KR20160103729A - 오디 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오디(Mulberry) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 천연식물로부터 유래하여 생체 독성이 없고, 신경세포에서 세포내 산화적 스트레스로 인하여 감소한 GSH, 항산화 효소의 발현, 및 관련 시그널링 경로를 회복시키는 효과가 있고, 세포의 죽음과 관련된 단백질의 발현을 억제하는 등 세포자멸로부터 보호하는 효과가 확인되었다. 따라서 글루타메이트로 인하여 유발되는 트라우마, 뇌졸중, 알츠하이머등과 같은 신경병성 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

Description

오디 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Composition for prevention and treatment of cognitive disorder comprising extracts of Mulberry}

본 발명은 오디 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 글루타메이트에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하고, 세포자멸을 방지함으로써 글루타메이트 관련 질환을 예방 또는 치료하는 약학 조성물에 관한 것이다.

산화적 스트레스는 일반적으로 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)을 생산하고 제거하는 세포생화학적 프로세스 사이의 불균형인 것으로 알려져 있고, 신경세포에서 ROS의 축적은 신경병성 장애의 발병에서 중요한 역할을 한다. 다른 장기와 비교하여, 뇌는 높은 불포화 지방산 과산화물 함량, 단위 무게 당 높은 산소 소비량, 지질 과산화의 주된 역할을 하는 성분인 철 및 아스코르브산염의 높은 함량 및 항산화 방어 시스템의 결핍과 같은 다양한 이유 때문에 인하여 산화적 스트레스에 대하여 더 예민하다. 산화적 스트레스로 인한 신경세포의 점진적인 죽음은 학습 및 기억 손실, 관련 질환의 발병 및 신경병성 장애를 일으킨다(Yang EJ et al., Neurotoxicology, 2013a 39:114-23). 알츠하이머(AD), 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상(TBI), 우울증 및 파킨슨 병(PD)을 포함하는 산화적 스트레스로 인한 많은 질병들은 병리학적 및 임상적인 증상이 따른다. 치명적인 신경 장애 중 하나인 알츠하이머는 뇌에서 학습 및 기억과 관련이 있는 콜린 작동성 뉴런의 감소와 연관이 있다. 산화적 스트레스와 흥분성독성은 건만증성 인지장애를 유발한다(Cho N et al., Food Chem Toxicol, 2013. 58:355-61).

글루타메이트는 포유동물의 신경전달물질이다. 일반적인 생리학적 조건에서는, 글루타메이트는 두 개의 시냅스 후부의 글루타메이트 수용체인, 대사형 글루타메이트 수용체(mGluR) 및 통로형 글루타메이트 수용체(iGluR)에 연결되어 있는 시냅스 간극에서 분비된다. mGluRs는 iGluRs와 협력하여 시냅스 가소성(synaptic plasticity), 학습, 기억 및 기타 인지 기능을 가능하게한다. 높은 농도의 글루타메이트는 산화적 스트레스를 유발하여 트라우마, 뇌졸중, 알츠하이머 및 파킨슨병과 같은 신경병성질환을 일으킨다(Moussawi K et al., Front Syst Neurosci, 2011. 5:94). 글루타메이트는 수용체-매개의 흥분성독성 및 수용체-매개되지 않은 산화적 세포독성 두 가지 경로를 통하여 산화적 스트레스와 세포독성을 유발할 수 있다. 전자는 글루타메이트가 순간적인 Ca^{2 +}의 유량을 일으켜 ROS의 수치를 증가시키고 궁극적으로 세포 사멸을 일으키는 통로형 글루타메이트 수용체의 활성화를 통하여 흥분성 독성을 유도한다. 후자는 글루타메이트가 글루타메이트-시스틴 역수송체를 억제하고 이후 시스틴의 유출을 촉진하여 그리고/또는 시스틴의 흡수를 봉쇄함으로써 산화적 스트레스를 유도한다. 이는 세포 내 글루타티온의 손실 및 세포 내 ROS의 축적을 일으키고 궁극적으로 산화적 세포 사멸을 유발한다. 글루타메이트 유도된 산화적 스트레스와 뉴런의 사멸은 주요한 병리학적 및 임상적인 증상의 시작 전에 발생하는 많은 신경병성 질환(알츠하이머를 포함한)의 발달에서 중요한 기여 인자인 것으로 확인되었다(Coyle JT et al., Science, 1993. 262:689-95).

해마에서의 뉴런의 기능장애 및 죽음은 알츠하이머와 관련된 기억결함의 병리 생리학에 기여하는 것으로 생각되었다. 이에 오디의 다양한 생물학적 및 생리학적 효과를 바탕으로 오디 초산 에틸 추출물(Mulberry fruit ehtylacetate extract, MFE)의 마우스 해마 HT22세포에서 글루타메이트-유도된 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과 및 항-세포 자멸 효과를 실험한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

공개특허공보 제10-2013-0060835호 공개특허공보 제10-2014-0019967호

따라서 본 발명은 천연 식물자원을 이용하여 세포독성이 없고, 세포자멸을 일으켜 여러 신경병성 질환을 나타낼 수 있는 산화적 스트레스로부터 세포 보호 활성을 갖는 오디 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오디(Mulberry) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 오디는 뽕나무에서 열리는 열매를 의미하는 것으로 중국 남쪽 및 기타 아시아 국가에서 많이 재배된다. 한국의 가장 오래된 의학서적인 동의보감에 의하면 오디는 안토시아닌 및 페놀릭과 같은 성분으로 인하여 다양한 생물학적 및 생리학적 효과를 가진다고 기재되어 있다. 영양학적으로 오디는 지방(1-10%), 리놀릭산, 팔마틱산 및 올레익산, 비타민 C와 같은 지방산(22.4mg/100g), 미네랄, 페놀성분(181mg), 갈릭산(동등량/100g) 및 플라보노이드류(29.0 mg 쿼세틴 동등량/100g)을 포함하고 있다(Ercisli S and Orhan E, Food Chem, 2007. 103:1380-1384).

본 발명에 의하면, 상기 오디추출물은 농도와 관련 없이 세포 독성을 나타내지 않았다(실시에 3.2 및 도 6 참조). 또한 글루타메이트 처리로 신경세포에 산화적 스트레스를 유도할 경우, 세포 사멸, 활성산소종 생성, 글루타티온(GSH)의 감소, 항산화 효소 발현 감소를 일으키고, Bcl2, AIF, 칼페인 및 시토크롬 C와 같은 세포자멸성 단백질을 증가시켜, 결과적으로 신경세포의 사멸이 일어난다. 그러나, 이러한 현상은 오디 추출물의 처리로 회복시킬 수 있다.

