WO2014025202A1 - 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2014025202A1
WO2014025202A1 PCT/KR2013/007118 KR2013007118W WO2014025202A1 WO 2014025202 A1 WO2014025202 A1 WO 2014025202A1 KR 2013007118 W KR2013007118 W KR 2013007118W WO 2014025202 A1 WO2014025202 A1 WO 2014025202A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peony
health
pharmaceutical composition
mixed extract
cognitive dysfunction
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/007118
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2014025202A8 (ko
Inventor
박영준
성하창
박지혜
조예경
강지윤
박형록
김선여
오명숙
Original Assignee
씨제이제일제당(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당(주) filed Critical 씨제이제일제당(주)
Priority to CN201380039376.7A priority Critical patent/CN104507486A/zh
Publication of WO2014025202A1 publication Critical patent/WO2014025202A1/ko
Publication of WO2014025202A8 publication Critical patent/WO2014025202A8/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/906—Zingiberaceae (Ginger family)
    • A61K36/9068—Zingiber, e.g. garden ginger
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/65—Paeoniaceae (Peony family), e.g. Chinese peony
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of dementia and cognitive dysfunction, and more specifically, to the dementia and cognitive dysfunction comprising a mixture of health and peony as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition and a functional health food which are effective in preventing or treating.
  • senile dementia including Alzheimer's disease
  • cognitive function significantly reduces the quality of life, both personally and socially, and makes people and people around them unhappy. It is the fourth leading cause of death for the elderly following disease and stroke.
  • Dementia can be caused by many causes, but the most convincing scientific causes are: First, it is recognized that a decrease in the concentration of a neurotransmitter called acetylcholine in the hippocampus is highly related to dementia. In patients with dementia, acetylcholine is hydrolyzed by acetylcholine esterase, which hydrolyzes acetylcholine to make choline, resulting in relatively low levels of acetylcholine. Therefore, it has been reported that the inhibition of acetylcholine esterase increases the concentration of acetylcholine in the brain, thereby improving symptoms of dementia patients. Drugs that have been developed and used as an acetylcholine esterase inhibitor by FDA approval include donepezil, galanthamine, and rivastigmine.
  • Amyloid beta (A ⁇ ) plaques and entanglement of intercellular nerve fibers are known to be a major cause of Alzheimer's dementia, which is found in the brain of patients with dementia.
  • Amyloid beta (A ⁇ ) is cleaved by ⁇ -amyloid precursor protein ( ⁇ APP) by BACE1 ( ⁇ -site APP-cleaving enzyme 1) and ⁇ -secretase activity. Is generated.
  • BACE1 ⁇ -site APP-cleaving enzyme 1
  • BACE1 ⁇ -site APP-cleaving enzyme 1
  • Amyloid beta produced in this way inhibits the signaling between nerve cells and causes inflammation. Therefore, it has been reported that inhibiting the aggregation of amyloid beta reduces the damage of the cranial nerve and improves cognitive function.
  • Cognitive dysfunction refers to decreased attention, decreased learning ability, decreased memory, and sensory cognitive impairment.
  • Memory impairment is a common symptom, and most of the memory of past events is intact, but the ability to remember and learn new information becomes difficult, resulting in difficulty in learning.
  • Herbal extracts have significantly less side effects than other drugs, but in some cases, there are also other side effects, and the therapeutic effect is not enough yet.
  • the present invention uses 46 kinds of herbal medicines, including health and peony, to find herbal medicines that are effective in improving dementia and cognitive dysfunction. Inhibition of acetylcholine esterase, amyloid beta aggregation inhibitory activity and nerve growth factor (nerve growth factor, NGF), a novel object recognition test (NORT), passive avoidance test (PAT), Y in scopolamine-induced memory impaired animal models
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • NNT nerve growth factor
  • NNT nerve growth factor
  • NTT nerve growth factor
  • PAT passive avoidance test
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia and cognitive dysfunction comprising a therapeutically effective amount of health, peony mixture extract and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides a functional food composition for improving dementia and cognitive dysfunction comprising health, peony mixed extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a health, peony mixed extract according to the present invention as an effective ingredient effective in preventing and / or treating dementia and cognitive dysfunction.
  • the pharmaceutical composition and / or food composition comprising the health, peony mixed extract of the present invention as an active ingredient can prevent and / or treat dementia, prevent or treat memory impairment, and also enhance learning or memory.
  • NGF nerve growth factor
  • FIG. 2 is a graph showing the secretion promoting effect and cytotoxicity evaluation of NGF according to the mixing ratio of the health, peony mixed extract of the present invention in glioma C6 cell line of rats.
  • Figure 3 is a graph showing the secretion inhibitory effect and cytotoxicity evaluation of LPS-induced NO in BV-2 cells according to the mixing ratio of health, peony mixture extract of the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the memory improvement effect in the novel object recognition test (NORT) of the scopolamine-induced health, peony blend extract according to the present invention by the combination ratio of the present invention.
  • Recognition index is the percentage of time it takes to search for a new object.
  • 5 is a graph showing the memory-improving effect in the Y-maze test of health, peony mixed extract according to the present invention in scopolamine-induced rats.
  • FIG. 6 is a graph showing the memory improvement effect in the passive avoidance test (PAT) of the health, peony mixture extract according to the present invention in scopolamine-induced rats.
  • PAT passive avoidance test
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia and cognitive dysfunction comprising a therapeutically effective amount of health, a peony mixture extract and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Dementia and cognitive dysfunction of the present invention may include Alzheimer's disease and vascular dementia, Parkinson's disease, mild cognitive impairment, senile dementia, frontal lobe dementia and the like.
  • Health and peony used in the present invention has been used for the purpose of treating and preventing diseases as a herbal herbal medicine.
  • the dried rhizomes of Zingiber officinale roscoe are dried roots of the perennial herbaceous ginger, which belongs to the ginger family. Ginger has been widely used as a tonic, gangjeong and anticancer food since ancient times. Ginger or ginger, which is a pungent ingredient of ginger, has the effect of inhibiting acetylcholine esterase or inhibiting aggregation of amyloid beta, and thus is known to be effective in treating Alzheimer's disease and the like (Kim DS et al., J Altern Complement). Med. 2007 Apr; 13 (3): 333-40).
