KR20100012923A - 동충하초균의 배양방법 및 이에 따른 배양물의 용도 - Google Patents

Abstract

균 배양물에 효과적으로 면역활성기능 및 항산화활성을 부여하기 위한 동충하초균사체 배양방법이 개시된다.

본 발명의 방법에 따르면, 안전하고 값싼 농산 부산물을 이용하여 동충하초균을 배양함으로써 항보체활성 및 항산화활성이 증강된 배양액을 얻을 수 있으며, 이는 동물의 사료첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

동충하초, 면역활성, 항산화, 사료첨가제

Description

동충하초균의 배양방법 및 이에 따른 배양물의 용도 {METHOD OF CULTIVATING CORDYCEPS SINENSIS AND USE OF CULTURE THEREOF}

본 발명은 동충하초균의 배양방법 및 이에 따른 배양물의 용도에 관한 것이다.

동충하초(冬蟲夏草)란 겨울에는 벌레(蟲)상태로 있다가 여름이 되면 버섯(草)이 된다는 뜻에서 나온 말로써 곰팡이의 일종인 동충하초균의 포자나 균사가 살아있는 곤충의 몸 속에 침입하여 겨울 동안에는 그대로 잠복해 있다가 여름이 되면 그 곤충을 죽게하고 기주안에 있는 물질을 영양원으로 이용하여 내생균핵을 만든다음 곤충의 몸밖으로 자실체를 형성하는 기이한 버섯이다.

동충하초의 종류는 지금까지 세계적으로 750여 종류가 발견되고 있으며, 코디셉스 속(Cordyceps sp.)균, 패실로마이세스 속(Paecilomyces sp.)균, 이사리아 속(Isaria sp.)균 등 100여 가지 속으로 구분된다.

중국의 고서들에 의하면 동충하초는 암질환, 간질환, 폐질환, 뇌질환, 순환 기 질환, 심장병, 당뇨병 등에 탁월한 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 현대실용중약전에는 폐결핵, 노인쇠약성 만성결핵 빈혈, 허약체질 등을 치료한다고 나타나 있다. 최근에는 종양 억제율이 83%로 높은 항암효과 및 마약중독의 해독제로서도 효과가 있는 것으로 보고되고 있으며, 자연치유력을 가지고 있어 심한 운동으로 체력소모가 클 때 회복효과가 있다고 보고하고 있다.

밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)는 우리나라를 비롯하여 미국, 영국, 일본, 중국 등 세계적으로 항암, 항균, 항진균, 당뇨병 치료, 마약중독해독, 폐결핵, 자양강장제, 면역요법 등의 효능을 인정받고 있어 산업적으로 많은 가치를 가진다.

한편, 본 발명의 시넨시스 동충하초(Cordyceps sinensis)는 상기 밀리타리스 동충하초에 비해 높은 약리 효과를 가지고 있는 것으로 보고되고 있으며, 종균을 보유하고 있는 연구진이 드물어 효능면이나 균주 보유의 희속성 등 잠재적 가치는 무궁무진할 것으로 생각된다.

상기 시넨시스 동충하초는 자낭균강 맥각균 코디셉스 속에 속하며, 중국의 최고 지도자였던 등소평이 평소에 복용하였다고 알려진 것으로, 인시목 박쥐나방 유충의 몸을 기주로 하여 발생하는 자실체(버섯)와 유충의 복합체이다. 티벳 산맥의 해발 3,000m 이상에서 자생하는 것이 대표적이며, 중국의 사천, 운남, 귀주, 감숙, 청해, 서장 등지에서 자생하고 있으며 아직까지는 인공재배가 불가능하다.

그 성분으로는 수분 10.8%, 지방 8.4%, 조단백 25.3%, 조섬유 18.5%, 탄수화물 28.9%, 회분 4.1%가 포함되어 있으며 지방은 포화지방산 13.0%, 불포화지방산 82.2%가 함유되어 있다. 이외에도 비타민 B12 0.29 mg/g, mannital 78.8 mg/g, 폴리사카라이드 11.5% 등을 포함한다.