구체적으로, 신경세포에 글루타메이트를 처리할 경우, 세포 외 글루타티온 및 세포 내 활성산소종의 축적으로 세포가 사멸하였고, 미토콘드리아 막 포텐셜(△Ψm)의 불균형을 일으켜 세포 자멸을 유도하였으나, 오디 추출물을 처리할 경우 세포독성을 완벽하게 예방할 수 있음이 확인되었다(실시예 3.3 내지 3.5, 4.1, 5, 도 7 내지 10 및 16 내지 17 참조).

상기와 같은 세포 사멸은 글루타메이트 처리로 Bcl2, AIF, 칼페인 및 시토크롬 C와 같은 세포 사멸/자멸과 관련된 단백질을 증가시킴으로 써 이루지는데, 이는 오디 추출물을 처리할 경우 상기 단백질의 발현을 차단함으로써 세포 사멸을 방지할 수 있음을 확인하였다(실시예 6.1, 6.2, 도 18 및 19 참조). 또한, 뉴런의 발달과 생존을 조절하는 것으로 알려진 CREB의 발현 또한 산화적 스트레스로 인하여 감소하는데, 오디 추출물의 처리로 회복시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 6.3, 6.4, 도 20 및 21 참조).

또한 글루타메이트를 처리할 경우, NQO-1, GCLC, HO-1과 같은 항산화 효소의 발현이 감소하는데, 오디 추출물을 처리할 경우 p38, JNK MAPK 경로 및 PI3K/Akt경로의 활성화를 유도하여 Nrf2/ARE 시그널링을 활성화 시켜 궁극적으로 항산화 효소의 발현을 회복시켰다(실시예 4.2 내지 4.6 및 도 11 내지 15참조).

높은 농도의 글루타메이트는 산화적 스트레스를 유발하여 트라우마, 뇌졸중, 알츠하이머 및 파킨슨병과 같은 신경병성질환을 일으키는데(Moussawi K et al., Front Syst Neurosci, 2011. 5:94), 오디추출물에는 글루타메이트 유도된 산화적 스트레스로 인한 신경세포의 사멸로부터 보호하는 효과가 있다고 할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 오디추출물을 포함하는 조성물은 글루타메이트로 인하여 발병하는 트라우마, 뇌졸중, 알츠하이머 등과 같은 신경병성 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

또한 본 발명의 약학 조성물은 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여 방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 mg/kg이다.

또한 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 국소 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 오디 추출물은 당업계에 공지된 방법에 따라 추출하거나 상업적으로 추출, 정제된 것을 구입하여 사용할 수 있다. 또한 오디는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 깨끗이 세척하여 동결 건조한 것을 사용할 수 있다. 건조된 오디는 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 증류수, 알코올 또는 유기용매를 넣는다. 이를 적당한 온도에서 24시간 이상 동안 추출한 후, 여과하여 본 발명에 따른 열수추출물, 알코올 추출물 또는 유기용매 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 오디추출물은 탄소수 1-4의 알콜, n-헥산, n-부탄올, 클로로포름 및 아세트산에틸(Ethyl acetate)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것일 수 있으나, 바람직하게는 아세트산에틸(Ethyl acetate)로 추출한 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 오디추출물의 조성물 내 농도는 25-100㎍/mL인 것일 수 있으나, 바람직하게는 25㎍/mL이상인 것으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인지기능 장애 질환은 알츠하이머, 허혈성 뇌졸중, 외상선 뇌손상, 우울증 및 파킨슨병으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 인지기능 장애는 주의력 감소, 학습능력의 감소, 기억력 감퇴, 감각인지기능(perception)의 장애 등을 나타낸다. 기억력의 장애는 흔한 증상으로서 대부분 과거의 사건에 대한 기억력은 온전하지만 새로운 정보를 기억하고 배우는 기능에 장애가 생기게 되어 학습에 어려움이 생기게 된다. 이와 관련된 질환으로는 정상적인 노화와는 구분해야 할 병적인 현상으로, 알츠하이머, 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상(TBI), 우울증, 혈관성 치매(vascular dementia), 파킨슨병, 경도 인지장애(mild cognitive impairment), 노인성 치매, 전측두엽 치매 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 오디(Mulberry) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 식품 조성물은 본 발명의 우수한 세포보호 효과를 갖는 오디 추출물을 함유함으로써 일정수준의 약리적 효능을 기대할 수 있는 식품으로서, 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 인지기능 장애 질환의 예방 및 개선용 조성물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부로 첨가될 수 있다. 상기 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 조성물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구 투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면 오디 추출물에는 천연식물로부터 유래하여 생체 독성이 없고, 신경세포에서 세포내 산화적 스트레스로 인하여 감소한 GSH, 항산화 효소의 발현, 및 관련 시그널링 경로를 회복시키는 효과가 있으며, 세포의 죽음과 관련된 단백질의 발현을 억제하는 등 세포자멸로부터 보호하는 효과가 확인되었다. 따라서 본 발명의 오디추출물을 포함하는 조성물은 글루타메이트로 인하여 유발되는 트라우마, 뇌졸중, 알츠하이머등과 같은 신경병성 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