  • Peony Paeonia lactiflora Pallas
  • Amphitaceae a perennial herbaceous plant belonging to the family Amphitaceae, and contains paeoniflorin and alkaloid paeonine, tannin, resin and benzoic acid as glycosides.
  • Peony is known to have neuroprotective action and antioxidant activity (National Patent Publication No. 10-2006-0023885, etc.).
  • the present invention is characterized by comprising a mixture of health, peony as an active ingredient, and by using a mixture of health and peony, the additive effect is increased than when using the health, peony as a single extract, respectively do. In addition, the effect is further maximized when used at a specific compounding ratio.
  • Each herbal ingredient used in the present invention is based on the dried weight.
  • the mixed extract of health and peony may be a mixed extract of health and peony mixed at a ratio of 1: 10-10: 1, preferably a mixture of healthy and peony at a ratio of 1: 5-5: 1 Extract.
  • the health, peony mixed extract includes the step of extracting health, peony with an extraction solvent selected from the group consisting of C 1 ⁇ C 4 alcohol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, chloroform, and a mixed solvent thereof Can be obtained by performing an extraction process. More preferably, the health, peony mixed extract may be an ethanol extract obtained by extracting health, peony with ethanol.
  • the amount of the extractant used is not particularly limited.
  • the extractant may be used in a ratio of about 1 to 10 times by volume, preferably about 5 to 10 times by volume, based on 1 weight of health and peony powder sample.
  • the extraction may be performed by extraction methods such as cold needle extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction for about 1 hour to 24 hours, preferably about 1 hour to 5 hours.
  • the extraction may be performed by reflux cooling extraction method 79 °C, and the extraction process may be performed once or several times, preferably about three times can be repeated.
  • the obtained extract can be concentrated under reduced pressure or dried under reduced pressure at a conventional method, for example, at about 20 to 100 ° C., preferably at about 30 to 70 ° C., to obtain a ginger extract in liquid or powder form.
  • the health, peony mixed extract can be obtained by performing an additional extraction process to increase the content of the active ingredient. That is, (a) extracting health, peony with C 1 -C 4 alcohol; And (b) extracting by adding water and n-hexane to the extract obtained in step (a), and separating the obtained n-nucleic acid layer. Peony mixture extract can be obtained.
  • step (a) extracting health, peony with C 1 -C 4 alcohols;
  • step (b ') adding water and n-hexane to the extract obtained in step (a) to extract and separating the aqueous layer;
  • step (c) extracting ethyl acetate by adding ethyl acetate to the aqueous layer obtained in step (b '), and separating the ethyl acetate layer obtained.
  • terapéuticaally effective amount means an amount necessary to alleviate the symptoms of at least one disease as described herein to be prevented, reduced or treated.
  • composition of the present invention comprises 0.01 to 95% by weight of the extract based on the total weight of the composition.
  • compositions comprising extracts according to the invention may be in various forms, including pharmaceutically acceptable carriers, for example oral formulations, external preparations, suppositories, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. And sterile injectable solutions. Especially preferably, it can be formulated in an oral dosage form.
  • pharmaceutically acceptable carriers for example oral formulations, external preparations, suppositories, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • suppositories such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • sterile injectable solutions Especially preferably, it can be formulated in an oral dosage form.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like. Also included are diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and the like.
  • Oral solid preparations include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose. ), Gelatin, and the like, and may include a lubricant such as magnesium stearate, talc, and the like.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like, and may include water, diluents such as liquid paraffin, wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, and the like.
  • Parenteral preparations include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and ethyl. Injectable esters such as oleate and the like.
  • aqueous solvents such as olive oil, and ethyl.
  • Injectable esters such as oleate and the like.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycero gelatin and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition comprising the health, peony mixed extract of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. For example, it can be administered in a dose of 0.01 to 500 mg / kg, preferably 10 to 300 mg / kg per day, the administration may be administered once or several times a day.
  • the present invention also provides a food composition for improving or alleviating symptoms of learning or memory impairment, comprising a healthy, peony mixed extract as an active ingredient.
  • the health, peony mixed extract can be obtained as described above.
  • the food composition of the present invention can be used as a dietary supplement.
  • health functional food means a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to Act No. 6767 of the Health Functional Food Act, and "functionality” refers to the structure of the human body. And ingestion for the purpose of obtaining nutrients for function or for obtaining useful effects in health uses such as physiological actions.
  • the food composition of the present invention may include a conventional food additives, and the suitability as the "food additives", unless otherwise specified, corresponding items according to the General Regulations and General Test Methods of the Food Additives approved by the Food and Drug Administration It is determined by the standard and the standard.
  • Food Additive Revolution examples include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid, natural additives such as color pigments, licorice extracts, crystalline cellulose, high color pigments, guar gum, And mixed preparations such as sodium L-glutamate, algae additives, preservatives and tar dyes.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid
  • natural additives such as color pigments, licorice extracts, crystalline cellulose, high color pigments, guar gum
  • mixed preparations such as sodium L-glutamate, algae additives, preservatives and tar dyes.
  • the food composition of the present invention may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. for the purpose of improving or alleviating symptoms or improving learning or memory impairment.
  • the food composition of the present invention may comprise from 0.01 to 95% by weight, preferably 1 to 80% by weight of health, peony mixed extract based on the total weight of the composition.
  • the health functional foods in the form of tablets are granulated in a conventional manner with a mixture of health, peony mixture extract, excipients, binders, disintegrants, and other additives, and then compression-molded with a lubricant or the like, The mixture can be directly compression molded.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a mating agent and the like, if necessary, may be coated with a suitable coating agent.
  • Hard capsules of the health functional foods in the form of capsules can be prepared by filling a conventional hard capsules with a mixture of additives such as health, peony mixed extract and excipients, or granules or peeled granules thereof.
  • the peony mixture extract may be prepared by filling a mixture with an additive such as an excipient into a capsule base such as gelatin.
  • the soft capsule agent may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, as necessary.
  • the dietary supplement in cyclic form can be prepared by molding a mixture of excipients, binders, disintegrants, etc. in a healthy, peony mixed extract in a suitable manner, and if necessary, the coating is carried out with white sugar or other suitable coating agent, or starch, talc or You can also be greeted with a suitable substance.
