CN118048315A - 一株沙门氏菌噬菌体及其应用和沙门氏菌噬菌体联合抗菌药的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株沙门氏菌噬菌体及其应用和沙门氏菌噬菌体联合抗菌药的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB‑SenS‑SEC2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 20231272。本发明的沙门氏菌噬菌体对不同来源肠炎血清型沙门氏菌的裂解率高达70.73％，且可以裂解鼠伤寒和布兰德鲁普血清型沙门氏菌，即可以裂解以肠炎血清型为主的多种血清型沙门氏菌。本发明的沙门氏菌噬菌体联合抗菌药治疗抗菌药耐药沙门氏菌可有效降低沙门氏菌的致病率，提高沙门氏菌敏感性且有效降低抗菌药的使用剂量。

Description

一株沙门氏菌噬菌体及其应用和沙门氏菌噬菌体联合抗菌药 的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株沙门氏菌噬菌体及其应用和沙门氏菌噬菌体联合抗菌药的应用。

背景技术

沙门氏菌属于革兰氏阴性肠杆菌，生长环境为需氧或兼性厌氧。由于沙门氏菌对营养要求不高，所以可在环境中广泛存在且存活时间较长。此外，在动物和人的肠道中也常见沙门氏菌存在。沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，也是常见的食源性致病菌之一。沙门氏菌可通过食物链传播，一般会在食品加工的过程中发生沙门氏菌的污染，也会粘附在一些物品表面进行传播。沙门氏菌在兽医临床上常导致鸡白痢、禽伤寒、禽副伤寒和猪副伤寒等严重影响生产经济价值的疾病。沙门氏菌在人临床上常导致呕吐、腹痛、腹泻和发烧等轻微症状，而严重的临床症状则是败血症。败血症非常少见，一般由其他基础性疾病引发，另外还有局部化脓性感染，可在身体的任何局部部位形成脓肿。沙门氏菌的感染途径较多，其中在屠宰过程中沙门氏菌有沿屠宰链从上游环节到成品鸡肉传播的趋势，并且在屠宰过程中存在环境和人员操作交叉污染的情况。养殖过程中被沙门氏菌感染的肉鸡活体是最初的污染源，而屠宰加工过程中肉鸡胴体的交叉污染是导致污染扩大的原因。食物在运输及加工过程中被沙门氏菌污染则有可能导致人的沙门氏菌病，在国内外，因沙门氏菌导致的人患病率和死亡率一直居高不下。由此可见，沙门氏菌不仅影响养殖业的发展，而且也会对人体健康构成相应威胁，所以对沙门氏菌进行防控显得尤为重要。

噬菌体是一种以细菌作为宿主的病毒，具有严格的宿主特异性，可以杀灭宿主细胞且不产生耐药性，其具有指数增殖、分布广泛、结构简单等优点。噬菌体不仅具有良好的杀菌作用，同时具有优良的生物安全性，对动物和人体无副作用或者仅产生非常轻微的副作用。噬菌体在食源性病原菌感染防治、控制病原菌的传播以及治疗耐药细菌感染等方面都取得了巨大的进展。在已经出现严重的多重耐药情况下，沙门氏菌作为一种重要的人畜共患和食源性致病菌，急需采用更高效的方法来防控沙门氏菌的感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一株沙门氏菌噬菌体及其应用和沙门氏菌噬菌体联合抗菌药的应用，本发明的沙门氏菌噬菌体能够高效防控沙门氏菌的感染。

本发明提供了一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB-SenS-SEC2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 20231272。

本发明还提供了一种沙门氏菌噬菌体和抗菌药的组合物，包括上述方案所述的沙门氏菌噬菌体和抗菌药；所述抗菌药优选的包括黏菌素、四环素、多西环素和替加环素中的一种或几种。

本发明还提供了上述方案所述的沙门氏菌噬菌体在制备沙门氏菌抑制剂和/或制备提高沙门氏菌敏感性的制剂中的应用.

本发明还提供了上述方案所述的沙门氏菌噬菌体联合抗菌药在制备沙门氏菌抑制剂和/或制备提高沙门氏菌敏感性的制剂中的应用；所述抗菌药优选的包括黏菌素、四环素、多西环素和替加环素中的一种或几种。

优选的，所述沙门氏菌噬菌体的感染复数为10-5；所述抗菌药的工作浓度≥1/8MIC。

优选的，所述沙门氏菌包括耐药沙门氏菌；优选的，所述沙门氏菌对黏菌素、萘啶酸、四环素、链霉素和氨苄西林中的一种或几种抗生素耐药。

优选的，所述沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和布兰德鲁普沙门氏菌中的一种或几种。

优选的，所述沙门氏菌抑制剂包括预防和/或治疗沙门氏菌感染引起的疾病的药物、食品抑菌剂或者环境净化剂。

优选的，所述食品包括生肉或鲜蛋。

优选的，所述沙门氏菌抑制剂包括预防和/或治疗沙门氏菌感染引起的疾病的药物。

本发明提供了一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB-SenS-SEC2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 20231272。本发明的沙门氏菌噬菌体对于沙门氏菌具有强的裂解作用，对不同来源肠炎血清型沙门氏菌的裂解率高达70.73％，且可以裂解鼠伤寒和布兰德鲁普血清型沙门氏菌，即可以裂解以肠炎血清型为主的多种血清型沙门氏菌。本发明的沙门氏菌噬菌体联合抗菌药治疗抗菌药耐药沙门氏菌可有效降低沙门氏菌的致病率，提高沙门氏菌敏感性且有效降低抗菌药的使用剂量。本发明的沙门氏菌噬菌体和黏菌素联合，提高了沙门氏菌敏感性至少4倍以上；本发明的沙门氏菌噬菌体和四环素联合，提高了沙门氏菌敏感性8倍。单独使用本发明的沙门氏菌噬菌体或者将所述沙门氏菌噬菌体与抗菌药联合应用或杀灭沙门氏菌，能够为减少耐药沙门氏菌的产生和传播提供帮助，同时也为减少抗菌药的使用提供理论与技术支持，对于减抗替抗具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为噬菌体vB-SenS-SEC2电镜观察图，放大倍数为60,000×，标尺为100nm；

