CN113425858A - 一种珊瑚致病菌的益生菌筛选及防治方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种珊瑚致病菌的益生菌筛选及防治方法，包括以下步骤：通过拮抗实验筛选针对目标致病菌的潜在益生菌，获得多株针对目标致病菌具有拮抗作用的潜在益生菌，选取其中一种拮抗能力强的潜在益生菌和生长状态良好的珊瑚样本用于珊瑚致病菌防治实验。通过比较单独添加有海水，单独添加有致病菌，单独添加有益生菌，同时加致病菌与益生菌，提前五小时加益生菌后加致病菌，将海水、目标致病菌、目标益生菌按照分组接种于珊瑚上，通过观察珊瑚上虫黄藻数量变化、光合效率和珊瑚表观形态变化判断目标益生菌是否能对目标致病菌有防治作用及效果。本发明防治珊瑚致病菌的方法科学可靠，对保护珊瑚礁资源和提高珊瑚人工移植成活率有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及珊瑚疾病防治技术领域，具体涉及一种珊瑚致病菌的益生菌筛选及防治方法。
背景技术
珊瑚礁生态系统是初级生产力最高的海洋生态系统之一，具有极高的生物多样性和重要的经济价值。然而，近几十年来，珊瑚礁逐渐退化。据Mulhall M等调查，1980年代初到2000年，珊瑚礁的总面积已从约60万平方公里，减少到约25万平方公里。导致珊瑚礁退化的因素很多，包括自然环境因素(气候变化、海洋酸化、厄尔尼诺、漂白、旋风)和人为因素(炸药捕鱼、过度使用生物资源、冲洗农田、化学污染)以及生物因素(海星摄食、大型藻类竞争、病原微生物)。其中，病原微生物是导致珊瑚退化重要原因之一。由于环境因素及人为因素的影响，珊瑚的免疫能力下降，从而进一步使珊瑚更易受到病原菌的感染及危害。迄今为止，已经发现的由病原微生物导致的珊瑚疾病已经波及106种珊瑚，范围遍及54个国家。
在2002年，Y.Ben-Haim等人从患病的鹿角杯形珊瑚中分离得到Vibriocoralliilyticus，并且通过科赫法则验证了Vibrio coralliilyticus为鹿角杯形珊瑚的病原菌。Vibrio coralliilyticus是一种温度依赖性的病原菌，在高于27℃时就可以导致鹿角杯形珊瑚的虫黄藻裂解和组织脱落，进而导致珊瑚白化。21世纪以来，Vibriocoralliilyticus引起珊瑚白化的事件频发，因此，探索Vibrio coralliilyticus引起鹿角杯形珊瑚白化的防治尤为重要。
现在主要对珊瑚疾病采用的防治方法主要包括：物理方法、抗生素疗法、益生菌疗法、噬菌体疗法这几种。其中，益生菌疗法为本发明主要探讨的方法，益生菌疗法在水生生物疾病防治中已得到多数学者证实并应用。朱正祥等发现在饲料中添加适宜浓度丁酸梭菌可以改善鲤机体免疫力，调节肠道菌群结构，并且抑制有害菌群增殖；谷舞等发现其获得的益生芽孢菌对对虾生长发育及抗病能力方面有益生作用，且提升凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的能力。近两年，在珊瑚疾病防治中益生菌疗法也被证明有一定的效果，PhillipeM.Rosado等人发现使用益生菌团可以缓解Vibrio coralliilyticus导致的珊瑚白化。然而，对于Vibrio coralliilyticus导致的鹿角杯形珊瑚的白化尚未有较好的防治方法。因此，本发明提供对于目标致病菌一种防治方法具有重要的意义。
本发明涉及的目标致病菌株为Vibrio coralliilyticus，目标益生菌株为GXUZ9。本发明对目标益生菌菌株GXUZ9是否具有防治目标菌株引起的珊瑚疾病进行了鉴定，并以提前用目标益生菌处理珊瑚的思路来防治致病菌导致的疾病。
发明内容
本发明的目的在于针对现有鹿角杯形珊瑚致病菌的防治的不足，提供一种针对珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及利用益生菌防治致病菌导致的珊瑚疾病方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：
(a1)样本选择：采集生长状态良好的健康珊瑚，置于养殖池中适应至少15d；
(a2)菌株培养：将待筛选菌株和目标致病菌菌株分别接种于液体培养基中，摇床培养，测定菌株的OD600值并制作其生长曲线；
(a3)拮抗实验：将备好的无菌干净的药敏纸片置于待筛选菌株的培养液中，将目标致病菌涂布于MA平板上，再将沾有待筛选菌株的药敏纸片置于已涂布有目标致病菌的MA平板上，将平板置于29℃培养箱中培养，定期观察拍照。