도 1은 세포 자멸 시그널 매커니즘을 나타내는 개념도이다.
도 2는 Nrf2/Keep1 시그널 매커니즘을 나타내는 개념도이다.
도 3은 CREB 시그널 매커니즘을 나타내는 개념도이다.
도 4는 본 발명에 따른 오디추출물을 추출하는 과정을 개략적으로 나타내는 순서도이다.
도 5는 본 발명에 따른 오디추출물의 HPLC 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 HT22 세포에 대한 오디추출물의 세포독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 HT22 세포에서 글루타메이트-유도된 세포독성에 대한 오디추출물의 보호효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 글루타메이트에 노출시킨 후 오디추출물을 처리하거나 처리하지 않은 HT22세포의 현미경 분석 사진이다.
HT22세포를 5mM의 글루타메이트에 노출시키기에 앞서 다른 농도의 오디추출물을 처리 하였다. 도 8 (a)는 오디추출물과 글루타메이트를 모두 처리하지 않은 대조군의 사진이고, 도 8 (b)는 5mM의 글루타메이트만을 처리한 양성그룹의 사진이며, 도 8 (c) 내지 (f)는 각각 5mM의 글루타메이트와 오디추출물을 (c) 10㎍/mL, (d) 25㎍/mL, (e) 50㎍/mL 및 (f) 100㎍/mL의 농도로 처리한 그룹의 사진이다.
도 9는 글루타메이트에 노출된 HT22 세포에서 오디추출물의 세포 내 ROS의 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 글루타메이트에 노출된 HT22 세포에서 오디추출물의 처리 여부에 따른 GSH 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 HT22세포에서 항산화 효소의 발현에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다. 3x10⁵ 세포/웰로 24시간 동안 씨드하고 100㎍/mL의 오디추출물을 0-24시간 동안 처리하였다.
도 11 a는 글루타메이트 처리한 세포에 다양한 농도(10, 25, 50, 100㎍/mL)의 오디 추출물을 12시간 동안 처리한 결과이고, 도 11 b는 NQO-1, GCLC-, HO-1 및 -액틴을 검출하기 위해 세포용해물을 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 12는 HT22 세포에서 Nrf2의 핵 전위에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 13은 HT22 세포에서 p38, ERK1/2, JNK의 단백질 발현 및 인산화에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 14는 HT22 세포에서 PI3K/Akt의 활성화에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 15는 HT22 세포에서 ERK1/2, p38, JNK 및 PI3K/Akt 시그널을 통한 Nrf2의 핵 축적에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 16은 아넥신-를 사용하여 세포자멸을 측정한 유동세포분석 결과이다.
HT22 세포는 다른 농도의 오디 추출물을 30분 동안 처리한 후(10, 25, 50, 100㎍/mL), 5mM의 글루타메이트로 12시간 더 처리하였다. 이후 세포는 아넥신 -FIC 및 PI로 염색하였다. 도 16(a)는 오디추출물과 글루타메이트를 모두 처리하지 않은 대조군이고, 도 16 (b)는 5mM의 글루타메이트만을 처리한 양성그룹이며, 도 16 (c) 내지 (f)는 각각 5mM의 글루타메이트와 오디추출물을 (c) 10㎍/mL, (d) 25㎍/mL, (e) 50㎍/mL 및 (f) 100㎍/mL의 농도로 처리한 그룹의 유동세포분석 결과이다.
도 17은 미토콘드리아 막 포텐셜의 유동세포분석 결과이다.
HT22 세포는 다른 농도의 오디 추출물을 30분 동안 처리한 후(10, 25, 50, 100㎍/mL), 5mM의 글루타메이트로 12시간 더 처리하였다. 도 17 (a)는 오디추출물과 글루타메이트를 모두 처리하지 않은 대조군이고, 도 17 (b)는 5mM의 글루타메이트만을 처리한 양성그룹이며, 도 17 (c) 내지 (f)는 각각 5mM의 글루타메이트와 오디추출물을 (c) 10㎍/mL, (d) 25㎍/mL, (e) 50㎍/mL 및 (f) 100㎍/mL의 농도로 처리한 그룹의 유동세포분석 결과이다.
도 18은 Bcl2/Bax 발현에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 19는 AIF/칼페인/시토크롬 C의 발현에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 20은 글루타메이트-유도된 세포 사멸에서 BDNF/p-CREB의 발현에 대한 오디추출물의 효과를 나타내는 그림이다.
도 21은 오디추출물에 의해 유도된 상향조절된 p-CREB 수준에 대한 K252a의 효과를 나타내는 그림이다.
도 22는 오디추출물의 항산화 시그널 매커니즘을 나타내는 개념도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험재료의 준비

1.1 화학물질

DMEM 배지(Dulbeccos modified eagles medium), 10X PBS(10X phosphate buffered saline), 10X TBS(10X tris-buffered saline) 및 HBSS(Hanks balance salt solution)은 웰진 Inc(Daegue, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 소 태아 혈청(FBS), 2´, 7´-디클로로디하이드로프루오레세인 디아세테이트(2´, 7´-dichlorodihydroflorescein diacetate, H₂DCF-DA) 및 2´, 7´-디클로로플루오레세인(2´, 7´-dichloroflorescein, DCF)는 인비트로젠 Inc(Calsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 트립신-EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid) 및 항생제(페니실린 및 스트렙토마이슨)는 깁코 Inc(BRL life technologies, NY, USA)로부터 공급받았다. EZ-사이톡스 세포 생존 분석 키트는 LPS solution Inc(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 소듐포스페이트-모노베이직(sodium phosphate-monobasic), 소듐 포스페이트-디베이직(sodium phosphate-diabasic), 아세트산(acetic acid), 포타슘 포스페이트-모노페이직(potassium phosphate-monobasic) 및 포타슘 포스페이트-디베이직은(potassium phosphate-dibasic) 대정 Ltd(Chung won, Korea)에서 구입하였다. 4,6-디하이드록시-2-머캅토피리미딘(2,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidine)은 알파 에이사(Alfa Aesar, Seoul, Korea)에서 구입하였다. EDTA는 준세 화학 Co, Ltd(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. L-글루탐산, DMSO(dimethyl sulfoxide), SDS(sodium dodecyl sulfate), NADPH(-nicotinamide adenine dinucletide 2´-phosphate reduced tetrasodium salt hydrate), DTNB(4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidine), 글루타티온 리덕타제 (glutathione reductase, GR, 이스트의 type Ⅲ) 및 환원된 L-글루타티온(GSH), TWEEN-20은 시그마 알드리치 Inc(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항-GCLC, 항-NQO-1 및 항-시토크롬 C항체는 Abcam Inc(Cambridege, UK)에서 구입하였다. HO-1을 위한 항체는 Enzo life sciences Inc(Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였다. 그리고 phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2), p44/42 MAPK(ERK1.2), phospho-p38 MAP 키나제, p38 MAPK, phospho-SAPK/JNK, SAPK/JNK, phospho-Akt, Akt, phospho-PI3 키나제 p85, PI3 키나제 p-85, Nrf2, 라민 B2, AI(세포자멸 유도 인자), Bcl2, Bax, 칼페인, phosph-CREB, -액틴 및 Anti-rabbit IgG 를 포함하는 항체는 cell signaling technology Inc(MA, USA)에서 구입하였다. BDNF는 Santa cruz biotechnology, Inc(TX, USA)에서 구입하였다. 핵 추출 키트 및 anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-one(SP600125), 4-(4´-fluorophenyl)-2-(4´methylsulfinylphenyl)-5-(4´-pyridyl)imidazole(SB203580), 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one(LY294002) 및 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one(PD65059)를 포함하는 억제제 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다. MK-2206은 Selleckchem(Houston, TX, USA)에서 구입하였고, PBDF 막은 Bio-Rad Laboratories(Alfred Nobel drive, Hercules, CA)에서 구입하였다. ECL 탐지 시료는 intron, Inc(Kyung-gi do, Korea)에서 구입하였다. X-ray firm은 AGFA Inc(ON, Canada)에서 구입하였다. Millipore(Darmstadt, Germany)에서 구입한 뮤즈 아넥신 (muse annexin Ⅴ) & 죽은 세포 키트 및 뮤즈 마이토포텐셜 키트는 뮤즈 유동세포 분석법을 위해 사용되었다.

