KR101329341B1

KR101329341B1 - 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101329341B1
Application number: KR1020110118056A
Authority: KR
Inventors: 김민정; 김효진; 이원용; 손현주; 이윤희; 탁동섭; 윤은임; 방면호; 백윤수; 조인수
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2011-11-14
Publication date: 2013-11-15
Also published as: KR20130052804A

Abstract

본 발명은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제용 조성물, 또는 동물사료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 세포에 지속적으로 감염된 소해면상뇌증 변형 프리온의 생산을 억제 또는 제거시킴으로써 소해면상뇌증을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.

Description

백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising Zinnia elegans extracts for preventing or treating of bovine spongiform encephalopathy}

전염성해면상뇌증은 치명적인 신경의 퇴행성 질환을 일으키는 일종의 퇴행성 신경 질환으로, 소해면상뇌증(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE), 면양 또는 산양의 스크래피(Scrapie), 사람에서의 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob Disease, CJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤인커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome), 쿠루(Kuru), 밍크의 전염성밍크뇌증(Transmissible Mink Encephalopathy), 사슴의 만성소모성질병(Chronic Wasting Disease), 그리고 고양이 해면상뇌증(Feline Spongiform Encephalopathies) 등이 여기에 속한다.

특히 소해면상뇌증은 소에서 발생하는 만성 신경 변성 질병으로서 일명 광우병 또는 프리온 질병(Prion Diseases)으로 불려지고 있다. 이 질병은 변형 프리온 단백질 감염에 의한 신경세포의 공포변성과 중추신경조직의 해면상 변화가 특징으로 2년 내지 5년의 다양하고 긴 잠복기와 불안, 보행장애, 기립불능, 전신마비 등 임상증상을 보이다가 결국은 100% 폐사되는 치명적인 만성 진행성 질병이다. 또한, 최근에 와서 그 원인체가 변형 프리온이라는 동질성 때문에 전염성해면상뇌증(TSE)으로 분류되고 있으며, 종간 장벽(species barrier)을 넘어 사람에게도 발병되므로 공중보건학적으로 대단히 중요한 질병으로 분류되고 있다.

전염성해면상뇌증의 원인체인 변형 프리온은 감염성 단백질로 보고되고 있으며, 이 단백질은 체내에서 정상 프리온 단백질과 마찬가지로 면역원성을 갖지 않아 숙주의 면역체계로 제거되거나 항체반응을 유발하지 않는 특징을 가지고 있다. 또한 긴 잠복기를 가지면서 소해면상뇌증에 감염된 소의 뇌에 대한 사후 분석에서 신경세포의 파괴와 비정상 단백질 섬유의 침적으로 인하여 뇌에 스펀지(해면상) 형태의 특이한 패턴의 공포(空胞)가 형성됨이 보고되고 있다.

현재 전염성해면상뇌증 원인체의 면역원성 부재 및 분명한 원인물질의 규명이 되어있지 않은 실정으로 이 질병에 대한 예방약이나 유효한 치료제가 없는 실정이다. 이 질병에 대한 억제물질의 스크리닝에 스크래피 감염 마우스 신경세포 (scrapie-infected mouse neuroblastoma cell, ScN2a) 또는 면양 스크래피 감염 토끼 신장세포(Rov9 cells chronically-infected with sheep scrapie)를 이용하여 폴리페닐, 항말라리아 화합물, 폴리아민, 및 펜토산 폴리설페이트 등의 억제물질이 보고 된 바 있다. 그러나 소해면상뇌증에 유효한 치료효과를 가지는 천연물질에 대해서는 보고된 바가 없다.

한편, 백일홍 또는 배롱나무는 속씨식물문 쌍떡잎식물강 도금양목 부처꽃과에 속하는 낙엽관목 또는 소교목으로 학명은 Zinnia elegans 으로 중국 남부 지방의 원산지로 대한민국, 일본, 호주에도 분포한다. 가지 끝에 달리는 원추화서의 꽃은 홍자색으로 피며 늦가을까지 꽃이 달려있고 꽃받침은 7~10 cm 이며 6개로 얕게 갈라졌고, 꽃잎은 6개로 둥글고 가장자리에는 주름이 잡혀서 굽어졌고 밑부분은 갈고리 모양이다. 수술은 30~40개로서 가장자리는 6개는 약간 길고 암술대는 1개로 밖으로 나와있다. 열매는 삭과로 길둥글며 털이 있고 이듬해 가을에 익는다

백일홍 (배롱나무)의 뿌리는 연중 수시로 채취할 수 있고, 뿌리에는 sitosterol 과 3,3',4-trimethyl ellagic acid가 함유되어 있다. 잎에는 decinine, decamine, lagerstroemine, lagerine, dihydroverticillatine, decodine 등의 alkaloid가 분리되었고, 꽃에는 dellphinidin-3-arabinoside, petunidin-3-arabinoside, malvidin-3-arabinoside, ellagic acid 등이 분리되었고, alkaloid의 methyl lagerine이 알려져 있다. decamine은 항진균 작용에 우수하다.