(a4)菌株鉴定：当MA平板上药敏纸片周围出现明显抑菌圈时，将对应的筛选菌株进行PCR，16srDNA测序，鉴定其种属，选取其中一种作为目标潜在益生菌。
优选地，所述目标菌株为致病菌Vibrio coralliilyticus的菌株，该致病菌保藏于海洋微生物菌种保藏管中心，保藏编号为MCCC1A00545。
优选地，所述珊瑚为鹿角杯形珊瑚。
优选地，步骤(b2)中，若空白组和阴性对照组的珊瑚样本状态优于阳性对照组，且实验组1或实验组2的珊瑚样本状态优于阳性对照组，且检测数据存在显著性差异，表明对珊瑚致病菌防治有效。
优选地，所述液体培养基为MA液体培养基。
优选地，步骤(b1)中的5组处理，每组处理设有至少3个重复。
优选地，所述的潜在益生菌为GXUZ9。
一种珊瑚致病菌的潜在益生菌的防治方法，包括如下步骤：
(b1)菌株培养：将已筛选的目标潜在益生菌(GXUZ9)与目标致病菌分别加入到MA培养基中，培养至平稳期。
(b2)分组处理：将珊瑚株分为五组，每组三株，处理如下：单独添加有海水，作为空白组，单独添加有致病菌，作为阳性对照组，单独添加有潜在益生菌，作为阴性对照组，同时加致病菌与潜在益生菌作为实验组1，提前五小时加潜在益生菌后加致病菌作为实验组2；
(b3)接种观察：将步骤(b1)的5组的单个珊瑚样本分别进行接种处理，期间测定珊瑚样本上的共生虫黄藻密度及光合效率，并观察记录珊瑚样本表观特征；
(b4)防治评估：以步骤(b2)各珊瑚样本表观特征，共生虫黄藻密度，光合速率判断致病菌作用珊瑚样本前后差异为指标，评估珊瑚样本在致病菌作用前后白化程度，若空白组和阴性对照组的珊瑚样本状态优于阳性对照组，且实验组1或实验组2的珊瑚样本状态优于阳性对照组，则表明潜在益生菌对珊瑚致病菌防治有效。
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明通过拮抗实验筛选得出潜在益生菌菌株GXUZ9可以拮抗Vibriocoralliilyticus。因此，针对Vibrio coralliilyticus引起的珊瑚疾病，通过加入一定浓度的潜在益生菌菌株GXUZ9防治该致病菌导致的珊瑚疾病，防治的结果可以通过分析珊瑚表观特征来检验，检验结果迅速可靠。本发明的鉴定方法和防治方法科学可靠，成本较低，操作简单，防治效率及样本成活率高，可规模化操作，可以应用于对珊瑚特定疾病的预防，对保护珊瑚礁资源和提高珊瑚人工移植成活率有重大意义，对助力珊瑚礁生态系统保护取得长远发展有一定的积极作用。
附图说明
图1为不同处理组鹿角杯形珊瑚表观特征。
图2为不同处理组鹿角杯形珊瑚共生虫黄藻密度。
图3为不同处理组鹿角杯形珊瑚Fv/Fm值。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1
一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，所述筛选方法包括如下步骤：
(a1)样本选择：采集生长状态良好的健康鹿角杯形珊瑚，置于养殖池中适应20d。
根据珊瑚生长特性，设置养殖池水质条件为：T:29℃、KH:7.0±0.3、pH: 8.2±0.1、Ca2+:400±15ppm、Mg2+:1400±20ppm、PO4 3-<0.03ppm、NH3+<0.15ppm、 NO2-<0.1ppm、NO3-≈0ppm，设置12/12h光照，采用250WMetal halogen lamp +4T5HO,ODYSSEA，每周两次喂食刚孵化的丰年虾。
(a2)菌株培养：将待筛选菌株和目标致病菌株(Vibrio coralliilyticus) 分别接种到MA液体培养基中，29℃，160rpm下培养，测定菌株的OD值并制作其生长曲线，待筛选菌株来源于珊瑚及海水中分离培养，致病菌购于国家微生物资源平台(NIMR)。
(a3)拮抗实验筛选：
(a31)药敏纸片制备：将灭菌药敏纸片浸于待筛选菌株培养液中10min。
(a32)目标菌株涂布：当目标致病菌株(Vibrio coralliilyticus)在MA 液体培养基中培养至平稳期时，移取200μL的菌液涂布于MA固体培养基上。同时，将沾有待筛选菌株的药敏纸片附于涂布有目标致病菌株的MA固体培养基上。
(a33)菌株培养：将步骤(a32)的平板置于29℃恒温培养箱中培养，并且观察是否有抑菌圈出现，当有抑菌圈出现时，拍照且记录。
本实施例还提供一种由所述目标致菌株导致珊瑚疾病的防治方法，包括如下步骤：
(b1)菌株培养：将已筛选的目标潜在益生菌(GXUZ9)与目标致病菌分别加入到MA培养基中，培养至平稳期。
(b2)分组处理
