TWI549684B

TWI549684B - A mycelia active substance for protecting nerve cells and a food composition thereof

Info

Publication number: TWI549684B
Application number: TW103142283A
Authority: TW
Inventors: Chin Chu Chen; Sheng Chieh Hsu; Yen Po Chen; Shu Hsing Yeh
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2016-09-21
Also published as: TW201620534A

Description

一種保護神經細胞之蟬花菌絲體活性物質及其食品組合物

本發明係關於一種蟬花菌絲體活性物質及其食品組合物，特別指一種保護神經細胞之蟬花菌絲體活性物質及其食品組合物。

神經退化疾病(Neurodegenerative Diseases)

神經退化性疾病(neurodegenerative diseases)是一種大腦及中樞神經系統中神經元細胞逐漸失去功能的症狀。腦部及脊髓是由各種神經元所構成，各自負責不同功能，例如控制運動、處理接收訊息、進行判定。而腦區中的海馬迴(Hippocampus)主要是負責學習與記憶的樞紐，海馬迴上的神經細胞受損則會導致失智及學習能力的缺陷。由於神經元的惡化或負責傳遞訊息的髓鞘隨著時間而失去功能，都可能會造成神經退化性疾病。因為腦部和脊髓的神經細胞不易再生，只要受到損傷可能造成永久性的傷害。神經退化疾病的患者需要經過一段長時間後，症狀才會逐漸出現。病患可能要經過數個月或數年才能感受到其影響。通常是在許多腦室內神經細胞死亡或是細胞功能停止，以及大量神經死亡影響腦室的功能之後，症狀出現才會被注意到。其明顯的特徵即是(1)某特定腦區之神經細胞緩慢漸進地死亡(2)神經訊息傳遞功能喪失(3)常好發於中老年人身上，且隨著時間症狀會更加嚴重。由於患者在發病期間會逐漸與社會隔離，再加上目前相關的醫藥知識匱乏不足，所以社會大眾很少了解和注意。隨著人口結構的老化，神經退化病患也日益增加，對家屬、患者和社會大眾而言，無論是經濟、心裡和生活形態的衝擊、著實是難以估計和承擔的。常見的神經退化性疾病包括帕金森氏症(Parkinson's disease)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)以及亨丁頓氏症(Huntington's disease)等。

阿茲海默症(Alzheimer's disease)

阿茲海默症是老年人口中最常見的神經退化性疾病，主要病變在大腦皮質(cortex)和海馬迴(hippocampus)的神經細胞，許多病理上出現大腦異常老年斑(senile plaque)，神經纖維糾結(neurofibrillary tangle)以及β型類澱粉(β-Amyloid)的沉積。老年斑是一複雜的病變結構，在疾病初期是由澱粉樣β型類澱粉逐漸堆積形成。它是由大約40至42個胺基酸所組成。β型類澱粉蛋白存在於身體各器官，在腦部的各區域也都有分泌。然而，單一的β型類澱粉蛋白是無害的，只有聚合的β型類澱粉蛋白才具有毒性，形成衰老斑而破壞細胞的正常運作。雖然單一的β型類澱粉蛋白在腦部各區域皆有分泌，但具有毒性的衰老斑最密集的地方是在海馬迴。堆積成熟的類澱粉斑塊(amyloid plaques)經常圍繞在許多功能不良的軸突(axons)跟樹突(dendrites)周圍，使的這些神經突增厚，成熟的類澱粉斑塊亦能夠活化微膠細胞(microglia)來幫助引起發炎反應及清除類澱粉斑塊。在大腦皮質跟海馬迴中累積大量的老年班和類澱粉斑塊病理是判斷阿茲海默症狀最好的標的。阿茲海默症在生理上主要的症狀包括認知功能退化(例如記憶力變差，對時間、人物、地點感到混淆)、行為功能退化(例如處理日常生活的能力減退)、及精神狀態退化(例如出現憂鬱、妄想及異常行為等等)。目前用來治療阿茲海默症的藥物僅能延緩病人的症狀，並無法治癒。

帕金森氏症(Parkinson's disease)

