KR101492688B1 - 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건강(Zingiber officinale ROSC.), 작약(Paeonia lactiflora Pallos) 혼합추출물을 유효 성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING MIXED EXTRACTS OF PAEONIA LACTIFLORA PALLAS AND DRIED RHIZOMES OF ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE FOR PREVENTING OR TREATING OF DEMENTIA AND COGNITIVE DYSFUNCTION}

본 발명은 치매(dementia) 및 인지기능장애(cognitive dysfunction)의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 건강, 작약의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애의 예방 또는 치료에 효과가 있는 약제학적 조성물 및 기능성 건강 식품에 관한 것이다.

전 세계가 빠른 속도로 고령화 사회로 진입하고 있으며, 이에 따라 인간은 질병없이 건강하게 장수할 수 있는 높은 삶의 질을 추구하고 있다. 과학의 발달로 인한 수명의 연장으로 노인 인구가 증가하면서, 신경퇴행성 질환인 치매 환자의 비율이 급증하고 있다.

일반적으로, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)을 비롯한 노인성 치매는 점진적인 인지기능의 소실을 특징으로 하는 질환으로서, 개인적으로나 사회적으로 삶의 질을 크게 떨어뜨리고 본인과 주변의 사람들을 불행하게 만들며, 암, 심장질환 및 뇌졸중에 이어 노인 사망의 네 번째 원인이 되고 있다.

치매는 여러 가지 원인에 의해 발병이 되지만, 이중 가장 설득력 있는 과학적 원인은 다음과 같다. 첫째로, 두뇌 해마(hippocampus) 부위의 아세틸콜린 (acetylcholine)이라는 신경전달물질(neurotransmitter)의 농도 저하가 치매와 매우 깊은 관련이 깊은 것으로 인식되고 있다. 치매 환자의 경우, 아세틸콜린을 가수분해하여 콜린(choline)으로 만드는 작용을 하는 아세틸콜린 에스테라아제(acetylcholine esterase)에 의해 아세틸콜린이 가수분해됨으로써 상대적으로 아세틸콜린의 농도가 저하된다. 따라서, 아세틸콜린 에스테라아제를 억제할 경우 뇌의 아세틸콜린의 농도가 상승하여 치매환자의 증상이 개선된다는 것이 보고되어 있다. 아세틸콜린 에스테라아제 저해제로서 FDA 승인을 받아 치매 치료제로 개발되어 사용되고 있는 의약품은 도네페질(donepezil), 갈란타민(galanthamine), 리바스티그민(rivastigmine)등이 있다.

그러나, 이와 같은 아세틸콜린 에스테라아제 저해 약물들은 대부분 말초신경의 콜린성 부작용이 있고, 반감기가 너무 짧으며, 간 독성 등의 심각한 부작용이 있다( Br.J.Psychiatry, 138, 46, 1981).

둘째로, 아밀로이드 베타(Amyloid beta; Aβ) 플라크의 응집 및 세포 간 신경섬유의 엉킴은 알츠하이머성 치매 유발의 주원인으로 알려져 있으며, 이는 치매 환자의 뇌에서 많이 발견된다. 아밀로이드 베타(Aβ)는 β-아밀로이드 전구체 단백질(β-amyloid precursor protein; βAPP)로부터 BACE1(β-site APP-cleaving enzyme 1) 및 β-세크리타아제(β-secretase) 활성에 의한 절단 작용을 통해 생성된다. BACE1의 과발현은 APP의 β-세크리타아제 절단을 증가시켜 아밀로이드 베타를 생성시킨다. 이렇게 생성된 아밀로이드 베타는 신경세포간 신호전달을 억제하고 염증을 유발한다. 따라서, 아밀로이드 베타의 응집을 억제할 경우 뇌신경의 손상이 줄어들어 인지기능이 호전된다는 것이 보고되어 있다.

인지기능장애는 주의력 감소, 학습능력의 감소, 기억력 감퇴, 감각인지기능(perception)의 장애 등을 나타낸다. 기억력의 장애는 흔한 증상으로서 대부분 과거의 사건에 대한 기억력은 온전하지만 새로운 정보를 기억하고 배우는 기능에 장애가 생기게 되어 학습에 어려움이 생기게 된다.