폴리사카라이드는 헤테로폴리사카라이드와 호모폴리사카라이드의 두 그룹으로 분류되는데, 헤테로폴리사카라이드는 다중당 타입(multiple sugar type)으로 구성되며 여러 종류의 글리코실트랜스퍼라아제(glycosyltransferase enzyme)에 의해 합성되어지는 반면, 호모폴리사카라이드는 일반적으로 수크라아제 효소(sucrase enzyme)에 의해 단독의 기질인 수크로스로부터 합성되어진다. 이러한 수크라아제 타입 효소들은 글루코스 잔기 (glucan) 또는 프럭토스 잔기(fructan)로 구성된 다당류를 합성하며(Arskold 등, 2007), 식품 또는 의약품 산업의 첨가물로써 다양하게 응용되어 왔다.

또한, 그 일종인 세포외다당체(EPS, exopolysaccharide)는 산업적 유용성 측면의 물리적인 특성뿐만 아니라 체내에 유효한 생리적 특성인 면역증진(immunity stimulation), 항궤양 활성(anti-ulcer activity), 혈중 콜레스테롤 감소(cholesterol reduction) 등의 유용한 효과가 보고되어 왔으며, GRAS (Generally Recognized as Safe)로 인식되어 왔다.

본 발명의 목적은 동충하초균사체 배양에 있어서, 그 배양물에 효과적으로 면역활성기능 및 항산화활성을 증강시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따르면,

동충하초균의 배양에 있어서, 배양 배지에 귤피 1~3%을 첨가하여 배양하는 방법을 제시할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면,

상기 방법에 의하여 생산된, 면역활성기능이 우수한 EPS 또는 배양물을 제시할 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면,

상기 방법에 의하여 생산된 면역활성기능이 우수한 EPS 또는 배양물을 포함하는 사료첨가제를 제시할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 시넨시스 동충하초 배양물을 이용하여 동물의 면역증강기능을 위한 사료첨가제로 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 상기 균 배양액의 면역활성능 및 항산화활성을 최대화할 수 있는 영양성분 및 배양 조건을 확립하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 방법은 식용가능한 다양한 동충하초 균에 적용될 수 있으며, 여기에는 Cordyceps sinensis , Cordyceps militaris 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 동충하초균의 배양에 있어서, 배양 배지에 귤피 1~3%을 첨가하여 배양함으로써 생산되는 배양물의 면역활성능 및 항산화활성을 증진시킬 수 있었다.

귤피 첨가에 앞서 동충하초균의 최적의 배양조건을 확립하기 위해 탄소원, 질소원, 배양온도 및 배양시간을 검토하였다.

배양액의 균체량을 나타내는 글루코사민 양은 당밀을 탄소원으로 사용시 가장 높은 균체량을 보였고, 면역활성물질로 알려진 EPS의 양은 미강 사용시에 가장 높은 것으로 나타났으므로, 미강과 당밀의 혼합비율을 3:1로 하여 탄소원으로 사용하였다(도 3 참조).

상기 미강과 당밀의 혼합비율을 3:1로 한 배지에 질소원을 각각 yeast extract 또는 CSL로 하여 배양한 결과, 균체량은 yeast extract와 CSL 사이에 커다란 차이를 보이지 않았으나 yeast extract 2-4% 사용시 다소 높은 균체량을 보여 질소원은 yeast extract 2% 로 정하였다.

상기 탄소원과 질소원을 함유한 배지에서 최적의 배양시간과 배양온도를 검토한 결과, EPS나 균체량의 최대 생산을 위한 배양온도는 25 내지 35℃가 적합한 것으로 나타났다. 배양시간에 다른 EPS 생산량은 4일 이후 큰 차이를 보이지 않았으며, 균체량 역시 5일 이후에는 큰 변화가 없었다. 따라서 4-7일 정도 배양하는 것이 바람직한 것을 알 수 있었다.

