CN114717199A - 一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体ckt1及其应用 - Google Patents

一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体ckt1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体CKT1及其应用，该烈性噬菌体CKT1已于2022年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCM2022110。本发明分离到的沙门菌噬菌体CKT1对不同来源的鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌及肠炎沙门菌等D群沙门菌均具有裂解活性，潜伏期短，子代噬菌体爆发量高，抗噬菌体突变率低，基因组上不携带毒力基因与耐药基因，不具转导能力，不会造成耐药基因的传播，是一种安全、高效、特异性强的烈性噬菌体，不会破坏雏鸡肠道菌群。该噬菌体制剂可成为一种新型环保的净化种鸡场鸡白痢沙门菌的辅助手段，也是预防和治疗鸡群鸡白痢或鸡伤寒沙门菌感染的替代策略。

Description

一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体CKT1及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体CKT1及其应用。
背景技术
沙门菌属于肠杆菌科，是食源性疾病中重要的病原菌，据统计，我国大约70～80％的食源性疾病由沙门菌感染引起。在我国，主要流行的D群沙门菌包括可引起人畜共感染的肠炎沙门菌和雏鸡高死亡率的鸡白痢沙门菌，它们是养殖业特别是禽类养殖中造成损失的重要因素。已知禽类是沙门菌最主要的宿主，其中鸡白痢沙门菌不但在群体间水平传播，还能垂直传播给下一代，给雏鸡造成极高的死亡率，严重降低生长性能；成年鸡感染后虽无明显症状，但却可以在动物和环境中广泛传播，给养殖业带来巨大经济损失。目前多数发达国家已完成鸡白痢沙门菌的净化工作，而发展中国家因养殖期间隐形感染鸡的存在，而无法完全消除沙门菌。此外，蛋、蛋制品及家禽副产品可通过食物链间接对人类健康造成危害。为了保障家禽养殖健康和蛋品、肉品安全，沙门菌病被国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)列为优先防控疫病。当前，种鸡场鸡白痢沙门菌的净化主要通过血清学检测不断剔除阳性感染的鸡只，以及加强饲养管理，但存在效果差、成本高昂等缺点。此外，细菌耐药性正在不断增强，而现阶段减抗的推进，都使得研发新型抗菌药物成为当前亟待解决的重要问题。
噬菌体(bacteriophage)是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体是由核酸和蛋白质构成，蛋白质起着保护核酸的作用，并决定噬菌体的形态和表面特征。已知噬菌体必须利用宿主进行增殖并最终裂解宿主释放子代噬菌体。目前，噬菌体制剂作为一种新型抗菌药物正在不断被接纳，其在美国等多个国家已成为合法药物，其杀菌作用显著。但有些噬菌体基因组中含有耐药基因和编码毒力因子的基因；还有些噬菌体可将宿主菌的毒力基因与耐药基因通过噬菌体转导转移给其他细菌中，从而造成传播耐药基因与毒力基因的风险。当前国内噬菌体产品中的噬菌体菌株特性不一、效果不同，对噬菌体能否转导耐药基因与毒力基因进行评估的研究也很少。此外，致病菌的噬菌体制备必须通过宿主菌来增殖，因此宿主菌的毒力与安全性需要深入评估。因此，对筛选的噬菌体及噬菌体制剂进行安全性评估是噬菌体能否推广应用的关键。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，从养殖场周边污水样品中分离得到一株不具转导耐药基因能力的烈性沙门菌噬菌体CKT1。该烈性噬菌体CKT1对不同来源的鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌及肠炎沙门菌等D群沙门菌均具有裂解活性，潜伏期短，子代噬菌体爆发量高，抗噬菌体突变率低，不携带毒力基因与耐药基因，不会转导耐药基因至其他细菌中，可保护雏鸡肠道菌群健康，是一种安全、高效、特异性强的烈性噬菌体，具有广泛的应用前景。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一株不具转导耐药基因能力的鸡白痢沙门氏菌噬菌体CKT1(Salmonella phage CKT1)，该噬菌体已于2022年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2022110。