另一個常見的神經退化疾病為帕金森氏症，好發於五、六十歲以上的人口，主要是肇因於一種叫做多巴胺(dopamine)化學物質的缺乏。而多巴胺是由腦幹中一處叫黑質(substantia nigra)的神經細胞所製造。中腦黑質的多巴胺神經元退化無法製造足夠的神經引導物質多巴胺來指揮肌肉的活動；神經元之間訊息傳遞必需仰賴多巴胺才能使身體的動作來的流順，缺乏足夠的多巴胺就產生各種活動障礙。表現的症狀以肢體靜止型顫抖、肌肉僵硬、動作遲緩、姿態不穩導致平衡失調為主。而早期症狀常出現有單手規律性顫抖，動作變慢，肌肉僵硬逐漸地蔓延全身，到了末期幾乎都要靠輪椅才能行動。由於帕金森氏症是由於多巴胺的缺乏導致，疾病初期並沒有明顯特徵，到確定病例時往往都已經過五年，且目前並沒有有效藥物來治療。粒線體功能喪失及氧化壓力已被證實是導致帕金森氏症的重要致病機轉，而MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶)是一個帶正電的化合物。它是粒線體complex I的抑制劑，能夠抑制粒線體中的氧化磷酸化，造成ATP耗盡及細胞死亡，因此具有毒性。在小鼠實驗中，MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)能夠通過血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)，並被大腦中的神經膠細胞轉化成MPP⁺，而MPP⁺會引起黑質的發炎反應並殺死黑質緻密部中產生多巴胺的神經細胞，使動物產生類似帕金森氏症的癥狀。MPP⁺會在引發產生多巴胺神經細胞死亡上具有高度的選擇性。它是通過一個在神經末梢中負責再吸收多巴胺的轉運蛋白，多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter)在這個過程中將MPP⁺會轉運至細胞中。

內質網壓力(Endoplasmic Reticulum Stress)

老化過程中，神經細胞接收到過多的氧化壓力，過量氧化物的累積造成神經細胞損傷或死亡，以及神經膠質細胞異常活化或死亡，則稱之為氧化神經毒性(oxidative neurotoxicity)，而此種氧化毒性的逐漸累積便是神經退化性疾病的發生的原因。Tunicamycin(衣黴素，TM)能經由抑制蛋白質N端的醣化作用(N-linked glycoproteins)來引起大量未折疊蛋白的產生，並使細胞停留在G1期，導致內質網壓力(Endoplasmic ReticulumStress)。過去研究指出，內質網壓力跟神經退化性疾病有相關，內質網壓力是主要誘導神經細胞凋亡的路徑，因此利用TM引起神經細胞壓力後能當作篩選模式。

大蟬花(Cordyceps cicadae)

蟬花(學名：Cordyceps cicadae.)，又名胡蟬、蟬菌、蟬蛹草、金蟬花、蠶茸，為子囊菌亞門(Ascomy cotina)，麥角菌目(Claricipiyales)，麥角菌科(Clavicipitaceae)，蟲草屬(Cordyceps)真菌。蟬花會寄生在蟬蛹或者是山蟬(Cicada flammate)、竹蟬(Platylomia pieli)等幼蟲後於蟲體頭部形成花蕾狀子囊，故名蟬花。子囊殼為長卯形，埋生於子座內；子囊呈圓柱形，內含8枚線狀、條隔、透明的子囊抱子。野生蟬花多分布在中國南方諸省，主要集中在四川、江蘇、浙江、福建各地居多。性寒，晒乾後可入藥，味甘，無毒。能散風熱，退翳障，透疹。近來研究亦發現，該菌菌絲在固體培養和發酵過程中含有甘露醇等物質。

小蟬花(Cordyceps sobolifera)