백일홍 (배롱나무)의 효능은 활혈, 지혈, 해독, 소종한다. 각종출혈, 골절, 유선염, 습진, 간염, 간경화에 좋다고 알려져 있다. 또한 월경과다, 산후 지혈, 대하증, 설사, 장염 그리고 지혈에 쓰인다. 그러나 백일홍 추출물이 소해면상뇌증에 유효한 치료효과가 있음에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 소해면상뇌증에 직접적으로 유효한 억제능을 갖는 천연물질을 선발하고자 소해면상뇌증이 지속감염된 세포(M2B)를 이용하여 국내외에서 확보한 천연식물 추출물을 스크리닝한 결과, 백일홍 추출물이 소해면상뇌증이 지속감염된 M2B 세포를 억제하는 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 동물사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 동물사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물의 유효성분으로 포함되는 백일홍 추출물은 변형 프리온의 생산 억제 및 제거 효과가 우수하므로, 전염성해면상뇌증, 바람직하게는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료제로 적합하다. 또한 최근 연구에 따르면 소해면상뇌증은 종간 장벽(species barrier)을 넘어 사람에게 전이될 수 있는 비의도적 감염의 가능성을 제시하고 있어 동물에서의 변형 프리온의 억제는 매우 중요하다. 또한, 상기 백일홍 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에서는 현재까지 세계적으로 소해면상뇌증과 직접적으로 관련된 세포를 이용한 소해면상뇌증 억제제의 스크리닝이나 억제제가 보고된 바 없는 실정에서, 소해면상뇌증이 지속감염된 세포(M2B)를 이용하여 상기 세포에 지속적으로 감염된 소해면상뇌증 변형 프리온 (PrP^BSE)의 생산을 억제 또는 제거시키는 천연물질로 백일홍 추출물을 스크리닝하였다.

본 발명에서 사용한 M2B 세포는 본 발명자들이 기 개발한 전염성해면상뇌증 감수성 세포로서, 그 제조방법은 국내특허출원 제10-2009-0114269호에 상세히 기술되어 있다. 보다 구체적으로, 정상 프리온 단백질 유전자를 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터에 삽입하여 감염성 재조합 렌티바이러스를 제조하고, 상기 감염성 재조합 렌티바이러스를 비인간 포유동물 세포주인 MDBK 세포에 접종하여 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 제조 및 선별한 후, 상기 선별된 형질도입 세포에 소해면상뇌증에 감염된 소의 뇌 유제액을 접종하여 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)가 포함된 세포 배양액에서 배양함으로써 감염성 변형 프리온(PrP^BSE)에 지속감염되도록 제조한 세포이다. 바람직하게, 상기 M2B 세포는 기탁번호 KCTC 11594BP 의 세포를 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기 M2B 세포를 이용하여 백일홍 추출물이 소해면상뇌증을 억제하는 효과가 있음을 입증하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

첫째, 본 발명자들이 기 개발한 M2B 세포(국내특허출원 제10-2009-0114269호, 세포기탁번호 KCTC 11594BP)를 천연 식물 추출물 처리 24시간 전에 96 웰 플레이트에 배양하여 접종 할 수 있는 세포를 제공하였다.

둘째, 한국생명공학연구원 식물추출물은행으로부터 도입한 20mg/ml의 추출물 100종류를 10% 소태아혈청이 포함 되어 있는 세포 배양 배지에 25㎍/ml로 희석하여 접종액으로 제공하였다.

셋째, 추출물의 효능평가를 위해서 M2B 세포를 6대 계대배양 하는 동안 추출물이 첨가된 배지를 지속적으로 처리해 주었다.

넷째, 표준 세포내 스크래피 검출기법(SSCA: Standard Scrapie Cell Assay, Klohn PC et . al, 2006)을 적용하여 세포에서 생산된 변형 프리온의 제거 유무를 확인하여 억제제로 사용 할 수 있는 천연 식물 추출물을 선발하였다.

다섯째, 선발된 식물 추출물을 이용하여 변형 프리온 유효 억제 농도를 측정하고자 SSCA 방법과 면역블로팅 방법을 이용하여 억제 농도를 측정하였다.