최근, 아세틸콜린 에스테라아제를 억제하거나 치매 유발 단백질인 아밀로이드 베타의 응집을 억제할 수 있는 생약 추출물을 이용하여 치매 또는 인지기능장애를 예방 또는 치료하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(국내특허공개번호 제10-2005-0095819호 등). 생약 추출물은 다른 약물에 비하여 부작용이 크게 적으나 경우에 따라서는 또 다른 부작용도 우려되며, 아직까지는 그 치료효과 또한 충분하지 않다.

본 발명은 치매 및 인지기능장애의 개선에 효과를 가지는 생약을 찾고자 건강, 작약을 포함한 46종의 생약을 이용하여, 아세틸콜린 에스테라아제의 저해, 아밀로이드 베타 응집 억제 활성 및 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)의 분비 유도 효과를 가지며, 스코폴라민(scopolamine)으로 유도된 기억력 손상 동물 모델의 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT), 수동적 회피 테스트(passive avoidance test; PAT), Y-미로 테스트(Y maze test)에서 기억력 개선 효과, 학습증진 및 공간지각 능력을 정상 동물군에 가깝게 향상시키는 탁월한 효능을 가지는 혼합추출물을 개발하고, 이를 이용한 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 치료학적 유효량의 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치료학적 유효량의 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 치매 및 인지기능장애 예방 및/또는 치료에 효능이 있는 유효성분으로서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 식품 조성물은 치매의 예방 및/또는 치료, 기억력 장애를 예방 또는 치료할 수 있으며, 또한 학습 또는 기억력을 증진시킬 수 있다.

도 1은 쥐의 신경교종세포(glioma) C6 세포주에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF) 분비 유도 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 쥐의 신경교종세포(glioma) C6 세포주에서 본 발명의 건강, 작약 혼합 추출물의 혼합 비율에 따른 NGF의 분비 촉진 효과 및 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 건강, 작약 혼합추출물의 혼합 비율에 따른 BV-2세포에서의 LPS로 유도된 NO의 분비 억제 효과 및 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 스코폴라민으로 유도된 쥐에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 배합비별 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT)에서의 기억력 개선효과를 나타낸 그래프이다. 인지 지표(recognition index) 는 새로운 물체를 탐색하는데 걸리는 시간의 비율이다.
도 5는 스코폴라민으로 유도된 쥐에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 Y-미로 테스트(Y maze test)에서의 기억력 개선효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 스코폴라민으로 유도된 쥐에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 수동적 회피 테스트(passive avoidance test; PAT)에서의 기억력 개선 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 치료학적 유효량의 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 치매 및 인지기능장애에는 알츠하이머병 및 혈관성 치매(vascular dementia), 파킨슨병, 경도 인지장애(mild cognitive impairment), 노인성 치매, 전측두엽 치매 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 건강 및 작약은 종래부터 한방생약으로 질환치료 및 예방을 목적으로 사용되어 왔다.

건강(dried rhizomes of Zingiber officinale roscoe)은 생강과에 속한 다년생 초본인 생강의 뿌리줄기를 건조한 것으로, 생강은 예로부터 강장, 강정, 항암식품으로 널리 이용되어 왔다. 생강 또는 생강의 매운 성분인 진저올 등은 아세틸콜린 에스테라아제를 저해하거나 아밀로이드 베타의 응집을 억제하는 효과를 가지고 있으므로 알츠하이머병 등의 치료에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Kim DS et al., J Altern Complement Med . 2007 Apr;13(3):333-40).

작약(Paeonia lactiflora Pallas)은 미나리아재비과에 속하는 다년생 초본식물로, 예로부터 배당체로서 파에오니플로린(paeoniflorin)과 알칼로이드인 파에오닌(paeonine), 탄닌, 수지 및 안식향산 등을 함유하고 있다. 작약은 신경보호작용 및 항산화 활성도 가지는 것으로 알려져 있다(국내특허공개번호 제10-2006-0023885호 등).