이와 같이 선정된 조건을 기반으로 하여 본 발명의 방법에서는 귤피 1~3%를 첨가하여 배양한다.

귤피는 감귤류 과실의 과피로 옛날부터 한방의 처방약으로 진피, 귤피, 지실, 지각의 이름으로 사용되어진 생약으로서, 시네프린(synephrine), 플라보노이드(flavonoids), 리모노이드(limonoids), 카르테노이드(carotenoids) 등의 다양한 화합물들이 함유된 것으로 알려져 있다. 귤피의 주요 플라보노이드 성분은 나린긴(naringin), 헤스페리딘(hesperidin)이며 그 밖에도 노빌리에틴(nobilietin), 탄게레틴(tangeretin) 등이 있다. 미국 FDA 보고서에 따르면, 나린긴 및 헤스페리딘은 안전한 화합물로 보고되고 있다.

상기 귤피는 배지에 1~3% 농도로 첨가되는 것이 바람직한데, 1% 미만 첨가되면, 얻어지는 배양물의 면역활성능이나 항산화활성이 미비하고, 3%를 초과하여 첨가되면, 배양시 통기량이 원활치 않으며, 배양 후 불요성 물질의 증가되어 제품의 품질을 저하시킬 수 있는 문제가 있다.

실시예와 같이 2% 귤피 농도를 첨가하여 동충하초균을 배양한 결과, 얻어진 배양물의 EPS 및 글루코사민 함량은 도 7에 나타내었으며, 귤피 첨가에 따른 배양 산물의 면역활성 증진 효과, 즉 항보체 활성의 증진 여부를 측정한 결과, 항보체 활성이 증진되는 효과를 얻을 수 있었다(도 9).

즉, 귤피를 첨가하지 않고 배양한 배양물로부터 얻은 EPS의 경우 48.2-68.7% 활성을 보인 반면, 귤피를 첨가하여 배양 후 얻은 EPS는 58.0-80.8%의 항보체활성을 확인하였다. 특히 양성대조군으로 사용한 PSK는 71.1% 항보체 활성을 보인 반면, 귤피 첨가시 3-7일 사이의 배양물의 EPS의 항보체 활성은 70.7-80.8%의 높은 활성을 보였다.

또한, 귤피를 첨가하여 배양하였을 경우에는 배양물의 항산화활성도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 귤피를 첨가하여 배양한 경우, 284.3-384.6 mg/100 g의 AEAC 값을 보인 반면, 귤피를 첨가하지 않은 경우 142.8-219.5 mg/100 g의 AEAC 값을 나타내었다.

이상의 결과로부터 본 발명의 방법에 의하여 동충하초 균 배양액의 면역활성 및 항산화활성을 증진시킬 수 있음을 알 수 있으며, 상기와 같이 배양된 배양물은 동물 섭취시 면역증강기능을 나타낼 수 있으므로 사료첨가제로서 유용하다.

본 발명에 따르면, 유용한 생리활성물질을 생산하는 것으로 알려진 동충하초균을 이용하여 동물에 효과적인 면역증강기능을 부여할 수 있는 물질을 생산하기 위한 배양방법 및 상기 방법에 의해 생산된 배양물의 사료첨가제로서의 용도를 제시한다. 본 발명의 방법은 값싼 농산 부산물을 이용하므로, 제조비용의 큰 상승없 이 면역활성기능을 높일 수 있는 사료첨가제의 개발에 유용하다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1: 동충하초균의 배양조건 확립

1-1. 사용균주 및 배지

본 발명에서 사용한 균주는 고려대학교 식품영양학과에서 보관중인 Cordyceps sinensis KR-5를 사용하였으며, 보관용 배지로는 PDA (potato dextrose agar) 사면배지를, 액체배양 기본배지로는 glucose 30 g, peptone 8 g, KH₂PO₄ 1 g and MgSO₄ 0.5 g (per liter)을 사용하였다.