그 결과 최종적으로 M2B 세포 내의 변형 프리온(PrP^BSE)을 효과적으로 억제하는 백일홍 추출물을 스크리닝하였으며, 그 유효 억제 농도는 12.5㎍/ml 이상임을 규명하였다.

본 발명의 백일홍 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알코올, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 백일홍 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 수의학적 조성물의 투여량은 동물의 연령, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 백일홍 추출물 12.5㎍/ml 농도부터 변형 프리온이 검출되지 않았으므로 12.5㎍/ml 이상의 농도를 포함하는 것이 바람직하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 동물사료 조성물에 관한 것이다.

상기에서, 백일홍 추출물은 20 내지 90%의 고농축액, 분말 또는 과립 형태로 동물사료 첨가제에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 동물사료 첨가제는 구연산, 푸말산, 아디프산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백일홍 추출물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다. 상기 동물사료 첨가제는 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제는 또한 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 용이하게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다. 상기 동물사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 백일홍 추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 동물사료 첨가제를 포함하는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다. 상기 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 백일홍 추출물을 포함하는 동물용 사료 배합 방법의 한 예로는 백일홍 추출물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1kg 당 약 1g 내지 100g의 양으로 혼입한다. 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명의 백일홍 추출물은 변형 프리온의 억제효과가 우수하여 친환경적 소해면상뇌증 예방 또는 치료제로서 활용될 수 있으며, 동물용의약품, 사료 첨가제, 및 기능성 보조사료 등의 동물의약산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가 향후 다양한 소해면상뇌증의 예방 또는 치료제 개발을 위한 기초 자료로써 충분히 활용될 수 있다.

도 1은 소해면상뇌증이 감염된 세포에 천연물질 추출물을 접종하는 실험 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 변형 프리온의 억제 유무를 판단하기 위해 SSCA 검사법을 수행하여 변형 프리온이 검출되지 않은 웰을 사진 촬영하여 검증한 결과이다.
도 3은 백일홍 추출물의 변형 프리온 유효 억제 농도가 6.25㎍/ml 임을 SSCA 검사법으로 확인한 결과이다.
도 4는 백일홍 추출물의 변형 프리온 유효 억제 농도가 12.5㎍/ml 임을 면역블로팅 검사법으로 최종 확인한 결과이다.
도 5는 백일홍 추출물의 독성에 의한 세포 활성여부를 확인하기 위해 cell proliferation assay를 통해 활성을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업자에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.

천연 식물 유래 추출물의 제조

한국생명공학연구원 식물추출은행으로부터 국내외에서 자생하고 있는 총 100 종의 천연 식물 유래 추출물을 분양받았다. 상기 추출물은 100 종의 각 식물들을 건조하여 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올로 이루어진 용매 군 중에서 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 얻은 추출물이다. 상기 추출물은 추출 용매에 따라 인산완충용액, 에탄올, 메탄올 또는 DMSO 를 이용하여 20mg/ml 농도로 제조하였다. 본 발명의 억제제 추출물은 위에서 얻어진 추출물의 1~50중량% 범위에 함유된다.

BSE 지속감염 세포주( M2B ) 의 제조 및 배양

국내특허출원 제10-2009-0114269호에 기재된 방법으로 변형 프리온이 존재하는 M2B 세포를 제조하였다 (KCTC 11594BP). 상기 M2B 세포를 24시간 동안 96 웰 플레이트에 배양하였다. 각 웰당 2,600여개의 세포(2.6 x 10³개/ml) 가 존재하도록 배양하였다. 배양액으로는 10% 소태아혈청, 항생제(스크렙토마이신 및 페니실린) 및 비필수아미노산이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 각 웰당 200㎕ 씩 분주하였다.

천연 식물 유래 추출물의 희석과 접종

실시예 1에서 제조한 각 20mg/ml 의 천연 식물 유래 추출물을 실시예 2에 기재된 세포 배지에 25㎍/ml 농도로 희석하여 접종하였다.

세포의 계대배양

실시예 3에서 제조된 추출물 포함 세포 배양 배지를 추출물의 접종 72시간 후에 트립신 처리하여 계대배양하였으며, 추출물의 독성에 의한 세포 활성여부를 assay을 통해 확인하고 (도 5), 정상적으로 성장하는 세포에 대해서는 72시간 후에 다시 계대배양하였다. 매 계대배양에 사용되는 배지에는 각각의 추출물의 농도가 25㎍/ml 이 되도록 하였다.

실시예 2부터 4까지의 과정은 도 1에 모식도로 나타내었다.