图2为噬菌体vB-SenS-SEC2最佳感染复数；

图3为噬菌体vB-SenS-SEC2一步生长曲线；

图4为噬菌体vB-SenS-SEC2pH稳定性；

图5为噬菌体vB-SenS-SEC2热稳定性；

图6为噬菌体vB-SenS-SEC2紫外线稳定性；

图7为噬菌体vB-SenS-SEC2系统发育进化树；

图8为噬菌体vB-SenS-SEC2基因组圈图；

图9为抗菌药对噬菌体vB-SenS-SEC2效价影响；

图10为噬菌体vB-SenS-SEC2与MIC黏菌素联合应用；

图11为噬菌体vB-SenS-SEC2与不同浓度黏菌素联合应用，其中，不同的小写字母代表组内的显著差异(P＜0.05)；

图12为与不同浓度黏菌素联合应用噬菌体vB-SenS-SEC2效价，其中，不同的小写字母代表组间的显著差异(P＜0.05)；

图13为噬菌体vB-SenS-SEC2与MIC四环素联合应用；

图14为噬菌体vB-SenS-SEC2与不同浓度四环素联合应用，其中，不同的小写字母代表组内的显著差异(P＜0.05)；

图15为与不同浓度四环素联合应用噬菌体vB-SenS-SEC2效价，其中，不同的小写字母代表组间的显著差异(P＜0.05)；

图16为噬菌体联合抗菌药治疗对感染黏菌素耐药沙门氏菌大蜡螟幼虫存活率的影响。

生物保藏说明

沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage)vB-SenS-SEC2，于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 20231272。

具体实施方式

本发明提供了一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB-SenS-SEC2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 20231272。

本发明的沙门氏菌噬菌体具有头部和尾部等基础结构，其中头部为70nm左右的正二十面体，尾部为10nn*120nm结构，按照形态学分类属于尾噬菌体目，长尾噬菌体科，环状DNA双链，具有良好的生物学特性，没有耐药或毒力基因，具有噬菌体溶素等蛋白。在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则；所述沙门氏菌噬菌体的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

本发明从山东部分地区的养殖场畜禽(猪、禽)、零售生肉以及零售鲜蛋中采集样本，分离沙门氏菌，PCR鉴定沙门氏菌血清型以及bla_NDM、mcr-1、bla_CTX-M-9G、bla_CTX-M-1G等4种耐药基因，琼脂稀释法确定菌株对抗菌药的敏感性。以分离到的沙门氏菌为宿主菌，采用双层平板法分离到本发明的沙门氏菌噬菌体。本发明所用宿主菌为从聊城蛋鸡粪便中分离到一株沙门氏菌，命名为SEC88，经PCR鉴定为肠炎血清型(S.Enteriditis)，对黏菌素、萘啶酸、四环素、链霉素、氨苄西林等五种药物耐药。本发明的沙门氏菌噬菌体分离所用样品为2022年从山东省河流中采集的河水。

在本发明中，以宿主菌浓度为10⁸CFU·mL^-1，所述沙门氏菌噬菌体的最佳感染复数优选为10^-5；所述沙门氏菌噬菌体的潜伏期在0～20min，爆发期为20～120min，120min以后是稳定期，vB-SenS-SEC2裂解量为37PFU/cell。

本发明的沙门氏菌噬菌体对沙门氏菌具有强的裂解作用，对不同动物来源沙门氏菌具有交叉裂解作用，但不能裂解大肠杆菌；所述沙门氏菌优选的包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和布兰德鲁普沙门氏菌中的一种或几种。本发明沙门氏菌噬菌体的对不同来源肠炎血清型沙门氏菌的裂解率高达70.73％，且可以裂解部分鼠伤寒和布兰德鲁普血清型沙门氏菌，即可以裂解以肠炎血清型为主的多种血清型沙门氏菌。

本发明还提供了一种沙门氏菌噬菌体和抗菌药的组合物，包括上述方案所述的沙门氏菌噬菌体和抗菌药。

在本发明中，所述组合物中沙门氏菌噬菌体的浓度优选为10⁷～10⁹PFU·mL^-1。

在本发明中，所述抗菌药优选的包括黏菌素、四环素、多西环素和替加环素中的一种或几种。

当所述抗菌药为黏菌素时，所述组合物中黏菌素的浓度优选为1/4MIC～1/2MIC，沙门氏菌噬菌体的浓度优选为10⁸PFU·mL^-1；当所述抗菌药为四环素时，所述组合物中四环素的浓度优选为1/8MIC～1/2MIC，更优选为1/4MIC，沙门氏菌噬菌体的浓度优选为10⁹PFU·mL^-1。

在本发明中，噬菌体与抗菌药共同培养，不会影响噬菌体效价。

本发明还提供了上述方案所述的沙门氏菌噬菌体在制备沙门氏菌抑制剂和/或制备提高沙门氏菌敏感性的制剂中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的沙门氏菌噬菌体联合抗菌药在制备沙门氏菌抑制剂和/或制备提高沙门氏菌敏感性的制剂中的应用。

在本发明中，所述沙门氏菌噬菌体的最佳感染复数为10^-5。在本发明中，所述抗菌药优选的包括黏菌素、四环素、多西环素和替加环素中的一种或几种。在本发明中，所述抗菌药的工作浓度≥1/8MIC。