所述烈性噬菌体CKT1分离养殖场周边污水样品，具有如下特征：
烈性噬菌体CKT1呈正多面体头部(长径约60nm)，无收缩性尾巴(长120nm)，属于长尾噬菌体科。基因组全长41Kb(GenBank accession OK143508)，不携带耐药基因与毒力基因，不会转导耐药基因至其他细菌中，安全性高。
烈性噬菌体CKT1可对沙门菌属的肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌等D群沙门菌具有裂解能力。在pH 4-11、温度4-60℃条件下比较稳定，抗噬菌体突变率<10-6。
本发明的第二方面，提供上述烈性噬菌体CKT1在如下(1)或(2)中的应用：
(1)制备抑制或杀灭D群沙门菌的产品；
(2)制备预防和/或治疗鸡群D群沙门菌感染的药物。
优选的，所述D群沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌。
本发明的第三方面，提供一种噬菌体制剂，所述噬菌体制剂以上述烈性噬菌体CKT1 为活性成分。
优选的，所述噬菌体制剂中，烈性噬菌体CKT1的剂量大于或等于106PFU/mL。
上述噬菌体制剂可以以本发明的烈性噬菌体CKT1作为唯一活性成分；还可以含有除本发明的噬菌体以外的其他噬菌体，其与本发明的噬菌体复配使用可以得到与之相当或者更好的防治鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和/或肠炎沙门菌的效果。
上述噬菌体制剂还可以包括载体，所述载体可以为固体载体或液体载体；其中，固体载体可以选自矿物材料、植物材料或高分子化合物；液体载体可以选自有机溶剂、植物油、矿物油和水。
上述噬菌体制剂可以被制备成各种使用形式，如液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等，经喷雾、注射或口服等方式用于预防或治疗沙门菌在鸡群中的感染，或用于改善鸡群养殖环境、降低蛋壳表面沙门菌含量。
本发明的第四方面，提供上述噬菌体制剂在如下(1)或(2)中的用途：
(1)制备预防和/或治疗鸡群鸡白痢沙门菌或鸡伤寒沙门菌感染的药物；
(2)制备杀灭养殖环境中D群沙门菌的环境改良剂。
本发明的第五方面，提供以上述烈性噬菌体CKT1作为有效成分的饲料添加剂、饮用水添加剂或杀菌剂。
本发明的有益效果：
本发明分离到的沙门菌噬菌体CKT1对不同来源的鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌及肠炎沙门菌等D群沙门菌均具有裂解活性，潜伏期短，子代噬菌体爆发量高，抗噬菌体突变率低，不携带毒力基因与耐药基因，不会转导耐药基因至其他细菌中，可保护雏鸡肠道菌群健康，是一种安全、高效、特异性强的烈性噬菌体。该噬菌体制剂可成为一种新型环保的净化种鸡场鸡白痢沙门菌的辅助手段，也是预防和治疗鸡群鸡白痢或鸡伤寒沙门菌感染的替代策略。
附图说明
图1：噬菌体CKT1纯化后在野生型鸡白痢沙门菌CVCC526上产生的噬菌斑图(A) 及电镜图(B)。
图2：噬菌体CKT1的生物学特性。(A)温度稳定性；(B)酸碱稳定性；(C)一步生长曲线；(D)体外裂解能力。
图3：噬菌体CKT1对耐药基因的转导频率。
图4：噬菌体治疗改善鸡白痢沙门菌感染的雏鸡生长性能。(A)噬菌体治疗改善沙门菌感染的雏鸡体重；(B)噬菌体治疗降低雏鸡肝、脾中沙门菌定植量。
图5：噬菌体CKT1在治疗鸡白痢沙门菌感染的成年种鸡中的应用。(A)噬菌体降低环境中沙门菌含量；(B)噬菌体降低蛋壳表面沙门菌含量；(C)噬菌体治疗可降低血清中抗沙门菌IgG抗体滴度。
具体实施方式
