CN115838693A - 一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及噬菌体技术领域，公开了一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体及其应用，该噬菌体的保藏编号为CGMCC No.45227。本发明提供的噬菌体，能特异性裂解丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，因此，该噬菌体能够用于防治由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种引起的猕猴桃细菌性溃疡病；同时，本发明能够扩大丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体资源库，在猕猴桃溃疡病防控战略布局上具有重要意义。

Description

一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及噬菌体技术领域，具体涉及一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体及其应用。

背景技术

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa)是猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。该病原引发溃疡病症状有褐色叶斑、叶枯、茎尖死亡、树干流脓以及果实的溃烂等，严重时造成植株大面积死亡。该病于1980年代在中国和日本首次报道，2008年在意大利严重爆发，并蔓延到其他欧洲国家，严重威胁全球猕猴桃产业的发展。近年来溃疡病给我国猕猴桃产业带来的损失日益严重，已成为亟待解决的重要难题。

目前，防治猕猴桃细菌性溃疡病的最常见的方法是用消毒剂、铜基杀菌剂或抗生素喷洒果园，这些化学药剂在环境和食品中存在高残留、细菌耐药性等问题，因此，发展安全高效的方法来防治猕猴桃细菌性溃疡病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服目前防治猕猴桃细菌性溃疡病主要为化学药剂，且在环境和食品中存在高残留、细菌耐药性等问题，提供了一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体及其应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体，该噬菌体的保藏编号为CGMCC No.45227。

优选地，所述噬菌体在pH值为4～11的环境下具有耐性。

优选地，所述噬菌体在温度为28～50℃的环境下具有耐性。

优选地，所述噬菌体的最佳感染复数为0.01。

本发明第二方面提供一种根据如上所述的噬菌体在制备防治猕猴桃细菌性溃疡病的生物药剂中的应用。

优选地，所述生物药剂的剂型为喷雾剂或注射剂。

优选地，所述注射剂的注射部位为待防治猕猴桃树的韧皮部。

优选地，所述生物药剂的制备过程包括：所述生物药剂的制备过程包括：将滴度为10⁸～10⁹PFU/mL噬菌体悬液与水和吐温混合。

优选地，所述噬菌体悬液与水的体积比为1:20～40。

优选地，所述生物药剂中，吐温的体积分数为0.02～0.1％。

本发明提供的噬菌体，能特异性裂解丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae，Psa)，因此，该噬菌体能够用于防治由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种引起的猕猴桃细菌性溃疡病；同时，本发明能够扩大丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体资源库，在猕猴桃溃疡病防控战略布局上具有重要意义。

附图说明

图1是本发明提供的噬菌体的双层平板噬菌斑形态示意图；

图2是本发明提供的噬菌体的透射电镜结果示意图；

图3是本发明提供的噬菌体在不同温度下的测试结果图；

图4是本发明提供的噬菌体在不同pH下的测试结果图；

图5是本发明提供的噬菌体的一步生长曲线示意图。

生物保藏

本发明提供的噬菌体，是从自然界分离的烈性噬菌体，该噬菌体于2022年7月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45227，分类命名为：丁香假单胞菌噬菌体KBC54。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体，该噬菌体的保藏编号为CGMCC No.45227。

本发明提供的噬菌体，作为特异性感染丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌株的病毒，一般不影响正常微生物群，能够安全高效地对抗丁香假单胞菌猕猴桃致病变种耐药性。

此外，在细菌与噬菌体相互作用过程中，由于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌株存在遗传多样性，而不同噬菌体特异性识别不同菌株的特征与二者共进化有关，为保证噬菌体的多样性和覆盖率，需要具有丰富的针对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体资源库。本发明提供的噬菌体，能够扩大丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体资源库，在猕猴桃溃疡病防控战略布局上具有重要意义。

本发明所述的噬菌体的稳定性良好，具体的，所述噬菌体在pH值为4～11的环境下具有耐性，在30min内滴度降低不超过3个数量级。

在本发明中，所述噬菌体在温度为28～50℃的环境下具有耐性，在30min内滴度降低不超过2个数量级。

在具体的实施方式中，所述噬菌体的最佳感染复数为0.01。

本发明还提出了如上所述的噬菌体制备防治猕猴桃细菌性溃疡病的生物药剂中的应用。

本发明不限制所述生物药剂的剂型，只要能与患有猕猴桃细菌性溃疡病的猕猴桃树中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种接触即可。在具体的实施方式中，所述生物药剂的剂型为喷雾剂或注射剂。较优地，同时采用喷雾剂和注射剂对猕猴桃树进行防治。