본 발명은 건강, 작약의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 건강과 작약의 혼합추출물을 사용함으로써 건강, 작약을 각각 단독 추출물로 사용했을 때보다 상가적인 효과가 증가하는 것을 특징으로 한다. 또한, 특정 배합비로 사용하였을 때 그 효과가 더욱 최대화된다.

본 발명에서 사용된 각 생약성분은 건조된 중량을 기준으로 한 것이다.

상기 건강, 작약의 혼합추출물은 건강, 작약을 1: 10 - 10: 1의 비율로 혼합한 혼합추출물일 수 있으며, 바람직하게는 건강, 작약을 1:5 - 5:1의 비율로 혼합한 혼합추출물이다. 상기와 같은 성분 구성과 함량비율 범위에서 가장 독성이 낮고 부작용이 적으며, 최적의 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다.

상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약을 C₁~C₄의 알콜, n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 클로로포름, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약을 에탄올로 추출하여 얻어진 에탄올 추출물일 수 있다.

상기 추출용매의 사용량은 크게 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 건강, 작약의 분말 시료 1 중량에 대하여 약 1 내지 10배 부피, 바람직하게는 약 5 내지 10배 부피의 비율로 사용될 수 있다. 또한, 상기 추출은 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 5시간 동안, 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 추출방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출은 79℃ 환류냉각 추출법에 의해 수행될 수 있으며, 또한 상기 추출 과정은 단회 또는 수회 수행할 수 있고, 바람직하게는 약 3회 정도 반복 수행할 수 있다. 얻어진 추출액은 필요에 따라 통상의 방법, 예를 들어 약 20 내지 100℃, 바람직하게는 약 30 내지 70℃에서, 감압 농축하거나 감압 건조함으로써, 액상 또는 분말 형태로 생강 추출물을 얻을 수 있다.

상기 건강, 작약 혼합추출물은 유효성분의 함량을 높이기 위하여 추가의 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 즉, (a) 건강, 작약을 C₁~C₄의 알콜로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-핵산층을 분리하는 단계;를 포함하는 추출공정을 더 행함으로써 유효성분의 함량이 높은 건강, 작약 혼합추출물을 얻을 수 있다.

또한, 선택적으로 (a) 건강, 작약을 C₁~C₄의 알콜로 추출하는 단계; (b') 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b')에서 얻어진 수층에 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 에틸 아세테이트층을 분리하는 단계;를 포함하는 추출공정(및 필요에 따라 추가의 크로마토그래피 분획공정)을 수행하거나, 혹은 (a) 건강, 작약을 C₁~C₄의 알콜로 추출하는 단계; (b') 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; (c') 상기 단계 (b')에서 얻어진 수층에 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c')에서 얻어진 수층에 n-부탄올을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-부탄올층 또는 수층을 분리하는 단계;를 포함하는 추출공정(및 필요에 따라 추가의 크로마토그래피 분획공정)을 수행함으로써 유효성분의 함량이 높은 건강, 작약 혼합 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용된 "치료학적 유효량"은 일반적으로 예방되고, 감소되고 또는 치료될 본원에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 질병의 증상을 완화하는데 필요한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 - 95 중량%로 포함한다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 다양한 형태, 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구용 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 특히 바람직하게는, 경구용 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 건강, 작약 혼합추출물을 포함하는 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 1일 0.01 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 10 내지 300 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명은 또한 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는, 학습 장애 또는 기억력 장애의 개선 또는 증상 완화용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물에 있어서, 건강, 작약 혼합 추출물은 상기에서 설명한 바에 따라 얻을 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 학습 장애 또는 기억력 장애의 개선 또는 증상완화를 목적으로 또는 학습 또는 기억력 증진을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 건강, 작약 혼합추출물을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 건강, 작약 혼합추출물, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피 할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 건강,작약 혼합 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 건강,작약 혼합 추출물에 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 건강, 작약 혼합 추출물에 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 상기 건강, 작약 혼합추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

이하, 본 발명을 실시예 및 시험 예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 건강, 작약 혼합추출물의 제조

건강 0.5kg, 작약 1.5kg을 갈아서 20 리터의 95% 에탄올을 넣고, 79℃에서 3시간 환류 냉각 추출 후 여과하여 여액을 분리하였다. 얻어진 여액을 모두 합하여 감압 농축하여 용매를 제거한 뒤, 동결건조를 통해 수분을 완전히 제거하여 건강, 작약 혼합추출물 약 340 g 을 얻었다.