如前所述，沙门菌是一种广泛分布在自然界中的革兰氏阴性杆菌，可导致贝类、羊、猪、鸡、鸭等多种动物和人患病。临床中噬菌体能够特异性侵染细菌并抑制病菌增殖，目前已有许多关于沙门菌烈性噬菌体的相关报道。但是，噬菌体可以通过转导作用与其宿主细菌进行遗传物质的交换，以利于繁殖或促进其进化。有研究表明，噬菌体的遗传交换不仅可以在紧密相关的细菌物种间发生，也可以发生在远缘的物种间。因此，理论上环境中大量存在的噬菌体可以通过转导作用与细菌基因进行重组并携带相关基因在环境中传播，使得噬菌体成为耐药性基因传播的潜在储存载体，造成安全隐患。
基于此，本发明从养殖场周边污水样品中分离得到一株烈性噬菌体CKT1。采用双层琼脂平板法测定分离得到的噬菌体宿主谱，测定噬菌体的抗性突变率、pH和温度稳定性、电镜形态、耐药基因转导能力，并进行全基因组测序分析。噬菌体CKT1可裂解100％的鸡白痢沙门菌，但对大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌等没有裂解能力；在pH 4-11、温度4-60℃条件下比较稳定，属于Guernseyvirinae中的Jerseyvirus噬菌体，抗噬菌体突变率低于10-6，属于长尾噬菌体，基因组全长41Kb(GenBank accession OK143508)，不具有耐药基因与毒力基因。
本发明分离的烈性噬菌体CKT1与现有报道的沙门菌烈性噬菌体相比，其显著的优点在于：本发明的烈性噬菌体CKT1不具有转导耐药基因的能力，不会造成耐药基因的传播，安全性高。
在治疗感染鸡白痢沙门菌的雏鸡应用中，单次以灌服方式应用噬菌体CKT1107PFU/ 只，6天后可显著降低肝、脾病变程度，1周后可恢复因鸡白痢沙门菌感染导致的肠道菌群紊乱，显著改善雏鸡生长性能。在治疗感染鸡白痢沙门菌的种鸡应用中，以灌服方式连续应用噬菌体CKT1 108PFU/只，可明显降低成年种鸡肝脏及输卵管中沙门菌分离率 20～70％，使蛋壳表面及环境中的鸡白痢沙门菌含量下降10-10000倍。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：烈性沙门菌噬菌体CKT1的分离与培养
取从养殖场采集的离心过滤的污水10mL加入2倍浓缩的LB液体中，按1％比例加入鸡白痢沙门菌，37℃震荡培养8～10h，10,000rpm/min离心3min，取上清用0.22μm滤膜过滤得到无菌的噬菌体富集液。用SM缓冲液按10倍梯度倍比稀释，点板10μL于含宿主鸡白痢沙门菌的双层琼脂平板上，37℃恒温培养6～8h，观察噬菌体斑情况。挑取单个噬菌体斑于S M缓冲液中，振荡混匀后倍比稀释，取各稀释梯度10μL点板于双层琼脂平板上，如此重复 4次后，得到噬菌斑透明、边缘整齐且形态一致的噬菌体CKT1(图1A)。取富集的噬菌体采用负染方法进行染色，于Hitachi H7650透射电镜下观察噬菌体的形态，结果显示噬菌体 CKT1呈正多面体头部(长径约60nm)，无收缩性尾巴(长120nm)，属于长尾噬菌体科 (图1B)。
对噬菌体CKT1进行生物保藏，保藏信息如下：
请求保藏的培养物名称：鸡白痢沙门氏菌噬菌体CKT1(Salmonella phage CKT1)；保藏编号为：CCTCC NO：M2022110，保藏日期：2022年1月21日。
实施例2：噬菌体CKT1的生物学特性测定
宿主谱测定：取10μL噬菌体富集液(109PFU/mL)点板于不同沙门菌的双层琼脂平板上，37℃恒温培养6～8h，若出现透明空斑，则表示宿主菌可被噬菌体CKT1裂解。
表1：噬菌体CKT1对不同沙门菌及肠杆菌科细菌的裂解能力
Figure RE-GDA0003673533910000051
注：++表示具有裂解能力，-表示无裂解能力
结果如表1所示，结果表明：噬菌体CKT1可对沙门菌属的肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌等D群沙门菌均具有裂解能力。
温度稳定性测定：将含有1mL 108PFU/mL噬菌体稀释液的离心管分别置于37℃、50℃、 60℃、70℃、80℃下孵育2h，随后SM缓冲液倍比稀释，取10μL点板于双层琼脂平板，计算噬菌体存活率。结果表明噬菌体在37～60℃可保持80％以上的活力(图2A)。
pH稳定性测定：将108PFU/mL噬菌体置于pH 2-13的溶液中，37℃静置孵育2h后，用S M缓冲液进行梯度稀释，取10μL点板于双层琼脂平板，计算噬菌体存活率。结果表明在p H值4-11范围内，噬菌体效价均可保留80％以上的活力，说明噬菌体对酸碱的耐受性较强(图2B)。
