KR102577873B1

KR102577873B1 - 아데노신 고함유 동충하초 재배방법 및 용도

Info

Publication number: KR102577873B1
Application number: KR1020230014726A
Authority: KR
Inventors: 양덕춘; 김종학; 노종훈; 양동욱; 안종찬; 공병만; 이동욱; 홍반안
Original assignee: 한방바이오 주식회사
Priority date: 2023-02-03
Filing date: 2023-02-03
Publication date: 2023-09-15

Abstract

본 발명은 아데노신 고함유 동충하초의 재배방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 천연물을 이용하여 재배함으로써 아데노신 함량이 획기적으로 증가된 고품질의 동충하초를 재배하는 방법, 그리고 이렇게 재배된 아데노신 고함유 동충하초와 이를 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

아데노신 고함유 동충하초 재배방법 및 용도{Cultivation method for Cordyceps with high adenosine content and its use}

본 발명은 아데노신 고함유 동충하초 재배방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 천연물을 이용하여 재배함으로써 아데노신 함량이 획기적으로 증가된 고품질의 동충하초와 이를 재배하는 방법, 그리고 이를 이용하는 용도에 관한 것이다.

본 배경 기술에서 제시되는 내용은 관련 기술의 배경에 대한 설명을 제시하는 것일 뿐 이로 인해, 본 발명이 제한적으로 해석되지 않는다.

경제발전과 인구 고령화에 따라 건강에 대한 관심이 날로 증가되고 있다. 특히, 사람의 피부는 생체를 보호하는 1차적인 보호막인 동시에 사람의 인상을 결정하는 중요한 요소의 하나이기 때문에 노화에 따른 피부건강 관리는 매우 중요하다.

피부 노화는 주로 잔주름 발생, 피부건조, 탄력감소, 죽은깨 생성 등으로 나타나며 그 원인은 나이의 증가에 따른 나타나는 자연 노화 현상인 내인성과 공해물질에 노출, 자외선에 의해 광노화 등이 원인인 외인성이 대표적이다. 피부노화억제 및 피부건강을 위해서는 이러한 외적 요인뿐만 아니라 내적 요인을 포함하여 피부를 보호 관리하는 것이 필요하다.

지금까지 피부 관리를 위한 방편으로 수많은 물질과 제품들이 개발, 유통되고 있으며, 이에 대한 관심은 날로 더 증가될 것으로 전망된다. 그 중 주름발생 억제 및 개선용으로는 아데노신이 가장 보편적으로 사용되고 있다.

아데노신은 주름개선 기능성 화장품 원료로 인정된 물질로서, 표피가 아닌 피부 내부에서 단백질 합성을 촉진하여 세포 재생력 향상, 피부 탄력 증강에 탁월한 효능을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 또한, 아데노신은 독성과 부작용이 없을 뿐만 아니라 지속력이 강하기 때문에, 이미 알려져 있는 기능성 물질인 빛에 약한 레티놀과는 달리 밤과 낮 상관없이 사용이 가능한 기능성 원료이다. 아데노신은 이와 같은 장점이 있으나, 여전히 고가이어서 천연소재로부터 다량 얻을 수 있는 기술개발이나 소재 발굴이 절실히 필요하다.

한편, 동충하초는 예로부터 인삼, 녹용과 함께 3대 명약으로 알려져 있으며, 면역력 증강, 항염증 등 다양한 효능이 밝혀졌다. 동충하초는 수백 종이 있는데, 그 중 식품원료로 등재된 동충하초((Cordyceps)는 밀리타리스 동충하초로 불리우는 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris)와 누애동충하초 등 2가지가 알려져 있다. 이 중에서도 특히, 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris)는 아데노신(Adenosine)과 코디세핀(cordycepin)이 주성분이며, 이러한 유익한 성분을 획득할 수 있는 유일한 천연소재이다.

그러나, 이러한 천연의 유익한 성분들이 밀리타리스 동충하초의 주성분이긴 하지만, 두 성분은 그 구조가 유사하고 동일 대사 과정을 가지고 있어서 이 두 성분을 동시에 증강시키기가 어렵다. 또한, 천연소재에는 그 함량이 상대적으로 낮아 인체 내에서 효능을 발휘하기 위해서는 다량을 섭취해야 하는 문제점이 있다. 실제로, 동충하초 자실체 중 아데노신의 함량은 균종에 따라 다소의 차이는 있으나 자실체 건조 g당 0.5 내지 1.5mg에 불과하고 코디세핀 함량의 약 25% 수준에 불과하다.

그러므로 이러한 유효성분, 특히 아데노신을 동충하초에서 고함량으로 획득할 수 있는 방안이 마련되면 매우 유용할 것이다.