SSCA 검사를 통한 변형 프리온의 생산 억제 또는 제거 여부 확인

마지막 계대배양 시에 각 웰의 50% 세포를 SSCA 검사법을 위해 ELISPOT 플레이트(Multiscreen-IP filter plates, Millipore, USA)에 옮겨 놓았다. 변형 프리온의 검출을 위해 세포 전처리 단계로 프로테이나제 K(2ug/ml)를 37에서 30분간 반응시켰다. 프리온과 반응할 수 있는 일차항체로 6H4 (Prionics, Switzeland)를 1:4,000 배로 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 2차 항체로는 알카라인-포스파타아제 접합된 항 마우스 IgG (Alkaline-Phosphatase conjugated anti mouse IgG)를 1:2000 배로 희석하여 실온에서 1시간 처리한 후, 발색을 위해서 NBT/BCIP 포스파타아제 기질(phosphatase substrate)을 분주한 후 실온에서 16분 정치하였다. 증류수로 2번 세척한 후에 공기중에 건조하여 자색을 나타내는 변형 프리온 스팟을 Immunospot software system(Cellular Technology Ltd. USA)을 이용하여 측정하였다.

변형 프리온의 생산 억제 또는 제거하는 천연물질 추출물의 선별

실시예 5의 측정 결과 스팟들이 전혀 없는 웰을 선택하여 접종한 천연물질 추출물을 확인해보니, 메탄올에서 추출한 백일홍임을 확인할 수 있었다(도 2). 이 때 어떠한 약제도 처리하지 않은 M2B 세포를 양성 대조군으로 이용하였으며 백일홍 추출물을 접종한 웰은 자색의 스팟(변형 프리온의 생산 억제 또는 세포에서의 변형 프리온 제거)이 관찰되지 않았다.

SSCA 검사법을 통한 백일홍 추출물의 유효 억제 농도 측정

백일홍 추출물의 변형 프리온의 유효 억제 농도를 측정하기 위해 25㎍/ml의 추출물을 두 배씩 단계 희석하여 6.25㎍/ml 농도까지 희석한 후, 상기 희석된 추출물을 실시예 4와 같은 방법으로 계대배양하였다. 그 결과, 백일홍 추출물은 12.5㎍/ml부터 변형 프리온을 억제할 수 있는 것으로 나타났다 (도 3).

면역블로팅 검사법을 통한 백일홍 추출물의 유효 억제 농도 측정

실시예 7에서 추출물 농도별로 처리한 각 웰의 세포를 면역블로팅 검사에 사용할 세포를 확보하기 위해 6 웰 플레이트로 옮겨 배양하였다. 이때 사용하는 배지는 추출물이 없는 일반 세포배양 배지를 사용하였다. 검경 후 6 웰 플레이트가 가득 차면 세포를 수확하여 면역블로팅을 위해 전처리 과정을 수행하였다. 세포 라이시스 버퍼의 조성은 0.5% Triton X-100, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 5mM EDTA 이다. 라이시스 버퍼를 이용하여 수확한 세포를 용해 시키고 세포 용해물에 프로테이나제 K (10ug/ml)를 37에서 20분간 반응시켰다. 원심분리하여 침전된 세포 용해물과 1X SDS 샘플 버퍼 12.5㎕를 잘 섞은 후, 100에서 5분간 반응시켰다. 추출된 세포 용해물을 12% Bis-tris polyacrylamide gel (Invitrogen, USA)에 로딩하였다. 전기영동은 200V로 35분간 시행하고 단백질 시료들을 PVDF (polyvinylidene difluoride) 막을 이용하여 전기적으로 150V로 1시간 트랜스퍼 시켰다. 막을 30분간 블럭킹 한 후, 본 기관에서 제작한 S1 (1:3,000) 토끼 다클론항체 (rabbit anti-prion protein polyclonal antibody)를 1시간 실온에서 반응시켰다. TBST로 5분간 3회 세척한 후, 2차 항체로 알카라인 포스파타아제-접합된 염소 항토끼 IgG 항체(alkaline phosphatase-conjugated goat antibody to rabbit IgG)를 1:3,000 배로 TBST에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 5분간 3회 세척한 후 발색제로 화학발광제(chemiluminescence)인 CDP star를 사용하여 LAS 4000 (Kodak, Japan)으로 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 백일홍 추출물 12.5㎍/ml 농도부터 변형 프리온이 검출되지 않은 것을 면역블로팅으로도 확인할 수 있었다.

Claims

농도가 12.5㎍/ml 이상인 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용하여 추출되는 것인 조성물.
삭제
농도가 12.5㎍/ml 이상인 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 동물사료 첨가제 조성물.
농도가 12.5㎍/ml 이상인 백일홍 추출물을 포함하는 소해면상뇌증의 예방 또는 치료용 동물사료 조성물.