  • the health functional food in the form of granules may be prepared by granulating a mixture of the above-mentioned health, peony mixed extract, excipient, binder, disintegrant, etc. in a suitable manner, and may contain a flavoring agent, a copper, and the like as necessary.
  • excipients binders, disintegrants, glidants, copulation agents, flavoring agents, etc. of the present invention are described in documents known in the art and include those having the same or similar functions. Sacrament, Korean College of Pharmacy, 5 revised edition, p33-48, 1989).
  • a mouse glioma C6 cell line known to secrete nerve growth factor (NGF) was used.
  • C6 cells were obtained from the Korea Cell Line Bank (KCLB No. 10107).
  • C6 cells were treated with DMEM medium (Gibco) supplemented with 3.4 g / L sodium bicarbonate (NaHCO 3 , sodium bicarbonate), 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin antibiotic (10000 U / ml). BRL, USA).
  • PC12 cells for neuronal differentiation by NGF were supplemented with 2.0 g / L sodium bicarbonate, 10% horse serum, 5% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin antibiotic (10000 U / ml) Cultured using RPMI1640 medium (Gibco BRL, USA). The fetal bovine serum and horse serum used were inactivated at 55 ° C. for 30 minutes before use, and were cultured in a cell incubator maintained at 70% humidity and 37 ° C. and supplied with 5% carbon dioxide.
  • the measurement of neuronal growth factor secreted from C6 cells was quantified by treatment of the condition medium in the neuronal growth factor measurement kit (DY556, R & D system, USA).
  • the growth factor was quantitatively analyzed in conditioned medium obtained by treatment with C6 cells, and the results are shown in FIG. 1.
  • the supernatant cultured in the above example was collected and the remaining cells contained 3- [4,5-dimethylthiazo-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (3- After treatment with [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) (MTT, sigma Cat # M5655) for 1 hour, 200 ⁇ l of DMSO was added to lyse the cells, followed by a 570 nm wavelength value. The cytotoxicity was evaluated by measuring with an ELISA plate reader.
  • the NGF secretion promoting effect was different according to the ratio of peony and healthy mixed extract when calculating the non-treated group on the basis of 100%, which is a promoting effect within the range of not showing cytotoxicity. It was confirmed through. In each case, the optimal blending condition of Peony 3 at the ratio of Health 1 is considered to have the highest NGF secretion promoting effect.
  • Mouse-derived glial cells were cultured in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin.
  • the BV-2 cells were dispensed into 3> 10 4 cells in each well of a 96 well plate and incubated for 24 hours. Thereafter, the healthy and peony mixed extracts prepared in Example 1 were treated for each concentration, and after 30 minutes, lipopolysaccharide (LPS) was treated with a concentration of 100ng / ml and incubated for 24 hours. After 24 hours, the supernatant was collected and 1: 1 with Grease reagent (N- (1-naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride (sigma cat # N9125) + Sulfanilic acid in 5% phosphoric acid (sigma cat # S9251)).
  • LPS lipopolysaccharide
  • the LPS-treated group was converted to 100% standard, and the calculation showed that the NO secretion inhibitory effect was different according to the ratio of peony and healthy mixed extract, which inhibited NO secretion within the range of not showing cytotoxicity. The effect was confirmed by MTT assay.
  • the optimal compounding condition was that the ratio of health 1 to peony 3 and health 1 to peony 1 were the most effective in suppressing NO secretion.
  • Test Example 3 Novel object recognition test (NORT) in a scopolamine-derived animal model
  • mice Seven-week-old ICR male mice (30-35 g) were purchased from Orient Bio and used in animal breeding rooms at Kyung Hee University College of Pharmacy for at least one week. Water and feed were freely consumed, and the temperature (22 ⁇ 2 ° C), humidity (53 ⁇ 3%) and contrast cycle (12 hours) were automatically controlled.
  • the rats were divided into nine groups of eight animals. After one week of adaptation, the first group (control) received 0.5% methyl cellulose orally once a day at 5 mL / kg of mouse weight per day, and the second group (scopolamine alone), Group 3 (donepezil 1mg / kg administration group), Group 4 (health extract 50mg / kg administration group), Group 5 (peony extract 50mg / kg administration group), Group 6 (healthy three major peony 1 ratio mixed extract 50mg / kg Administration group), Group 7 (50mg / kg dose of 1 healthy Peony 1 extract), Group 8 (50mg / kg dose of 1 healthy Peony 3 ratio mixed extract) were dissolved in 0.5% methyl cellulose Was administered orally once a day for 1 day.
  • the drug was orally administered once and 30 minutes after drug administration, scopolamine (1 mg / kg) was intraperitoneally administered and 30 minutes after NORT.
  • NORT moved the animals to the Behavior Observation Room for 5 minutes, and after 3 minutes of exposure, placed two identical sets (1 set) in a box at 30 cm intervals and measured the time the animals spent searching for 3 minutes.
  • the withdrawal was prepared with one object that was revealed when exposed to the same box and one newly replaced object, and the time taken by the animal was measured. The result is shown in FIG. 4.
  • Test Example 4 Y maze test in animal model induced with scopolamine
  • the rats were divided into four groups of 10 rats. After one week of adaptation, the first group (control) received 0.5% methyl cellulose orally once a day at 5 mL / kg of mouse weight per day, and the second group (scopolamine alone), Group 3 (peony, healthy mixed extract 50mg / kg) and group 4 (donepezil 1mg / kg administration group) were orally administered with a drug dissolved in 0.5% methyl cellulose once a day for 1 day.
  • the drug was orally administered once and 60 minutes after the administration of scopolamine (1mg / kg) was intraperitoneally administered 30 minutes after the Y maze.
  • the Y maze device is composed of three identical arms (8 cm wide, 30 cm long and 14 cm high), each arranged at a constant angle of 120 ° to each other.
  • the mouse was placed at the tip of one arm and allowed to wander freely in the Y maze for 8 minutes.
  • Spontaneous alteration (%) was assessed by measuring the number and order of entry into each cancer. Alteration is defined as the case of entering three arms sequentially, that is, ABC, BCA, CAB, and the like. % Alteration was calculated by the following equation.
  • Test Example 5 Passive avoidance test in scopolamine-derived animal model
  • mice were divided into 10 animals per group.