1.2 오디추출물의 준비

건조된 오디는 대한민국 경상북도 상주에서 2011년 6월 21일 구입하였다. 오디는 상처가 나지 않고 일정한 크기의 것으로 특별히 선별하였고, 흐르는 물에서 씻은 후 동결건조시켰다. 건조된 오디(400.0g)을 80%의 EtOH에 잠기도록 하여 하루 동안 상온에서 보관하였다. 이러한 과정을 3번 반복한 후 모두 한곳에 두었다. 80%의 EtOH 추출물은 필터 페이퍼(No. 3, Whatman International Limited, Kent, England)에 정리되었고 농축되도록 증발건조기(N11; Yamato Co., Tokyo, Japan)로 증발되었다. 남은 부분은 에틸아세테이트로 분리된 깔때기를 사용하여 추출되었다. 에틸아세테이트 분획물을 수득하기 위해 진공챔버 안에서 건조 및 증발시켰다. 추출과정은 도 5와 같다. 건조된 에틸 아세테이트 추출물이 100mg/mL의 농도로 DMSO에 용해된 것은 MFE(Mulberry Fruit Extract)라 명명하였다. 샘플은 안토시아닌 함량은 10.31mg/g 이고 플라보노이드 함량은 7.34 mg/g인 것으로 표준화되었다.

<실시예 2> 실험 방법

2.1 HT22 세포 배양

HT22 세포는 마우스 해마-유래된 세포계로, 글루타메이트 유도된 신경독성의 메커니즘을 연구하기 위한 세포외 모델로 널리 사용된다(Fukui M et al., 2009). HT22 세포는 DMEM 배지에서 10%의 FBS, 100units/mL 페니실린 및 100g/mL의 스트렙토마이신과 함께 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양되었다.

2.2 세포내 활성 산소종(ROS) 수준의 측정

세포내 ROS는 2´,7´-디클로로플루오세인 디아세테이트(DCFDA)(Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 글루타메이트 처리 12시간 후 세포는 HBSS(Hanks balanced salt solution)에서 10M DCFDA로 30분 동안 암실에 보관함으로써 고정되었고, 플루오르세인은 마이크로플레이트 측정기(Beckman Coulter DTX 880 Multimode Detector, Brea, CA, USA)로 485 nm의 여기 파장 및 525nm의 방출파장에서 관찰되었다.

2.3 글루타티온( GSH )의 함량 측정

총 글루타티온(GSH) 수준은 공지된 과정(Lee JH et al., BR J Nutr, 2009. 101:1246-1254)에 따라 확인되었다. 20μL의 상척액은 5mM의 EDTA, 10mM의 5,5′-dithoiobis-(2-nitrobenzoic acid) 및 5mM NADPH를 포함하는 100mM의 인산화 버퍼와 함께 혼합되었다. 25℃에서 평형이 된지 3분 후, 2 units의 글루타티오닌 리덕타제(GR)을 첨가함으로써 반응이 시작되었다. DTNB의 형성은 412nm에서 UV/VIS 분광기로 지속적으로 측정되었다. 샘플에서의 GSH의 총 함량은 알고 있는 GSH양과 비교한 412nm일 때 흡광도의 변화율로 제도된 표준 곡선으로부터 결정되었다.

2.4 유동세포분석

HT22 세포는 60mm 플레이트에 씨드(seed)되었고 24시간동안 배양되었다. 세포는 다양한 농도의 RDP로 5mM의 글루타메이트를 첨가하거나 첨가하지 않은 조건에서 12시간 동안 처리되었다. 떠오르거나 부착된 세포 모두 수확되었고, 세포자멸 분석을 위하여 PBS로 두 번 세척되었다. 자멸성/괴사성 세포 및 MMP(Mitochondrai membrane potential)은 유동세포분석법(Muse Cell Analyser, Merck Millipore, Billerrica, MA, USA)으로 뮤즈 아넥신 Ⅴ & 죽은 세포 키트와 뮤즈 마이토포텐셜키트(Merck Millipore)를 사용하여 분석되었다. 아넥신 Ⅴ & 죽은 세포를 위하여 재부유된 세포들은 10% FBS 및 100μL의 아넥신 Ⅴ & 죽은 세포 검출 시약을 포함하는 100μL의 미디엄으로 상온에서 20분 동안 배양되었다.

매 시간 각 샘플마다 약 10,000세포가 조사되었고 세포의 자멸 또는 괴사도는 뮤즈 1.1.2 분석 소프트웨어(Merck Millipore)를 사용하여 다양한 통계적 분석에 따라 세 번 실시된 실험으로부터 계산되었다. 아넥신-Ⅴ와 함께 고정된 세포는 조기 세포자멸한 것으로 정의되었고, 아넥신-Ⅴ 및 7-AAD 이중-고정된 세포는 늦게 세포자멸된 것으로 정의되었다. 그리고 마이토포텐셜 분석을 위하여, 세포는 마이토포텐셜 염색시료와 1X 분석 버퍼가 1:1000로 희석된 마이토포텐셜 작용 용액과 100μL의 세포에 95μL의 뮤즈 마이토포텐셜 작용 용액을 첨가한 것으로 37℃에서 20분 동안 배양되었다. 그리고는 뮤즈 7-AAD가 상기 용액에 첨가되었고 5분 동안 배양하였다. 그 결과 혼합물은 완전히 혼합되었고 뮤즈 세포 분석기에서 분석되었다.

2.5 핵 및 세포질 단백질 추출

핵 및 세포질 단백질은 핵 추출 키트를 사용하여 지시 방침에 따라 분리되었다. 간략하게 설명하면, 세포는 4℃에서 원심분리 한 후(300Xg, 5분), 세포 펠릿은 인산화 저해제 및 프로테아제 저해제를 포함하는 저삼투압 버퍼와 함께 혼합되었다. 얼음에서 10분 동안 배양한 후 세포에 10%의 Nonidet P40분석 시료를 첨가하였다. 핵은 원심분리(14,000Xg, 30초)로 다시 얻었고, 상청액은 세포질 추출물로 -80℃에서 사용될 때까지 보관되었다. 핵은 핵 추출 버퍼로 얼음에서 30분 동안 처리하여 추출되었다. 용해 가능한 성분은 원심분리(14,000Xg, 10분)로 제거되었고, 상청액은 핵 추출물로 사용되었다.

