KR20110089223A

KR20110089223A - 6-진저롤을 주성분으로 하는 생강 조 추출물의 표준화 추출 분획물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방용 조성물

Info

Publication number: KR20110089223A
Application number: KR1020100008852A
Authority: KR
Inventors: 김윤철; 정길생; 박현; 김은철; 이동성; 리빈
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2010-01-30
Filing date: 2010-01-30
Publication date: 2011-08-05

Abstract

본 발명은 뇌세포 보호 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 6-진저롤을 주성분으로 하는 생강 조 추출물의 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 뇌세포에 대한 뛰어난 보호 및 항산화 효과를 나타내므로, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

6-진저롤을 주성분으로 하는 생강 조 추출물의 표준화 추출 분획물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방용 조성물{A composition comprising the standardized fraction of ginger extract containing 6-gingerol as a standard for the preventing and treating of neuro-degenerative diseases}

본 발명의 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 뇌세포 보호 효과 및 항산화 효과를 나타내므로, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 이용할 수 있다.

[문헌 1] Jeong GS et al, Planta Medica, 74, pp.1368-1373, 2008.

[문헌 2] Jin DQ et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 331, pp.1264-1269, 2005. 　

[문헌 3] Lim CS et al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29, pp.1212-1216, 2006.

[문헌 4] Satoh M et al, Neuroscience letters, 288, pp.163-166, 2000.

[문헌 5] 배기환, 한국의 약용식물, 교학사, p.584, 2000.

[문헌 6] 한국생약학교수협의회, 본초학, 사단법인 대한약사회, pp.84-86, 1995.

[문헌 7] 생약학연구회, 현대생약학, 학창사, pp.159-161, 2000.

[문헌 8] Lee YR et al, Proteomics, 7, pp.185-193, 2007.

[문헌 9] Davis JB and Maher P, Brain Research, 652, pp.169-173, 1994.

[문헌 10] Jeong GS et al, Natural Product Sciences, 13, pp.268-272, 2007.

[문헌 11] Tenhunen R et al, The Journal of laboratory and clinical medicine, 75, pp.410-421, 1970.

[문헌 12] Royall J and H Ischiropoulos, Archives of biochemistry and biophysics, 302, 348-355, 1993.

산화적 스트레스(oxidative stress)는 체내 활성 산소종(ROS)이 많이 생성되거나 항산화 시스템의 기능이 저하되면서 체내 산화계와 항산화계의 불균형으로 일어나는 것으로 알려져 있다 (Jeong GS et al, Planta Medica, 74, pp.1368-1373, 2008). 생활수준이 향상되고 인간의 수명이 증가함에 따라 노화 및 노화에 관련된 각종 질병에 관심이 커지고 있으며 산화적 스트레스가 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 헌팅턴 증후군과 같은 중추신경계의 퇴행성 뇌질환의 중요한 요인으로 밝혀졌다 (Jin DQ et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 331, pp.1264-1269, 2005.; Lim CS et al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29, pp.1212-1216, 2006.).

글루타메이트(Glutamate)는 잘 알려진 신경전달물질로서 과다 분비되면 신경흥분독성과 산화적 스트레스로 인해 뇌 세포 손상을 초래하게 된다 (Satoh M et al, Neuroscience Letters, 288, pp.163-166, 2000.). 생쥐의 해마유래 세포주인 HT22 세포주는 글루타메이트 수용체(receptor)가 없는 세포주로서 글루타메이트와 함께 처리할 때 신경흥분독성이 아닌 산화적 스트레스로 인하여 세포가 손상을 받으며, 산화적 스트레스로 인한 퇴행성 뇌질환 연구에 대한 유용한 실험 모델 중 하나이다 (Lee YR et al, Proteomics, 7, pp.185-193, 2007.).

산화적 스트레스로 인한 산화적 손상으로부터의 세포보호효과를 나타내는 효소로 헤마틴 산화효소 (Heme Oxygenase, HO)가 있다. HO의 주요 기능은 헤마틴 (Heme)의 산화를 유도하여 빌리베르딘 (biliverdin), 유리 철(free iron)과 일산화탄소 (carbon monoxide)로 분해시킨다. 빌리베르딘 (biliverdin)은 빌리베르딘 환원효소 (biliverdin reductase)에 의해서 빌리루빈 (bilirubin)으로 변환되는데 이는 항산화 효과가 있고 활성산소종의 소거역할을 한다.