(b21)珊瑚分组：将珊瑚株分为六组，每组三株，处理如下：单独添加有海水，作为空白组，单独添加有致病菌，作为阳性对照组，单独添加有潜在益生菌，作为阴性对照组，同时加致病菌与潜在益生菌作为实验组1，提前五小时加潜在益生菌后加致病菌作为实验组2；
(b22)菌株处理：当菌株培养至刚达到稳定期时，取目标潜在益生菌 (GXUZ9)菌液18ml，8000rpm离心3min，吸弃上清，菌体用海水重悬为 6ml，将重悬菌液加入实验组1和阴性对照组的每株珊瑚1ml。同时，取海水加入空白对照组的每株珊瑚1ml。5h后，取目标潜在益生菌(GXUZ9)菌液 9ml，8000rpm离心3min，吸弃上清，菌体用海水重悬至3ml，将重悬菌液加入实验组2的每株珊瑚1ml，并且，取目标致病菌(Vibrio coralliilyticus) 菌液6.6ml，8000rpm离心3min，吸弃上清，菌体用海水重悬至2.2ml，将重悬菌液加入实验组1、实验组2、阳性对照组的每株珊瑚180μL。
(b3)接种观察
(b31)接种：取15个1L烧杯，每个烧杯放置一株珊瑚，将步骤(b22) 中的菌株和海水按照时间顺序淋加于珊瑚表面，每次淋加菌株后，每株珊瑚在外干露10min，后将其移入烧杯中，再加入500ml珊瑚缸内海水于烧杯中， 24h后将珊瑚从烧杯中放回缸内。
(b32)数据采集：在(b31)实验期间，对珊瑚进行拍照记录，用于后期分析不同条件珊瑚表观特征变化，采用Diving-PAM underwater fluorometer (WALZ,Germany)测定共生虫黄藻叶绿素荧光Fv/Fm值，将研磨珊瑚获得的组织液，以滤纸过滤掉杂质获得滤液进行显微镜计数，计算得到虫黄藻密度，结果如图1-图3所示。
(b4)防治评估
如图1所示，图1中，Tank 1为空白对照组的珊瑚样本，Tank 2为阳性对照组的珊瑚样本，Tank 3为阴性对照组的珊瑚样本。Tank 4为实验组1的珊瑚样本，Tank 5为实验组2的珊瑚样本。由珊瑚表观形态可见，Tank 2组及Tank 4组出现明显白化及组织脱落现象，而仅加有益生菌的Tank 3组、提前5h加有益生菌的Tank 5组都无明显白化及组织脱落现象，仅有部分触手收缩，与空白对照组Tank 1并无差异。这说明从珊瑚表观形态看，提前5h 加入益生菌GXUZ9对目标菌株导致的珊瑚疾病有防治功效。
在图2中，C为空白对照组的珊瑚样本虫黄藻含量，BO为阴性对照组的珊瑚样本虫黄藻含量，V为阳性对照组的珊瑚样本虫黄藻含量，VOS为实验组1的珊瑚样本虫黄藻含量，VOF为实验组2的珊瑚样本虫黄藻含量。由图可知，VOF、C和BO显著高于V与VOS，这说明益生菌GXUZ9本身对珊瑚样本无毒性，且提前5h加入益生菌GXUZ9于珊瑚株上可有效降低目标致病菌株对珊瑚虫黄藻的毒性。
在图3中，C为空白对照组的珊瑚样本Fv/Fm值，BO为阴性对照组的珊瑚样本Fv/Fm值，V为阳性对照组的珊瑚样本Fv/Fm值，VOS为实验组1的珊瑚样本Fv/Fm值，VOF为实验组2的珊瑚样本Fv/Fm值。由图可知，在实验进行至第10天，VOF、C和BO开始显著高于V与VOS，这说明益生菌 GXUZ9本身对光合效率影响不大，且提前5h加入益生菌GXUZ9于珊瑚株上可有效降低目标致病菌株对珊瑚光合效率的影响。
以上结果表明通过加入一定浓度的益生菌(GXUZ9)防治致病菌的方法科学可靠，可以应用于对珊瑚特定疾病的预防，对保护珊瑚礁资源和提高珊瑚人工移植成活率有重大意义，对助力我国珊瑚礁生态系统保护取得长远发展有一定的积极作用。
Claims (8)
1.一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选方法，其特征在于，该筛选方法包括如下步骤：
(a1)样本选择：采集生长状态良好的健康珊瑚，置于养殖池中适应至少15d；
(a2)菌株培养：将待筛选菌株和目标菌株分别接种于液体培养基中，摇床培养，测定菌株的OD600值并制作其生长曲线；
(a3)拮抗实验：将备好的无菌干净的药敏纸片置于待筛选菌株的培养基中，将目标致病菌涂布于MA平板上，再将沾有筛选菌株的药敏纸片置于已涂布有目标致病菌的MA平板上，将平板置于29℃培养箱中培养，定期观察拍照。
(a4)菌株鉴定：当MA平板上药敏纸片周围出现明显抑菌圈时，将对应的筛选的潜在益生菌菌株进行PCR，16srDNA测序，鉴定其种属，选取其中一种作为目标潜在益生菌。
2.根据权利要求1所述的一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，所述目标菌株为致病菌Vibrio coralliilyticus的菌株，该致病菌保藏于海洋微生物菌种保藏管中心，保藏编号为MCCC1A00545。
