CN107034160A - 鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗 - Google Patents

鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗，其中的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13736。该缺失株利用Red同源重组方法缺失aroA和luxS两个基因得到，所以毒力得到显著降低，制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗免疫保持良好，所以可以用于制备防治鼠伤寒沙门菌感染的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。

Description

鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗。
背景技术
沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病病原菌，不仅能引起多种畜禽疾病(鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、猪副伤寒等)，造成全身性败血症和肠炎，给养殖业造成严重经济损失，而且能够通过污染食物引起人类食物中毒，对人类健康造成严重威胁。鼠伤寒沙门菌可以感染很多家禽、家畜、鼠、鸟和冷血动物，且蝇、蚤可带菌传播。人类通常是由于摄入被污染的蛋类或未完全煮熟的肉类而感染沙门菌，而且，鼠伤寒沙门菌感染的发病率居沙门菌感染的首位，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高，因此造成的危害和经济损失巨大。
目前，主要采用抗生素类药物来预防和治疗鼠伤寒沙门菌病，但由于抗生素的广泛使用，导致了鼠伤寒沙门菌的耐药性和耐药谱的不断变化。另外，大量使用抗生素，极易造成畜禽产品出现药物残留，进而直接影响食品的安全，这不仅关系到畜牧业生产和畜牧业经济的发展，还关系到人类的身体健康和生存环境。因此，国内外逐渐采用疫苗接种的方法来预防沙门菌感染。
但是，由于沙门菌灭活苗需要经皮下多次接种，使用不方便，且不能诱导产生消化道局部保护力和细胞免疫，无法提供有效的保护效果。而弱毒活疫苗能够模拟自然感染状况，可以诱导细胞、体液和黏膜免疫，免疫力坚实，免疫期长。因此，利用基因工程技术构建基因缺失株，用作新型减毒活疫苗的研究备受关注。
国内外的研究表明，调控基因以及代谢相关基因的缺失、改造和修饰，都可以降低细菌的毒力，如aroA和luxS等，其中aroA基因编码芳香族氨基酸生物合成途径中的3-烯醇丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶，该基因的功能缺失导致细菌的生长需要酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，在缺乏这些代谢产物的情况下，细菌的生长会受到抑制。此外，aroA突变株所需要的芳香族代谢产物没有在脊椎动物组织中发现，包括人体组织，确保了其在哺乳动物体内有限的复制，减少了在野外条件下散毒的风险。而luxS基因是构成LuxS/AI-2型密度感应系统的关键基因，对沙门菌的致病力具有重要的调控作用。
发明内容
本发明提供鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗，以达到安全预防鼠伤寒沙门菌感染的作用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13736。
进一步的，本发明还提供了一种上述的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株在制备鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗中的应用。
进一步的，本发明还提供了一种采用上述的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。
发明作用与效果
本发明构建提供的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其应用以及由其制备的弱毒疫苗，构建得到的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，其毒力明显降低，且可以显著降低细菌在感染宿主体内的增殖能力，制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗免疫保持良好，所以可以用于制备防治鼠伤寒沙门菌感染的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。
附图说明
图1为实施例一涉及的鼠伤寒沙门菌aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在脾脏中的定殖清除情况；
图2为实施例一涉及的鼠伤寒沙门菌aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在肝脏中的定殖清除情况。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一
1.鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其构建。
本发明提供的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株是利用Red同源重组的方法构建的，具体包括以下步骤：
步骤1，aroA打靶片段构建，根据pKD3序列设计第一引物对，第一引物对中的两个引物的5＇端分别含有aroA基因的上游基因和aroA基因的下游基因，以pKD3为模板，采用第一引物对通过PCR扩增氯霉素抗性基因得到含有aroA基因的上游基因和aroA基因的下游基因的aroA打靶片段，
如表1所示，本实施例中，第一引物对名称为aroA缺失-F和aroA缺失-R，其序列见表1，aroA基因的上游基因和aroA基因的下游基因的序列为相应引物序列中的下划线部分。
步骤2，luxS打靶片段构建，根据pKD3序列设计第二引物对，第二引物对中的两个引物的5＇端分别含有luxS基因的上游基因和luxS基因的下游基因，以pKD3为模板，采用第二引物对通过PCR扩增氯霉素抗性基因得到含有luxS基因的上游基因和luxS基因的下游基因的luxS打靶片段，
如表1所示，本实施例中，第二引物对名称为luxS缺失-F和luxS缺失-R，其序列见表1，luxS基因的上游基因和luxS基因的下游基因的序列为相应引物序列中的下划线部分；
步骤3，基因缺失株筛选，采用含有pKD46的鼠伤寒沙门菌SAT52菌株，依次将aroA打靶载体和luxS打靶载体全部进行转化，筛选得到鼠伤寒沙门菌的aroA基因缺失株或luxS基因缺失株，具体包括以下子步骤：
步骤3.1，感受态细胞准备，将含有pKD46的鼠伤寒沙门菌SAT52菌株在温度条件为28℃下培养后，加入L-阿拉伯糖诱导Red重组系统充分表达后，在6000g的离心率、4℃的离心温度下进行5min的离心，然后收集得到菌体，采用10％的甘油对离心后收集的菌体洗涤两次后，再用10％甘油重悬后分装得到第一感受态细胞和第二感受态细胞；
步骤3.2，转化，将aroA打靶载体加入到第一感受态细胞中，进行电转化，电击参数为：电压2300V，电容25μF，电阻200Ω，然后加入LB培养基，在在37℃摇床中复苏1h后，涂布于含氯霉素的LB平板，在37℃下培养过夜得到氯霉素抗性克隆菌落；
步骤3.3，目的菌株筛选，挑取单个步骤3.2中得到的氯霉素抗性克隆菌落培养，进行PCR鉴定筛选得到aroA基因缺失株，其中用到的引物及相应的序列如表1所示，分别为：
使用引物对aroA内部检测-F和aroA内部检测-R，引物对aroA外部检测-F和aroA外部检测-R。
