— Rのリアルタイム PCRの行い、解析した。

[0061] 実験の結果より、 mASCsは、 St AR及び全てのステロイド合成酵素が発現していた。図 2はその結果の一部を記載したものである。（副腎'性腺ステロイドを分泌しているとヽぅ上述の実験結果より、 P450cl7、 17 j8 -HSD, P450c21及び P450cl l以外のデータは明示せず。）。

[0062] 図 2の比較実験の結果より、同程度の SF— lZAd4BP発現状況において、脂肪由来間葉系幹細胞は骨髄由来間葉系幹細胞の場合よりも P450c21及び CP45011 の発現が強いため、副腎系のステロイド産生傾向が強いと示唆された。

[0063] H旨) 1方曰 H 細q びに曰 H 細qにする SF_ iタンパク皙のの

本発明者らは、本発明のステロイド産生細胞が SF— 1タンパク質の発現強度を変えることによってどのような影響を受けるか検討するために、マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞 (mASCs)及びマウス初代培養骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs )ゥシ SF— 1タンパク質発現ウィルスを異なる発現強度で感染させ、 dayl4〜18に培養した培地のホルモンを測定した。 MOIが高いほど、多くのウィルスが細胞に感染しており、その結果、 SF—1タンパク質の発現も強くなる。副腎ステロイドを代表しコルチコステロン、性腺ステロイドを代表しテストステロンを測定した。コルチコステロン/ テストステロン値が高いほど副腎ステロイド産生傾向が強ぐ値が低いほど性腺ステロイド産生傾向が強いと考えられる。 [0064] この実験の結果を図 3に示した。図 3より、 SF— lZAd4BPの発現が強いほど、脂肪由来間葉系幹細胞は副腎系のステロイド産生傾向が強まる (右)が、骨髄由来間葉系幹細胞は性腺系のステロイド産生傾向が強まる (左)。

[0065] 以上の実験結果より、本発明のステロイド産生細胞は、 SF- 1タンパク質の発現強度を調節することにより異なるステロイド産生細胞を分ィ匕誘導することが可能となることが示された。

[0066] 脂肪由間葉系榦細胞の副腎皮皙ホルモン刺激ホルモン (ACTH)反件

本発明者らは、本発明のステロイド産生細胞の特性を検討することを目的に、次に本発明のステロイド産生細胞の ACTH反応性を測定した。なお、上述のステロイドホルモン合成酵素への影響を RT—PCRによって検討した実験において、本発明のステロイド産生細胞は ACTH— Rの発現が確認されている（データは示さず)。

[0067] マウス脂肪間葉系幹細胞に Adx— bSFlを MOI50で感染後、 ACTH (2. 4 μ Μ) で DayO、 4、 7、 10、 14と刺激し、 Dayl4〜18の培地のコルチコステロン濃度を測定した。対照として、 Adx— LacZで感染した脂肪由来間葉系幹細胞を用いた。

[0068] 図 4はその結果を示したグラフである。実験の結果より、 ACTHは、 Axd—LacZ感染細胞と比較して、 Adx— SF1感染脂肪由来間葉系幹細胞においてコルチコステロンを有意に産生した。

[0069] 以上の結果より、 bSF— 1の導入によって、培養脂肪由来間葉系幹細胞が ACTH 刺激状態で副腎系ステロイドであるコルチコステロンを分泌するステロイド産生細胞に分ィ匕したことが示され、本発明のステロイド産生細胞は、副腎系ステロイドの産生傾向という特性を有していることが明らかになった。

[0070] この点にぉヽても本発明で得られたステロイド産生細胞は非常に有用であると考えられる。例えば副腎不全の患者に対して本発明で得られたステロイド産生脂肪由来間葉系幹細胞を移植した場合、生体の副腎皮質ステロイドが不足してヽれば ACTH が分泌され、前記細胞より副腎系ステロイドが分泌され、反対に過剰であれば ACT Hが抑制され、その結果副腎系ステロイド分泌も抑制され得るからである。