  • the first group (control) was orally administered 0.5% methyl cellulose at 5 mL per kg body weight for 3 days, and the second group was treated with 1 mg / kg of Donepezil dissolved in 0.5% methyl cellulose.
  • Group 3 was orally administered a healthy, peony mixture extract dissolved in 0.5% methyl cellulose at 50 mg / kg for 3 days. Once a day orally for 3 days and a passive avoidance task (1 hour after the last oral administration) was performed as follows.
  • Passive avoidance testing is a test device in which the internal structure is divided into two equal spaces, with the door in the middle of the first day, with one light on and the other one staying in the dark for 10 seconds first on the light side between
  • the sole of the foot was subjected to electrical stimulation of 0.25 mA.
  • a manual avoidance test was conducted in the same manner and the time to stay in the bright place was measured. The result is shown in FIG.
  • the control group showed 150 ⁇ 3.39 seconds to maintain memory due to electric shock, and the donepezil group was about 90 seconds, healthy, peony mixed extract 50 mg / kg group was 120 seconds, and the scopolamine group was 40 seconds.
  • the peony mixed extract group significantly increased the retention time (p ⁇ 0.05).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 건강(Zingiber officinale ROSC.), 작약(Paeonia lactiflora Pallos) 혼합추출물을 유효 성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. [대표도] 도 4

Description

작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 발명은 치매(dementia) 및 인지기능장애(cognitive dysfunction)의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 건강, 작약의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애의 예방 또는 치료에 효과가 있는 약제학적 조성물 및 기능성 건강 식품에 관한 것이다.
전 세계가 빠른 속도로 고령화 사회로 진입하고 있으며, 이에 따라 인간은 질병없이 건강하게 장수할 수 있는 높은 삶의 질을 추구하고 있다. 과학의 발달로 인한 수명의 연장으로 노인 인구가 증가하면서, 신경퇴행성 질환인 치매 환자의 비율이 급증하고 있다.
일반적으로, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)을 비롯한 노인성 치매는 점진적인 인지기능의 소실을 특징으로 하는 질환으로서, 개인적으로나 사회적으로 삶의 질을 크게 떨어뜨리고 본인과 주변의 사람들을 불행하게 만들며, 암, 심장질환 및 뇌졸중에 이어 노인 사망의 네 번째 원인이 되고 있다.
치매는 여러 가지 원인에 의해 발병이 되지만, 이중 가장 설득력 있는 과학적 원인은 다음과 같다. 첫째로, 두뇌 해마(hippocampus) 부위의 아세틸콜린 (acetylcholine)이라는 신경전달물질(neurotransmitter)의 농도 저하가 치매와 매우 깊은 관련이 깊은 것으로 인식되고 있다. 치매 환자의 경우, 아세틸콜린을 가수분해하여 콜린(choline)으로 만드는 작용을 하는 아세틸콜린 에스테라아제(acetylcholine esterase)에 의해 아세틸콜린이 가수분해됨으로써 상대적으로 아세틸콜린의 농도가 저하된다. 따라서, 아세틸콜린 에스테라아제를 억제할 경우 뇌의 아세틸콜린의 농도가 상승하여 치매환자의 증상이 개선된다는 것이 보고되어 있다. 아세틸콜린 에스테라아제 저해제로서 FDA 승인을 받아 치매 치료제로 개발되어 사용되고 있는 의약품은 도네페질(donepezil), 갈란타민(galanthamine), 리바스티그민(rivastigmine)등이 있다.
그러나, 이와 같은 아세틸콜린 에스테라아제 저해 약물들은 대부분 말초신경의 콜린성 부작용이 있고, 반감기가 너무 짧으며, 간 독성 등의 심각한 부작용이 있다( Br.J.Psychiatry, 138, 46, 1981).
둘째로, 아밀로이드 베타(Amyloid beta; Aβ) 플라크의 응집 및 세포 간 신경섬유의 엉킴은 알츠하이머성 치매 유발의 주원인으로 알려져 있으며, 이는 치매 환자의 뇌에서 많이 발견된다. 아밀로이드 베타(Aβ)는 β-아밀로이드 전구체 단백질(β-amyloid precursor protein; βAPP)로부터 BACE1(β-site APP-cleaving enzyme 1) 및 β-세크리타아제(β-secretase) 활성에 의한 절단 작용을 통해 생성된다. BACE1의 과발현은 APP의 β-세크리타아제 절단을 증가시켜 아밀로이드 베타를 생성시킨다. 이렇게 생성된 아밀로이드 베타는 신경세포간 신호전달을 억제하고 염증을 유발한다. 따라서, 아밀로이드 베타의 응집을 억제할 경우 뇌신경의 손상이 줄어들어 인지기능이 호전된다는 것이 보고되어 있다.
인지기능장애는 주의력 감소, 학습능력의 감소, 기억력 감퇴, 감각인지기능(perception)의 장애 등을 나타낸다. 기억력의 장애는 흔한 증상으로서 대부분 과거의 사건에 대한 기억력은 온전하지만 새로운 정보를 기억하고 배우는 기능에 장애가 생기게 되어 학습에 어려움이 생기게 된다.
최근, 아세틸콜린 에스테라아제를 억제하거나 치매 유발 단백질인 아밀로이드 베타의 응집을 억제할 수 있는 생약 추출물을 이용하여 치매 또는 인지기능장애를 예방 또는 치료하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(국내특허공개번호 제10-2005-0095819호 등). 생약 추출물은 다른 약물에 비하여 부작용이 크게 적으나 경우에 따라서는 또 다른 부작용도 우려되며, 아직까지는 그 치료효과 또한 충분하지 않다.
본 발명은 치매 및 인지기능장애의 개선에 효과를 가지는 생약을 찾고자 건강, 작약을 포함한 46종의 생약을 이용하여, 아세틸콜린 에스테라아제의 저해, 아밀로이드 베타 응집 억제 활성 및 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)의 분비 유도 효과를 가지며, 스코폴라민(scopolamine)으로 유도된 기억력 손상 동물 모델의 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT), 수동적 회피 테스트(passive avoidance test; PAT), Y-미로 테스트(Y maze test)에서 기억력 개선 효과, 학습증진 및 공간지각 능력을 정상 동물군에 가깝게 향상시키는 탁월한 효능을 가지는 혼합추출물을 개발하고, 이를 이용한 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 치료학적 유효량의 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치료학적 유효량의 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 및 인지기능장애 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 치매 및 인지기능장애 예방 및/또는 치료에 효능이 있는 유효성분으로서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 식품 조성물은 치매의 예방 및/또는 치료, 기억력 장애를 예방 또는 치료할 수 있으며, 또한 학습 또는 기억력을 증진시킬 수 있다.