또한 각각의 배합비별 최적 효과를 확인하기 위하여 하기와 표 1과 같은 배합비로 추출하여 배합비별 추출물을 제조하였다.

구분	작약10: 건강1	작약5: 강1	작약3: 건강1	작약1: 건강1	작약1: 건강3	작약1: 건강5	작약1: 건강10
작약 (kg)	1.81	1.66	1.5	1.0	0.5	0.33	0.18
건강 (kg)	0.18	0.33	0.5	1.0	1.5	1.66	1.81
추출량 (kg)	320	340	340	335	350	345	350

시험예 1. 신경성장인자( NGF )의 분비 효과 확인

신경성장인자(nerve growth factor, NGF)를 분비한다고 알려져 있는 쥐의 신경교종세포(glioma) C6 세포주를 이용하였다. C6 세포는 한국세포주 은행에서 분양 받아 사용하였다(KCLB No. 10107). C6 세포는 3.4 g/L의 탄산수소나트륨(NaHCO₃, sodium bicarbonate), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10000 U/ml) 1%가 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 배양하였다.

NGF에 의한 신경분화를 알아보기 위한 PC12 세포는 2.0 g/L의 탄산수소나트륨, 10% 말혈청(horse serum), 5% 우태혈청 및 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10000 U/ml) 1%가 보충된 RPMI1640 배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 배양하였다. 사용한 소태아혈청 및 말혈청은 사용하기 전 55℃에서 30분간 비활성시켜 사용하였고, 70%의 습도와 37℃의 온도가 유지되고, 5%의 이산화탄소가 공급되는 세포 배양기에서 배양하였다.

0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA(Gibco BRL, 미국)를 처리하여 100 mm 배양용기에 부착된 C6 세포를 이탈시킨 후, 10 ml의 신선한 배지를 첨가하여 세포현탁액을 만든 후, 세포수 측정기를 이용하여 살아있는 세포수를 측정 및 계산하였다. 계산한 값을 바탕으로 100 mm 배양접시에 2 X 10⁶개의 세포가 포함되도록 분주하였다. 24시간 배양 후, 기존의 배지를 제거하고 실시예 1에서 얻어진 건강, 작약 혼합추출물 각각 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 첨가한 2% 우태혈청의 DMEM 배지 10 ml으로 교환해주었으며, 다시 24시간 동안 배양한 후 배지를 각각 얻었다. 얻은 배지를 1500 rpm 에 10분간 원심분리한 후, 상층액 만을 다시 모았다.

C6 세포에서 분비된 신경성장인자의 측정은 신경성장인자 측정 키트(DY556, R&D system, 미국)에 조건배지를 처리하여 정량하였다. 건강, 작약 혼합 추출물이 신경성장인자 분비 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해, C6 세포에 처리한 후 배양하여 얻은 조건배지에서 신경성장인자를 정량 분석하였으며, 그 결과는 도 1 과 같다.

세포독성을 알아보기 위하여, 상기 실시예에서 배양한 상층액이 수거되고 남은 세포에는 3-[4,5-디메틸티아조-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)(MTT, sigma Cat# M5655)를 1시간 동안 처리한 후, DMSO 200㎕를 가하여 세포를 용해시킨 뒤 570nm 파장 값의 ELISA 플레이트 리더기로 측정하여 세포독성 여부를 평가하였다.

음성 대조군으로 무처리군을 100% 기준으로 환산하여 계산시 작약, 건강 혼합 추출물의 비율에 따라 NGF 분비 촉진 효과가 다르게 나타남을 확인하였으며, 이는 세포 독성을 보이지 않는 범위 내에서의 촉진효과임을 MTT 검정을 통해 확인하였다. 각각의 경우에서 최적의 배합조건은 작약 3에 건강 1의 비율로 혼합 추출하는 것이 가장 NGF 분비 촉진 효과가 높은 것으로 판단된다.

시험예 2: 신경염증에 관여하는 NO 분비 억제 효과 확인

마우스 유래 뇌교세포인 BV-2세포를 5% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 DMEM 배양액에서 배양하였다.