헤마틴 산화효소 (HO)는 HO-1, HO-2와 HO-3의 형태가 있는데 이 중 HO-1은 각종 세포 조직에서 자극이나 약물 등에 의해 유도되는 형태이며, HO-2, 3은 일정 수준이 유도되어 그 수준의 차이가 없다. HO-1은 산화적 스트레스로부터의 보호를 제공하는 간과 비장에 많은 양이 발견된다. 또한 HO-1의 유도는 in vitro 와 in vivo 실험 모두에서 산화적인 손상으로부터의 보호에 중요한 세포적인 메커니즘을 가지고 있다 (Satoh M et al, Neuroscience letters, 288, pp.163-166, 2000.).

생강(生薑; Zingiberis Rhizoma Crudus)은 생강과(Zingiberaceae)의 여러해살이풀인 생강(Zingiber officinale Rosc.)의 뿌리줄기로(배기환, 한국의 약용식물, 교학사, p.584, 2000.), 맵고 따뜻한 성질이 있고 독이 없다고 알려져 있다 (한국생약학교수협의회, 본초학, 사단법인 대한약사회, pp.84-86, 1995). 약리효과로는 해열, 진통, 진해, 항염증 및 진토 작용 등이 있어, 방향성 및 신미성 건위제, 발한, 이뇨제로 이용되고 있으며, 주요성분은 정유성분으로 징기베렌(zingiberene), 캄펜(camphene), 비스아볼렌(bisabolene) 등과 매운맛성분으로 진저롤(gingerol), 진저올(gingeol) 등의 화합물이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있으나 (생약학연구회, 현대생약학, 학창사, pp.159-161, 2000), 상기 문헌 어디에도 생강추출물이 뇌 세포 보호에 효과적이라는 어떠한 개시도 된 바가 없다.

이에 따라, 본 발명자들은 생강 조 추출물의 진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물이 각종 퇴행성 뇌질환의 원인 중 하나인 산화적 스트레스로부터 항산화 효과 및 세포보호 효소인 HO-1를 유도하여 뇌세포에 대한 유의한 보호효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 6-진저롤을 주성분으로 하는 생강의 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 생강(生薑; Zingiberis Rhizoma Crudus)은 생강과(Zingiberaceae)의 여러해살이풀인 생강(Zingiber officinale Rosc.)의 뿌리줄기를 포함한다.

본원에서 정의되는 표준화 추출 분획물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매의 극성 용매, 바람직하게는 20 내지 90% 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50 내지 80% 물 및 에탄올 혼합용매로 당업계의 통상적인 추출방법으로 추출하여 수득된 생강 조 추출물을 1 내지 10배 부피(v/v)의 물을 가해 현탁액을 제조한 후에 실온 방치 후에 원심 분리하여 수득되는 생강 표준화 침전물 추출 분획물 및 생강 표준화 상등액 추출 분획물, 바람직하게는 생강 표준화 침전물 추출 분획물을 포함한다.

이하 본 발명의 표준화 추출 분획물을 제조하기 위한 방법을 구체적으로 설명한다.