1-2. 배양조건 최적화

생리활성 다당의 생산을 위한 배지의 최적화를 위해, 탄소원, 질소원, 무기질 및 pH와 온도에 대한 영향을 측정하고자, 각 탄소원을 기본배지에 2% 첨가하여 5일간 배양 후 활성 다당생산량을 측정하였다. 질소원은 미강 2%를 함유한 기본배지에 0.5% 질소원을 첨가하여 활성 다당 생산량을 측정하였다. 무기질은 미강 2%, peptone 0.5% 첨가된 기본배지에 무기질 0.1%를 각각 첨가하여 활성다당 생산량을 측정하였으며, pH 및 온도에 따른 영향은 각각 20, 30, 40 및 50℃와 pH 4, 5, 6, 7 및 8에서 각각의 활성 다당 생산량을 측정하였다.

1-3. 부산물 첨가효과

미강 2%, peptone 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%에 농산 부산물인 당밀 (전당 50% 함유), 전분박 (탄수화물 7.7%, 단백질 0.05%), 순물 (탄수화물 1.4%, 단백질 0.3%), 효모 가수분해물, corn steep liquor (CSL)을 각각 고형분 함량으로 0.5% 첨가하여 이에 따른 활성 다당 및 글루코사민의 생산에 미치는 영향을 조사하였다.

1-4. 당밀과 CSL 첨가 농도에 따른 효과

미강 2%, peptone 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%에 농산 부산물인 당밀과 CSL을 각각 0-2% 첨가하여 활성 다당 및 glucosamin의 생산량에 미치는 효과를 조사하였다.

1-5. 활성 다당

생리활성 물질인 활성 다당의 생산량은 박등 (2001)의 방법에 준하여 측정하였다. 균 배양액 12000 g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상징액에 4배량에 해당되는 에탄올을 가하여 4℃에서 12시간 방치하였다. 12시간 후 12000 g에서 10분간 원심분리하여 얻은 침전을 80℃에서 12시간 건조 후 무게를 측정하여 활성 다당을 측정하였다.

1-6. 글루코사민 측정

발효과정 중의 곰팡이균의 성장은 글루코사민 함량을 측정하여 나타내었다. 배양액을 80℃에서 12시간 동안 건조 후 분쇄하여 400 mg을 cap tube에 취하고 6 N HCl 5 ml를 가하여 121℃에서 60분간 처리하였다. 이것을 원심분리 (2,800 g, 15분)하고, 상징액 0.5 ml을 취하여 rotary vacuum evaporator를 사용하여 HCl을 완전히 제거한 다음 다시 1 ml의 증류수로 용해시켜 Swift 법 (1968)에 따라 글루코사민 함량을 구하였다. 각 농도별 글루코사민 수용액 3 ml에 6 N HCl 3 ml를 가하여 동일한 방법으로 처리하여 얻은 검량선에 의해 각 시료의 글루코사민 함량을 구하였다.

1-7. 항보체활성 측정

1) 정상인 혈청(normal human serum, NHS)의 제조

실험실의 건강한 성인의 혈액을 채취하여 실온 및 4℃에서 각각 30분씩 방치하여 응고시킨 후, 원심분리(3000 rpm, 20 min)하여 혈청을 분리한 뒤 미량 원심분리용 튜브에 1 ㎖씩 분주하여 -70℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용한다.

2) 항보체활성의 측정

항보체활성은 Mayer법을 이용하여 시료에 의한 보체 소비(complement comsumption) 후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test로 측정한다. 즉, 여러 농도(100, 500, 1000 ㎍/㎖)로 증류수에 녹인 시료(EPS)에 정상인의 혈청과 2% gelatin, 500μM Ca⁺⁺, 2 mM Mg⁺⁺이 함유된 GVB⁺⁺ (gelatin veronal buffered saline, pH 7.4) 완충액을 각각 50 ㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 1차 반응시키고 GVB⁺⁺를 350 ㎕를 가 한 후 이를 10-160배로 연속 희석한다. 여기에 다시 750 ㎕의 GVB⁺⁺를 가한 후 양의 감작적혈구(IgM-sensitization sheep erythrocyte, EA Cell, 1×10⁸ cell/㎖)를 250 ㎕를 가해 37℃에서 60분간 2차 반응시키고 PBS 2.5 ㎖을 넣어 반응을 정지시켰다. 반응액을 2500 rpm에서 약 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정한다(도 1 참조).