기존에 동충하초로부터 유용한 성분을 고함량으로 생산하기 위한 방법으로, 한국특허공개 제10-2019-0007999호에서는 코디셉스(cordyceps, 동충하초)를 유기 및 무기 질소원 함유 배양 조건에서 균일화된 균사체 형태로 배양하여 단기간에 배양액을 수득하여 코디세핀, 아데노신, 아데닌 등의 유용물질을 생산하는 방법이 제안되어 있다.

그 외에, 동충하초로부터 유용한 성분을 분리하는 방법으로, 한국특허공개 제10-2018-0068516호에서는 정제수를 이용하여 동충하초로부터 기능성 물질을 추출하는 방법이 제안되어 있고, 한국특허등록 제10-0509718호에서는 큰번데기동충하초로부터 물이나 저금 알코올로 추출하여 각종 암세포에 활성을 보이는 코디세핀을 대량으로 신속하게 분리 정제하는 방법이 제안되어 있다. 또, 한국특허공개 제10-2018-0118412호에서는 큰번데기동충하초로부터 각종 암세포에 활성을 보이는 코디세핀을 대량으로 신속하게 분리 정제하는 방법이 제안되어 있다.

그러나 위 종래기술 등에서 코디세핀 등 일부 유용물질을 생산하는 방법이나 유용물질의 추출방법이 제안되어 있을 뿐이지, 아직까지 동충하초 자체에 아데노신을 고함량으로 함유하도록 하여 유용물질을 고함량으로 활용할 수 있는 방법은 제안된 바 없어서, 동충하초로부터 아데노신 등 유효성분의 충분한 활용을 기대하기 어려운 문제가 있다.

한국특허공개 제10-2019-0007999호 한국특허공개 제10-2018-0068516호 한국특허등록 제10-0509718호 한국특허공개 제10-2018-0118412호

본 발명은 상기와 같은 종래기술이 문제점을 해결하기 위하여, 동충하초의 재배방법을 개선함으로써 기존에 비해 고함량으로 아데노신을 함유하는 새로운 동충하초 원료를 제조하는 것을 해결과제로 한다.

따라서 본 발명의 목적은 아데노신을 고함량으로 함유하는 동충하초를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 아데노신을 고함량으로 함유하는 동충하초 자실체 또는 균사체를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명이 또 다른 목적은 아데노신을 고함량으로 함유하는 동충하초의 제조를 위한 배지 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 아데노신을 고함량으로 함유하는 동충하초의 재배방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 아데노신을 고함량으로 함유하는 동충하초의 새로운 용도로서 건강식품이나 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

위와 같은 본 발명의 과제해결을 위하여, 본 발명은 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 천연 억제제로서, quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 천연물을 유효성분으로 이용하여 재배되고, 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 아데노신 고함유 동충하초를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연물은 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 아데노신 함량은 상기 천연물 불사용 대비 50중량% 이상 증가한 량으로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 아데노신 함량은 상기 천연물 불사용 대비 50~200중량% 증가한 량으로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 동충하초는 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris), 박쥐나방동충하초(Cordyceps sinensis), 눈꽃동충하초, 누애동충하초 중에서 선택된 하나이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 0.001~20중량% 함유하고, pH가 5.0~6.8인 동충하초 배양용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 동충하초 배양용 유효성분으로 사용하는 것을 특징으로 하는 아데노신 고함유 동충하초의 재배방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 동충하초 배양용 유효성분을 준비하는 단계;

상기 배양용 유효성분을 0.001~20중량% 함유하고, pH가 5.0~6.8인 동충하초 배양용 조성물을 제조하는 단계;

배지에서 동충하초 종균을 배양하는 단계;

베양된 종균에서 모균을 배양하여 균사체 또는 자실체를 증식시키는 단계

상기 모균 배양 과정에서 상기 배양용 조성물을 처리하여 아데노신 함량이 20중량% 이상 증가한 동충하초를 생산하는 단계

를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 배양용 조성물을 이용하여 액상배양시 모균 접종과 동시에 첨가하고, 고상배양의 경우 수확일을 기준으로 5일 내지 30일 전에, 일회 또는 연속하여 배양용 조성물을 적용하여 아데노신 고함유 동충하초를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 천연물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 재배되고, 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 아데노신 고함유 동충하초를 포함하는 피부건강개선용 건강식품을 포함한다.