예를 들어, 본 발명의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물은 건조시킨 생강을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매 등의 극성 용매, 바람직하게는 20 내지 90% 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50 내지 80% 물 및 에탄올 혼합용매로 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법으로 추출하여 생강 조 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 단계에서 수득한 생강 조 추출물에 증류수, 정제수 등의 통상적인 물, 바람직하게는 증류수, 보다 바람직하게는 정제수를 첨가하여, 충분히 교반하여 현탁액을 제조하는 제 2단계; 상기 현탁액을 상온에서, 12 내지 48시간 동안, 바람직하게는 18 내지 24시간 동안 방치하여 수용액상 및 현탁액상을 제조하는 제 3단계; 상기에서 제조된 수용액상 및 현탁액상을 용매-용매 분배법을 이용한 분획법, 원심분리기를 이용한 분획법 등의 당업계에 통상적인 분리방법, 바람직하게는 용매-용매 분배법 또는 원심분리법을 이용한 분획법, 보다 바람직하게는 원심분리기를 이용하여 500 내지 10000 rpm, 바람직하게는 2000 내지 6000 rpm의 회전속도에서 10분 내지 3시간, 바람직하게는 20분 내지 1시간 동안 원심분리를 수행하여 침전물 및 상등액을 각각 수득하는 제 4단계 공정을 포함하는 제조방법을 통하여 본 발명의 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물인 생강 표준화 침전물 추출분획물(이하, SG-S라 함) 및 생강 표준화 상등액 추출분획물(이하, SG-R이라 함)을 각각 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법 및 상기의 제조방법으로 얻어진 생강 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 생강의 표준화 추출 분획물의 뇌세포 보호효과를 확인하기 위하여 MTT 실험법, 헤마틴 산화효소-1 (Heme oxygenase-1) 발현 유도 효과를 측정하기 위한 웨스턴 블럿 분석법, HO 효소 활성 측정 실험을 하기와 같이 뇌세포에 대한 뛰어난 보호효과 및 항산화 작용을 나타내며, 뇌세포 보호효과에 중요한 헤마틴 산화효소(HO)-1의 발현을 유도함으로써, 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

또한 본원에서 정의되는 “생강의 표준화 추출 분획물”은 하기 화학식 1의 6-진저롤 (gingerol) 지표성분을 주성분으로 하는, 바람직하게는, 1.0 내지 10%(w/w), 보다 바람직하게는 1.5 내지 9.5 %(w/w)를 함유함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 피크(Pick) 질환 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob) 질환, 바람직하게는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 또는 헌팅턴 질환을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 생강 조 추출물의 진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 분획물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 분획물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 분획물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

따라서, 또한, 본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 상기 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 식품 및 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 분획물을 포함하는 건강기능식품은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 분획물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 분획물은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 분획물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 분획물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기와 같이, 본 발명의 생강의 표준화 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 뇌세포에 대한 뛰어난 보호효과 및 항산화 작용을 나타내며, 뇌세포 보호효과에 중요한 헤마틴 산화효소(HO)-1의 발현을 유도함으로써, 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에 유용하게 쓰일 수 있다.

도 1은 SG-E, SG-S 및 SG-R의 HPLC 분석을 나타낸 도면이며,
도 2는 SG-E, SG-S 및 SG-R 중에 함유된 6-진저롤의 함량을 나타낸 도면이며,
도 3은 SG-S의 뇌 세포 보호 효과를 나타낸 도면이고,
도 4는 SG-S의 HO-1 발현 효과 및 HO 효소 활성 평가를 나타낸 도면이며,
도 5는 SG-S의 HO-1 발현에 의한 세포보호 효과 및 ROS 소거 효과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 하기 비교예, 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용은 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

비교예 1. 생강 조 추출물의 제조

본 실험에서 사용한 생강은 2009년 4월 익산시 소재 대학한약국에서 구입하여 건조된 생강 50 g을 70% 에탄올 수용액 300 mL 로 80 내지 100 ℃ 에서 2시간 동안 가열추출하고 여액을 감압 농축하여 생강 조 추출물 6.05 g (이하, 'SG-E'로 표시함,“수율: 12.1%)을 얻었다.

실시예 1. 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물의 제조

상기 비교예 1에서 수득한 생강 조 추출물 6.05 g 에 정제수 100 mL를 넣고 교반하여 잘 녹인 뒤 18시간 동안 실온에서 방치한 후에 원심분리기(FLETA5, Hanil)에서 3000 rpm으로 30 분 동안 원심 분리하여 침전물(이하, 'SG-S'이라 함)을 취함으로서 이를 건조하여 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 생강 표준화 침전물 추출 분획물 0.7 g(수율: 1.4%)을 얻었다. 본 표준화 분획물은 국가지정 연구소재은행 천연물신소재은행에 소재번호(NMBS-098)로 등록되어 있다. 또한 상기 원심분리 후 침전물을 제거한 상등액을 얻고 이를 건조하여 건조 상태의 생강 표준화 상등액 추출 분획물 5.35g (이하 'SG-R'이라 함, 수율:10.7%)을 각각 수득하였다. 상기 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)을 실험에 사용한 배지에 녹여서 사용하였다.