항보체활성은 NHS 와 buffer, 증류수만을 반응시킨 대조군의 총보체 용혈(50% total complement hemolysis, TCH_{50 ,} %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total total complement hemolysis, ITCH_{50 ,} %)로서 나타낸다.

[식 1]

ITCH₅₀ = (TCH₅₀ of control - TCH₅₀ of sample)/TCH₅₀ of control × 100

1-8. ABTS에 의한 항산화활성 측정

항산화활성의 측정법인 ABTS법은 페놀성 화합물을 함유한 시료의 첨가로 인해 2,2‘-azinobis(3-ethyl-benzo-thiaziline-6-sulfonate, ABTS)가 산화되어 라디칼 양이온인 ABTS·⁺가 생성되고 이것의 분해를 측정하여 항산화활성을 계산하는 방법이다. 페놀성 화합물이 없는 경우 ABTS·⁺는 비교적 안정하지만, 페놀성 화합물과 같은 수소공여체와는 강렬하게 반응하여 무색의 ABTS로 변환된다. 따라서 항산화활성은 페놀성 화합물을 함유한 시료와 반응하여 소비된 ABTS·⁺의 양을 측정하여 Vitamin C의 양으로 환산하며, 이값은 AEAC(ascorbic acid equivalent antioxidant activity)로 표시한다.

ABTS 라디칼을 이용한 총 항산화력의 측정은 Re 등(1999)의 방법에 의해서 측정하였다. ABTS 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 하루 동안 암소 방치하여 ABTS⁺·을 형성시킨 후 이 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 몰 흡광계수(ε = 1.6×10⁴ mol^-1cm^-1)를 이용하여 메탄올로 희석하였다. 희석된 ABTS⁺·용액 1 mL에 추출액 20 μL를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 30분 후에 측정하였다. 0.1 mM 아스코르브산을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 시료(균 배양액)의 항산화력(AEAC, ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)을 계산하였다.

실험결과

탄소원에 따른 pH , 배양액의 건물량 , 글루코사민 및 EPS 생산능

C. sinensis로부터 면역 증강 물질인 EPS 생산량 증가를 위하여 미강, 전분 등 탄소원을 기본 배지에 각각 2% 첨가하여 25℃에서 5일간 배양 후의 pH, 배양액의 건물량(broth dry weight)과 글루코사민 양을 측정한 결과(표 1), 균체량을 나타내는 글루코사민 양은 당밀을 탄소원으로 사용시 25.5 μg/ml로 가장 높은 균체량을 보였다. 특히 옥수수 전분, 감자 전분 및 쌀겨(미강)에서의 균체량은 19.0, 15.1과 13.8 μg/ml으로 차이를 보였으나 비교적 높은 균체량을 보였다.

[표 1] 다양한 탄소원에서 C. sinensis의 배양 후의 pH, 고형분 함량 및 글루코사민 함량

탄소원	최종 pH	배양액 건물량 (mg)	글루코사민 (μg/ml)
무첨가	7.61	357.7	0
덱스트로스	7.28	1384.6	9.1
수크로스	7.08	1410.4	10.8
쌀겨(미강)	6.64	1200.8	15.1
전분(옥수수)	6.24	825.6	19.0
전분(감자)	6.37	756.0	13.8
솔비톨	6.87	1565.2	8.2
당밀	6.6	1432.8	25.5

C. sinesis를 이용하여 사료첨가제 개발시 가장 중요한 성분은 면역활성물질인 EPS이다. 따라서 탄소원을 달리하여 EPS 생산량을 측정한 결과(도 2 참조), 쌀겨(미강)가 19.8 mg/ml로 가장 높은 생산량을 보였으며, 당밀과 감자 전분은 각각 14.5과 12.5 mg/ml의 EPS 생산량을 보였다.