2.6 웨스턴 블롯 분석

HT22 세포에서의 NQO-1, GCLC, HO-1 MAPKs, Nrf2, AIF, Bax, 칼페인, Bcl2, BDNF 및 p-CREB 단백질의 발현은 웨스턴 블롯으로 결정되었다. 간략하게 설명하면, 세포의 총 단백질은 PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology, Gyunggi-do, Korea)을 사용하여 사용 지침에 따라 추출되었다. 세포 용해물에서 단백질 함량은 Bradford 분석법(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 결정되었다. 상청액으로부터 얻은 단백질(50μg)은 SDS-PAGE에 용해되었고, PVDF 멤브레인에 전환되었다. 멤브레인은 5%의 무지방 우유를 포함하는 TBS 버퍼(20mM Tris-HCl + 150mM NaCl, pH 7.4)로 2시간 동안 고정되었고, 이후 다른 1차 항체와 함께 배양되었다. 멤브레인은 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)-결합된 항-마우스 IgG 또는 항-토끼 IgG와 함께 1시간 동안 면역블로팅을 위하여 배양되었고, 이어 West One(TM) 웨스턴 블롯 측정 시스템(iNtRON Biotechnology, Gyunggi-do, Korea)를 사용하여 가시화되었다.

2.7 통계적 분석

결과는 평균±SD로 또는 SEM으로 표현되었다. 모든 통계적 분석은 SPSS 21.0 소프트웨어(Statistical package for social, SPSs Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 3개 또는 이상의 그룹을 비교하기 위하여 듀넷 검정에 따라 ANOVA(One-way analysis of variance)를 사용하였다. p<0.05일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 하였다.

< 실시예 3> 실험결과 1

3.1 오디추출물의 페놀릭 프로파일

고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 MFE의 성분을 분석하기 위해 사용되었다. HPLC 시스템은 Agilent 1200시리즈(Agilent Technologies, Wilminton, DE, USA) 및 컬럼(C₁₈ 4.6X250mm, 5μm, phenomenex Luna, Inc)을 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.1% 아세트산을 물과 혼합하고 0.1%의 아세트산을 아세토니트릴에 혼합한 용액을 섞어 사용하였다. 각각의 피크에 대한 최고의 결과를 얻기 위하여, 선형기울기 용리(linear gradient elution) 프로그램을 사용하였다(10% B(0min), 100% B(100min), 100% B(102min), 10% B(105min), 10% B(110min)). 칼럼 오븐 온도는 30℃로 하였고 흐름 속도는 1.0 mL/min으로 하였으며 주입 부피는 10μL로 하였다. UV/Vis 탐지기는 214 nm로 설정하였다. HPLC를 이용하여 분리된 성분은 15 FT-ICr/MS를 이용하여 해당 성분의 분자량 스펙트럼을 확인하였다. ESI 양성/음성 이온화법에 의하여 각각 분자량 프로파일을 확인하였으며, 주입 부피는 100L/min(9:1의 비율로 LC로부터 분리의속도로 주입하였다. 분석 조건의 최적화를 위하여 7-아르기닌 클러스터(Arginine cluster)를 이용하여 m/z 200-1,500 영역의 피크 보정을 수행하였고, 이 때의 해상도는 1,000,000-270,000임을 확인하였다.

그 결과 도 5와 같이 MFE는 주로 양성 모드에서 각각 두 개의 520.3396 및 496.3396를 갖는, 세 개의 화합물인 것으로 나타났다. 이는 다음과 같이 계산되었다; m/z 496.33964는 0.18ppm의 오차범위에서 [C₂₉H₄₇NNaO₄]⁺로 확인되었으며, 이는 클루파노도닐 카르니틴(clypanodonyl carnitine), 아세톡시솔라듈시딘(acetoxysoladucidine) 및 펜타에노일 카르니틴(pentaenoyl carnitine)과 같은 구조의 화합물 중 하나일 것으로 예상되었다. 520.33954는 0.37ppm의 오차범위에서의 [C₃₁H₄₇NNaO₄]⁺인 것으로 매칭되었다. 또한 항산화 효과를 갖는 플라보노이드로 알려진 6-하이드록시캠페롤(6-hydroxykaempferol)과 6-하이드록시루테올린(6-hydroxyluteolin)이 MFE에서 확인되었다. 이외에 N-올레오일 티로신(N-oleoyl tyrosine) 및 1a,25-디하이드록시-24-옥소-23-아자에르고 칼시페롤(1a,25-dihydroxy-24-oxo-23-azaergo calciferol)이 확인되었다.

3.2 세포독성 실험

세포 생존은 EX-Cytox 세포 생존 분석 키트를 사용하여 제조 설명서에 따라 측정되었다. HT22 세포는 96-웰 플레이트에 웰 당 3X10³ 세포의 밀도이고, 각각의 웰은 100μL의 미디엄을 포함하도록 씨드하였다. 세포는 각각 RDP-EA(5-50 μg/mL)를 포함하거나 또는 포함하지 않는 조건에서 글루타메이트(5mM)로 처리되었다. 배양한지 11시간 후 10μL의 EZ-Cytox 용액은 각각의 웰에 첨가되었고 플레이트는 37℃에서 추가로 1시간 동안 배양되었다. 이후, 흡광도는 Emax precision microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 확인하였다. 세포의 생존률은 대조군 값과 비교하여 결정되었다.

세포는 다양한 농도의 MFE(10, 25, 50, 100, 250 및 500μg/mL)로 12시간 동안 처리하고, HT22세포의 흡광도를 450nm의 파장에서 세포 생존 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 그 결과 도 6에서와 같이 MFE는 세포 생존률을 향상시켰고 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.

3.3 글루타메이트 -유도된 세포 사망에 대한 MFE 의 세포보호 효과

글루타메이트-유도된 세포 자멸에 대한 MFE의 효과를 확인하기 위하여, HT22 세포는 5mM의 글루타메이트에 12시간 동안 노출되기 전에 다양한 농도의 MFE(10-500μg/mL)로 30분 동안 처리되었다. 측정 방향은 EZ-cytox 세포 생존 분석 키트를 사용하여 MFE의 세포독성으로 동일하게 설정되었다.

그 결과 도 7에서와 같이, 5mM의 글루타메이트와 함께 12시간 배양한 후 세포 독성은 약 50%정도 감소하였다. 그러나 MFE가 100μg/mL이상 처리되었을 경우, 세포는 대조군보다 더 많이 생존하였다. 결과적으로, MFE는 글루타메이트-유도된 세포독성을 거의 완벽하게 예방하고 글루타메이트-유도된 세포 사멸에 대한 보호 효과가 있을 것이다.

3.4 형태학적 변화에 대한 MFE 의 효과

5mM의 글루타메이트를 12시간 동안 처리하거나 처리하지 않고 MFE 처리된(10, 25, 50 또는 100μg/mL) HT22세포의 형태학적 변화를 측정하였다. 도 8과 같이 세포 형태학은 현미경으로 확인되었고 디지털카메라로 촬영하였다.