참고예 1. 세포의 배양

생쥐 해마 유래 HT22 세포주(Davis JB and Maher P, Brain Research, 652, pp.169-173, 1994)는 서울대학교 의과대학 묵인희 교수로부터 분양받아 2× 10⁵ 세포/well을 10% heat-inactivated FBS, 페니실린 G (100 IU/ml)와 스트렙토마이신 100 μg/ml을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO₂ 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양하였다.

실험예 1. HPLC를 이용한 SG-E, SG-S, SG-R 중의 진저롤의 함량 확인

1-1. HPLC용 표준용액 조제

6-진저롤 표준품은 WAKO사 (일본)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 6-진저롤 표준품 4 mg을 정밀하게 달아 HPLC용 메탄올에 녹이고 이것을 스톡(stock) 용액으로 하여 25, 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖의 검액을 만들어 검량선용 표준용액으로 하였다.

1-2. 검액의 조제

상기 비교예 1 및 실시예 1에서 수득한 SG-E, SG-S 및 SG-R를 각각 10 mg씩 정확히 칭량하여 HPLC용 메탄올에 용해시켜 0.45 ㎛ 막여과기(Size-40/35, Wheaton)로 여과하고 여액을 1 ㎖로 조정하여 검액으로 하였다.

1-3. HPLC 의 분석조건

HPLC는 Sykam S-2100(Sykam, Germany), 컬럼은 Inertsil ODS-3(GL Sciences, Inc., Japan)을 사용하였으며, 검출 스펙트럼은 UV 210 nm를 사용하였다. 이동상은 물:아세토니트릴 혼합용액(45:55)을 40분 후에 물:아세토니트릴 혼합용액(25:75)이 되도록 사용하였고, 유속은 1.3 ㎖/min으로 하였다.

1-4. 각 시료 중의 6- 진저롤의 함량 측정

상기 실험예 1-2에서 조제된 각 농도의 6-진저롤 표준용액을 20 ㎕씩 취하여 3회 반복 HPLC를 실시하고 얻어진 크로마토그램의 면적을 구하고 검량선을 작성하여 얻은 각각의 회귀방정식으로부터 6-진저롤의 함량을 구하였다.

1-5. HPLC 를 이용한 각 시료 중의 6- 진저롤 함량 확인

상기 실험예 1-4의 6-진저롤 표준용액에 대한 HPLC를 실시하여 얻은 검량선을 작성하여 얻은 회귀직선 방정식은 y = 1.3736 × 10^-7x - 1.1924 × 10^-2 (r²=0.999361)이었다. 상기 실험예 1-2에서 조제한 SG-E, SG-S 및 SG-R 3종의 검액에 대한 HPLC를 실시한 결과, 하기 도 1의 HPLC 크로마토그램을 얻을 수 있었다.

6-진저롤은 상기 실험예 1-3의 HPLC 조건에서 9,758분의 정체 시간 (retention time)을 나타냈다. 상기 3종의 검액을 20 ㎕씩를 취하여 HPLC를 실시하여 얻은 크로마토그램(도 2)에서 면적을 구하여 상기 3종의 검액 중의 6-진저롤의 함량을 구한 결과는 하기 표 1에 나타냈으며, 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)의 6-진저롤 함량이 가장 탁월함을 알 수 있었다.

시료명	6-진저롤 함량 (w/w %)
SG-E	0.066
SG-S	8.691
SG-R	2.740

실험예 2. HT22 세포 배양 및 뇌세포보호 활성 측정

상기 실시예 1에서 수득한 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)의 뇌세포 보호효과를 확인하기 위하여 문헌(Jeong GS et al, Natural Product Sciences, 13, pp.268-272, 2007)의 방법으로 MTT 실험법을 하기와 같이 수행하였다.

상기 참고예 1의 세포주에 5 mM 글루타메이트를 처리하여 독성을 유발한 후, 상기 실시예 1에서 수득한 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)과 SG-R을 각각 5, 10, 20, 40 ㎍/ml, 비교예 1에서 수득한 SG-E 5, 10, 20 및 40 ㎍/ml을 각각 처리한 후, 12시간 동안 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였다. 양성대조약물로는 Trolox (수용성 Vit. E, 238813, Aldrich) 50 μM 을 사용하였다.