为了使所述生物药剂对猕猴桃树的防治效果好，在优选的实施方式中，所述注射剂的注射部位为待防治猕猴桃树的韧皮部。

在具体的实施方式中，所述生物药剂的制备过程包括：将滴度为10⁸～10⁹PFU/mL噬菌体悬液与水和吐温混合。

在优选的实施方式中，所述噬菌体悬液与水的体积比为1:20～40，具体的，例如可以为1:20、1:22、1:25、1:30、1:35、1:39或1:40。

在优选的实施方式中，所述生物药剂中，吐温的体积分数为0.02～0.1％。

在最优选的实施方式中，按体积比为1:39的比例将滴度为10⁹PFU/mL噬菌体悬液与混合液混合，且所述生物药剂中，吐温的体积分数为0.05％。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。以下实施例中，宿主菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)，从四川省苍溪县猕猴桃果园的患病植株上分离所得。

实施例1

本实施例用来说明本发明的噬菌体的分离与纯化。

本发明中的污水样品采自中科院微生物所；

将采集到的污水样品在7,500×g的转速下离心5min，留上清液，然后过0.22μm滤膜除菌，得到水样。

(1)噬菌体的分离

将宿主菌培养至对数生长期，得到菌液，取所述菌液50μL加1mL水样，混合均匀后，在室温下静置15min，然后加入3mL、42℃的LB培养基(上层)中混匀，得到混合悬液，将混合悬液倾倒于含有1.5％琼脂的LB培养基(下层)中(双层平板法)，凝固后放于28℃培养过夜，并观察过夜后平板上的噬菌斑。

(2)噬菌体的纯化

将长出的单个噬菌体斑移至无菌1.5mL离心管中，用牙签捣碎，并加入1mL的ddH₂O混匀，然后置于4℃过夜，再经0.22μm滤膜过滤除菌后进行梯度稀释。取原液、10^-1、10^-2稀释度的噬菌体各200μL，与50μL宿主菌菌液混合后，用双层平板法培养，获得含有单个噬菌斑的双层平板。

重复上述方式纯化3～4次后，得到纯化的噬菌体(见图1)，并命名为噬菌体KBC54。

实施例2

本实施例用来说明本发明的噬菌体的鉴定。

(1)噬菌体的形态观察

将实施例1获得的噬菌体KBC54在透射电镜下观察，结果如图2所示。由图2可以看出，该噬菌体的头部呈多面体对称，直径约为58nm，尾部有12nm左右，根据噬菌体分类标准，噬菌体KBC54属于有尾噬菌体目短尾噬菌体科的成员。

(2)噬菌体的测序

将实施例1获得的噬菌体KBC54的原液，送往上海凌恩生物科技公司进行测序分析，采用Illumina TruSeq^TM Nano DNA Sample Prep Kit方法构建文库，使用GeneMarks软件对新测序的基因组进行编码基因预测，将预测基因的蛋白序列分别与NR、Swiss-Prot、eggNOG、KEGG、GO等数据库进行比对，从而获得预测基因的注释信息。测序结果显示分离得到的噬菌体基因组为环状双链DNA，大小为42.609kb，GC含量为63.1％。基因注释结果显示共有47个开放阅读框，其中17个基因编码假设蛋白，7个编码与噬菌体遗传物质调控功能有关的核酸内切酶类、RNA 酶类、DNA 酶类等，其余是与噬菌体结构功能有关的基因，编码头部蛋白、衣壳蛋白、尾管蛋白和其他蛋白等，使用tRNAscan-SE没有预测到tRNA。

将测序获得的噬菌体基因组序列与NCBI数据库进行比对，基于BlastN搜索结果，以及噬菌体分类原则，即噬菌体属级别分类的阈值为至少50％的核苷酸序列相似性，物种级别分类的阈值为至少95％的核苷酸序列同一性，我们将所分离的噬菌体鉴定为有尾噬菌体纲(Caudoviricetes)、有尾噬菌体目(Caudovirales)、自复制短尾噬菌体科(Autographiviridae)、多孢病毒属(Pollyceevirus)的新种。Psa噬菌体KBC54基因组序列已提交至GenBank(Acession number：OL854071)，全基因组序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3

本实施例用于说明温度对本发明的噬菌体滴度的影响。

将滴度约为10⁸PFU/mL的500μL噬菌体KBC54(实施例1获得)悬液，在28℃、50℃、60℃、70℃、80℃下水浴30min，之后迅速置于冰上冷却。将冷却后的噬菌体KBC54悬液10倍稀释后与宿主菌混合，利用双层平板法对噬菌体KBC54进行计数，并根据计数结果，以作用温度为横坐标，以噬菌体滴度的对数值作为纵坐标，绘制了温度对噬菌体KBC54滴度的影响曲线，见图3。

由图3可以看出，噬菌体KBC54在28～50℃下作用30min后，滴度无明显变化，活性仍然很高；经60～70℃处理后，滴度下降了10⁵；当温度超过80℃后，噬菌体KBC54完全失活。由此说明本发明提供的噬菌体KBC54在28～50℃下具有耐性。