그 결과, 대조군 세포(도 8의 a)와 비교하여 글루타메이트만 처리된 세포(도 8의 b)는 많은 손상이 확인되었고, 증식하지 않은 것으로 확인되었다. 그러나 세포가 MFE로 처리되었을 경우 세포는 형태를 유지하고 있었고 농도에 의존하여 손상을 입지 않는 것으로 나타났다. 10μg/mL농도의 MFE(도 8의 c)에서는 (도 8의 b)와 같은 패턴을 나타냈다. 그러나 25μg/mL의 MFE를 처리한 그룹(도 8의 d)에서는 빠른 회복을 나타냈다. 50μg/mL의 MFE를 처리한 그룹(도 8의 e)과 100μg/mL의 MFE를 처리한 그룹(도 8의 f)에서는 대조군과 같은 수준으로 세포가 회복된 것으로 나타났다. 그러므로 HT22 세포의 형태학적 분석에서 MFE는 글루타메이트-유도된 산화적 스트레스에 대하여 보호효과가 있는 것으로 확인되었다.

3.5 글루타메이트 -유도된 세포외 활성산소종 형성에 대한 MFE 의 억제 효과

세포 외에서 높은 수치의 글루타메이트는 글루타메이트-시스테인 역수송체를 억제하고, 연속적으로 세포 외 글루타티온(GSH) 및 세포 내 ROS의 축적을 감소시키며, 궁극적으로 산화적 세포 사멸을 일으킨다.

도 9에서와 같이 5mM의 글루타메이트로 1시간 동안 처리된 HT22세포는 ROS의 축적을 나타내는 DCF 형광이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 약 3-fold정도 증가한 것으로 나타났다. 그러나 MFE로 처리한 것은 ROS의 발생을 효과적으로 감소시켰다. 다양한 농도의 MFE(10-100μg/mL)는 세포에서 글루타메이트-유도된 ROS의 생성을 대폭 감소시켰다. 특히, 100μg/mL의 MFE를 처리하였을 경우 글루타메이트-유도된 ROS 생성을 효과적으로 차단하였고, 세포 생존률을 처리하지 않은 그룹의 수준까지 회복시켰다. 결과적으로 MFE는 글루타메이트로 유도된 산화적 스트레스를 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> 실험결과 2

4.1 세포내 글루타티온( GSH ) 수준에 대한 MFE 의 효과

글루타티온(GSH)은 L-시스테인, L-글루타민산 및 글라이신 아미노산의 트리펩타이드이다. 이 화합물은 식물, 동물, 균류 및 몇몇의 박테리아와 고세균류에서 자유라디칼 및 과산화물과 같은 활성산소종에 의해 유발되는, 세포 화합물로 인한 손상을 방지하는 중요한 항산화제이다(Pompella A et al., 2003). HT22 세포에 글루타메이트를 처리하는 것은, 산화적 스트레스의 증가에 따라 세포 내 GSH의 고갈을 일으켜, 산화적 세포 죽음을 유발하는 것으로 보고되었다(Luo Y et al., J Biol Chem, 2006. 281(24):16436-42).

HT22세포에서 GSH 수준의 변화를 조사하기 위하여, 세포가 글루타메이트와 MFE에 노출되었을 때 관찰하였다. 그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이 5mM의 글루타메이트에 HT22 세포가 노출되었을때 GSH 수준의 감소가 일어났으나, MFE를 처리할 경우 농도에 의존하여 GSH의 수준이 회복되었다.

4.2 항산화 효소의 발현에 대한 MFE 의 효과

NQO-1, GCLC 또는 HO-1과 같은 항산화 효소는 보통 HT22 세포에서 Nrf2 시그널링 경로의 활성화를 통하여 ROS의 제거를 위해 반응한다. 세포는 MFE(10, 25, 50 또는 100μg/mL)로 처리 되었고 5mM의 글루타메이트로 12시간 동안 처리되거나 처리되지 않았다.

그 결과 도 11 a에서와 같이, 이러한 세 단백질의 발현은 글루타메이트만 처리한 그룹에서 현저하게 감소하였으나(p<0.01), MFE의 처리양에 의존하여 증가하였다. 그동안 12시간의 MFE의 처리는 HT22 세포에서 NQO-1, GCLC 또는 HO-1의 발현을 강화하였다. 게다가 NQO-1과 GCLC는 처리하지 않은 대조군과 비교하여, MFE의 처리량이 50μg/mL일때부터 현저하게 회복되었다.

시간-의존성에 대하여 확인하기 위해, 세포는 100μg/mL의 MFE로 0, 4, 8, 12, 18, 24 시간 동안 배양되었다. 그 결과 도 11 b에서와 같이, GCLC는 24시간 처리군까지 점차적으로 증가하였으나, HO-1 및 NQO-1은 18시간 처리군 까지 증가하였고 이후 감소하였다. 이는 Nfr2가 ARE의 HO-1와 같은 항산화 효소 유도와 관련이 있기 때문에, Nrf2/ARE 시그널링은 18시간 배양하는 동안 저항성이 있는 것으로 보인다.

4.3 Nrf2 핵 전위에 대한 MFE 의 효과

Nrf2(Nuclear factor E2-related factor 2)는 항산화 경로와 관련이 있는 단백질로 알려져 있다. 일반적인 조건에서, Nrf2는 Keap1(Kelch ECH associating protein 1) 단백질과 결합한다. 그러나 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase) 및 미토겐 활성화된 단백질 키나제를 포함하는 많은 키나제의 상승으로 인하여 지장을 받을 경우, Nrf2는 Keap1으로부터 분비되고 핵으로 전위된다. MAPKs와 PI3K/Akt 키나제에 의하여 전위된 Nrf2는 cis-활성화 요소인 ARE와 결합하고, 다양한 항산화 물질들의 전사를 조절한다. Nrf2와 MFE의 상호작용기능을 조사하기 위하여, 세포질 및 핵에서의 Nrf2의 단백질 발현은 웨스턴 블롯팅으로 확인되었다.

그 결과 도 12에서와 같이, 세포질에서의 Nrf2의 발현은 2시간까지 상향조절되었으나, 이후에는 하향조절되었다. 그동안, Nrf2의 핵발현은 MFE의 처리로 4시간 까지 증가하였다. 결과적으로, MFE는 Nrf2 단백질의 핵 부위로의 전위에 효과가 있는 것으로 확인되었다.