MTT법을 활용한 실험방법은 배양시킨 세포에 0.5 mg/ml 농도로 MTT (Sigma, M2128) 시약을 넣고, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 배양한 후 상등액을 버리고 DMSO (Junsei, 35535-0350) 150㎕를 첨가하여 30분간 흔들어준 후에 ELISA reader(Bio-Rad, Microplate reader model 680)를 사용하여 파장 570nm 에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험치는 대조군에 대한 세포 보호율을 평균치로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.

실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)은 SG-E과 SG-R에 비하여 우수한 세포 보호 활성을 나타냈다.

실험예 3. 웨스턴 블럿 분석법 ( Western blot analysis )

상기 참고예 1의 HT22 세포주에서 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)의 헤마틴 산화효소-1 (Heme oxygenase-1) 발현 유도 효과를 측정하기 위해 웨스턴 블럿 분석법 (western blot analysis)을 이용하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. (Jeong GS et al, Planta Medica, 74, pp.1368-1373, 2008.)

항산화 및 세포보호 효과를 나타내는 효소인 HO-1의 발현 유도제인 코발트 프로토포르피린 (Cobalt protophorphyrin; CoPP, C1900, Sigma)을 사용하여 HO-1을 유도하고, HO 효소 활성을 알아보기 위해 상기 실시예 1에서 수득한 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)을 5, 10, 20, 40 μg/ml 농도별로 12시간 처리(도 4B)하였으며, SG-E(도 4A)와 SG-R(도 4C)도 동일한 조건에서 시험하였다.

웨스턴 블럿 분석법 (western blot analysis)을 이용한 실험 방법은 60 mm 디쉬에 3 X 10⁶ 셀/ml 농도로 HT22 세포를 24시간 배양한 후에 HO-1 유도제인 코발트 프로토포르피린 (Cobalt protophorphyrin, CoPP) 20 μM과 각각의 시료를 농도별로 12시간 처리하였다. HT22 세포에 RIPA (89900, Thermo) 버퍼를 첨가한 다음, 4℃, 14,000 X g 에서 25분간 원심 분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트 (23227, Pierce Biotechnology)를 이용하였고 각각의 시료를 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 (polyacrylamide gel)에서 2시간 영동하고 나이트로셀룰로스 맴브레인 (Nitrocellulose membrane; NC membrane, 162-0115, BIO-RAD)으로 전사하였다. 전사된 나이트로셀룰로스 맴브레인 (Nitrocellulose membrane, NC membrane) 을 5% 무지방유가 포함된 신선한 블로킹 버퍼 (blocking buffer, 0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline) 에서 1시간 동안 반응을 정지시켰다. PBST (PBS, 0.1% Tween 20) 로 10분에 1회씩 3회 세척한 후에 HO-1 (374087, Calbiochem) 항체를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 10분에 1회씩 3회 세척한 후에 2차 항체 (Anti-mouse IgG, NA934, Amersham Pharmacia Biotech)를 1:1000으로 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBST로 10분에 1회씩 3회 세척한 다음, ECL (Amersham Pharmacia Biotech) 용액을 1:1 로 잘 섞어서 나이트로셀룰로스 맴브레인 (Nitrocellulose membrane, NC membrane) 위에 부어서 발광시키고 암실에서 X선 필름에 감광한 후 현상하였다. 같은 방법으로 Actin 항체 (1:1000으로 희석하여 사용) (SC1616, Santacruz biotechnology)를 이용하여 Actin을 측정하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)은 농도 증가함에 따라 유의한 수준으로 HO-1의 발현을 유도함을 확인할 수 있었으며, SG-E 또는 SG-R에 비하여 그 효과가 높음을 알 수 있었다.

실험예 4. HO 효소 활성( Heme oxygenase activity )

상기 실험예 3의 HO 발현으로 인해 증가된 빌리루빈 (biliverdin)의 양으로 HO 효소 활성을 측정하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Tenhunen R et al, The Journal of laboratory and clinical medicine, 75, pp.410-421, 1970.).