또한, 본 발명은 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 천연물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 재배되고, 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 아데노신 고함유 동충하초를 포함하는 화장료 조성물을 포함한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 아데노신 고함유 동충하초는 기존에 비해 아데노신을 고함량으로 함유하여, 매우 경제적으로 아데노신을 대량생산할 수 있고, 이를 유효성분으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

특히, 본 발명의 ADA 억제제를 첨가하여 제조된 동충하초는 아데노신(adenosine) 함량이 기존에 상기 천연물을 사용하지 않고 재배한 경우(천연물 불사용)에 비해 20중량% 이상, 좋기로는 50중량% 이상, 더 바람직하게는 70 내지 200중량% 이상 증가된 동충하초 자실체(fruit body) 또는 균사체를 생산할 수 있다.

따라서 본 발명의 방법으로 재배하여 생산한 동충하초는 주름개선 등 피부개선 효과가 우수한 기능성 물질이 크게 강화된 피부건강개선용 건강식품(inner beauty) 또는 화장품 원료로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법에서 아데노신 탈아미노효소(ADA) 천연 억제제로서 사용되는 녹차 분말을 보여주는 예시 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법에서 동충하초 액상배양에서 녹차 분말 처리가 아데노신 생성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법에서 동충하초 자실체 배양 중에 ADA 천연 억제제 녹차 분말 처리 일자를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법을 적용한 일 예로서, 밀리타리스 동충하초 고상배양 중의 성장 중기에 녹차 분말 처리에 의한 자실체의 아데노신 및 코디세핀 함량 변화를 나타난 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법을 적용한 일 예로서, 밀리타리스 동충하초 고상배양 중의 성장 후기에 녹차 분말 처리에 의한 자실체의 아데노신 및 코디세핀 함량 변화를 나타난 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법을 적용한 일 예로서, 밀리타리스 동충하초의 수확 10일 전에 녹차 분말 처리에 의한 자실체의 아데노신 함량 변화를 나타난 그래프이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 천연물을 이용하여 주름개선 기능성 물질인 아데노신(Adenosine) 함유량을 획기적으로 증가시킨 동충하초에 관한 것이다.

본 발명은 이러한 아데노신이 고함량으로 함유된 동충하초의 새로운 재배방법을 제시한다.

본 발명에서 재배방법이라 함은 동충하초를 키우는 방법을 의미하며, 동충하초를 재배하여 수확한 동충하초 자실체를 추출, 농축하여 사용할 수 있게 원료화 하는 이후의 과정을 가공방법, 또는 원료의 제조방법으로 정의한다.

본 발명에서 동충하초는 동충하초의 균사체와 자실체를 포함하는 개념으로서, 협의로는 자실체인 경우가 더 바람직한 경우로 이해될 수도 있다.

본 발명에서는 생체 내에서 아데노신(Adenosine)을 이노신(Inosine)으로의 분해를 촉매하는 효소인 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA)의 활성을 억제하는 성분인 ADA 억제제를 함유한 천연물을 이용하여 동충하초의 재배에 적용함으로써 동충하초, 예컨대 동충하초의 자실체나 균사체에서 다른 유용 성분의 함량에 큰 영향을 주지 않으면서 아데노신 함량을 획기적으로 증가시킬 수 있는 재배방법을 제안하는 것이다.

본 발명에서 상기 천연물로는 예컨대 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서는 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제로 표현하는 경우 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제로 간단하게 표현하기도 한다.

따라서 본 발명은 동충하초, 예컨대 바람직하게는 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris) 재배에 있어서 아데노신 디아미네이즈(adenosine deaminase, ADA) 활성을 억제하는 성분을 함유한 천연물의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 처리하여 동충하초 자실체 등에서 천연 아데노신의 함량을 획기적으로 증가시키는 재배 기술을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같은 특정의 천연물을 이용하여 예컨대 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris)와 같은 아데노신 함유 동충하초에서 주름개선 등에 효과가 있는 기능성 물질인 아데노신 함량을 획기적으로 증가시킬 수 있는 것이다.