4.4 MAPK 시그널링 경로의 활성화에 대한 MFE 의 효과

MFE가 Nrf2의 핵으로의 전위를 유도하고, 항산화 효소의 Nrf2-의존성 발현을 유도하기 때문에, Nrf2의 MFE-매개된 핵 전위에서 관련된 상향조절 시그널링 경로를 조사하였다. 상향조절 메커니즘 중 하나는 Nrf2의 인산화는 ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPK이다. 이러한 단백질이 인산화되면, 핵에서 Nrf2의 전위가 유도된다. 웨스턴 블롯 분석은 MFE(100μg/mL)만을 단독 처리한 HT22 세포에서는 p38, ERK 및 JNK의 인산화가 증가한다는 것을 나타냈다. 도 13에서와 같이 p-p38의 발현은 MFE 처리 후 1시간일 때 최고점에 도달하였으나 다음 기간(2-4시간)에서는 그러하지 않았다. 또한 p-ERK 및 p-JNK의 수준은 MFE 처리 후 3시간일 때 현저하게 증가하였다. 이러한 결과에 근거하면, HT22 세포에 MFE를 처리하는 것은 p38, ERK 및 JNK의 인산화에 영향을 미치고, 이들은 핵에서 Nrf2의 전위를 일으킬 것이라는 것을 확인할 수 있다.

4.5 PI3K / Akt 경로의 활성화에 대한 MFE 의 효과

PI3K/Akt 시그널링 경로는 다양한 산화적 반응에 의해 활성화 된다. 많은 산화 효소를 생산하는 Nrf2/ARE 시그널링은, PI3K/Akt경로에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 그러므로 PI3k/Akt 시그널링 경로는 Nrf2-유도된 시그널링 형질도입의 중심이 되는 조절 요소이다. 이번 연구에서, HT22 세포에서 MFE의 처리 후 PI3K의 인산화는 1시간까지 서서히 증가했다. 그러나, p-PI3K 단백질의 발현은 MFE 처리 1시간 후에 감소하였다. Akt의 인산화는 MFE-처리된 세포에서 강화되었다. 특히, p-Akt의 수준은 1-2시간 사이에 가장 발현이 잘 되는 것으로 나타났다.

4.6 HT22 세포에서 MFE 는 JNK , p38 및 PI3K / Akt 를 통하여 Nrf2 핵 축적을 매개한다.

MFE가 항산화 효소 발현 및 Mrf2 축적을 p38, ERK 및 JNK 경로, 그리고 PI3K/Akt 시그널링 경로를 통하여 유도하는지에 대하여 더 확인하기 위하여, 약학적 억제제가 사용되었다. 개별 경로의 역할을 확인하기 위하여, 각각 ERK, p38, JNK, PI3K 및 Akt 경로 특이적 억제제인 PD98059(20μM), SB20358(10μM), SP600125(10μM), LY294002(20μM) 또는 MK2006(5μM)의 효과를 실험하였다.

그 결과 도 15와 같이 MFE의 처리는 핵에서 Nrf2의 발현은 MFE를 처리하지 않은 그룹과 비교하였을 때 약 2-fold정도 증가시켰다. 특이적 억제제 SB20358(p38 억제제), SP600125(JNK 억제제), LY294002(PI3K 억제제) 및 MK2006(Akt 억제제)와 같이 처리하였을때 MFE-매개된 Nrf2의 핵전위가 현저하게 억제되었다. 이와 대조하여, Nrf2의 핵 전위 발현은 억제제 PD98059(ERK 억제제)에 의하여는 억제되지 않았다. 이러한 결과는 MFE에 의한 Nrf2/ARE 시그널링의 활성화는 p38, JNK MAPK 경로 및 PI3K/Akt 경로의 활성화를 통하여 유도 될 것이라는 점을 나타낸다.

< 실시예 5> 실험결과 3

5.1 HT22 세포자멸에 대한 MFE 의 효과의 유동세포분석

HT22 세포는 글루타메이트와 MFE(10-100μg/mL)로 처리되었다. 그리고는 자멸성 및 괴사성 세포는 유동세포분석법을 이용하여 아넥신Ⅴ 및 7-AAD(7-aminoactinomycin D) 염색으로 검출되었다. 세포자멸의 초기 단계는 아넥신 Ⅴ-양성 및 7-AAD음성 이나, 후기 단계에서는 아넥신Ⅴ-양성 및 7-AAD-양성(y-axis)이다.

그 결과, 도 16에서와 같이 아무것도 처리되지 않은 대조군은 HT22 세포는 대부분 생존하는 것으로 나타난다. 그러나 글루타메이트의 처리는 세포 자멸 수준을 최대 60%까지 증가시켰다. 10-100μg/mL의 MFE의 처리는 글루타메이트의 처리로 감소한 세포 생존성을 처리양-의존적인 방식으로 향상시켰다. 특히, 100μg/mL의 MFE-처리된 그룹은 대조군과 유사한 수준으로 세포 생존 수준이 복귀되었다. 그러므로 MFE의 처리는 HT22 세포에서 보호 효과가 있고 글루타메이트-유도된 자멸성 세포 죽음에 영향을 미친다고 할 수 있다.

5.2 HT22 세포에서 미토콘드리아 막 포텐셜에 대한 MFE 의 효과 유동세포분석

미토콘드리아 막 포텐셜(△Ψm)의 불균형은 보통 세포자멸의 초기단계의 증상인 것으로 알려져 있다. HT22 세포에서 글루타메이트가 처리될 경우, ROS의 과생성이 일어나고 이는 막 내부의 삼투성과 포테셜(△Ψm)의 변화를 일으킬 수 있고 미토콘드리아로부터 세포질로 시토크롬 C의 분비를 유도할 수 있어, 결과적으로 세포자멸을 일으킨다(Hasnain SE et al., 2003). 이번 연구에서, MFE가 글루타메이트-유도된 △Ψm 손실에 보호효과를 갖는지 여부를 확인하기 위하여, 미토콘드리아 막 포텐셜(△Ψm) 분석 키트가 사용되었다.

그 결과 도 17에서와 같이 글루타메이트-처리된 HT22 세포에서 △Ψm의 감소가 관찰되었다. 그러나 MFE의 처리는 농도에 의존하여 △Ψm가 손실된 세포의 비율을 감소시켰고, 가장 높은 농도의 MFE가 처리된 그룹에서 대조군과 비슷하게 회복되었다. 따라서 MFE에는 글루타메이트 유도된 △Ψm를 회복시키는 효과가 있다고 할 수 있다.