一步生长曲线：将培养至稳定期的108CFU/mL的鸡白痢沙门菌与106PFU/mL的噬菌体于37℃下静置孵育10min使噬菌体充分吸附，之后10,000rpm/min离心2min弃上清，用预冷的液体LB洗涤一次以除去上清中残留的噬菌体后用等体积LB液体重悬，37℃ 180rpm/min摇床振荡培养2h。从0min开始每隔10min取样加入2％氯仿震荡1-2min，倍比稀释后取10μL点板于双层琼脂平板上，计算噬菌体效价并绘制曲线。根据以下公式计算平均裂解量：平均裂解量＝(噬菌体最终滴度-噬菌体初始滴度)/宿主细胞初始数。结果如图2C所示，噬菌体CKT1的潜伏期约10min，裂解量约147PFU/cell。
噬菌体体外裂解能力测定：向培养至稳定期的108CFU/mL的鸡白痢沙门菌按感染复数(MOI)分别为10、1、10-1、10-2、10-3与10-4比例加入噬菌体，振荡混匀后分装至96 孔板内，200μL/孔，设定三个重复。将96孔板封膜后置于已预热至37℃的酶标仪上，每隔1h测定OD600，至培养6h为止。结果如图2D显示，即使在MOI为10-4条件下，噬菌体CKT1也可在2h内快速裂解鸡白痢沙门菌至澄清，表明噬菌体CKT1具有很强的裂解能力。
实施例3：噬菌体CKT1转导能力分析及抗噬菌体突变率测定
1、噬菌体CKT1有无转导能力验证：
向培养至稳定期的108CFU/mL的鸡白痢沙门菌SPLH19(含耐药基因blaTEM、链霉素耐药基因aadA)中加入噬菌体CKT1至终浓度105PFU/mL，37℃裂解6h后离心过滤，采用双层平板法测定噬菌体滴度。分别取上述噬菌体制备液(109PFU/mL)1μL、5μL和20μL加入200μL过夜的鸡白痢沙门菌SPLH12(对氨苄青霉素和链霉素敏感，无耐药基因blaTEM、链霉素耐药基因aadA)中，涡旋混匀后室温下静置孵育15min使噬菌体充分吸附到细菌上，之后加入1mL液体LB，37℃振荡培养1h，10,000rpm离心弃上清，沉淀用100μL新鲜LB重悬，分别涂布含链霉素100μg/mL和氨苄青霉素100μg/mL的LB抗性平板，37℃培养24h。试验设置只有鸡白痢沙门菌SPLH12和只有噬菌体的阴性对照，同时设置以具有转导能力的沙门菌噬菌体P22HT105/int为阳性对照。结果如图3所示，氨苄青霉素和链霉素抗性平板上均无任何转导子生长，沙门菌噬菌体CKT1的转导频率低于 3.25×10-10，显著低于沙门菌噬菌体P22HT105/int的转导频率(2.17×10-7)，这一结果表明噬菌体CKT1不具有转导耐药基因的能力，具有良好安全性。
2、抗噬菌体突变率测定：
分别向培养至稳定期的2×108CFU/mL的鸡白痢沙门菌CVCC526、20JS04中加入噬菌体CKT1至终浓度105PFU/mL，设定不加噬菌体CKT1的对照，37℃裂解3h后直接用含噬菌体CKT1 108PFU/mL的无菌蒸馏水倍比稀释1、10、100倍，涂布LB平板，计数各组平板上的菌落数，计算抗噬菌体突变率(噬菌体裂解组存活突变株CFU/未处理组总 CFU)，结果噬菌体CKT1的抗性突变率低于10-6。
实施例4：噬菌体CKT1制剂制备工艺的优化
由于噬菌体制备必须使用其宿主细菌进行增殖，因此选择一株毒力弱且耐药谱窄的鸡白痢沙门菌对于噬菌体制备而言具有重要意义。首先，将含5mL108CFU/mL鸡白痢沙门菌CVCC526菌液的6cm平皿置于紫外灯下诱变45s，之后避光培养12h，稀释涂布LB 平板，所得突变株每24h传代一次，连续传代20次，最终获得鸡白痢沙门菌CVCC526 的弱毒株CVCC526R2(通过紫外诱变的方法筛选弱毒株是现有技术中的常规方法，对于弱毒株CVCC526R2，公知自申请日起20年内可从申请人处获得以用于重复本试验)。刮取培养24h的LB平板上的鸡白痢沙门菌弱毒株CVCC526R2菌苔置于生理盐水中测定 OD600，按0.001％-1％(v/v)比例接种至噬菌体增殖液体培养基(蛋白胨0.5％，酵母粉 0.5％，CaCl2 0.2％,MgSO4 0.1％)中至OD600＝0.1(1×108CFU/mL)，同时加入噬菌体至终浓度104-5PFU/mL，37℃120rpm振荡培养3-5h至噬菌体裂解澄清。裂解液于10,000rpm 离心3min，0.22μm滤膜过滤上清，采用双层琼脂平板法测定噬菌体滴度可达109PFU/mL 以上。用上述制备的109PFU/mL的噬菌体裂解液给1日龄雏鸡灌服1mL，发现雏鸡生长良好，7日龄时各脏器无明显病理变化，表明用该弱毒株制备的噬菌体具有良好的安全性。