이러한 본 발명의 새로운 동충하초 제조기술은 본질적으로는 예컨대, 동충하초균을 예컨대 PDA(potato dextrose agar)배지에서 종균을 배양하는 단계; 배양된 종균에서 모균을 액상 배양하는 단계; 균사체 또는 자실체를 증식시키는 본 배양하는 단계; 본 배양에서 ADA 천연 억제제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바림직한 실시예에 의하면, 상기와 같이 아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 천연물을 유효성분으로 이용하여 재배되고, 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 아데노신 고함유 동충하초를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연물은 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 성분을 분말화, 추출 또는 정제한 것으로서, 예컨대 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물 중 하나이상이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 아데노신 함량은 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상, 50중량% 이상, 더 좋기로는 70중량% 이상 증가한 고함량, 예컨대 50~200중량%, 더 좋기로는 70~200중량% 증가한 고함량으로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명에서 사용되는 동충하초로서는 바람직하게는 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris), 박쥐나방동충하초(Cordyceps sinensis), 눈꽃동충하초, 누에동충하초 중에 하나 이상이 사용될 수 있다. 전형적으로는 큰번데기동충하초가 사용될 수 있다. 그러나 동충하초의 종류에 제한이 있는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같은 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 극성용매 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 0.001~20중량% 함유하고, pH가 5.0~6.8인 동충하초 배양용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 이러한 배양용 조성물은 상기 동충하초의 모균 배양과정에서 다양한 방법으로 적용될 수 있는데. 배지 조성물에 첨가하거나 분무 적용하는 등으로 처리할 수 있다,

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연물의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 동충하초 배양용 유효성분으로 사용하여 아데노신 고함유 동충하초을 재배하는 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 동충하초 재배방법은 상기 동충하초 배양용 유효성분을 준비하는 단계; 상기 배양용 유효성분을 0.001~20중량% 함유하고, pH가 5~6.8. 더 좋기로는 pH 5.5~6.6인 동충하초 배양용 조성물을 제조하는 단계; 배지에서 동충하초 종균을 배양하는 단계; 및 배양된 종균에서 모균을 배양하여 균사체 또는 자실체를 증식시키는 단계를 거치되, 상기 모균 배양 과정에서 상기 배양용 조성물을 처리하여 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 동충하초를 생산할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 배양용 조성물을 이용하여 액상배양시 모균 접종과 동시에 첨가하고, 고상배양의 경우 수확 일을 기준으로 5일 내지 30일 전에, 일회 또는 연속하여 배양용 조성물을 적용하여 아데노신 고함유 동충하초를 재배할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같이 제조된 아데노신 함량이 20중량% 이상 증가한 아데노신 고함유 동충하초는 피부건강 개선용 건강식품으로 바람직하게 사용될 수 있다. 예컨대 이너부티(Inner Beauty)용 식품으로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같이 재배된 아데노신 고함유 동충하초는 아데노신 이외에도 코디세핀 등 유용한 성분이 함유되어 있다. 그러므로 이러한 본 발명의 아데노신 고함유 동충하초의 경우 기존에 비해 우수한 피부개선 효능을 나타낼 수 있는 바, 예컨대 주름개선 효과를 비롯하여 항산화, 피부미백, 항염증, wound healing, 피부면역증강 효과 등의 효능을 나타낼 수 있다.

또한, 상기와 같이 제조된 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 아데노신 고함유 동충하초는 피부에 직접 적용하는 화장료 조성물로 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같은 건강식품이나 화장료 조성물을 예컨대 피부의 주름개선을 포함하는 피부건강개선용 조성물로 적용할 수 있다.

본 발명에서 상기와 같이 동충하초 제배과정에서 아데노신 탈아미노 효소 억제제를 함유하는 천연물을 사용하여 아데노신 함량을 혁신적으로 증가 시키는 방법을 일 예로서 좀더 구체적으로 설명한다.

단계 (a): 동충하초균를 PDA 배지에 종균을 배양하는 단계

본 단계는 동충하초 종균을 배양하는 단계로 예컨대 pH가 5.5~6.5로 조절된 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 25℃에서 10일 동안 배양할 수 있다. 여기서 종균은 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris) 또는 박쥐나방동충하초(Cordyceps sinensis), 눈꽃동충하초, 누에동충하초 등이 사용 가능하나 이나 이에 국한되지 않는다.

단계 (b): PDA 배양된 종균으로부터 모균을 액상배양 하는 단계

PDA배지에 배양된 균사체를 멸균된 원통형 절단기로 약 1cm의 PDA 플레이트 배양물을 10 펀칭하여 모 배양 배지에 이식한다. 모 배양(Mother culture) 배지는 L당 펩톤 10g, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 0.5g, 포도당 20g, MgSO₄ 1g, 비타민 B1 0.05g로 구성될 수 있다.

시드 배양은 예컨대, 500mL의 액상배양액을 함유하는 1,000mL 플라스크에서 성장시키고, 암 조건에서 5일 동안 회전 진탕(110rpm)하며, 23℃에서 배양할 수 있다.

단계 (c): 균사체 또는 자실체를 증식시키는 본 배양 단계

(1) 액상배양(liquid culture) : 상기 배양한 모균을 이용하여 액상 배양하는 단계로서 23~27℃의 온도에서 바람직하게는 25℃의 온도에서 배양하는 것이 바람직하다. 한편, 상기 배양은 100~200rpm으로, 바람직하게는 110rpm으로 교반하면서 7일 내지 21일간 배양하는 것으로서 동충하초를 액상배양방법으로 본 배양할 수 있다.