在本发明中，所述沙门氏菌优选的包括耐药沙门氏菌；更优选的，所述沙门氏菌对黏菌素、萘啶酸、四环素、链霉素和氨苄西林中的一种或几种抗生素耐药。

在本发明中，所述沙门氏菌优选的包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和布兰德鲁普沙门氏菌中的一种或几种。

在本发明中，当沙门氏菌噬菌体单独用于制备沙门氏菌抑制剂时，所述沙门氏菌抑制剂优选的包括预防和/或治疗沙门氏菌感染引起的疾病的药物、食品抑菌剂或者环境净化剂。在本发明中，所述食品抑菌剂用于抑制或杀灭食品表面的沙门氏菌。在本发明中，所述食品优选的包括生肉或鲜蛋；所述生肉优选的包括生鸡肉；所述鲜蛋优选为鲜鸡蛋。在本发明中，所述环境净化剂优选为养殖环境净化剂；当所述沙门氏菌抑制剂为养殖环境净化剂时，所述应用优选的包括：将包含所述沙门氏菌噬菌体的培养液或制剂喷洒在待净化的养殖环境的表面。

在本发明中，当沙门氏菌噬菌体联合抗菌药用于制备沙门氏菌抑制剂时，所述沙门氏菌抑制剂优选的包括预防和/或治疗沙门氏菌感染引起的疾病的药物。在本发明中，所述药物的剂型优选为注射剂。

本发明的沙门氏菌噬菌体联合抗菌药治疗抗菌药耐药沙门氏菌可有效降低沙门氏菌的致病率，提高沙门氏菌敏感性且有效降低抗菌药的使用剂量。本发明的沙门氏菌噬菌体和黏菌素联合，提高了沙门氏菌敏感性至少4倍以上；本发明的沙门氏菌噬菌体和四环素联合，提高了沙门氏菌敏感性8倍。本发明的沙门氏菌噬菌体和黏菌素联合治疗感染黏菌素耐药沙门氏菌的大蜡螟幼虫，黏菌素给药剂量减少50％，且显著提高了大蜡螟幼虫的存活率。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株沙门氏菌噬菌体及其应用和沙门氏菌噬菌体联合抗菌药的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1沙门氏菌的分离鉴定

本发明使用在2017年5月至2021年4月在山东部分地区超市、集市等不同来源采集的样本其中鲜蛋样本130份、生肉样本177份(猪肉31份，鸡肉146份)。以及山东部分地区养殖场样本685份，其中猪粪便样本190份、肉鸡粪便样本248份、蛋鸡粪便样本123份、肉鸭粪便样本124份。共计采集不同来源样本992份。对分离到的沙门氏菌鉴定沙门氏菌血清型、耐药基因、对抗菌药的敏感性试验。

畜禽沙门氏菌的分离：使用一次性无菌棉签蘸取0.9％浓度无菌生理盐水，从畜禽肛门/泄殖腔处插入，轻轻旋转蘸取粪便后取出，立即放入已经装有0.9％浓度无菌生理盐水的5mL离心管中，折断后端被手污染的部分并盖紧盖子，放入带有冷藏功能的泡沫盒并尽快运达实验室进行处理。从采样管中吸取100μL液体加入含有1mL缓冲蛋白胨水(BPW)的2mL离心管中，37℃过夜培养。抽取120μL预增菌液加入已预加1mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)的2mL离心管中，37℃培养18～24h。使用接种环蘸取菌液于XLT-4琼脂培养基上划线，37℃过夜培养后，观察菌落形态特征进行初步筛选。选择外形特征为黑色圆形，表面光滑，边缘整齐的单菌落，使用接种环蘸取后在沙门氏菌显色培养基(二代)上划线，37℃培养18～24h后观察菌落形态特征。选择沙门氏菌显色培养基(二代)上菌落形态特征符合沙门氏菌显色培养基(二代)说明书标准的单菌落并再次划线接种至沙门氏菌显色培养基(二代)，于37℃培养18～24h后观察菌落形态特征。

生肉样品中沙门氏菌的分离：在大型购物超市或者小型菜市场购买足量的生肉样品，分别标记后放入一次性无菌样品袋，放入带有冷藏功能的泡沫盒并尽快运达实验室进行处理。称取生肉样品25g，放入匀浆机，在匀浆机中加入225mL缓冲蛋白胨水，工作2min，转至离心管，37℃培养18～24h。抽取120μL预增菌液加入已预加1mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)的2mL离心管中，37℃培养18～24h。使用接种环蘸取菌液于XLT-4琼脂培养基上划线，37℃过夜培养后，观察菌落形态特征进行初步筛选。选择外形特征为黑色圆形，表面光滑，边缘整齐的单菌落，使用接种环蘸取在沙门氏菌显色培养基(二代)划线，37℃培养18～24h后观察菌落形态特征。选择沙门氏菌显色培养基(二代)上菌落形态特征符合沙门氏菌显色培养基(二代)说明书标准的单菌落并再次划线接种至沙门氏菌显色培养基(二代)，于37℃培养18～24h后观察菌落形态特征。

鲜蛋样品中沙门氏菌的分离：在大型购物超市或者小型菜市场购买不同种类的鲜蛋样品，标记后运达实验室进行处理。使用一次性PE手套，每一枚鸡蛋更换一次手套，防止交叉污染，使用高压灭菌后的棉签蘸取75％酒精擦拭鸡蛋表面。将合适大小的锥形瓶洗净备用，配制90mL LB肉汤，用75％酒精擦拭鸡蛋顶端，在顶端打开一个直径约1cm的小孔，蛋清由此小孔倒出，使用自制剪短的1mL蓝枪头吸出蛋黄至锥形瓶中，在37℃140r/min摇床中培养18h。抽取100μL增菌液加入至已预加1mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)的2mL离心管中，37℃培养18～24h。使用接种环蘸取菌液于XLT-4琼脂培养基上划线，37℃过夜培养后，观察菌落形态特征进行初步筛选。选择外形特征为黑色圆形，表面光滑，边缘整齐的单菌落，使用接种环蘸取于沙门氏菌显色培养基(二代)划线，37℃培养18～24h后观察菌落形态特征。选择沙门氏菌显色培养基(二代)上菌落形态特征符合沙门氏菌显色培养基(二代)说明书标准的单菌落划线接种到沙门氏菌显色培养基(二代)，于37℃培养18～24h后观察菌落形态特征。