상기 참고예 1의 세포주에 항산화 및 세포보호 효과를 나타내는 효소인 HO-1의 발현 유도제인 코발트 프로토포르피린 (Cobalt protophorphyrin, CoPP) 20 μM 을 사용하여 유도하고, HO 효소 활성을 알아보기 위해 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)을 5, 10, 20, 40 μg/ml의 농도별로 12시간 처리하였으며, SG-E와 SG-R도 동일한 조건에서 시험하였다 (도 4D, 4E, 4F). 양성대조군으로는 HO-1 유도제인 CoPP 20 μM 만을 처리하였다.

세포로부터 얻어진 마이크로솜 (microsome)에 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)와 랫드 간 시토졸 (cytosol)에서 얻어진 빌리베르딘 산화효소 (biliverdin reductase)를 포함하는 반응용액 (reaction mixture)인 100 mM PBS, 2 mM 염화 마그네슘 (MgCl₂), 3 mg의 랫드 간 시토졸 (cytosol), 0.8 mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NADPH), 2 mM 글루코스-6-포스페이트 (glucose-6-phosphate, G7772, Sigma), 0.2 U의 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나아제 (glucose-6-phosphate dehydrogenase, G8878, Sigma) 등을 첨가하고 기질로서 헤민 (Hemin, H651-9, Porphyrin Products) 을 20 μM 처리한 뒤에 37℃에서 1시간 동안 암실에서 반응한 뒤 클로로포름 1ml으로 반응을 종결하고 450 nm에서 흡광도 (SpectramaxGemini XS, Molecular Devices)를 측정하여 하기 수학식 1의 계산식으로 표 1의 흡광도 값을 이용하여 계산하였다.

HO 농도 (ng/ml)	0.0	0.125	0.250	0.5	1.0	2.0	4.0	8.0
OD₄₅₀	0.091	0.134	0.143	0.214	0.421	0.786	1.325	3.021

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)은 유의한 수준에서 HO 효소 활성이 증가함을 확인할 수 있었으며, SG-E 또는 SG-R에 비하여 HO 효소 활성이 증가됨을 알 수 있었다.

실험예 5. 세포보호효과 및 ROS 측정법

상기 실시예 1에서 수득한 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)의 ROS에 대한 억제효과를 측정하기 위하여 문헌 (Royall J and H Ischiropoulos, Archives of biochemistry and biophysics, 302, 348-355, 1993.) 등의 방법으로 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참고예 1의 세포주에 5 mM 글루타메이트를 처리하여 독성을 유발한 후, 각각 상기 실시예 1에서 수득한 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S) 5, 10, 20, 40 ㎍/ml, 비교예 1에서 수득한 SG-E 5, 10, 20, 40 ㎍/ml을 처리하여 12시간 동안 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였다. 트롤록스 (Trolox) 50 μM 및 SnPP (Tin protophorphyrin, porphyrin products) 50 μM은 양성대조군으로 사용하였다.

5-1. MTT 법

상기 실험예 1와 동일한 방법으로 MTT 법을 수행하였다.

실험결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S) 20 및 40 ㎍/ml을 처리한 경우 세포 보호효과가 증가하였으며, HO-1의 억제제인 SnPP로 효과가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. SnPP 단독 처리시는 세포에 영향을 주지 않았음을 실험결과를 통해 알 수 있으며, 따라서, HO-1의 발현에 기하여 뇌세포 보호효과를 나타냄을 예측할 수 있었다 ( ^* P < 0.05 글루타메이트 처리군과 비교).

5-2. ROS 측정

상기 배양된 세포를 PBS로 세척한 후, 10 μM 2',7' -dichlofluorescein diacetate (DCFDA, 35845, Fluka) 를 포함하는 Hank's balanced salt 용액에 30분 동안 암실에서 반응한 후 세포의 형광광도 (SpectramaxGemini XS, Molecular Devices)를 특정파장(excitation wavelength : 490nm; emission wavelength : 525nm)에서 측정하였다.

실험결과, 도 5B에 나타난 바와 같이 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)을 20 및 40 ㎍/ml을 처리한 경우 양성대조군으로 사용한 트롤록스(trolox)와 유사한 값을 나타냈으며, HO-1의 억제제인 SnPP로 효과가 감소되는 것을 확인할 수 있었다 ( ^* P < 0.05 글루타메이트 처리군과 비교).