实施例5：噬菌体制剂在预防和治疗雏鸡感染鸡白痢沙门菌的应用
将1日龄SPF雏鸡平均分成4组，每组20只，1日龄时阴性对照组和噬菌体对照组灌服500μL PBS，攻毒组与噬菌体治疗组灌服500μL2×106CFU/mL致关节炎型鸡白痢沙门菌20JS04，8h后噬菌体对照组与噬菌体治疗组灌服500μL 2×107PFU/mL(107PFU/只) 噬菌体CKT1，只灌服1次。在第6d对各组鸡只进行称重，随机剖检6只，观察脏器病理变化并取肝脏进行HE染色，取盲肠内容物进行16S rRNA测序，分析肠道菌群变化。
结果显示，单次噬菌体灌服即可显著改善鸡白痢沙门菌感染造成的雏鸡体重下降(图 4A)，减轻肝窦淤血扩张，调整因鸡白痢沙门菌感染导致的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等病原菌增加的肠道菌群失衡状况。
将某养殖场沙门菌检测阳性的1日龄青脚麻鸡20只平均分为两组，其中对照组1日龄起每日灌服500μL饮用水，噬菌体治疗组则每日灌服500μL含107PFU/mL沙门菌噬菌体CKT1的饮用水，连续灌服3天。在14日龄时雏鸡肝、脾沙门菌载菌量均显著下降(图 4B)。
实施例6：噬菌体CKT1在治疗鸡白痢沙门菌感染的成年种鸡的应用
将24只22周龄哈伯德利丰父母代健康肉种鸡随机分为四组(攻毒组、阴性对照组、噬菌体对照组、噬菌体治疗组)，分别于通风良好的房间内隔离平养，每日自由饮水，每只每天定量饲喂200g饲料。攻毒组与噬菌体治疗组胸肌注射1×109CFU野生型鸡白痢沙门菌CVCC526，对照组与噬菌体组注射PBS；3周后，噬菌体组与治疗组灌服噬菌体CKT1，剂量为1×108PFU/只，每天1次，连续灌服两天。噬菌体治疗5天后，将含有无菌PBS 7 mL的平皿置于房间内10min，随后收集混匀后的液体，倍比稀释涂布XLD平板。取无菌湿润的棉拭子擦拭整个蛋壳表面，置于含1mL无菌PBS的离心管内，倍比稀释涂布XLD 平板。颈静脉采血，室温离心后取血清，用ELISA检测试剂盒测定抗沙门菌IgG抗体滴度。
表2：噬菌体CKT1对各器官中鸡白痢沙门菌分离率的影响
Figure RE-GDA0003673533910000081
结果发现，噬菌体治疗可明显降低成年种鸡肝脏及输卵管中沙门菌分离率(表2)，显著降低空气及蛋壳表面沙门菌含量，同时降低血清中抗沙门菌IgG抗体滴度(图5)。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株不具转导耐药基因能力的的烈性沙门菌噬菌体CKT1，其保藏编号为：CCTCCM2022110。
2.权利要求1所述的烈性噬菌体CKT1在如下(1)或(2)中的应用：
(1)制备抑制或杀灭D群沙门菌的产品；
(2)制备预防和/或治疗鸡群D群沙门菌感染的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述D群沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌。
4.一种噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂以权利要求1所述的烈性噬菌体CKT1为活性成分。
5.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂中，烈性噬菌体CKT1的剂量大于或等于106PFU/mL。
6.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂还包括载体，所述载体为固体载体或液体载体。
7.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。
8.权利要求4-7任一项所述的噬菌体制剂在如下(1)或(2)中的用途：
(1)制备预防和/或治疗鸡群鸡白痢沙门菌或鸡伤寒沙门菌感染的药物；
(2)制备杀灭养殖环境中D群沙门菌的环境改良剂。
9.以权利要求1所述的烈性噬菌体CKT1作为有效成分的饲料添加剂、饮用水添加剂或杀菌剂。
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