沙门氏菌鉴定：参考文献(Ferretti，R.，Mannazzu，I.，Cocolin，L.，Comi，G.，Clementi，F.，2001.Twelve-hour PCR-based method for detection of Salmonellaspp.infood.Appl Environ Microbiol 67，977-978.)合成invA引物(该引物由青岛派森诺基因生物技术有限公司合成)。对不同来源的样品进行分离纯化后，将在培养基上选择的疑似沙门氏菌的菌落进行invA PCR扩增，鉴定沙门氏菌。

血清型鉴定：参考文献(Jean-Gilles Beaubrun，J.，Cheng，C.M.，Chen，K.S.，Ewing，L.，Wang，H.，Agpaoa，M.C.，Huang，M.C.，Dickey，E.，Du，J.M.，Williams-Hill，D.M.，Hamilton，B.，Micallef，S.A.，Rosenberg Goldstein，R.E.，George，A.，Joseph，S.W.，Sapkota，A.R.，Jacobson，A.P.，Tall，B.D.，Kothary，M.H.，Dudley，K.，Hanes，D.E.，2012.The evaluation of a PCR-based method for identification of Salmonellaenterica serotypes from environmental samples and various food matrices.FoodMicrobiol 31，199-209.；Khaltabadi，R.F.，Shahrokhi，N.，Ebrahimi-Rad，M.，Ehsani，P.，2019.Salmonella Typhimuriun in Iran：Contribution of molecular and IS200 PCRmethods in variants detection.PLoS One 14，e0213726.)合成STM0716、STM1350、STM0839、STM4525、STM4538、STY2299/2300、STM3845、PT4和STM2150引物，并采用15μLPCR反应体系进行PCR扩增，对扩增后的产物测序，BLAST对比验证是否为目的序列，引物均由青岛派森诺基因生物技术有限公司合成。

耐药基因鉴定：参考文献(Brinas，L.，Moreno，M.A.，Zarazaga，M.，Porrero，C.，Saenz，Y.，Garcia，M.，Dominguez，L.，Torres，C.，2003.Detection of CMY-2，CTX-M-14，and SHV-12 beta-lactamases in Escherichia coli fecal-sample isolates fromhealthy chickens.Antimicrob Agents Chemother 47，2056-2058.；Liu，B.T.，Song，F.J.，Zou，M.，2019.Characterization of Highly Prevalent Plasmids Coharboringmcr-1，oqxAB，and bla(CTX-M)and Plasmids Harboring oqxAB and bla(CTX-M)inEscherichia coliIsolates from Food-Producing Animals in China.Microb DrugResist 25，108-119.)合成mcr-1、bla_CTX-M-9G、bla_CTX-M-1G、bla_NDM引物，引物序列及退火温度见表1，采用15μL PCR反应体系，扩增后测序，BLAST对比验证是否为所需序列，引物均由青岛派森诺基因生物技术有限公司合成。

表1沙门氏菌耐药基因引物序列

药敏试验：参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and LaboratoryStandards Institute，CLSI)指南，采用琼脂稀释法进行药物敏感性试验并进行结果判读。

(1)将需要做药敏试验的沙门氏菌菌株和质控菌ATCC 25922接种于MH肉汤，37℃过夜培养，复活菌株。

(2)超净台中将一次性培养皿底部标记药物的名称以及相对应的药物浓度，将无菌的一次性96板放入超净台，紫外照射过夜。

(3)复活后的菌株取30μL接种于3mL MH肉汤中，置于37℃、160r/min的恒温摇床中震荡培养4h。

(4)使用高压后的蒸馏水在做好标记的培养皿中稀释药物至终体积为1mL，药物稀释方法见表2，药物稀释梯度见表3。

(5)使用移液枪吸取19mL MH琼脂加入已稀释后的含药培养皿中，轻轻摇匀后，等待琼脂凝固(磷霉素在吸取琼脂前需加入6-磷酸葡萄糖至浓度为25μL/mL)，并吸取20mL MH琼脂加入到空白的培养皿中，制备空白对照平板。

(6)将培养4h后的菌液移取2.5μL至已加247.5μL MH肉汤的96孔板中，注意质控菌ATCC 25922为对照菌，同时需保留空白对照孔，使用专用的盖章器蘸取菌液盖于已晾干凝固的含药琼脂平板上，等待菌液晾干后倒置放于37℃培养箱培养18～24h。

(7)根据药物的MIC数值，对比CLSI标准进行判定(参考标准见表4)，统计数据后进行分析。

表2抗菌药物稀释方法表

表3抗菌药物稀释梯度表

表4 ATCC 25922质控范围及判定标准

本发明从992份样本中成功分离到130株沙门氏菌，通过PCR技术鉴定沙门氏菌血清型，结果如表5所示，肠炎沙门氏菌检出率为31.54％，鼠伤寒沙门氏菌检出率为40.77％，布兰德鲁普血清型检出率为27.69％。130株沙门氏菌耐药基因检出情况如表6所示，mcr-1基因的携带率为31.54％，仅在鼠伤寒沙门氏菌中检出；bla_CTX-M-1G和bla_CTX-M-9G的携带率分别为0.77％和1.54％，仅在肠炎沙门氏菌中检出；使用琼脂稀释法测定了130株沙门氏菌对美罗培南、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、大观霉素、卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、萘啶酸、左氧氟沙星、头孢噻呋、头孢噻肟、替加环素、多西环素、四环素、磷霉素、黏菌素、喹乙醇等19种抗菌药的最低抑菌浓度结果如表7所示，肠炎沙门氏菌对氨苄西林、链霉素、萘啶酸、多西环素、四环素的耐药率超过50％，对黏菌素耐药率为46.34％；鼠伤寒沙门氏菌对氨苄西林、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、萘啶酸、黏菌素耐药率超过70％。