도 1은 쥐의 신경교종세포(glioma) C6 세포주에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF) 분비 유도 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 쥐의 신경교종세포(glioma) C6 세포주에서 본 발명의 건강, 작약 혼합 추출물의 혼합 비율에 따른 NGF의 분비 촉진 효과 및 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 건강, 작약 혼합추출물의 혼합 비율에 따른 BV-2세포에서의 LPS로 유도된 NO의 분비 억제 효과 및 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 스코폴라민으로 유도된 쥐에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 배합비별 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT)에서의 기억력 개선효과를 나타낸 그래프이다. 인지 지표(recognition index) 는 새로운 물체를 탐색하는데 걸리는 시간의 비율이다.
도 5는 스코폴라민으로 유도된 쥐에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 Y-미로 테스트(Y maze test)에서의 기억력 개선효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 스코폴라민으로 유도된 쥐에서 본 발명에 따른 건강, 작약 혼합추출물의 수동적 회피 테스트(passive avoidance test; PAT)에서의 기억력 개선 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 치료학적 유효량의 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 치매 및 인지기능장애에는 알츠하이머병 및 혈관성 치매(vascular dementia), 파킨슨병, 경도 인지장애(mild cognitive impairment), 노인성 치매, 전측두엽 치매 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 건강 및 작약은 종래부터 한방생약으로 질환치료 및 예방을 목적으로 사용되어 왔다.
건강(dried rhizomes of Zingiber officinale roscoe)은 생강과에 속한 다년생 초본인 생강의 뿌리줄기를 건조한 것으로, 생강은 예로부터 강장, 강정, 항암식품으로 널리 이용되어 왔다. 생강 또는 생강의 매운 성분인 진저올 등은 아세틸콜린 에스테라아제를 저해하거나 아밀로이드 베타의 응집을 억제하는 효과를 가지고 있으므로 알츠하이머병 등의 치료에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Kim DS et al., J Altern Complement Med. 2007 Apr;13(3):333-40).
작약(Paeonia lactiflora Pallas)은 미나리아재비과에 속하는 다년생 초본식물로, 예로부터 배당체로서 파에오니플로린(paeoniflorin)과 알칼로이드인 파에오닌(paeonine), 탄닌, 수지 및 안식향산 등을 함유하고 있다. 작약은 신경보호작용 및 항산화 활성도 가지는 것으로 알려져 있다(국내특허공개번호 제10-2006-0023885호 등).
본 발명은 건강, 작약의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 건강과 작약의 혼합추출물을 사용함으로써 건강, 작약을 각각 단독 추출물로 사용했을 때보다 상가적인 효과가 증가하는 것을 특징으로 한다. 또한, 특정 배합비로 사용하였을 때 그 효과가 더욱 최대화된다.
본 발명에서 사용된 각 생약성분은 건조된 중량을 기준으로 한 것이다.
상기 건강, 작약의 혼합추출물은 건강, 작약을 1: 10 - 10: 1의 비율로 혼합한 혼합추출물일 수 있으며, 바람직하게는 건강, 작약을 1:5 - 5:1의 비율로 혼합한 혼합추출물이다. 상기와 같은 성분 구성과 함량비율 범위에서 가장 독성이 낮고 부작용이 적으며, 최적의 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다.
상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약을 C1~C4의 알콜, n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 클로로포름, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약을 에탄올로 추출하여 얻어진 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 추출용매의 사용량은 크게 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 건강, 작약의 분말 시료 1 중량에 대하여 약 1 내지 10배 부피, 바람직하게는 약 5 내지 10배 부피의 비율로 사용될 수 있다. 또한, 상기 추출은 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 5시간 동안, 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 추출방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출은 79℃ 환류냉각 추출법에 의해 수행될 수 있으며, 또한 상기 추출 과정은 단회 또는 수회 수행할 수 있고, 바람직하게는 약 3회 정도 반복 수행할 수 있다. 얻어진 추출액은 필요에 따라 통상의 방법, 예를 들어 약 20 내지 100℃, 바람직하게는 약 30 내지 70℃에서, 감압 농축하거나 감압 건조함으로써, 액상 또는 분말 형태로 생강 추출물을 얻을 수 있다.
상기 건강, 작약 혼합추출물은 유효성분의 함량을 높이기 위하여 추가의 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 즉, (a) 건강, 작약을 C1~C4의 알콜로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-핵산층을 분리하는 단계;를 포함하는 추출공정을 더 행함으로써 유효성분의 함량이 높은 건강, 작약 혼합추출물을 얻을 수 있다.
또한, 선택적으로 (a) 건강, 작약을 C1~C4의 알콜로 추출하는 단계; (b') 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b')에서 얻어진 수층에 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 에틸 아세테이트층을 분리하는 단계;를 포함하는 추출공정(및 필요에 따라 추가의 크로마토그래피 분획공정)을 수행하거나, 혹은 (a) 건강, 작약을 C1~C4의 알콜로 추출하는 단계; (b') 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물 및 n-헥산을 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; (c') 상기 단계 (b')에서 얻어진 수층에 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c')에서 얻어진 수층에 n-부탄올을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-부탄올층 또는 수층을 분리하는 단계;를 포함하는 추출공정(및 필요에 따라 추가의 크로마토그래피 분획공정)을 수행함으로써 유효성분의 함량이 높은 건강, 작약 혼합 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용된 "치료학적 유효량"은 일반적으로 예방되고, 감소되고 또는 치료될 본원에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 질병의 증상을 완화하는데 필요한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 - 95 중량%로 포함한다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 다양한 형태, 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구용 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 특히 바람직하게는, 경구용 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 건강, 작약 혼합추출물을 포함하는 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 1일 0.01 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 10 내지 300 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명은 또한 건강, 작약 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는, 학습 장애 또는 기억력 장애의 개선 또는 증상 완화용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물에 있어서, 건강, 작약 혼합 추출물은 상기에서 설명한 바에 따라 얻을 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 학습 장애 또는 기억력 장애의 개선 또는 증상완화를 목적으로 또는 학습 또는 기억력 증진을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 건강, 작약 혼합추출물을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 건강, 작약 혼합추출물, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피 할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 건강,작약 혼합 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 건강,작약 혼합 추출물에 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 건강, 작약 혼합 추출물에 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
과립형태의 건강기능식품은 상기 건강, 작약 혼합추출물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
이하, 본 발명을 실시예 및 시험 예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1: 건강, 작약 혼합추출물의 제조
건강 0.5kg, 작약 1.5kg을 갈아서 20 리터의 95% 에탄올을 넣고, 79℃에서 3시간 환류 냉각 추출 후 여과하여 여액을 분리하였다. 얻어진 여액을 모두 합하여 감압 농축하여 용매를 제거한 뒤, 동결건조를 통해 수분을 완전히 제거하여 건강, 작약 혼합추출물 약 340 g 을 얻었다.