상기 BV-2 세포를 96웰 플레이트 각 웰에 3 > 10⁴ 개의 개수로 분주한 후, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1에서 제조된 건강, 작약 혼합추출물을 농도별로 처리한 후, 30분 후에 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 농도 100ng/ml로 처리하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 상층액을 수거한 뒤 그리스(Griess) 시약 (N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride(sigma cat# N9125) + Sulfanilic acid in 5% phosphoric acid(sigma cat# S9251))과 1:1 로 섞어 상온에서 10분 동안 반응시킨 뒤, ELISA 플레이트 리더기(ELISA plate reader)로 570nm 파장 값에서 흡광도를 측정하였다. 상층액이 수거되고 남은 세포에는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, sigma Cat# M5655)를 1시간 동안 처리한 후, DMSO 200㎕를 가하여 세포를 용해시킨 뒤 570nm 파장 값의 ELISA 플레이트 리더기로 측정하여 세포독성 여부를 평가하였다. 건강,작약 혼합 추출물의 염증에 관여하는 NO 분비에 미치는 영향을 분석하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.

음성대조군으로 LPS를 처리한 군을 100% 기준으로 환산하여 계산시 작약, 건강 혼합 추출물의 비율에 따라 NO 분비 억제 효과가 다르게 나타남을 확인하였으며, 이는 세포 독성을 보이지 않는 범위 내에서의 NO 분비 억제 효과임을 MTT 검정을 통해 확인하였다. 각각의 경우에서 최적의 배합조건은 작약 3에 건강 1의 비율과 작약 1에 건강 1의 혼합 추출하는 것이 가장 NO 분비 억제 효과가 높은 것으로 판단된다.

시험예 3: 스코폴라민으로 유도된 동물모델에서의 새로운 사물에 대한 인지 테스트( novel object recognition test ; NORT )

스코롤라민에 의해 유도된 기억손상 동물모델에서 건강, 작약 혼합추출물의 인지능력 및 기억력 증진 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실시하였다.

7주령의 ICR계 수컷 마우스(30-35 g)를 오리엔트 바이오(Orient Bio)에서 구입하여 경희대학교 약학대학의 동물 사육실에서 1 주일 이상 사육하여 적응시켜 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(22±2℃), 습도(53±3%) 및 명암주기(12 시간)는 자동적으로 조절되도록 하였다.

쥐는 8마리씩 9군으로 나누었다. 1주일 적응시킨 후, 제1군(대조군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 마우스 체중 kg당 5mL로 1일간 1일 1회 경구 투여하였고, 제2군(스코폴라민 단독 투여군), 제3군(도네페질 1mg/kg 투여군), 제4군(건강 추출물 50mg/kg 투여군), 제5군(작약 추출물 50mg/kg 투여군), 제6군(건강 3대 작약 1 비율 혼합추출물 50mg/kg 투여군), 제7군(건강 1대 작약 1 비율 혼합추출물 50mg/kg 투여군), 제8군(건강 1대 작약 3 비율 혼합추출물 50mg/kg 투여군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)에 녹인 약물을 1일 동안 1일 1회 경구 투여하였다.

약물을 1회 경구투여하고 약물투여 30분 후, 스코폴라민(1mg/kg)을 복강 투여한 뒤 30분 후 NORT를 실시하였다. NORT는 동물을 행동 관찰실로 옮겨 5분간 적응시킨 뒤 3분의 노출시행에서는 상자에 동일한 물체 2개(1set)를 30cm 간격으로 놓은 후 동물이 3분 동안 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다. 하루 후 인출시행에서는 동일한 상자에 노출 시 계시했던 물체 1개와 새롭게 대치된 물체 1개를 준비해 놓고, 동물이 탐색하는 시간을 측정하였다. 그 결과는 도 4와 같다.

시험예 4: 스코폴라민으로 유도된 동물모델에서의 Y- 미로 테스트(Y maze test )

쥐는 10마리씩 4군으로 나누었다. 1주일 적응시킨 후, 제1군(대조군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 마우스 체중 kg당 5mL로 1일간 1일 1회 경구 투여하였고, 제2군(스코폴라민 단독 투여군), 제3군(작약, 건강 혼합 추출물 50mg/kg), 제4군(도네페질 1mg/kg 투여군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)에 녹인 약물을 1일 동안 1일 1회 경구 투여하였다.