表5 130株不同来源沙门氏菌血清型鉴定表(％)

表6 130株沙门氏菌耐药基因型携带情况(％)

表7不同来源沙门菌的耐药率分析

实施例2沙门氏菌噬菌体的分离鉴定及特性分析

本发明试验所用宿主菌为从聊城蛋鸡粪便中分离到一株沙门氏菌命名为SEC88，经PCR鉴定为肠炎血清型(S.Enteriditis)(表8)，对黏菌素、萘啶酸、四环素、链霉素、氨苄西林等五种药物耐药(表9)。噬菌体分离所用样品为2022年从山东省河流中采集的河水。

表8沙门氏菌SEC88血清型

表9沙门氏菌SEC88药敏试验结果

(1)噬菌体的分离

采集的河水在4℃的条件下10000r/min高速离心10min后使用0.22μm水系滤膜过滤，滤液放置4℃备用。每份样品滤液分别取10mL与等体积的2×LB肉汤混合，分别按总体积1％的接种量接种全部新鲜宿主菌，混合均匀后置于培养箱37℃过夜培养。培养液于4℃，10000rpm/min离心10min，吸取上清液经过0.22μm滤器过滤除菌。取滤液重复以上步骤，反复富集3次，获得噬菌体富集液。取200μL宿主菌接种到10mL LB肉汤中，培养至对数期。取100μL对数期菌液，加入5mL LB半固体(50℃左右)，混匀后迅速倒入标记好的LB琼脂上，等待琼脂凝固后，每个样品富集液各取3μL点滴在加入了宿主菌的琼脂表面；点样后将琼脂板置于37℃恒温培养箱过夜培养，第二天观察点滴噬菌体富集液处有无噬菌斑形成。从河水样本中获得一株噬菌体。

(2)噬菌体纯化

使用接种环扣取单个清晰透亮的噬菌斑置于1mL SM缓冲液中，4℃静置过夜等待噬菌体颗粒从琼脂上脱落。经0.22μm滤器过滤后取100μL滤液进行十倍稀释，分别取各个稀释梯度100μL稀释液与相应的对数期宿主菌液混匀，室温孵育10min使噬菌体完成吸附后，双层平板法培养噬菌斑。方法为向噬菌体与宿主菌混合液中加入5mL LB半固体，混匀后迅速倒入标记好的LB琼脂上，等待琼脂凝固后37℃过夜培养。反复纯化至少五次以上直至出现形态大小及透明度一致的噬菌斑。获得1株噬菌体GBZ。

(3)噬菌体裂解率的测定

测定了噬菌体GBZ针对130株沙门氏菌的裂解率。取100μL对数期菌液与5mL LB半固体(50℃左右)混匀后迅速倒入LB琼脂上，等待凝固后收起，标记好滴加噬菌体液的点位。使用移液枪吸取3μL噬菌体液滴加在细菌琼脂板上，等待液滴干燥后放入37℃恒温培养箱过夜。次日记录每个细菌琼脂板标记点位的裂解情况(有无透亮噬菌斑)，进行统计分析，噬菌体的裂解率如表10所示，噬菌体GBZ对不同来源肠炎血清型沙门氏菌的裂解率高达70.73％，且可以裂解鼠伤寒和布兰德鲁普血清型沙门氏菌，即可以裂解以肠炎血清型为主的多种血清型沙门氏菌。

表10噬菌体对不同血清型沙门氏菌裂解率(％)

(4)噬菌体的电镜形态学观察

在电镜专用的200目铜网上滴加20μL样品，吸附时间为10min，将铜网反盖在20μL2％磷钨酸负染液上，染色时间为5min，在室温的环境下，等待铜网干燥后使用40kv透射电子显微镜对噬菌体的形态进行观察。噬菌体具有头部和尾部等基础结构，其中头部为70nm左右的正二十面体，尾部为10nni*120nm结构(图1)，按照形态学分类属于尾噬菌体目，长尾噬菌体科。按照国际病毒分类委员会(ICTV)最新分类标准将噬菌体GBZ正式命名为vB-SenS-SEC2。

(5)噬菌体最佳感染复数的测定

将宿主菌浓度调整为10⁸CFU·mL^-1，设置8个感染复数比例分别为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，按照感染复数比例调整噬菌体效价为10²～10⁹PFU·mL^-1。取各稀释梯度噬菌体100μL与宿主菌100μL混匀，LB肉汤定容至1mL，置于恒温摇床在37℃，180rpm/min条件下培养4h后测定噬菌体效价，效价最高的感染复数比例为最佳感染复数(MOI)。每组感染复数设置3个平行组，取平均值。噬菌体的最佳MOI如图2所示，在8个感染复数中，当感染复数为10^-5时有最高的噬菌体效价(表11)，所以感染复数为10^-5时即为噬菌体vB-SenS-SEC2的最佳感染复数。