(2) 고상배양(Solid culture): 기본 배지는 L당 효모 추출물 2g, 펩톤 8g, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 0.5g, 포도당 20g, MgSO₄ 1g으로 구성할 수 있다. 다음 기질로서 현미 30g을 배양 병에 별도로 부어 넣고 45mL의 영양분을 배양 병에 첨가한 다음 121℃에서 20분 동안 멸균한다. 여기서 질소원은 번데기 분말, 탈지분유를 사용할 수 있고, 기질로는 기장, 귀리, 검은콩 중 하나이상을 사용할 수 있으나 그 종류와 농도는 이에 국한되지 않는다.

배양 용기를 어두운 배양실로 옮긴 다음 3~5일 동안 배양하고, 다시 400∼700럭스의 광도에 노출시키면서 50~70일 동안 배양할 수 있다. 낮과 빛의 상태는 예컨대, 명 14시간, 암 10시간으로 하고, 배양 기간이 끝나면 동충하초 자실체를 고체배지에서 분리한 후 40℃에서 건조하는 것으로 동충하초 고상배양을 시행할 수 있다.

단계 (d): 본 배양에서 ADA 천연 억제제를 처리하는 단계

(1) 액상배양: 본 단계는 상기 본 배양에서 ADA 효소에 대한 천연물 억제제를 처리하는 단계로, 바람직하게는 자몽, 감귤류, 녹차, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 쟈바플럼(java plum), 양파, 멀꿀, 석류 중 하나이상의 분말, 추출물, 정제물, 또는 부분정제물을 농도별로 처리하고 배양할 수 있다. 처리 농도는 시료 중의 naringin, naringenin, quercetin 등 flavonoids 지표 성분의 농도에 따라 0.05 내지 5%가 바람직하나 이에 국한되지 않는다. 배양액은 ADA 천연 억제제 첨가로 인해 pH가 달라질 수 있기 때문에 이를 보정하는 것이 바람직하다.

한편, 모균을 1% 되게 첨가한 상기 배양은 5-40일, 바람직하게 5~14일 동안 수행하는 것이 좋다. 아데노신의 축적은 세포내 아데노신 대사 및 아데노신 탈아미노효소(ADA) 활성도와 관계가 있기 때문이다.

(2) 고상배양: 본 단계는 상기 고상 기본배양에서 ADA천연 억제제를 처리하는 단계로서 바람직하게는 자몽, 감귤류, 녹차, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물, 또는 부분정제물을 0.001% 내지 20% 농도별로 처리하고 배양할 수 있다. 다만, 유효성분 즉, ADA 억제제의 함유량에 따라 달리할 수 있다. 처리 농도는 시료 중의 naringin, naringenin, quercetin 등 flavonoids 지표 성분의 농도에 따라 0.001% 내지 5%가 바람직하나 이에 국한되지 않는다. 배양액은 ADA 천연 억제제 첨가로 인해 pH가 달라질 수 있기 때문에 이를 5.5 내지 6.5로 보정하는 것이 바람직하다.

상기 배양은 50일 내지 70일 배양하며 바람직하게는 60일간 배양할 수있다. ADA 천연 억제제 처리는 분말 또는 추출물 첨가는 직접 첨가 또는 용액으로 분사하는 방법으로 할 수 있고 처리 시기는 본 배양 시작 0일에서 50일까지 1회 또는 1일, 5일, 7일 또는 10일 간격으로 반복 처리할 수 있다.

본 발명은 상기와 같이 특정 천연물을 적용하여 동충하초를 재배함으로써, 동충하초에 함유되는 아데노신 함량을 현저하게 증가시킨 것으로서, 기존에 고가의 아데노신을 고함량으로 함유하기 때문에 경제적으로 피부 미용에 매우 효과적으로 적용할 수 있는 것이다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하는 바, 본 발명에 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : ADA 천연 억제제 선발 및 최적 조건 정립

1-1. ADA 천연 억제제 녹차 분말 준비

ADA inhibitor로 사용한 녹차 분말은 다음과 같이 준비하였다. 즉, 대한민국 전남 보성 소재 다원에서 구입한 녹차를 38℃ 건조기에서 5시간 건조한 후 70~100mesh 크기로 분쇄하였다. 녹차 분말의 표준화는 녹차의 대표적인 카티킨 성분인 epigallocatechin gallate(EGCG)을 정량하여 기준으로 하였다. 이렇게 제된 녹차분말은 도 1의 사진과 같다.