小蟬花(學名：C.sobolifera)又名蟲花、蟬菌、蟬草為子囊菌亞門(Ascomy cotina)，麥角菌目(Claricipiyales)，麥角菌科(Clavicipitaceae)，蟲草屬(Cordyceps)真菌感染蟬科蟪蛄屬(Platypleura sp.)若蟲所形成的蟲生真菌複合體，型體較大蟬花小，故名，是傳統的中藥材之一。小蟬花主要產於廣東、福建，台灣花蓮亦發現有少許。蟬花與冬蟲夏草功效相近，且含有許多相同的生物活性成分。小蟬花的分生孢子階段屬於尚未定名的棒束孢黴(Isaia sp)，而大蟬花的分生孢子階段則為蟬棒束孢菌(Isaia cicadae)，且其分生孢子階段為無性型，子曩殼階段則為有性型。在自然界中有性型很稀少，一般採收到的多為無性型，所以在產銷第常將兩者統稱為「蟬花」，一起收購使用。蟬花的藥理作用廣泛，將蟬花菌絲體開發為功能性食品或中藥製劑都具有發展潛能。蟬花藥理作用：(1)免疫調節作用：研究人員將蟬花菌株進行人工發酵產生蟬花菌絲，從中提取蟬花多醣，並以冬蟲夏草多醣為陽性對照組，對小鼠進行淋巴轉化試驗、Ea及E玫塊花環試驗、特異性免疫玫瑰花環試驗、巨噬細胞吞噬試驗、抗綿羊紅細胞抗體效價試驗，結果顯示蟬花多醣具有明顯提升免疫功能作用；(2)滋補強壯作用：近期報導指出，蟬花與多種蟲草的主要成分氨基酸種類相似，含量較一致。藥理試驗表明，蟬花與多種蟲草的氨基酸都有程度不同的補益作用，故可供服用者達滋補強壯之效；(3)抗疲勞作用：蟬花水煎劑能明顯延長小鼠的游泳時間，有助於提高在常壓缺氧狀態下及在高溫環境下的小鼠的存活時間；(4)鎮靜催眠作用：根據藥理實驗之結果發現，蟬花組小鼠給藥1小時後，測定10分鐘內自主活動次數，顯著少於對照組。說明蟬花還能明顯延長小鼠睡眠時間，縮短戊巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium)組的翻正反射消失時問，蟬花亦能增加在單位時問內的入睡率，經實驗證實人工培養品與天然蟬花功效相近；(5)中樞神經系統調節作用：小鼠腹腔注射天然蟬花或人工培養品之醇類萃取物能明顯減少其自主活動，對神經節有阻斷作用。

因此，利用天然之藥用真菌或中草藥來開發成改善神經退化的產品，是最自然健康的方法。有鑑於現今社會人口逐漸老化，且神經退化疾病並無明顯治療藥物，神經退化病是需要病患配合、且長期治療及控制之慢性疾病。因此本案發明人希望能籍由從蟬花中製備出具改善神經毒性之活性物質，以提供一可改善神經退化症狀之產品，方便一般中老年人於日常生活中服食；由於蟬花或蟬花萃取物本身具多種有益功能且無副作用外，更可供一般使用者或息者同時改善、控制、治療或預防高神經退化及其併發症。因此，本案發明人發展出一種具保護神經細胞功能之蟬花菌絲體活性物質及其食品組合物，以供一般使用者或息者來使用。

本說明書中所述之所有科學性及技術性用語，除非另有定義，否則皆為該所屬領域具通常知識者可通曉之定義。

本發明之主要目的在提供一種保護神經細胞之蟬花菌絲體活性物質，其中該蟬花菌絲體活性物質係將蟬花菌絲體經過下列步驟所製備者：(a)發酵：蟬花菌絲體於15-30℃、槽壓0.5-1公斤/平方公分及pH 2-8下，以10-150rpm速度攪拌或不攪拌，並以0.01-1.5VVM通氣速率通入氣體後，發酵培養3-5天，最後得一蟬花菌絲體液體培養懸浮液； (b)冷凍乾燥：將該蟬花菌絲體液體培養懸浮液冷凍乾燥，以形成一醱酵液凍乾粉；(c)萃取：將該醱酵液凍乾粉以其10-30倍體積之有機溶劑萃取，其中該萃取是以10-250rpm於15-25℃震盪萃取24小時，以形成一上清液；(d)濃縮乾燥：將該上清液以減壓濃縮方式至乾燥，最後得一蟬花菌絲體活性物質。

其中，該菌絲體為可購自寄存於財團法人食品工業發展研究所，登錄號碼：BCRC 37801之蟬花菌絲體；該發酵步驟之氣體為空氣，或空氣與氧氣、空氣與二氣化碳、空氣與氮氣的混合物；該萃取步驟之有機溶劑為水、乙醇、乙酸乙酯或正己烷；該蟬花菌絲體活性物質係用以拮抗MPP⁺或Tunicamycin引起的細胞毒性。

本發明之另一目的在提供一種保護神經細胞之食品組合物，其中該食品組合物係包含本發明之蟬花菌絲體活性物質，以及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑和輔劑等。