实施例4

本实施例用于说明pH对本发明的噬菌体滴度的影响。

在1.5mL EP管中，先加入不同pH(2、4、6、7、8、10、12)的LB液体培养基900μL，然后加入100μL滴度约为10⁹PFU/mL的噬菌体KBC54(实施例1获得)悬液，置于28℃水浴锅中，水浴30min。将噬菌体KBC54悬液10倍稀释后与宿主菌混合，利用双层平板法对噬菌体计数，并根据计数结果，以作用pH为横坐标，以噬菌体滴度的对数值作为纵坐标，绘制了pH对噬菌体KBC54滴度的影响曲线，见图4。

由图4可以看出，当pH为6～10时，噬菌体浓度可以保持在10⁸PFU/mL左右；当pH为4或11时，噬菌体滴度下降了10²；而pH为2或12时，噬菌体完全失活。由此说明本发明提供的噬菌体KBC54可以耐强酸强碱。

实施例5

本实施例用于说明本发明的噬菌体对宿主菌(丁香假单胞菌猕猴桃致病变种)的最佳感染复数。

以1、0.1、0.01、0.001的感染复数将噬菌体KBC54与宿主菌加入到100mL的KB液体培养基中，28℃、220rpm培养24h，取离心后的上清用0.22μm滤膜除菌，之后用双层平板法测定噬菌体的滴度，结果如下表1所示。

表1

宿主菌(CFU/mL)	噬菌体(PFU/mL)	感染复数	噬菌体滴度(PFU/mL)
				1×10<sup>4</sup>	1×10<sup>4</sup>	1	7.2×10<sup>6</sup>
1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>4</sup>	0.1	3.7×10<sup>7</sup>
				1×10<sup>6</sup>	1×10<sup>4</sup>	0.01	4.2×10<sup>8</sup>
1×10<sup>7</sup>	1×10<sup>4</sup>	0.001	2.4×10<sup>8</sup>

由表1可以看出，在感染复数从1降低到0.1的过程中，噬菌体滴度呈上升趋势；在感染复数为0.01时，噬菌体滴度最高，之后当感染复数降低为0.001时，噬菌体滴度也随之降低；这说明0.01为噬菌体KBC54的最佳感染复数。

实施例6

本实施例用于说明本发明的噬菌体的一步生长曲线。

将实施例1获得的噬菌体KBC54与宿主菌以0.01的感染复数混匀后，在室温条件下孵育20min，然后在13,000×g的条件下离心1min，弃掉上清，用1mL的LB培养基洗涤2次后，加入5mL LB培养基将沉淀重悬起来，在28℃、220rpm的条件下培养，从0min开始，之后每隔10min取样300μL，在13,000×g的条件下离心1min，再吸取100μL的上清进行10倍倍比稀释，用双层平板法测定噬菌体KBC54滴度。并根据测定结果，以时间为横坐标，噬菌体KBC54的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，见图5。

由图5可以看出，在前20min后内噬菌体KBC54滴度上升不明显，为噬菌体的潜伏期，在20～70min时，噬菌体KBC54迅速上升，为噬菌体的裂解期，在70min后噬菌体滴度趋于平稳，这表明噬菌体进入了平台期，该噬菌体的爆发量为702。

实施例7

本实施例用于说明本发明的噬菌体对猕猴桃细菌性溃疡病的防治效果。

在四川省苍溪县的溃疡病发病较严重的四个猕猴桃种植园进行实验，猕猴桃品种为“红阳”红心猕猴桃，分为对照组和治疗组，每组50株。将滴度为10⁹PFU/mL的1L噬菌体KBC54(实施例1获得)悬液加39L水，然后加吐温，得到生物药剂(含0.05％吐温)，采用所述生物药剂对猕猴桃全株进行喷雾及韧皮部输液防治，施用时间为当年12月份以及次年2月份和3月份，共施用3次；对照组给予等量含0.05％吐温的水。于末次处理的1个月后观察溃疡病发病情况。

结果显示，与对照组相比，经噬菌体KBC54防控治疗组的猕猴桃树体的病情指数(病情指数＝普遍率×严重度×100)降低了50％，且猕猴桃果实结实率提高30％，说明本发明提供的噬菌体KBC54对猕猴桃细菌性溃疡病有良好的抑制效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的噬菌体，其特征在于，该噬菌体的保藏编号为CGMCC No.45227。

2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体在pH值为4～11的环境下具有耐性。

3.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体在温度为28～50℃的环境下具有耐性。

4.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体的最佳感染复数为0.01。

5.一种根据权利要求1-4任一项所述的噬菌体在制备防治猕猴桃细菌性溃疡病的生物药剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物药剂的剂型为喷雾剂或注射剂。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述注射剂的注射部位为待防治猕猴桃树的韧皮部。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物药剂的制备过程包括：将滴度为10⁸～10⁹PFU/mL噬菌体悬液与水和吐温混合。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述噬菌体悬液与水的体积比为1:20～40。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物药剂中，吐温的体积分数为0.02～0.1％。

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