1-2. 녹차 분말의 EGCG 정량

녹차에 들어 있는 대표적인 카테킨인 epigallocatechin gallate(EGCG)를 정량하기 위하여 건조분말 1g에 물 20ml를 첨가한 다음, 배양액에서와 같은 조건에서의 농도를 확인하기 위해 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후 1ml를 취하고 13,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여, 상등액을 0.45μm로 막 여과한 다음 HPLC에 적용하였다. EGCG 분석은 HPLC 시스템 (Agilent technology 1260 infinity)을 사용하였으며, 분리는 C18 컬럼 (5μm, 4.6 x 250mm)에서 수행하였다. 또한, EGCG 표준품은 시그마-알드리치사로부터 구입하였다.

1-3. 아데노신 증강을 위한 녹차 분말의 최적 농도 및 배양 시간

본 실시예에서는 ADA 천연억제제 녹차가 밀리타리스 동충하초에서 아데노신 생성 증가를 위한 최적 조건을 확립하고자 하였다. 이를 위해 배양 시간이 빠른 액상배양 녹차 분말의 최적 첨가 농도와 최적 배양 시간을 설정하기 위해 다음과 같이 실시하였다.

액상배양을 위한 배지의 조성은 배양액 L당 펩톤 10g, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 0.5g, 포도당 20g, MgSO₄ 1g, 비타민 B1 0.1g으로 하였다. 그리고 녹차 분말을 1% 또는 2% 되게 첨가하고 배양액 100ml가 들어 있는 250ml 삼각 플라스크에 담은 후 121℃에서 15분간 멸균하였다.

멸균된 배양액에 모 배양액을 1% 되게 접종하고, 25℃, Shaking incubator에서 110rpm으로 14일 동안 배양하였다. 배양 배지의 pH는 자연적으로 유지되었고 종균 배양 접종 전에 pH 5.8로 조정하였다. 첨가된 녹차 분말의 지표 성분 EGCG의 농도는 각각 0.03% 및 0.06%이었다. 배양 중 생성된 adenosine은 7일과 14일 후에 1ml의 배양액을 취하여 하기 1-4의 방법에 따라 HPLC를 이용하여 정량하였다.

1-4. 액상배양액 중 아데노신 정량

본 실시예에서는 동충하초 액상배양액 중 아데노신 정량은 다음과 같이 실시하였다. 아데노신 표준물질은 미국 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, Co.)로부터 구입하고 표준 용액의 시리즈는 12.5, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0 및 125μg/mL로 준비하였다. 동충하초 액상배양액 1.0ml, 탈이온수 20mL에 현탁시키고 42kHz, 70W (08890-06, Cole-Parmer, USA)에서 60℃에서 1시간 동안 초음파 처리하였다. 추출액을 10분 동안 9,000rpm에서 원심분리하여 상등액을 수득하고, 그 중 1ml를 0.45μm 막 필터를 통해 여과한 다음, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석에 적용하였다. HPLC 분석 시스템은 Aglient infility 1260 모델이었으며, 사용된 컬럼은 역상 Aglient C18 (4.6mm × 150mm, 5μm 입자크기)이었다. 추출물로부터 아데노신 분리는 탈 이온수 및 HPLC 등급 메탄올(Merck, Germany)로 구성된 이동상을 이용하여 컬럼 온도 25℃에서 부피 기준 85:15의 상대 비율로, 유속은 분당 1.0mL 및 UV-visible 검출이 260nm에서 수행하였다.

하기 표 1은 큰번데기동충하초 액상배양에서 녹차 분말 처리가 아데노신 함량에 미치는 영향을 나타낸 결과이다. 녹차 분말을 1% 되게 첨가했을 때 아데노신 함량은 7일 후 1,922±24μg/dl로 처리하자 않은 대조구의 1,311±7μg/dl에 비해 약 47% 증가되었고, 14일 후에는 약 130% 증가되었다. 녹차 분말을 2% 되게 처리했을 때는 7일 후 1,730±31μg/dl로 대조구에 비해 32% 증가되었고 14일 후에는 1,328±28μg/dl로 약 67% 증가되었다. 이 결과는 도 2에서 그래프로 도시하였다.

Treatment	7days (μg/dl)	14days (μg/dl)
Control	1311±7	797±54
GT 1%	1922±34	1829±16
GT 2%	1730±31	1328±58

이러한 결과로부터, 동충하초 액상배양에서 녹차 분말 처리로 아데노신 함량이 크게 증가됨을 알 수 있고, 그 효과는 2주 후에 더 크게 나타남을 알 수 있다. 그러나 대조구를 포함한 모든 시험구에서 아데노신 함량이 7일 이후 약간 감소되는 경향을 나타내었다. 이 결과는 녹차 분말 처리 농도는 1% 수준이면 충분하며 액상 배양의 경우 7일 내지 10일 배양 시 효과가 큼을 보여 준다.