미강과 당밀의 혼합 사용시의 EPS 생산능

앞선 실험을 통하여 쌀겨가 우수한 탄소원으로 선정되었으며, 균체량 증식에 있어서는 당밀이 가장 우수하였다. 따라서 미강과 당밀을 혼합사용 시의 균체량과 EPS의 생산량을 측정하고자 탄소원의 양을 2%에서 4%로 상향 조정하여 혼합 비율에 따른 효과를 측정하였다.

[표 2] 미강과 당밀의 혼합비에 따른 C. sinensis 배양액의 pH, 건물량 및 글루코사민 함량

쌀겨/당밀 (4% 첨가)	최종 pH	건물량 (mg)	글루코사민 (μg/ml)
4/0	6.48	3508.4	133.5
3/1	7.00	2100	109.7
2/2	7.06	1940	112.0
1/3	6.56	1890	120.0
0/4	6.40	1870	139.0

그 결과, pH는 초기 5.5에서 배양 후에 6.40-7.06으로 약간 상승하였으며, 배양액의 건물량은 미강의 혼합비율이 감소할수록 감소하는 경향을 보였다.

이는 미강에 주성분인 전분의 양이 감소되어 나타나는 경향으로 추정된다. 균체량 성분인 글루코사민의 양은 미강과 당밀을 각각 4% 첨가하였을 경우 133.5와 139.0 μg/ml로 높은 균체량을 보였다. 당밀 혼합량이 증가할수록 균체량이 증가하는 경향을 보였다.

미강과 당밀의 혼합비율에 따른 EPS 생산량을 측정한 결과(도 3), 미강과 당밀의 혼합비율이 3:1인 경우 가장 높은 39.3 mg/ml의 생산량을 보였으며, 미강과 당밀을 각각 4% 사용시 34.8와 39.2 mg/ml의 생산량을 보였다. 2% 미강과 당밀 사용시 119와 87 mg/ml의 EPS 생산량을 보였다(도 2). 특히 당밀은 2%와 4% 사용시의 EPS 생산량에 급격한 증가량을 보였다.

질소원의 영향

탄소원으로 미강과 당밀의 혼합비율 3:1로 선정한 기본 배지에 효모추출물(yeast extract)과 CSL(corn steep liquor)를 배지에 각각 첨가하여 배양한 후 배양액의 특성을 평가하였다. Yeast extract와 CSL를 각각 0.5에서 4%를 첨가하여 배양 후 pH, 배양액의 건물량, 글루코사민 양을 측정한 결과(표 3)에서는 pH는 배양 후 4.99-7.13의 변화를 보였으며, 배양액의 건물량은 탄소원과 더불어 질소원의 첨가량이 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다. 균체량은 yeast extract와 CSL 사이에 커다란 차이를 보이지 않았으나 yeast extract 사용시 다소 높은 균체량을 보였다. 특히 2-4% 첨가시 139.5-141 μg/ml의 균체량을 보였다.

[표 3] yeast extract 또는 CSL의 여러 농도에 따른 C. sinensis 배양액의 pH, 건물량 및 글루코사민 함량

질소원	농도 (%)	최종 pH	건물량 (mg)	글루코사민 (μg/ml)
Yeast extract	0.5	6.28	1559.4	95
	1	7.13	1224	108
	2	7.07	2070.3	139.5
	3	6.55	2470.8	139.5
	4	7.05	2526.7	141
CSL	0.5	6.51	1507.2	82
	1	5.81	1848	109.5
	2	5.66	1531.7	116.5
	3	5.37	1812	138
	4	4.99	2123.6	133.5

배양온도 및 배양시간의 영향

C. sinensis에 의한 EPS 생산을 위한 배지 성분으로 미강 3%, 당밀 1%, yeast extract 2%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄ 0.05%으로 정하고 배양온도에 따른 EPS 생산능에 미치는 효과를 측정한 결과(도 5), 25℃를 기준으로 EPS나 균체량은 점차 감소하는 경향을 보였으며, 균체량이 감소하는 경향과 EPS가 감소하는 경향은 일치하는 것으로 나타났다. 이는 균체량의 증식이 EPS 생산에도 중요함을 알려주고 있다.