[0071] 副腎系ホルモン産牛.細胞への分化誘導

本発明者らはさらに、本発明のステロイド産生細胞が培養条件によってどのような影響を受けるかを検討した。上述した方法と同様に、マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞細胞 (mASCs)並びに対照としてマウス初代培養骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs)にゥシ SF— 1タンパク質発現ウィルスを一定の発現強度（この場合は M OI 50)で感染させ、レチノイン酸 (ATRA)をウィルス感染時及び培地交換時に添カロし（day 0、 4、 7、 11、 14)、 day 14〜 18に培養した培地のホノレモンを柳』定した。この結果を図 5に示した。

[0072] レチノイン酸を添加する事で、 mASCsはコルチコステロン/テストステロンが著明に上昇し、つまり、副腎ステロイド産生傾向が強まる (右白矢）力 mBMCsではコルチコステロン/テストステロンが著明に低下し、つまり、性腺系ステロイド産生傾向が強まった (左白矢)。

[0073] 前記 mASCs^びに mBMCsにおけるレチノイン酸のステロイド合成酵素発現への體

(1)RT— PCRによる測定 (mRNA発現に対する効果）

次に、上記実験で用いられた細胞の Real— time reverse transcriptase— pol ymerase chain reaction (RT— PCR)を行った。その結果を図 6に示した。

[0074] レチノイン酸添カ卩により、 mASCs, mBMCsいずれも、副腎系ステロイド合成酵素である p450c21、 p450cl l、性腺系ステロイド合成酵素である p450c 17の発現は増強した。しかし、性腺系ステロイド合成酵素である 17 —HSDは mASCsの場合、レチノイン酸添カ卩により発現が減弱されている。この結果、レチノイン酸添カ卩により m ASCsは副腎系ステロイド産生傾向が増強すると示唆された。

[0075] すなわち、 SF—1遺伝子導入脂肪細胞由来間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞とは逆に、 ATRA刺激により 17 18—HSDの発現が弱まるため、副腎系のステロイド産生傾向が強まることが示唆された。

[0076] 本発明の特定の好まヽ実施形態及び実施例は上記で記載され、例証されてヽる力本発明はこれらの一実施形態や一実施例に限定されるものではなぐ本発明の要旨を変更しな、範囲で種々変形可能である。

図面の簡単な説明

[0077] [図 1]図 1は、マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞 (mASCs)及びマウス初代培養骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs)の培養液中へのプロゲステロン (P4)、デォキシコルチコステロン（DOC、テストステロン (T)、及びコルチコステロン（B)の分泌量を示すグラフである。

[図 2]図 2は、ステロイド合成酵素遺伝子（P450cl7、 17 j8— HSD、 P450c21、及び P450cl 1)のリアルタイム PCRの結果を示すグラフである。

[図 3]図 3は、マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞 (mASCs)及び骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs)における SF— lZAd4BP発現強度とステロイド産生傾向との関係を示したグラフである。

[図 4]図 4は、 Adx— SF1感染マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞 (mASCs)におけるコルチコステロン産生に対する ACTHの影響を検討したグラフである。

[図 5]図 5は、マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞 (mASCs)及びマウス初代培養骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs)におけるレチノイン酸とステロイド産生傾向との関係を示したグラフである。

[図 6]図 6は、マウス初代培養脂肪由来間葉系幹細胞 (mASCs)及びマウス初代培養骨髄由来間葉系幹細胞 (mBMCs)におけるステロイド合成酵素遺伝子 (P450cl 7、 17 j8— HSD、 P450c21、及び P450cl l)に対するレチノイン酸 (ATRA)の景響を検討したグラフである。