또한 각각의 배합비별 최적 효과를 확인하기 위하여 하기와 표 1과 같은 배합비로 추출하여 배합비별 추출물을 제조하였다.
표 1
구분 작약10:건강1 작약5:강1 작약3:건강1 작약1:건강1 작약1:건강3 작약1:건강5 작약1:건강10
작약(kg) 1.81 1.66 1.5 1.0 0.5 0.33 0.18
건강(kg) 0.18 0.33 0.5 1.0 1.5 1.66 1.81
추출량(kg) 320 340 340 335 350 345 350
시험예 1. 신경성장인자(NGF)의 분비 효과 확인
신경성장인자(nerve growth factor, NGF)를 분비한다고 알려져 있는 쥐의 신경교종세포(glioma) C6 세포주를 이용하였다. C6 세포는 한국세포주 은행에서 분양 받아 사용하였다(KCLB No. 10107). C6 세포는 3.4 g/L의 탄산수소나트륨(NaHCO3, sodium bicarbonate), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10000 U/ml) 1%가 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 배양하였다.
NGF에 의한 신경분화를 알아보기 위한 PC12 세포는 2.0 g/L의 탄산수소나트륨, 10% 말혈청(horse serum), 5% 우태혈청 및 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10000 U/ml) 1%가 보충된 RPMI1640 배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 배양하였다. 사용한 소태아혈청 및 말혈청은 사용하기 전 55℃에서 30분간 비활성시켜 사용하였고, 70%의 습도와 37℃의 온도가 유지되고, 5%의 이산화탄소가 공급되는 세포 배양기에서 배양하였다.
0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA(Gibco BRL, 미국)를 처리하여 100 mm 배양용기에 부착된 C6 세포를 이탈시킨 후, 10 ml의 신선한 배지를 첨가하여 세포현탁액을 만든 후, 세포수 측정기를 이용하여 살아있는 세포수를 측정 및 계산하였다. 계산한 값을 바탕으로 100 mm 배양접시에 2 X 106개의 세포가 포함되도록 분주하였다. 24시간 배양 후, 기존의 배지를 제거하고 실시예 1에서 얻어진 건강, 작약 혼합추출물 각각 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 첨가한 2% 우태혈청의 DMEM 배지 10 ml으로 교환해주었으며, 다시 24시간 동안 배양한 후 배지를 각각 얻었다. 얻은 배지를 1500 rpm 에 10분간 원심분리한 후, 상층액 만을 다시 모았다.
C6 세포에서 분비된 신경성장인자의 측정은 신경성장인자 측정 키트(DY556, R&D system, 미국)에 조건배지를 처리하여 정량하였다. 건강, 작약 혼합 추출물이 신경성장인자 분비 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해, C6 세포에 처리한 후 배양하여 얻은 조건배지에서 신경성장인자를 정량 분석하였으며, 그 결과는 도 1 과 같다.
세포독성을 알아보기 위하여, 상기 실시예에서 배양한 상층액이 수거되고 남은 세포에는 3-[4,5-디메틸티아조-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)(MTT, sigma Cat# M5655)를 1시간 동안 처리한 후, DMSO 200㎕를 가하여 세포를 용해시킨 뒤 570nm 파장 값의 ELISA 플레이트 리더기로 측정하여 세포독성 여부를 평가하였다.
음성 대조군으로 무처리군을 100% 기준으로 환산하여 계산시 작약, 건강 혼합 추출물의 비율에 따라 NGF 분비 촉진 효과가 다르게 나타남을 확인하였으며, 이는 세포 독성을 보이지 않는 범위 내에서의 촉진효과임을 MTT 검정을 통해 확인하였다. 각각의 경우에서 최적의 배합조건은 작약 3에 건강 1의 비율로 혼합 추출하는 것이 가장 NGF 분비 촉진 효과가 높은 것으로 판단된다.
시험예 2: 신경염증에 관여하는 NO 분비 억제 효과 확인
마우스 유래 뇌교세포인 BV-2세포를 5% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 DMEM 배양액에서 배양하였다.
상기 BV-2 세포를 96웰 플레이트 각 웰에 3 > 104 개의 개수로 분주한 후, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1에서 제조된 건강, 작약 혼합추출물을 농도별로 처리한 후, 30분 후에 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 농도 100ng/ml로 처리하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 상층액을 수거한 뒤 그리스(Griess) 시약 (N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride(sigma cat# N9125) + Sulfanilic acid in 5% phosphoric acid(sigma cat# S9251))과 1:1 로 섞어 상온에서 10분 동안 반응시킨 뒤, ELISA 플레이트 리더기(ELISA plate reader)로 570nm 파장 값에서 흡광도를 측정하였다. 상층액이 수거되고 남은 세포에는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, sigma Cat# M5655)를 1시간 동안 처리한 후, DMSO 200㎕를 가하여 세포를 용해시킨 뒤 570nm 파장 값의 ELISA 플레이트 리더기로 측정하여 세포독성 여부를 평가하였다. 건강,작약 혼합 추출물의 염증에 관여하는 NO 분비에 미치는 영향을 분석하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.