表11噬菌体vB-SenS-SEC2最佳感染复数

(6)噬菌体一步生长曲线的测定

将噬菌体和培养至对数生长期的菌液按照最佳MOI混合均匀后，室温孵育5min，吸取200μL后12000r/min离心1min，倒掉上清液，使用5mLLB肉汤将沉淀重悬成为悬液后，在37℃，160r/min条件下震荡培养3h，同时计时，每次取样200μL，在0～1h期间每10min取样一次，1～2h每20min取样一次，2～3h每30min取样一次。所取样品在12000r/min条件下离心1min，取上清液进行10倍倍比稀释后使用双层平板法测定噬菌体的效价，记录数据并绘制一步生长曲线。噬菌体vB-SenS-SEC2的一步生长曲线结果显示，潜伏期在0～20min，爆发期为20～120min，120min以后是稳定期，vB-SenS-SEC2裂解量为37PFU/cell。

噬菌体裂解量的计算公式为：噬菌体裂解量(PFU·cell^-1)＝裂解爆发期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度。噬菌体的一步生长曲线结果如图3和表12所示。

表12噬菌体vB-SenS-SEC2一步生长曲线(lgCFU)

(7)噬菌体pH稳定性测定

使用盐酸(1mol/L)和氢氧化钠(1mol/L)在SM缓冲液的基础上配制不同pH(pH＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)值的溶液，移液枪移取100μL噬菌体液(已测定PFU)分别加入到不同pH的900μL溶液中，37℃恒温培养箱中培养3h，分别在1h，2h和3h采样一次，做10倍倍比稀释后采用双层平板法，37℃恒温培养箱中培养8h，测定噬菌体效价，试验重复3次，记录数据作出酸碱耐受曲线图。噬菌体vB-SenS-SEC2经过2～13共12个pH梯度处理3h后，噬菌体在pH为2时，培养1h后，噬菌体被杀死，而pH为3和12时，对噬菌体有一部分的杀死效果，可使噬菌体效价降低0.20～3.12lg PFU/mL，当pH为13时，1～3h处理后噬菌体效价降低1.45～3.40lg PFU/mL，在其他pH状态下处理1～3h，噬菌体效价保持稳定(图4和表13)。

表13噬菌体vB-SenS-SEC2pH稳定性(lgCFU)

(8)噬菌体热稳定性测定

提前测定噬菌体PFU，各取500μL噬菌体增殖液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴1h，在20min、40min、60min各取样100μL做10倍倍比稀释后采用双层平板法，37℃恒温培养箱中培养8h，测定噬菌体效价，试验重复3次，记录数据作出热稳定性曲线图。噬菌体vB-SenS-SEC2在80℃处理20min后被杀死，在70℃条件下，随着时间的增加，噬菌体的效价逐渐降低，最终噬菌体效价降低5.37lg PFU/mL。在40℃、50℃和60℃条件下处理60min并不会对噬菌体效价产生明显的影响(图5和表14)。

表14噬菌体vB-SenS-SEC2热稳定性(lgCFU)

(9)噬菌体紫外稳定性测定

提前测定噬菌体PFU，取4mL噬菌体原液置于60mm培养皿中，开盖置于紫外灯40cm处连续照射60min，每10min取样100μL，做10倍倍比稀释后采用双层平板法，37℃恒温培养箱中培养8h，测定噬菌体效价，试验重复3次，做出紫外稳定性曲线图。对噬菌体vB-SenS-SEC2的紫外稳定性进行测定，共检测1h，发现随处理时间的增加，噬菌体效价无明显波动(图6和表15)。

表15噬菌体vB-SenS-SEC2紫外线稳定性(lgCFU)

(10)噬菌体基因组类型测定

使用噬菌体基因组提取盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.4.0)提取噬菌体vB-SenS-SEC2的基因组。

取噬菌体基因组10μL以核酸酶DNA se I进行消化处理，包含噬菌体基因组10μL、DEPC水3μL、10×DNase I buffer 5μL和DNase I 2μL。37℃水浴30min后加入2.5μL 0.5MEDTA并80℃水浴2min，备用。

取噬菌体基因组10μL以核酸酶RNase A进行消化处理，包含噬菌体基因组10μL和RNase A(buffer10倍稀释)1μL，37℃水浴1h，备用。

取噬菌体基因组10μL以核酸酶Mung Bean Nuclease进行消化处理，包含噬菌体基因组10μL、buffer 5μL和Mung Bean Nuclease(无菌无酶水10倍稀释)3μL，37℃水浴10min，备用。

以0.8g琼脂糖与100mLTAE缓冲液混匀加热制备电泳胶块，配置SYBR Green I(1000×)工作液，包含SYBR Green I 1μL、1×TAE(或者灭菌水)和6×loading Buffer1mL。以4μL SYBR Green I工作液与10μL核酸酶消化备用的噬菌体基因组充分混匀后静置5min，在1×TAE中上样，对照组与DL10000 Marker同样与SYBR Green I工作液混匀静置5min，采用90V电泳40min方式跑胶，通过核酸凝胶成像仪观察电泳结果，并确定噬菌体基因组的核酸类型为环状DNA双链。