하기에 본 발명의 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

SG-S 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

SG-S 20 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

SG-S 20 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

SG-S 20 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ _,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

SG-S 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

SG-S 20 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

SG-S 20 mg

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

6-진저롤을 주성분으로 하는 생강의 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 생강(生薑; Zingiberis Rhizoma Crudus)은 생강과(Zingiberaceae)의 여러해살이풀인 생강(Zingiber officinale Rosc.)의 뿌리줄기인 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 표준화 추출 분획물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매의 극성 용매로 당업계의 통상적인 추출방법으로 추출하여 수득된 생강 조 추출물을 1 내지 10배 부피(v/v)의 물을 가해 현탁액을 제조한 후에 실온 방치 후에 원심 분리하여 수득되는 생강 표준화 침전물 추출 분획물 및 생강 표준화 상등액 추출 분획물을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)은 건조시킨 생강을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매 등의 극성 용매로 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법으로 추출하여 생강 조 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 단계에서 수득한 생강 조 추출물에 증류수, 정제수 등의 통상적인 물을 첨가하여, 충분히 교반하여 현탁액을 제조하는 제 2단계; 상기 현탁액을 상온에서, 12 내지 48시간 동안 방치하여 수용액상 및 현탁액상을 제조하는 제 3단계; 상기에서 제조된 수용액상 및 현탁액상을 용매-용매 분배법을 이용한 분획법, 원심분리기를 이용한 분획법 등의 당업계에 통상적인 분리방법을 이용하여 500 내지 10000 rpm의 회전속도에서 10분 내지 3시간 동안 원심분리를 수행하여 침전물 및 상등액을 각각 수득하는 제 4단계 공정을 포함하는 제조방법을 통하여 수득되는 생강 표준화 침전물 추출 분획물(SG-S) 또는 생강 표준화 상등액 추출 분획물(SG-R)임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 피크(Pick) 질환 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob) 질환을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 “생강의 표준화 추출 분획물”은 6-진저롤 (gingerol) 지표성분을 1.0 내지 10%(w/w)을 함유함을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물 총 중량에 대하여 상기 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)을 0.1 내지 50% 중량으로 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
6-진저롤을 주성분으로 하는 생강의 표준화 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 8항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.
제 8항에 있어서, 상기 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)은 상기 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 분획물(SG-S)은 건조시킨 생강을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매 등의 극성 용매로 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법으로 추출하여 생강 조 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 단계에서 수득한 생강 조 추출물에 증류수, 정제수 등의 통상적인 물을 첨가하여, 충분히 교반하여 현탁액을 제조하는 제 2단계; 상기 현탁액을 상온에서, 12 내지 48시간 동안 방치하여 수용액상 및 현탁액상을 제조하는 제 3단계; 상기에서 제조된 수용액상 및 현탁액상을 용매-용매 분배법을 이용한 분획법, 원심분리기를 이용한 분획법 등의 당업계에 통상적인 분리방법을 이용하여 500 내지 10000 rpm의 회전속도에서 10분 내지 3시간 동안 원심분리를 수행하여 침전물 및 상등액을 각각 수득하는 제 4단계 공정을 포함하는 제조방법을 통하여 수득되는 생강 표준화 침전물 추출 분획물(SG-S) 또는 생강 표준화 상등액 추출 분획물(SG-R)임을 특징으로 하는 건강기능식품.
건조시킨 생강을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매 등의 극성 용매로 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법으로 추출하여 생강 조 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 단계에서 수득한 생강 조 추출물에 증류수, 정제수 등의 통상적인 물을 첨가하여, 충분히 교반하여 현탁액을 제조하는 제 2단계; 상기 현탁액을 상온에서, 12 내지 48시간 동안 방치하여 수용액상 및 현탁액상을 제조하는 제 3단계; 상기에서 제조된 수용액상 및 현탁액상을 용매-용매 분배법을 이용한 분획법, 원심분리기를 이용한 분획법 등의 당업계에 통상적인 분리방법을 이용하여 500 내지 10000 rpm의 회전속도에서 10분 내지 3시간 동안 원심분리를 수행하여 침전물 및 상등액을 각각 수득하는 제 4단계 공정을 포함하는 제 1항의 생강 조 추출물의 6-진저롤을 주성분으로 하는 표준화 추출 분획물을 각각 수득하는 제조방법.