Claims

請求の範囲

[1] 脂肪由来間葉系幹細胞にステロイド合成酵素の転写調節因子を導入することで前記脂肪由来間葉系幹細胞力分化させたことを特徴とするステロイド産生細胞。

[2] 請求項 1記載のステロイド産生細胞にお!、て、

前記ステロイド合成酵素の転写調節因子は、 Steroidogenic factor l (SF- l) タンパク質であることを特徴とするステロイド産生細胞。

[3] 請求項 2記載のステロイド産生細胞にお、て、

前記脂肪由来間葉系幹細胞は、 SF— 1タンパク質の発現強度を調節することにより分ィ匕誘導されるステロイド産生細胞を選択することが可能となることを特徴とするステロイド産生細胞。

[4] 請求項 3記載のステロイド産生細胞にお、て、

前記脂肪由来間葉系幹細胞は、 SF— 1タンパク質を過剰発現させることにより副腎系ステロイド産生細胞を分ィ匕誘導することが可能となることを特徴とするステロイド産生細胞。

[5] 請求項 1記載のステロイド産生細胞にお!、て、

前記ステロイド産生細胞は、プレダネノロン、プロゲステロン、デォキシコルチコステロン、コルチコステロン、アルドステロン、 17 α— OH プレダネノロン、 17 α— ΟΗ プロゲステロン、 11ーデォキシコルチゾール、コルチゾール、 DHEA、アンドロステンジオン、テストステロン、エストロン、エストラジオールから成るステロイドホルモンの少なくとも 1つを産生するものであることを特徴とするステロイド産生細胞。

[6] 請求項 1記載のステロイド産生細胞にお!、て、

前記ステロイド産生細胞は、副腎系ステロイドを産生するものであることを特徴とするステロイド産生細胞。

[7] 請求項 6記載のステロイド産生細胞にお、て、

前記副腎系ステロイドは、デォキシコルチコステロン、コルチコステロン、アルドステロン、 11ーデォキシコルチゾール、コルチゾールから成るステロイドホルモンの少なくとも 1つを産生することを特徴とするステロイド産生細胞。

[8] 請求項 1記載のステロイド産生細胞にお!、て、前記ステロイド産生細胞は、レチノイン酸含有培地で培養することによって、副腎系ステロイドを産生するものであることを特徴とするステロイド産生細胞。

[9] (a)内臓脂肪細胞を準備する工程と、

(b)前記内臓脂肪組織力脂肪由来間葉系幹細胞を単離する工程と、

(c)前記脂肪由来間葉系幹細胞を所定期間培養する工程と、

(d)前記所定期間培養された脂肪由来間葉系幹細胞にステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子を導入することでステロイド産生細胞を生成する工程と

を有することを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法。

[10] 請求項 9記載の方法において、

前記ステロイドホルモン合成酵素の転写調節因子は、 Steroidogenic factor 1 ( SF- 1)であることを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法。

[11] 請求項 10記載の方法であって、さらに、

(e)前記脂肪由来間葉系幹細胞の SF—1タンパク質の発現強度を調節する工程を有し、分ィ匕誘導されるステロイド産生細胞を選択することが可能となることを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法。

[12] 請求項 11記載の方法において、

前記ステロイド産生細胞は、 SF— 1タンパク質を過剰発現させることによって副腎系ステロイドを産生するように分ィ匕されることを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法。

[13] 請求項 9の方法であって、さらに、

(f)前記脂肪由来間葉系幹細胞を、レチノイン酸含有培養液で培養する工程を有することを特徴とするステロイド産生細胞の製造方法。

[14] 請求項 1記載のステロイド産生細胞力分泌されたステロイドホルモンと、薬学的に許容される担体とを有することを特徴とする薬剤組成物。

[15] 請求項 14の薬剤組成物において、

前記薬剤組成物は、ステロイドホルモン分泌異常を治療するためのものであることを特徴とする薬剤組成物。

[16] 請求項 14の薬剤組成物において、前記薬剤組成物は、自己免疫性疾患を治療するためのものであることを特徴とする薬剤組成物。

請求項 14記載の薬剤組成物におヽて、

前記薬剤組成物は、臓器移植時における免疫抑制剤として用いるものであることを特徴とする薬剤組成物。