根据PCR鉴定结果表明，成功获得鼠伤寒沙门菌SAT52株的aroA基因缺失株，命名为aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA；
步骤3.4，基于步骤3.3得到的aroA基因缺失株制备第二感受态细胞，采用luxS打靶片段和第二感受态细胞，并重复和步骤3.2-步骤3.3一样的步骤，进一步缺失luxS基因，再进行PCR鉴定筛选，从而得到鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，此时用到的引物及其相应的序列如表1所示，分别为：
引物对luxS内部检测-F和luxS内部检测-R，引物对luxS外部检测-F和luxS外部检测-R进行PCR鉴定。
根据上述步骤构建的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，命名为双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS，已于2017年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC NO.13736。
表1缺失株构建及鉴定引物
试验1半数致死量(LD50)测定
本试验验证实施例一的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株的减毒作用，开展了半数致死量的检测，具体如下：
分别将野生株SAT52、aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS培养至对数期，收集菌体，无菌PBS洗涤2次，并用PBS重悬调整细菌数，倍比稀释。
然后以1×109CFU/只、1×108CFU/只、1×107CFU/只、1×106CFU/只、1×105CFU/只、1×104CFU/只剂量攻毒BALB/c清洁级小鼠，每个梯度8只，攻毒后观察14天，记录小鼠死亡情况并统计结果。
检测结果表明，野生株SAT52、aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS的LD50分别为3.16×104CFU,1.78×107CFU和4.22×107CFU。
aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA与野生株相比，其毒力降低563倍。
而双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS与野生株相比，其毒力降低了1335倍，可见双基因缺失后，毒力降低程度是单基因缺失的2.4倍，可以显著降低鼠伤寒沙门菌的毒力。
试验2双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在体内清除试验
本试验将野生株SAT52、单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS培养到对数期，收集菌体，每组细菌感染5只BALB/c小鼠，攻毒剂量1×106CFU/只，同时设立PBS空白对照组。分别在感染后4天、6天、8天和10天将小鼠安乐死，无菌条件下取其脾脏、肝脏，称重后加入无菌PBS匀浆，倍比稀释，均用平板计数法进行细菌计数。
图1为实施例一涉及的鼠伤寒沙门菌aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在脾脏中的定殖清除情况；
图2为实施例一涉及的鼠伤寒沙门菌aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在肝脏中的定殖清除情况。
如图1和图2所示，由于野生株SAT52的毒力较强，SAT52感染组小鼠的脾脏、肝脏载菌量过多，因此在接种后第4天，所有的小鼠均死亡。与野生株SAT52相比，单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS显著降低了其在小鼠体内的细菌载量，且在感染后第10天，单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在脾脏、肝脏中都最终被完全清除。PBS对照组小鼠脾脏、肝脏均未检出沙门菌。结果表明，进行双基因缺失可以显著降低细菌在感染宿主体内的增殖能力。
实施例一的作用与效果
本实施例提供的构建方法构建得到的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，毒力显著降低，且可以显著降低细菌在感染宿主体内的增殖能力，安全性较好。
实施例二
本实施例提供一种根据实施例一得到鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株的制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失株弱毒疫苗，采用以下方式评价其免疫效果和最佳免疫剂量：
将40只BALB/c小鼠分成5组，每组8只，分别为免疫剂量1×107CFU/只、1×106CFU/只、1×105CFU/只、1×104CFU/只和PBS空白对照组。免疫2周后，用1×106CFU野生株SAT52菌株进行攻毒，观察各组的存活与死亡数，对不同免疫剂量的免疫保护效果进行评价。
结果表明，PBS对照组全部死亡，免疫剂量1×107CFU/只、1×106CFU/只的保护率均为100％，而免疫剂量1×105CFU/只、1×104CFU/只的保护率分别为87.5％和62.5％(表2)。综合考虑双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS的LD50为4.22×107CFU，因此确定鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗的最佳免疫量为：1×106CFU/只。
表2不同剂量鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗的免疫保护效果
免疫持续期评价
采用以下方式对评价鼠伤寒沙门菌双基因缺失株弱毒疫苗的免疫持续期进行评价：
将20只BALB/c小鼠分成4组，每组5只，其中2组鼠伤寒沙门菌双基因缺失株弱毒疫苗，免疫剂量1×106CFU/只，另外2组为PBS对照组。免疫5周和7周后，用1×106CFU野生株SAT52菌株进行攻毒，观察各组的存活与死亡数，对免疫保护期进行评价。
结果表明，未免疫的对照组全部死亡，鼠伤寒沙门菌双基因缺失株弱毒疫苗免疫组在免疫后5周和7周的免疫保护期均为100％(表3)，表明本发明构建的鼠伤寒沙门菌双基因缺失株具有较长的免疫保护持续期。
表3鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗的免疫持续期测定
实施例二的作用与效果
本实施例提供的鼠伤寒沙门菌双基因缺失株弱毒疫苗具有优异的免疫保护效果，可有效抵抗鼠伤寒沙门菌感染，由此也可见鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株也能应用于防治鼠伤寒沙门菌感染的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗的制备。
另外，在实施例一中涉及的构建方法中，步骤3中，是先缺失aroA再缺失luxS，作为本发明涉及的构建方法，也可以先缺失luxS再缺失aroA，此时采用的步骤顺序同实施例一。

Claims (3)

1.一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13736。
2.一种如权利要求1所述的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株在制备防治鼠伤寒沙门菌感染的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗中的应用。
3.一种采用如权利要求1所述的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。
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