그러나 균체량은 25℃보다는 35℃에서 다소 높은 125.8 μg/ml을 보인 반면, 25℃에서는 112.5 μg/ml의 균체량을 보였다. EPS 생성량은 25℃가 가장 높은 46.5 mg/ml 보인 반면, 35℃에서는 35.4 mg/ml 생성량을 보였다. 그러므로, EPS나 균체량의 최대 생산을 위한 배양온도는 25 내지 35℃가 적합한 것을 알 수 있다.

배양시간에 따른 배양특성을 측정한 결과(도 6), 배양시간이 증가할수록 pH도 점차 증가하여 최초 pH 5.5에서 7일 배양 후 8.5로 증가하였다. 균체량의 지표인 글루코사민의 양 역시 배양시간이 증가할수록 증가하는 경향을 보여 배양초 10.2 μg/ml에서 점차 증가하여 배양 7일 후에는 135.1 μg/ml의 균체량을 보였으나, 배양 5일 이후에는 글루코사민 양이 134.8-156.6 μg/ml로 큰 차이를 보이지 않았다.

면역활성물질인 EPS 역시 배양시간이 증가할수록 증가하는 경향을 보여 배양초 40.6 mg/ml의 생산량을 보이다가 7일 배양 후에는 219.4 mg/ml의 생산량을 보였다. 이는 글루코사민 양의 증가 경향과 유사한 경향을 보였으며, 배양 4일 후 208.6 mg/ml의 EPS 생산량을 보였으며, 5, 6, 7일 배양시 각각 213.4, 223. 4, 219.4 mg/ml의 EPS 생산량을 보였다.

배양시간에 다른 EPS 생산량은 4일 이후 큰 차이를 보이지 않았으며, 균체량 역시 5일 이후에는 큰 변화가 없었다. 따라서 이상의 결과에 의해 4-7일 정도 배양하는 것이 바람직하며, EPS 생산량이 가장 많았던 5-6일 배양이 가장 적합한 것으로 보인다.

귤피 첨가 효과

이상에서는 C. sinensis에 의한 면역증강제 개발을 위해 영양성분과 발효조건을 검토하였으며, 상기 선정된 조건에서 귤피를 배지에 첨가하여 배양액의 면역활성의 증진과 항산화활성에 미치는 영향을 알아보았다.

귤피 2% 첨가에 따른 EPS와 균체량의 지표인 글루코사민의 변화량을 측정한 결과(도 7), 배양시간이 증가할수록 EPS와 균체량이 증가하는 경향을 보였으며, EPS 생성량은 6일째 최대 생성량인 244.8 mg/ml의 생성량을 보이다가 7일에는 234 mg/ml로 감소하였다. 반면 글루코사민은 배양시간이 증가할수록 증가하는 경향을 보여 7일에는 174.6 μg/ml의 균체량을 나타내었다.

귤피 첨가시 배양시간에 따른 폴리페놀과 플라보노이드 함량 변화를 측정한 결과(도 8), 폴리페놀 함량은 562.6-630.0 μg/ml을 보였으며, 배양시간이 증가할수록 서서히 증가하는 경향을 보여 7일 배양 시 630.0 μg/ml으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 플라보노이드 함량은 186.6-251.5 μg/ml의 함량 변화를 보였으며, 3일 배양시 가장 높은 251.5 μg/ml의 함량을 보였다. 즉, 배양초에는 서서히 증가 하다가 3일 이후에는 서서히 감소하는 경향을 보였다.

귤피 첨가에 따른 EPS의 면역활성 증진 효과, 즉 항보체활성의 증진 여부를 측정한 결과(도 9), 귤피를 첨가하지 않고 배양한 배양물에서 얻어진 EPS의 경우 48.2-68.7%의 활성을 보인 반면, 귤피를 첨가하여 배양한 경우의 EPS는 58.0-80.8%의 높은 항보체활성을 나타내었다.