약물을 1회 경구투여하고 약물투여 60분 후 스코폴라민(1mg/kg)을 복강 투여한 뒤 30분 후 Y 미로를 실시하였다.

Y 미로(Y maze) 장치는 동일한 3개의 암(arm)(가로 8 cm, 세로 30 cm, 높이 14 cm)으로 구성되어 있으며, 각각은 서로 120°의 일정한 각도로 배치되어 있다. 마우스를 한쪽 arm 끝에 위치시킨 다음에 8분 동안 자유롭게 Y 미로를 돌아다니도록 하였다. 각 암에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 자발적 변경(spontaneous alteration)(%)을 평가하였다. 변경(alteration)은 3개의 암(arm)을 순차적으로 들어가는 경우, 즉 ABC, BCA, CAB 등으로 정의하였다. % 변경(alteration)은 하기 수학식 1로 계산하였다.

[수학식1]

% 변경 = [총 변경 수]/ [암(arm)에 들어간 총 횟수-2] x 100

상기 Y미로 실험결과, 스코폴라민을 투여하지 않은 대조군의 경우 65%의 변경(spontaneous alteration)을 보였으며, 스코폴라민 만을 복강으로 투여한 마우스의 경우 기억력이 손상되어 그 수치가 47%로 감소하였다. 한편, 건강, 작약 혼합추출물을 50 mg/kg/day로 경구 투여한 마우스의 경우 자발적 변경(spontaneous alteration)이 58%로 현저하게 증가하여 기억력이 개선됨을 확인할 수 있었다. 그 결과는 도 5와 같다.

시험예 5: 스코폴라민으로 유도된 동물모델에서의 수동적 회피 테스트( passive avoidance test )

마우스를 각 군당 10 마리씩 나누었다. 제1군(대조군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 마우스 체중 kg당 5mL로 3일간 경구 투여하였고, 제2군은 0.5% 메틸 셀룰로오스에 녹인 도네페질(Donepezil) 1 mg/kg 투여군, 제3군은 0.5% 메틸 셀룰로오스에 녹인 건강, 작약 혼합추출물을 50 mg/kg로 3일간 경구투여 하였다. 1일 1회로 3일간 경구투여하고 마지막 경구투여 1 시간 후 수동 회피 시험(passive avoidance task)을 다음과 같이 수행하였다.

수동 회피 시험은 내부구조가 두 개의 동일한 공간으로 구분되어 있는 시험 장치에서, 첫째 날 가운데에 문을 사이에 두고 한쪽은 불을 켜놓고 다른 한쪽은 어두운 상태에서 밝은 쪽에서 먼저 10초간 머무르게 한 후 사이의 문을 열어주고, 시험동물이 어두운 공간으로 이동할 때 발바닥에 0.25 mA의 전기 자극을 주었다. 24 시간 후 같은 방법으로 수동 회피 시험을 진행하고 이때 밝은 곳에 머무르는 시간을 측정하였다. 그 결과는 도 6과 같다.

대조군은 150±3.39초를 나타내어 전기충격으로 인한 기억력이 유지되었고 도네페질 투여군은 약 90초, 건강, 작약 혼합 추출물 50 mg/kg 투여군은 120초, 스코폴라민 투여군은 40초로, 현저하게 건강, 작약 혼합 추출물 투여군이 체류시간을 유의성 있게 증가했다(p<0.05).

Claims (8)

1. 유효 성분으로서 건강 및 작약 혼합추출물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 여기에서 상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강 및 작약이 1:10 내지 10:1의 중량 비율로 혼합추출되고 총 중량에 대하여 0.01 - 95 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약 혼합물을 C₁-C₄의 알콜, n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 클로로포름, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약 혼합물을 에탄올로 추출하여 얻어진 것임을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 약제학적 조성물의 제형(dosage form)이 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택된 경구용 제형인 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
7. 제1항에 따른 약제학적 조성물 및 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
8. 삭제

Images