< 실시예 6> 실험결과 4

6.1 Bcl2 패밀리에서의 MFE 의 효과

글루타메이트 처리 후 뉴런세포에서 세포 내 ROS는 증가하였고, 이는 Ca^{2 +}의 유입을 일으켰다. 이는 미토콘드리아 기능 이상을 초래할 수 있고 또한 미토콘드리아 막 포텐셜의 붕괴를 매개하는 Bax/Bcl2와 같은 전-/항-세포자멸 조절인자의 변화효과를 가져올 수도 있다. 도 19와 같이 HT22 세포에 글루타메이트가 처리될 경우, Bcl2의 수준은 감소하고, 이와 대조적으로 Bax는 증가한다. Bcl2 패밀리 중 하나인 Bax 단백질은, 세포자멸을 촉진한다(Wylle et al., Int Rev Cytol, 1980. 68:251-306). 이 단백질의 발현은 글루타메이트의 처리로 증가하였으나, MFE의 처리로 억제되었다. 특히, 25-100μg/mL 범위 농도의 MFE와 함께 배양된 그룹의 수준은 대조군과 같은 수준으로 감소하였다. Bax와 대조적으로 Bcl2는 세포 사멸 조절인자인 Bcl2패밀리의 초기 인자로, Bcl2의 발현은 산화적 세포질 손상 또는 칼슘 유입-유도된 세포 죽음으로부터 세포자멸을 방지한다. 세포에 글루타메이트를 처리하는 것은 Bcl2 단백질의 발현을 유도한다. 그러나 MFE의 처리는 Bcl2 발현의 수준을 대조군 이상으로 회복시켰다. 따라서 MFE는 세포 죽음 조절인자로 알려진 Bcl2 패밀리의 발현 변화에 효과가 있다고 할 것이다(도 18 참조).

6.2 AIF , 칼페인 및 시토크롬 C를 포함하는 자멸성 단백질의 발현에 대한 MFE의 효과

AIF, 칼페인 및 시토크롬 C는 글루타메이트에 의해 유도된 세포자멸성 단백질로 알려져 있다. AIF는 미토콘드리아로부터 분비되고 핵으로 절단된 형태(tAIF)로 전위되고, 세포자멸-관련된 단백질의 전사가 촉진된다. 칼페인은 글루타메이트에 의해 유도된, 과도한 Ca^{2 +} 유입에 의해 활성화되는 프로테아제 이다. 시토크롬 C는 산화와 환원작용을 할 수 있으나 산소와 결합하지는 않는다. 또한 세포질로의 시토크롬 C의 분비, 단백질의 Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1)과의 결합은, 세포자멸을 유도한다. 이에, 글루타메이트-유도된 AIF, 칼페인, 시토크롬C의 발현에 대한 MFE의 효과를 조사하였다.

그 결과 도 19와 같이 세포가 5mM의 글루타메이트로 12시간 동안 배지에서 처리되었을 때, 세포자멸 단백질과 관련된 AIF, 칼페인 및 시토크롬 C는 약 3~7folds 정도 증가하였다. 또한, MFE의 처리는 글루타메이트-유도된 AIF, 칼페인 및 시토크롬 C의 생성을 농도에 의존하는 방식으로 감소시켰다. 100μg/mL의 MFE가 처리된 그룹에서는 글루타메이트-유도된 세포자멸성 단백질의 형성이 처리되지 않은 대조군의 수준과 유사하게 완벽하게 차단되었다. 따라서 MFE는 글루타메이트-유도된 세포자멸성 단백질을 억제함으로써 산화적 스트레스에 대한 세포자멸을 방지하는 효과가 있다고 할 수 있다.

6.3 BDNF 및 p- CREB 의 활성화에 대한 MFE 의 효과

CREB는 미토콘드리아와 함께 발현되고, 미토콘드리아 단백질 발현 및 뉴런의 생존에 영향을 미친다. CREB 인산화는 신경영양 패밀리의 일종인BDNF(brain-derived neurotrophic factor)와 같은 단백질의 발현과 관련이 있는 것으로 알려져 있는데, 이는 미성숙 뉴런의 발달을 촉진하고 성숙한 뉴런의 생존 및 기능을 조절한다.

MFE가 HT22 세포에서 BDNF 및 p-CREB수준을 회복시킬 수 있는지를 시험하기 위하여, 웨스턴블로팅으로 BDNF 및 p-CREB의 함량을 측정하였다. 그 결과 도 20과 같이, 글루타메이트의 처리는 BDNF 및 p-CREB 단백질 모두의 발현을 대조국과 비교하여 감소시키는 반면, MFE-처리된 그룹에서는 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 100μg/mL의 MFE가 처리된 그룹에서 p-CREB의 수준이 대조군과 유사하게 보호되었다. 따라서 MFE는 산화적 스트레스에의하여 미토콘드리아 단백질의 발현 및 뉴런의 생존이 감소하는 것을 방지할 수 있다.

6.4 MFE 는 HT22 세포에서 TrkB 를 통한 p- CREB 발현을 매개한다.

BDNF/TrkB/p-CREB 경로가 MFE 뉴런보호에서 중요한 역할을 하는지 더 알아보기 위하여, p-CREB 발현에서 K252a의 효과를 분석하였다. K252a는 TrkB 수용체의 활성화를 억제하는 억제제이다.

이번 실험에서, 그룹은 7조건으로 나뉘어졌고 K252a는 MFE 및 글루타메이트보다 먼저 1시간 동안 처리되었다. 그 결과 도 21에서와 같이, 5mM의 글루타메이트에 노출된 세포는 p-CREB 발현의 감소를 유발하였고 p-CREB의 발현 감소는 MFE 처리로 대조군 이상으로 강화되었다. 또한, K252a의 전-투여(200nM, 1시간)로 p-CREB의 하향 조절이 확인되었다. 따라서 MFE는 TrkB 수용체를 통하여 p-CREB의 발현을 강화함을 확인할 수 있다.

즉, 오디추출물에는 클루파노도일 카르니틴, 아세톡시솔라듈시닌 및 펜타에노일 카르니틴과 6-하이드록시캠페롤, 6-하이드록시루테올린과 같은 플라보노이드 화합물이 포함되어 있는 것으로 확인되었다.

오디추출물은 농도에 상관없이 세포독성을 나타내지 않았고, 신경세포에서 글루타메이트-유도된 산화적 스트레스에 대하여 보호효과가 있는 것이 확인되었다. 또한, 산화적 스트레스로 인하여 감소한 GSH, 항산화 효소의 발현, 및 관련 시그널링 경로를 회복시키는 효과가 있고, 세포의 죽음과 관련된 단백질의 발현을 억제하는 등 세포자멸로부터 보호하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

따라서, 오디추출물은 글루타메이트 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호할 수 있고 세포 자멸을 억제할 수 있으므로, 글루타메이트로 인하여 유발되는 트라우마, 뇌졸중, 알츠하이머등과 같은 신경병성 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 오디(Mulberry) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 오디추출물은 탄소수 1-4의 알콜, n-헥산, n-부탄올, 클로로포름 및 아세트산에틸(Ethyl acetate)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 오디추출물은 아세트산에틸(Ethyl acetate)로 추출한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 오디추출물의 조성물 내 농도는 25-100㎍/mL인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 인지기능 장애 질환은 알츠하이머, 허혈성 뇌졸중, 외상선 뇌손상, 우울증 및 파킨슨병으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 오디(Mulberry) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

Images