(11)噬菌体基因组测序

噬菌体送至广东美格基因科技有限公司进行DNA单病毒样品二代测序文库构建，完成噬菌体的全基组测序及拼装。使用软件Soapnuke(v2.0.5)对测序的数据质量进行评估并去除低质量的数据；使用BWA(v0.7.17)软件，将clean reads比对到沙门氏菌基因组，去除宿主菌的序列；使用组装软件Megahit(v1.1.2)软件对每个噬菌体的高质量reads进行组装获得contigs序列.测序得到的噬菌体基因组用BLASTN(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)与NCBI中的沙门氏菌噬菌体基因组进行全序列比对。选取并下载相似性最高的噬菌体基因组，使用通过Mauve软件对本研究的噬菌体基因组与同源性最高的噬菌体进行基因组共线性分析，并绘制进化树，如图7所示。研究噬菌体基因组之间的关系，使用BRIG(BLAST Ring Image Generator)软件绘制噬菌体基因组圈图。噬菌体vB-SenS-SEC2的基因组序列如SEQ ID NO.1所示，基因组由42948bp的双链DNA组成，G+C含量为47.65％，编码66个ORF(表16)。与结构与装配有关的噬菌体尾尖(ORF5)，噬菌体尾卷尺(ORF10)，噬菌体推定DNA结合蛋白(ORF17)，噬菌体衣壳与支架(ORF26)，噬菌体主要衣壳蛋白(ORF27)，噬菌体纤维蛋白(ORF30)，62kDa结构蛋白(ORF34)。与裂解有关的有噬菌体溶素(ORF45)。与合成与代谢有关的有噬菌体DNA解旋酶(ORF1)，噬菌体终止酶、大亚基(ORF15)，噬菌体复制DNA解旋酶、repA(ORF57)，DNA聚合酶I(ORF63)，噬菌体DNA解旋酶(ORF66)。

根据噬菌体全基因组序列，在NCBI数据库下载了30个与本研究中噬菌体相似度＞91.54％，构建噬菌体系统进化发育树(图7)。有29个属于沙门氏菌噬菌体，1个是Jerseyvirus，发现噬菌体vB-SenS-SEC2与SenS-EnJE6的同源性高。根据噬菌体全基因组序列，分别制作基因组圈图，外圈为功能蛋白注释结果(图8)。

表16噬菌体vB-SenS-SEC2

实施例3沙门氏菌噬菌体与抗菌药联合应用

选择噬菌体vB-SenS-SEC2，宿主菌为SEC88，抗菌药选择原则是SEC88耐药或实际广泛使用的药物，因此抗菌药选择黏菌素(MIC＝4μg/mL)和四环素(MIC＝16μg/mL)。

沙门氏菌复活：将沙门氏菌冻存菌液用LB肉汤稀释50倍并混匀，置于37℃恒温培养箱过夜培养。

沙门氏菌噬菌体复活：将噬菌体冻存液与沙门氏菌培养液按照体积比50∶50比例在LB肉汤中混匀，在160r/min的37℃摇床中培养3h，使用0.22μm滤膜过滤后，过滤液保存于4℃冰箱。

测定沙门氏菌菌株的CFU与沙门氏菌噬菌体的PFU后，以最佳感染复数为比例调节出适当的CFU与PFU。根据分组原则进行相应的菌液、噬菌体与药物的添加，固定最终各组离心管内液体量为8mL。将各组离心管置于37℃培养箱内培养16h，在4h、8h、12h测定噬菌体组与噬菌体+抗菌药组的噬菌体效价，测定空白对照组、抗菌药组、噬菌体组、噬菌体+抗菌药组的细菌浓度。在16h时测定全部组的细菌浓度，测定噬菌体组和联合应用组的噬菌体效价，进行3次重复试验，根据数据分析噬菌体与抗菌药联合应用效果。

本试验数据使用IBM SPSS 26软件进行分析，使用单因素ANOVA方法进行显著性分析。

在进行噬菌体与抗菌药联合应用降低MIC试验前，为排除抗菌药对噬菌体活性的影响，必须先进行抗菌药影响噬菌体效价的试验。结果如图9和表17所示，噬菌体与抗菌药共同培养，不会影响噬菌体效价。

抗菌药对噬菌体效价影响的测定：未过膜的噬菌体复活液测定初始的噬菌体效价，加入MIC浓度的抗菌药作为药物组，同时设置空白对照组，在37℃培养箱培养16h后，0.22μm滤膜过滤后梯度稀释，使用双层平板法测定噬菌体效价，试验重复3次，结果如图9所示MIC黏菌素和MIC四环素与噬菌体vB-SenS-SEC2共同培养16h后，对照组和原始组的噬菌体效价处于同一水平，同时也没有显著性差异(P＞0.05)，所以MIC黏菌素和MIC四环素以及低于MIC值的抗菌药不会对vB-SenS-SEC2的效价产生影响。

表17抗菌药对噬菌体vB-SenS-SEC2效价影响

噬菌体联合抗菌药试验分组：试验一共分为4个大组进行试验即①空白对照组；②噬菌体组；③抗菌药组；④噬菌体+抗菌药组。其中抗菌药组又分为MIC组、1/2MIC组、1/4MIC组、1/8MIC组、噬菌体+抗菌药组又分为噬菌体+MIC抗菌药组、噬菌体+1/2MIC抗菌药组、噬菌体+1/4MIC抗菌药组、噬菌体+1/8MIC抗菌药组。

噬菌体vB-SenS-SEC2与黏菌素联合应用试验按照上述原则可分为：①空白对照组；②噬菌体vB-SenS-SEC2组；③MIC黏菌素组；④1/2MIC黏菌素组；⑤1/4MIC黏菌素组；⑥1/8MIC黏菌素组；⑦噬菌体vB-SenS-SEC2+MIC黏菌素组；⑧噬菌体vB-SenS-SEC2+1/2MIC黏菌素组；⑨噬菌体vB-SenS-SEC2+1/4MIC黏菌素组；⑩噬菌体vB-SenS-SEC2+1/8MIC黏菌素组。噬菌体vB-SenS-SEC2与四环素联合应用试验分组与噬菌体vB-SenS-SEC2与黏菌素联合应用试验分组相同。