음성대조군으로 LPS를 처리한 군을 100% 기준으로 환산하여 계산시 작약, 건강 혼합 추출물의 비율에 따라 NO 분비 억제 효과가 다르게 나타남을 확인하였으며, 이는 세포 독성을 보이지 않는 범위 내에서의 NO 분비 억제 효과임을 MTT 검정을 통해 확인하였다. 각각의 경우에서 최적의 배합조건은 작약 3에 건강 1의 비율과 작약 1에 건강 1의 혼합 추출하는 것이 가장 NO 분비 억제 효과가 높은 것으로 판단된다.
시험예 3: 스코폴라민으로 유도된 동물모델에서의 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT)
스코롤라민에 의해 유도된 기억손상 동물모델에서 건강, 작약 혼합추출물의 인지능력 및 기억력 증진 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실시하였다.
7주령의 ICR계 수컷 마우스(30-35 g)를 오리엔트 바이오(Orient Bio)에서 구입하여 경희대학교 약학대학의 동물 사육실에서 1 주일 이상 사육하여 적응시켜 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(22±2℃), 습도(53±3%) 및 명암주기(12 시간)는 자동적으로 조절되도록 하였다.
쥐는 8마리씩 9군으로 나누었다. 1주일 적응시킨 후, 제1군(대조군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 마우스 체중 kg당 5mL로 1일간 1일 1회 경구 투여하였고, 제2군(스코폴라민 단독 투여군), 제3군(도네페질 1mg/kg 투여군), 제4군(건강 추출물 50mg/kg 투여군), 제5군(작약 추출물 50mg/kg 투여군), 제6군(건강 3대 작약 1 비율 혼합추출물 50mg/kg 투여군), 제7군(건강 1대 작약 1 비율 혼합추출물 50mg/kg 투여군), 제8군(건강 1대 작약 3 비율 혼합추출물 50mg/kg 투여군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)에 녹인 약물을 1일 동안 1일 1회 경구 투여하였다.
약물을 1회 경구투여하고 약물투여 30분 후, 스코폴라민(1mg/kg)을 복강 투여한 뒤 30분 후 NORT를 실시하였다. NORT는 동물을 행동 관찰실로 옮겨 5분간 적응시킨 뒤 3분의 노출시행에서는 상자에 동일한 물체 2개(1set)를 30cm 간격으로 놓은 후 동물이 3분 동안 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다. 하루 후 인출시행에서는 동일한 상자에 노출 시 계시했던 물체 1개와 새롭게 대치된 물체 1개를 준비해 놓고, 동물이 탐색하는 시간을 측정하였다. 그 결과는 도 4와 같다.
시험예 4: 스코폴라민으로 유도된 동물모델에서의 Y- 미로 테스트(Y maze test)
쥐는 10마리씩 4군으로 나누었다. 1주일 적응시킨 후, 제1군(대조군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 마우스 체중 kg당 5mL로 1일간 1일 1회 경구 투여하였고, 제2군(스코폴라민 단독 투여군), 제3군(작약, 건강 혼합 추출물 50mg/kg), 제4군(도네페질 1mg/kg 투여군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)에 녹인 약물을 1일 동안 1일 1회 경구 투여하였다.
약물을 1회 경구투여하고 약물투여 60분 후 스코폴라민(1mg/kg)을 복강 투여한 뒤 30분 후 Y 미로를 실시하였다.
Y 미로(Y maze) 장치는 동일한 3개의 암(arm)(가로 8 cm, 세로 30 cm, 높이 14 cm)으로 구성되어 있으며, 각각은 서로 120°의 일정한 각도로 배치되어 있다. 마우스를 한쪽 arm 끝에 위치시킨 다음에 8분 동안 자유롭게 Y 미로를 돌아다니도록 하였다. 각 암에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 자발적 변경(spontaneous alteration)(%)을 평가하였다. 변경(alteration)은 3개의 암(arm)을 순차적으로 들어가는 경우, 즉 ABC, BCA, CAB 등으로 정의하였다. % 변경(alteration)은 하기 수학식 1로 계산하였다.
[수학식1]
% 변경 = [총 변경 수]/ [암(arm)에 들어간 총 횟수-2] x 100
상기 Y미로 실험결과, 스코폴라민을 투여하지 않은 대조군의 경우 65%의 변경(spontaneous alteration)을 보였으며, 스코폴라민 만을 복강으로 투여한 마우스의 경우 기억력이 손상되어 그 수치가 47%로 감소하였다. 한편, 건강, 작약 혼합추출물을 50 mg/kg/day로 경구 투여한 마우스의 경우 자발적 변경(spontaneous alteration)이 58%로 현저하게 증가하여 기억력이 개선됨을 확인할 수 있었다. 그 결과는 도 5와 같다.
시험예 5: 스코폴라민으로 유도된 동물모델에서의 수동적 회피 테스트(passive avoidance test)
마우스를 각 군당 10 마리씩 나누었다. 제1군(대조군)은 0.5% 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 마우스 체중 kg당 5mL로 3일간 경구 투여하였고, 제2군은 0.5% 메틸 셀룰로오스에 녹인 도네페질(Donepezil) 1 mg/kg 투여군, 제3군은 0.5% 메틸 셀룰로오스에 녹인 건강, 작약 혼합추출물을 50 mg/kg로 3일간 경구투여 하였다. 1일 1회로 3일간 경구투여하고 마지막 경구투여 1 시간 후 수동 회피 시험(passive avoidance task)을 다음과 같이 수행하였다.
수동 회피 시험은 내부구조가 두 개의 동일한 공간으로 구분되어 있는 시험 장치에서, 첫째 날 가운데에 문을 사이에 두고 한쪽은 불을 켜놓고 다른 한쪽은 어두운 상태에서 밝은 쪽에서 먼저 10초간 머무르게 한 후 사이의 문을 열어주고, 시험동물이 어두운 공간으로 이동할 때 발바닥에 0.25 mA의 전기 자극을 주었다. 24 시간 후 같은 방법으로 수동 회피 시험을 진행하고 이때 밝은 곳에 머무르는 시간을 측정하였다. 그 결과는 도 6과 같다.