특히 양성대조군으로 사용한 PSK(Coliolus versicolar 유래의 공지된 면역 활성물질 폴리사카라이드-K)는 71.1%의 항보체활성을 보인 반면, 귤피를 첨가하여 3-7일 배양한 배양물의 EPS 항보체활성은 70.7-80.8%의 높은 활성을 보였다. 3-7일 배양시간에서는 활성다당인 EPS 생성량 역시 최대의 생성량을 보이는 배양시간이었다. 도 7에서 EPS 생성량은 6일째 가장 높았으며, 항보체활성 역시 6일 배양시 80.8%로 가장 높은 활성을 보였다. 도 7과 9에서 알 수 있듯이 EPS 생산경향과 항보체활성이 유사한 경향을 보였다. 따라서 동충하초가 지닌 항보체활성은 EPS에 기인함을 다시 한번 더 확인하였다.

한편, 귤피를 배양 배지에 첨가하였을 경우 배양액에 면역활성의 증진 외에 항산화활성을 부가할 수 있는지를 측정한 결과(도 10 참조), 귤피를 첨가한 경우는 배양시 284.3-384.6 mg/100 g의 AEAC 값을 보인 반면, 귤피를 첨가하지 않은 경우 142.8-219.5 mg/100 g의 AEAC 값을 보였다. 즉, 귤피를 첨가하였을 경우 배양액의 항산화활성이 증가하는 것을 확인하였다.

상기 항산화활성은 반응시간이 증가할수록 증가하는 경향을 보여 반응 초 귤 피 첨가 시 285.2 mg/100 g에서 7일 반응 후 384.6 mg/100 g 증가하였다. 이는 귤피 첨가시 배양시간이 증가할수록 폴리페놀 함량이 증가하는 앞의 경향과 일치한다(도 8 참조).

이상 첨부된 표와 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

도 1은 동충하초 배양액의 EPS 항보체활성을 평가하기 위한 실험순서도이고,

도 2는 다양한 탄소원의 첨가에 따른 균 배양액의 EPS 생산능의 차이를 보여주는 그래프이고,

도 3은 쌀겨와 당밀의 혼합비에 따른 균 배양액의 EPS 생산능의 차이를 보여주는 그래프이고,

도 4는 효모추출물(yeast extract)과 CSL에 농도에 따른 균 배양액의 EPS 생산능의 차이를 보여주는 그래프이고,

도 5는 여러 온도에서 균 배양액의 EPS 생산능의 차이를 보여주는 그래프이고,

도 6은 C. sinensis 배양기간 동안의 배양액의 EPS, 글루코사민 및 pH 변화를 나타내는 그래프이고,

도 7은 귤피 첨가에 따른 C. sinensis 배양기간 동안의 배양액의 EPS, 글루코사민 및 pH 변화를 나타내는 그래프이고,

도 8은 귤피 첨가에 따른 C. sinensis 배양기간 동안의 배양액의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 변화를 나타내는 그래프이고,

도 9는 귤피 첨가/무첨가에 따른 C. sinensis 배양기간 동안에 생산된 EPS의 항보체활성의 변화를 나타내는 그래프이고,

도 10은 귤피 첨가/무첨가에 따른 C. sinensis 배양기간 동안에 생산된 배양액의 항산화활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

Claims (6)

1. 동충하초균의 배양에 있어서, 배양 배지에 귤피 1~3%을 첨가하여 배양하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 미강(rice bran) 3%, 당밀(molasses) 1%, 효모추출물(yeast extract) 2%를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 동충하초균의 배양 온도는 25 내지 35℃이고, 배양 시간은 4 내지 7일인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항의 방법에 의하여 생산된, 항보체활성이 우수한 EPS.
5. 제1항의 방법에 의하여 생산된, 항산화활성이 우수한 배양물.
6. 제4항의 EPS 또는 제5항의 배양물을 포함하는 사료첨가제.

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