噬菌体vB-SenS-SEC2与黏菌素联合应用结果：16h联合应用组比空白组低8.60lgCFU/mL且菌量为0即完全杀死细菌，联合应用组与空白对照组、抗生素组、噬菌体组细菌浓度差异显著(P＜0.05)。单独使用黏菌素在16h时细菌浓度为4.48lg CFU/mL(肉眼已看不到细菌生长，即为MIC)且比空白组降低4.12lg CFU/mL，而单独使用噬菌体在16h只能比空白对照组降低1.12lg CFU/mL，达到7.48lg CFU/mL(有显著的细菌生长)(图10和表18)。这说明噬菌体vB-SenS-SEC2与COL联合应用具有显著的协同作用，不仅仅是抑制细菌的生长(即MIC)而可以完全清除细菌。黏菌素的浓度为1/2MIC时联合应用组比空白对照组低8.60lgCFU/mL，比1/2MIC组和噬菌体组均低7.50lg CFU/mL，联合应用组与空白对照组、抗生素组、噬菌体组细菌浓度差异显著(P＜0.05)，可以完全清除细菌。黏菌素的浓度降低至1/4MIC时联合应用组比空白组低6.90lg CFU/mL，比1/4MIC组和噬菌体组的细菌浓度低5.70～6.30lg CFU/mL，达到1.70lg CFU/mL(远低于判定MIC时的细菌浓度)，联合应用组与空白对照组、抗生素组、噬菌体组细菌浓度差异显著(P＜0.05)(图11和表19)，但各联合应用组噬菌体效价均比噬菌体组低(图12和表20)。这说明获得了黏菌素和噬菌体杀菌组合方案，且在噬菌体量减少的情况下该组合方案提高了沙门氏菌敏感性至少4倍以上。

表18噬菌体vB-SenS-SEC2与MIC黏菌素联合应用(lgCFU)

表19噬菌体vB-SenS-SEC2与不同浓度黏菌素联合应用(lgCFU)

表20与不同浓度黏菌素联合应用噬菌体vB-SenS-SEC2效价(lgCFU)

噬菌体vB-SenS-SEC2与四环素联合应用结果，联合应用组在16h细菌浓度为4.08lg CFU/mL(远低于判定MIC时的细菌浓度)，比空白组低4.49lg CFU/mL，单独使用四环素或单独使用噬菌体可分别降低1.65lg CFU/mL、0.31lg CFU/mL(图13和表21)，说明噬菌体vB-SenS-SEC2与四环素存在协同杀菌作用。四环素浓度降低后，联合应用组可降低细菌浓度3.27～3.57lg CFU/mL(图14和表22)，且1/2MIC四环素联合应用组、1/4MIC四环素联合应用组和1/8MIC浓度四环素联合应用组均使细菌浓度≤5.30lg CFU/mL(低于判定MIC时的细菌浓度)，且效果均优于各MIC药物组和噬菌体组.各联合应用组均与空白对照组、抗生素组和噬菌体组细菌浓度差异显著(P＜0.05)(图14)。各联合应用组噬菌体效价差异不显著(P＞0.05)(图15和表23)。这说明获得了四环素和噬菌体杀菌组合方案，提高了沙门氏菌敏感性8倍。

表21噬菌体vB-SenS-SEC2与MIC四环素联合应用(lgCFU)

表22噬菌体vB-SenS-SEC2与不同浓度四环素联合应用(lgCFU)

表23与不同浓度四环素联合应用噬菌体vB-SenS-SEC2效价(lgCFU)

实施例4噬菌体联合抗菌药治疗对感染黏菌素耐药沙门氏菌大蜡螟幼虫存活率的影响

将大蜡螟幼虫(上海爬缘有限公司，中国上海)随机分为五组，空白组注射生理盐水(每组n＝9)，阳性对照组注射沙门氏菌SEC88且不治疗(每组n＝10)，黏菌素治疗组(每组n＝10)，噬菌体治疗组(每组n＝10)，联合治疗组(每组n＝10)，在幼虫右后腹足感染沙门氏菌SEC88悬浮液(10μL，1.0×10⁵CFU/条)。感染后1h，在左后腹足注射生理盐水、粘菌素(10mg/kg)、噬菌体vB-SenS-SEC2(10μL，1.0×10⁷PFU/条)或黏菌素与噬菌体的组合(10μL，5mg/kg+1.0×10⁷PFU/条)。记录大蜡螟幼虫六天的存活率。如图16所示，空白组六天的存活率为100％；注射SEC88且不治疗组第六天全部死亡；黏菌素治疗组前四天存活率为90％，第五天存活率为80％，第六天存活率为60％；噬菌体治疗组第六天存活率为50％；联合治疗组前四天存活率均为100％，第五天和第六天存活率为90％。联合治疗组存活率显著高于噬菌体治疗组和黏菌素治疗组(P＜0.001)，且联合治疗组黏菌素使用剂量为黏菌素治疗组剂量的1/2，因此噬菌体联合黏菌素治疗黏菌素耐药沙门氏菌可有效降低沙门氏菌的致病率，且有效降低黏菌素的使用剂量。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB-SenS-SEC2，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 20231272。

2.一种沙门氏菌噬菌体和抗菌药的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体和抗菌药；所述抗菌药优选的包括黏菌素、四环素、多西环素和替加环素中的一种或几种。

3.权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体在制备沙门氏菌抑制剂和/或制备提高沙门氏菌敏感性的制剂中的应用。

4.权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体联合抗菌药在制备沙门氏菌抑制剂和/或制备提高沙门氏菌敏感性的制剂中的应用；所述抗菌药优选的包括黏菌素、四环素、多西环素和替加环素中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体的感染复数为10^-5；所述抗菌药的工作浓度≥1/8MIC。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌包括耐药沙门氏菌；优选的，所述沙门氏菌对黏菌素、萘啶酸、四环素、链霉素和氨苄西林中的一种或几种抗生素耐药。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和布兰德鲁普沙门氏菌中的一种或几种。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌抑制剂包括预防和/或治疗沙门氏菌感染引起的疾病的药物、食品抑菌剂或者环境净化剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食品包括生肉或鲜蛋。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌抑制剂包括预防和/或治疗沙门氏菌感染引起的疾病的药物。