其中該食品組合物係用以拮抗MPP⁺或Tunicamycin引起的細胞毒性。

實施例一

(一)有機體的來源

本發明之實施例所用之大蟬花(Cordyceps cicadae)菌絲體係可購得自寄存於中華民國台灣省新竹市食品工業研究所菌種保存中心的大蟬花(Cordyceps cicadae)菌絲體BCRC MU30106(寄存日期：102年11月25日)；所用之小蟬花(Cordyceps sobolifera)菌絲體係可購得自寄存於中華民國台灣省新竹市食品工業研究所菌種保存中心的小蟬花(Cordyceps sobolifera)菌絲體BCRC 37801(寄存日期：99年3月12日)，但本發明所述之蟬花活性物質不限於由此菌種所得。

(二)有機體的發酵

蟬花活性物質的液體培養，包括將菌絲體接種於平板上，使用馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextroso Agar,PDA)於適當溫度如15-35℃(較佳者約25℃)下培養5天至兩週後，刮取菌絲接種於燒瓶內，用下列培養基，在約25℃,pH 4.5，及振盪速率10-250rpm之下振盪培養數天；然後，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基(同燒瓶培春基)內，在15-30℃，較佳者約25℃)，槽壓0.5-1公斤/平方公分，pH 2-8下，10-150rpm攪拌速度或不攪拌情況下(air lift)，以0.01-1.5VVM通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣、空氣與二氧化碳、空氣與氮氣的混合物，較佳者空氣，培養時間為3-5天內，即得蟬花菌絲體液體培養懸浮液，包括菌絲體與澄清液，即可製得本發明之蟬花活性物質。其中該蟬花菌絲體液體培養懸浮液可進一步藉由乾燥步驟以製備為醱酵液凍乾粉之劑形。

培養基配方如下：

(三)有機體的萃取

100升醱酵培養完畢之蟬花菌絲體液體培養懸浮液經冷凍乾燥後，可得約2公斤醱酵液凍乾粉，冷凍乾燥後之凍乾粉以10-30倍體積之100%乙醇萃取，並以搖瓶進行震盪萃取，以10-250rpm於15-25℃震盪萃取24小時，可重複萃取數次，將上述之上清液以減壓濃縮方式至乾燥，得蟬花菌絲體之活性物質，置於4℃保存備用。

藉上述步驟所得之活性物質，再以其他有機溶劑，如水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等，進行液態分層萃取，以不同極性之有機溶劑萃取此活性物質，將不同層之萃取物一一分離，可重複萃取數次，將上述之上清液以減壓濃縮方式至乾燥，得蟬花菌絲體之活性物質，並以適當溶劑回溶並定量至適當濃度，置於4℃保存備用。

實施例二

神經細胞毒性損傷及保護神經細胞分析 1. 拮抗MPP ⁺ 引起的NG108-15細胞株毒性

將NG108-15的細胞株鋪設在一密度為2×10⁴ cells/ml-well的96孔平底組織培養盤；24小時後，每個細胞適當的貼覆其上；最後這些細胞再以檢測樣品(蟬花菌絲體活性物質)來測試。檢測樣品利用二甲基亞石楓(DMSO)作為溶劑，分別溶解在濃度為10、20和40mM的DMSO中。培養基(medium)中DMSO的濃度維持在不大於1μl/ml，以確保它不會影響到NG108-15細胞的生長；在以檢測樣品處理細胞2天後，分別以濃度20、40、60μM MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶)處理NG108-15細胞；四天後，移走培養基並加入100μl/well的MTT溶液(濃度為0.5mg/ml)；將細胞放入37℃，5% CO₂的培養箱中培養1小時後，移去96-well培養基的混合液；最後加入30μl/well的DMSO到細胞中，並以一分光比色計ELISA reader，於570nm吸光波長下測定吸光值，來獲得實驗結果；而和DMSO溶劑控制組比較可計算其存活率百分比(%)，存活率百分比=【樣品的吸光值(570nm)/DMSO的吸光值(570nm)】×100。

如表一，在細胞存活率試驗中，正己烷(HEX)萃取物處理的NG108-15實驗組中，低濃度正己烷萃取物(20μ/ml)有增加細胞存活率的情況，但沒有統計上的意義，而高濃度正己烷(40μ/ml)則對不同濃度MPP⁺引起的細胞毒性都有明顯保護的效果，在20μM MPP⁺濃度下可使存活率增加18%，60μM MPP⁺濃度下可使存活率增加7%，在水跟乙醇萃取物實驗組中亦有保護神經細胞的效果。*，p value<0.05，t-test。