3.根据权利要求1所述的一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，所述珊瑚为鹿角杯形珊瑚。
4.根据权利要求1所述的一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，步骤(b2)中，若空白组和阴性对照组的珊瑚样本状态优于阳性对照组，且实验组1或实验组2的珊瑚样本状态优于阳性对照组，且检测数据存在显著性差异，表明对珊瑚致病菌防治有效。
5.根据权利要求1所述的一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，所述液体培养基为MA液体培养基。
6.根据权利要求1所述的一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，步骤(b1)中的5组处理，每组处理设有至少3个重复。
7.根据权利要求1所述的一种珊瑚致病菌的潜在益生菌筛选及防治方法，其特征在于，所述的潜在益生菌为GXUZ9。
8.一种珊瑚致病菌的潜在益生菌防治方法，其特征在于，该防治方法包括如下步骤：
(b1)菌株培养：将已筛选的目标潜在益生菌(GXUZ9)与目标致病菌分别加入到MA培养基中，培养至平稳期；
(b2)分组处理：将珊瑚株分为五组，每组三株，处理如下：单独添加有海水，作为空白组，单独添加有致病菌，作为阳性对照组，单独添加有潜在益生菌，作为阴性对照组，同时加致病菌与潜在益生菌作为实验组1，提前五小时加潜在益生菌后加致病菌作为实验组2；
(b3)接种观察：将步骤(b1)的5组的单个珊瑚样本分别进行接种处理，期间测定珊瑚样本上的共生虫黄藻密度及光合效率，并观察记录珊瑚样本表观特征；
(b4)防治评估：以步骤(b2)各珊瑚样本表观特征，共生虫黄藻密度，光合速率判断致病菌作用珊瑚样本前后差异为指标，评估珊瑚样本在致病菌作用前后白化程度，若空白组和阴性对照组的珊瑚样本状态优于阳性对照组，且实验组1或实验组2的珊瑚样本状态优于阳性对照组，则表明潜在益生菌对目标致病菌导致的珊瑚疾病防治有效。
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| CN (1) | CN113425858A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094776A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-18 | 广西大学 | 一种珊瑚致病菌的鉴定与防治方法 |
-
2021
- 2021-04-02 CN CN202110363449.4A patent/CN113425858A/zh active Pending
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| THE DUC NGUYEN等: ""Glycerol Enhances Growth and Antimicrobial Properties of Selected Vibrio Bacteria Associated with the Coral Montipora digitata"", 《RESEARCH JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 * |
| THE DUC NGUYEN等: "Glycerol Enhances Growth and Antimicrobial Properties of Selected Vibrio Bacteria Associated with the Coral Montipora digitata"", 《RESEARCH JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 * |
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| CN112094776A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-18 | 广西大学 | 一种珊瑚致病菌的鉴定与防治方法 |
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