실시예 2 : 동충하초 자실체에서 녹차 분말의 아데노신 증강 효과

2-1. 동충하초 균사체 배양

본 실시예에서 사용한 동충하초 모균은 Cordyceps militaris HB8 (MT835161) 이었으며, 스톡배양은 PDA 배지에서 10일 동안 성장시킨 다음 모 배양에 사용되었다. 모 배양 배지는 L당 펩톤 10g, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 0.5g, 포도당 20g, MgSO₄ 1g, 비타민 B1 0.05g로 구성되었다. 배양된 균사체를 멸균된 원통형 절단기로 약 1cm의 PDA 플레이트 배양물을 10 펀칭하여 모 배양 배지로 옮겼다. 시드 배양은 500mL의 액상배양액을 함유하는 1000ml 플라스크에서 성장시키고, 암 조건에서 5일 동안 회전 진탕(110rpm)하며 23℃에서 배양하였다.

균사체 배양을 위한 기본배지는 L당 효모 추출물 2g, 펩톤 8g, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 0.5g, 포도당 20g, MgSO₄ 1g으로 구성되었다. 고체 기질로 현미 30g을 배양 병에 별도로 부어 넣고 45mL의 영양분을 배양 병에 첨가한 다음 121℃에서 20분 동안 멸균하였다. 각 배양 병을 어두운 배양실로 옮긴 다음 3일 동안 배양하고 다시 400∽700럭스의 광도에 노출시키면서 60일 동안 배양하였다. 명암 상태는 명 14시간, 암 10시간이었다. 배양 기간이 끝난 후 동충하초의 자실체를 고체배지에서 분리하고 38~40℃에서 건조하였다.

2-2. ADA 천연 억제제 녹차 분말 처리 및 효과 검증

상기 배양 조건에서 ADA 천연억제제 처리는 상기 2-1에서 준비한 녹차 분말을 이용하여 도 3의 schedule에 따라 각각 처리하였다.

즉, 실험은 2단계로 나누어 실시되었으며, 1단계는 접종 후 성장의 중기인 40일째에 수확하여 비교하는 것으로서 수확 일을 기준으로 10일 전(접종 후 30일째) 및 5일 전(접종 후 35일째)에 녹차 분말을 1% 되게 1회 스프레이어로 처리하고 40일째 되는 날 수확하였다.

다른 한 group은 종균 접종 후 45일(-15일), 50일(-10일) 및 55일(-5일)에 각각 같은 방법으로 처리하였으며, 대조군은 수확하는 날(60일째) 같은 양의 녹차 분말을 처리한 후 수확하였다. 수확한 동충하초 자실체는 칭량한 후 38~40℃에서 건조하여 아데노신과 코디세핀 함량을 분석하였다.

2-3 동충하초에서 아데노신 및 코디세핀 정량

본 실시예에서 동충하초 자실체의 아데노신과 코디세핀 정량은 실시예 1-4의 방법에 따라 실시하였다. 단, 액상배양액 시료 1.0ml 대신 동충하초 자실체 건조분말 1.0g을 시료로 한 사용한 것과 표준물질로 코디세핀을 추가한 것 외에 모든 분석 과정은 동일하였다.

하기 표 2는 밀리타리스 동충하초 고상배양에서 성장 중기에 녹차 분말 처리가 주성분인 아데노신과 코디세핀의 함량에 미치는 영향을 보여주는 것이다. 아데노신 함량은 수확 5일전 처리시 자실체 건조 분말 g당 949μg으로 대조구 644μg에 비해 47% 증가 되었고, 10일전 처리시 1,328μg으로 200% 이상 크게 증가되었다. 코디세핀의 경우는 대조군의 1,844μg에서 1,770μg까지 약간 감소되는 경향을 보였으나 유의한 차이는 없었으며 두 성분의 합은 오히려 크게 증가되었다.

도 4는 녹차 분말 처리 효과를 백분율로 비교한 그래프로 녹차 분말을 10일전에 처리로 아데노신이 선택적으로 더 증가됨을 분명히 보여주는 것이다.