2. 拮抗Tunicamycin引起的Neuro2a細胞株毒性

將Neuro2a的細胞株鋪設在密度為2×10⁴ cellc/ml-well的96孔平底組織培養盤；24小時後，每個細胞適當的貼覆其上；最後這些細胞再以檢測樣品(蟬花菌絲體活性物質)來測試。檢測樣品利用二甲基亞石楓(DMSO) 作為溶劑，溶解在濃度為20mM的DMSO中。培養基(medium)中DMSO的濃度維持在不大於1μl/ml，以確保它不會影響到Neuro2a細胞的生長；在以檢測樣品處理細胞2天後，分別以濃度0.25、0.5、0.75、1μg/ml Tunicamycin(衣黴素，TM)處理Neuro2a細胞；四天後，移走培養基並加入100μl/well的MTT溶液(濃度為0.5mg/ml)；將細胞放入37℃，5% CO₂的培養箱中培養1小時後，移去96-well培養基的混合液；加入30μl/well的DMSO到細胞中，並以一分光比色計ELISA reader，於570nm吸光波長下測定吸光值，來獲得實驗結果；而和DMSO溶劑控制組比較可計算其存活率百分比(%)，存活率百分比=【樣品的吸光值(540nm)/DMSO的吸光值(570nm)】×100。p value<0.05，t-test。

在細胞存活率的數據中顯示(表二)，在蟬花乙醇萃取的實驗組中，對濃度0.75μg/ml tunicamycin造成的細胞毒性，其存活率為明顯由55.19%增加到63.55%；而在高濃度TM的毒性下則沒有顯著差異；而蟬花-甲醇的實驗組中，對不同濃度TM引起的細胞毒性都有明顯保護的效果，在0.25μ/ml TM濃度下可使存活率增加8%，0.5μ/ml TM濃度下可使存活率增加8%，0.75μ/ml TM濃度下可使存活率增加10%，1μ/ml TM濃度下可使存活率增加12%。*，p value<0.05，t-test。

表二蟬花活性物質對Tunicamycin引起Neuro2細胞株毒性之存活率分析

本發明之蟬化活性物質，係用天然藥用真菌發酵而成，故相較於化學藥物，除更具安全性，亦具有治療及改善神經退化疾病之潛力。

上列詳細說明乃針對本發明之可行實施例進行具體說明，惟該實施例並非用以限制本創作之專利範圍，凡未脫離本創作技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案不僅在技術思想上確屬創新，且具有治療或預防神經退化疾病之潛力，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，委依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

Claims

一種蟬花菌絲體活性物質用於製備保護神經細胞之組合物之用途，該蟬花菌絲體活性物質係將蟬花菌絲體經過下列步驟所製備者：(a)發酵：蟬花菌絲體於15-30℃、槽壓0.5-1公斤/平方公分及pH 2-8下，以10-150rpm速度攪拌或不攪拌，並以0.01-1.5 VVM通氣速率通入氣體後，發酵培養3-5天，最後得一蟬花菌絲體液體培養懸浮液；(b)冷凍乾燥：將該蟬花菌絲體液體培養懸浮液冷凍乾燥，以形成一醱酵液凍乾粉；(c)萃取：將該醱酵液凍乾粉以其10-30倍體積之有機溶劑或水萃取，其中該萃取是以10-250rpm於15-25℃震盪萃取24小時，以形成一上清液；(d)濃縮乾燥：將該上清液以減壓濃縮方式至乾燥，最後得一蟬花菌絲體活性物質；該有機溶劑係乙醇、乙酸乙酯或正己烷；該蟬花係學名為Cordyceps cicadae或Cordyceps sobolifera之真菌。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該菌絲體為寄存於財團法人食品工業發展研究所，登錄號碼：BCRC 37801或BCRC MU30106之蟬花菌絲體。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該氣體為空氣，或空氣與氧氣、空氣與二氧化碳、空氣與氮氣的混合物。
如申請專利範圍第1項之用途，該組合物係食品組合物或醫藥組合物。
如申請專利範圍第1項之用途，該組合物進一步包含藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑和輔劑等。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該保護神經細胞係拮抗(1-甲基-4-苯基吡啶)(MPP⁺)引起的細胞毒性。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該保護神經細胞係拮抗衣黴素(Tunicamycin)引起的細胞毒性。