대조군은 150±3.39초를 나타내어 전기충격으로 인한 기억력이 유지되었고 도네페질 투여군은 약 90초, 건강, 작약 혼합 추출물 50 mg/kg 투여군은 120초, 스코폴라민 투여군은 40초로, 현저하게 건강, 작약 혼합 추출물 투여군이 체류시간을 유의성 있게 증가했다(p<0.05).

Claims (8)

  1. 건강, 작약 혼합추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강 및 작약이 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합추출된 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약 혼합물을 C1-C4의 알콜, n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 클로로포름, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 건강, 작약 혼합추출물은 건강, 작약 혼합물을 에탄올로 추출하여 얻어진 것임을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 건강, 작약 혼합추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 - 95 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물의 제형(dosage form)이 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택된 경구용 제형인 것을 특징으로 하는, 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 따른 약제학적 조성물 및 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 식품조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 건강, 작약 혼합추출물을 0.01 내지 95 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
PCT/KR2013/007118 2012-08-07 2013-08-07 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 WO2014025202A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201380039376.7A CN104507486A (zh) 2012-08-07 2013-08-07 包含白芍、干姜混合提取物的痴呆及认知功能障碍预防或治疗用药物组合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0086161 2012-08-07
KR20120086161A KR101492688B1 (ko) 2012-08-07 2012-08-07 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2014025202A1 true WO2014025202A1 (ko) 2014-02-13
WO2014025202A8 WO2014025202A8 (ko) 2015-02-12

Family

ID=50068367

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/007118 WO2014025202A1 (ko) 2012-08-07 2013-08-07 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR101492688B1 (ko)
CN (1) CN104507486A (ko)
WO (1) WO2014025202A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160103729A (ko) 2015-02-25 2016-09-02 충남대학교산학협력단 오디 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN105412901A (zh) * 2016-01-22 2016-03-23 王丹旎 一种治疗帕金森病的中药组合物及其制备方法及应用
KR101634619B1 (ko) 2016-03-14 2016-06-29 주식회사 그린메디넷 치매 인지 평가 방법 및 이를 실행하는 장치
KR102248093B1 (ko) 2019-10-11 2021-05-04 제천한약영농조합법인 천마, 홍삼 및 참당귀를 이용한 리큐르주의 제조방법
CN115844958A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 宁波立华制药有限公司 一种白芍总苷的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040053715A (ko) * 2002-12-13 2004-06-24 (주)바이오랩 수크라아제와 말타아제 및 글루코아밀라아제에 대한 율무추출물의 저해활성 및 이를 이용한 혈당 조절용 조성물
KR20060023884A (ko) * 2004-09-11 2006-03-15 정우약품공업 주식회사 항산화활성을 갖는 백작약 추출물을 함유하는 조성물
KR20110089223A (ko) * 2010-01-30 2011-08-05 원광대학교산학협력단 6-진저롤을 주성분으로 하는 생강 조 추출물의 표준화 추출 분획물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100700065B1 (ko) * 2004-04-20 2007-03-27 신준식 신경보호작용을 가지는 생약 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040053715A (ko) * 2002-12-13 2004-06-24 (주)바이오랩 수크라아제와 말타아제 및 글루코아밀라아제에 대한 율무추출물의 저해활성 및 이를 이용한 혈당 조절용 조성물
KR20060023884A (ko) * 2004-09-11 2006-03-15 정우약품공업 주식회사 항산화활성을 갖는 백작약 추출물을 함유하는 조성물
KR20110089223A (ko) * 2010-01-30 2011-08-05 원광대학교산학협력단 6-진저롤을 주성분으로 하는 생강 조 추출물의 표준화 추출 분획물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방용 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNG, KIL-SAENG ET AL.: "Neuroprotective Effects of the Extract of Zingiberis Rhizoma", KOREAN JOURNAL OF PHARMACOGNOSY, vol. 41, no. 3, 2000, pages 190 - 195 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101492688B1 (ko) 2015-02-12
WO2014025202A8 (ko) 2015-02-12
KR20140019967A (ko) 2014-02-18
CN104507486A (zh) 2015-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014025202A1 (ko) 작약, 건강 혼합추출물을 포함하는 치매 및 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2010058926A2 (ko) 생강 추출물 또는 쇼가올을 포함하는 약학 조성물
CN108472325B (zh) 包含蜂斗菜叶提取物的用于改善记忆力的组合物
JP6773821B2 (ja) 桑椹子およびブクリョウ皮の混合抽出物を含有する退行性神経疾患の予防、改善または治療用組成物
EP1843774B1 (en) Pulsatilla spp. extracts effective in brain function
CN106659749B (zh) 包含葎草提取物作为有效成分的用于预防或治疗退行性脑疾病的组合物
WO2016076607A2 (ko) Compound k 성분이 강화된 홍삼농축액을 함유하는 비알코올성 지방간증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 건강기능 식품
KR101420135B1 (ko) 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 두충 추출물
KR101085219B1 (ko) 뇌기능 개선 효능을 갖는 생약 추출물
WO2014133286A1 (ko) 한인진 및 울금의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 질환의 예방, 억제 또는 치료용 조성물
WO2018131780A1 (ko) 위염 또는 소화성궤양 예방 또는 치료용 조성물
WO2018038293A1 (ko) 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101426133B1 (ko) 백단향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20180112135A (ko) 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 열매 추출물을 함유하는 인지, 기억 증진용 약학적 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품
KR100980400B1 (ko) 치매치료 효과를 갖는 백두옹 추출물
WO2020071620A1 (ko) 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 브로콜리의 혼합 추출물을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2023055198A1 (ko) 반하, 대추, 감초, 인삼, 건강, 황금 및 황련 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머 치료용 조성물
WO2023177248A1 (ko) 상심자 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018038292A1 (ko) 녹나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2023054918A1 (ko) 네프릴라이신을 과발현하는 줄기세포, 이의 배양액 및 이들로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR100836559B1 (ko) 염증성 질환 치료 및 예방에 유용한 녹제초 추출물
WO2019225847A1 (ko) 흰강낭콩 및 아위버섯 추출물을 함유하는 항비만 또는 체지방 감소용 조성물
WO2022173273A1 (ko) 아로니아 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023204364A1 (ko) 고량강 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지성 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2022131724A1 (ko) 헴프 껍질 추출물을 포함하는 인지기능 개선용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13827679

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 07/07/2015)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13827679

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1