또한, 하기 표 3은 밀리타리스 동충하초의 고상배양에서 성장 후기에 녹차 분말 처리가 주성분의 생성에 미치는 영향을 보여주는 결과이다. 하기 표에서와 같이 녹차 분말을 1% 되게 수확하기 30일전, 25일전, 20일전, 15일전, 10일전, 5일전에 각각 1회 처리했을 때 아데노신 함량은 건조 자실체 g 당 909μg, 1070μg, 1,096μg, 1,208μg, 1,417μg, 1,144μg으로 처리 일자가 짧을수록 증가하다가 10일전에 처리했을 때 1,417μg으로 가장 높았다. 이 결과는 도 5에 나타내었다.

반면, 코디세핀의 함량도 큰 변화가 없거나 다소 증가되었다. 또한, 10일전 처리했을 때 아데노신 함량은 78%까지 현저하게 증가 되었다(도 6 참조). 아데노신과 코디세핀의 함량 비율 또한 처리하지 않은 대조군의 1:4.0 에서 10일전 처리시에는 1:2.8으로 아데노신의 상대적인 양도 크게 증가되었음을 알 수 있다.

상기 실험결과에서 본 바와 같이, 동충하초 배양 시 ADA 천연억제제 처리로 아데노신을 선택적으로 크게 증가시킬 수 있음이 확인되고, 처리 시기는 수확 전 10일 전후가 가장 효과적인 것을 알 수 있다. 도 6에서는 처리 10일 전의 아데노신 증강 효과가 78% 향상됨을 확인할 수 있다.

한편, 하기 표 4는 녹차 분말 처리가 동충하초 자실체 성장에 미치는 영향 평가 결과로서, 밀리타리스 동충하초를 60일간 고상 배양 후 각 실험구에서 자실체의 성장을 비교한 결과이다. 각 실험구 모두 자실체의 fresh 무게나 건조 무게 모두 대조군과 큰 차이가 없으므로 ADA 천연억제제로 동충하초 자실체의 수확량에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

상기한 본 발명의 아데노신이 고함량 함유된 동충하초와 이를 제조하는 기술은 동충하초의 품질을 현저하게 향상시키고, 아데노신을 기존에 비해 대량 생산할 수 있으므로 매우 경제적으로 활용할 수 있는 방법을 제시하고 있다.

이러한 본 발명의 아데노신 고함유 동충하초는 건강식품, 화장료 조성물로 활용 가능함은 물론, 향후 천연원료로 제조, 활용될 수 있는 바이오 소재로서 매우 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제로서, quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중 하나이상의 성분을 함유한 천연물을 유효성분으로 이용하여 동충하초를 재배하되, 여기서 천연물은 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 0.001~20중량% 함유하고, pH가 5.0~6.8인 동충하초 배양용 조성물에서 재배하여, 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 아데노신 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 아데노신 고함유 동충하초의 생산방법.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 아데노신 함량은 상기 천연물 불사용 대비 50~200중량% 증가한 량으로 증가시키는 아데노신 고함유 동충하초의 생산방법.
청구항 1에 있어서, 상기 동충하초는 큰번데기동충하초(Cordyceps militaris), 박쥐나방동충하초(Cordyceps sinensis), 눈꽃동충하초, 누에동충하초 중에서 선택된 하나이상인 아데노신 고함유 동충하초의 생산방법.
삭제
삭제
아데노신 탈아미노효소(Adenosine deaminase, ADA) 억제제인 quercetin, naringin, narigenin, kaempferol, myricetin, pentostatin, erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) 중에서 선택된 하나이상의 성분을 함유한 녹차, 자몽, 마늘, 토마토, 쐐기풀, 자바플럼, 양파, 감귤, 멀꿀, 석류 중에서 선택된 하나이상의 분말, 추출물, 정제물 또는 부분정제물을 포함하는 동충하초 배양용 유효성분을 준비하는 단계;
상기 배양용 유효성분을 0.001~20중량% 함유하고, pH가 5~6.8인 동충하초 배양용 조성물을 제조하는 단계;
배지에서 동충하초 종균을 배양하는 단계;
베양된 종균에서 모균을 배양하여 균사체 또는 자실체를 증식시키는 단계
상기 모균 배양 과정에서 상기 배양용 조성물을 처리하여 아데노신 함량이 상기 천연물 불사용 대비 20중량% 이상 증가한 동충하초를 생산하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노신 고함유 동충하초의 재배방법.
청구항 7에 있어서, 상기 배양용 조성물을 이용하여 액상배양시 모균 접종과 동시에 첨가하고, 고상배양의 경우 수확 일을 기준으로 5일 내지 30일 전에, 일회 또는 연속하여 배양용 조성물을 적용하여 아데노신 고함유 동충하초를 제조하는 것을 특징으로 하는 아데노신 고함유 동충하초의 재배방법.
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