CN113201504A - 一株防治植物黄单胞菌感染的噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株防治植物黄单胞菌感染的噬菌体及其应用，具体公开了一种针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体，其特征在于，其于2020年5月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏编号为CGMCC NO.19975。还公开了所述的噬菌体中制备治疗或预防野油菜黄单胞菌芒果致病型所致病症的药物制剂或保鲜剂中的用途。本发明噬菌体可以防治因野油菜黄单胞菌芒果致病型引起的芒果细菌性黑斑病，可以实现对养殖环境、树木、幼苗及养殖器具的消毒。能够起到预防野油菜黄单胞菌芒果致病型感染芒果植株的作用。

Description

一株防治植物黄单胞菌感染的噬菌体及其应用
技术领域
本发明属于噬菌体领域，具体提供了一株防治植物黄单胞菌感染的噬菌体的分离及其应用。
背景技术
芒果(Mangiferaindica L.)是一种原产印度的漆树科常绿大乔木果树，为著名热 带水果之一，芒果风味独特并富含维生素A、C，被誉为热带水果之王。因其生长的特殊地理环境，高湿高热、台风等自然气象条件，往往造成果树的细菌性感染，引起芒果细菌性黑斑病(Mango bacteria black spot)，该病又称为芒果细菌性角斑病、细菌性溃疡病、芒果枯萎病等。以野油菜黄单胞菌芒果致病型(Xanthomonas campestrispv.mangiferaeindicae)为主要致病菌，细菌侵染芒果叶片、枝条、花芽和果实。染病叶片现针头大小的小黑点，后扩展为凸起的小黑斑，四周有黄晕，病斑呈多角形，后期病斑融合成不规则大黑斑；枝条有溃疡，甚至枝枯；果实染病初果皮上生针头状黑色小点，后扩展为火山口状黑褐色溃疡斑。该致病菌还可以引起腰果、巴西胡椒、加椰芒果、槟榔青等漆树科植物感染，患病果树不仅使果实产量下降，而且患病果实严重影响外观质量，造成经济损失。
芒果细菌性黑斑病全年可发生，雨季是高发季节，尤其是台风暴雨会对芒果树造成多伤口，利于致病菌侵袭植株，高湿度同样是诱发病害的重要因素。当气候条件有利时，芒果产量损失一般为15％～30％，严重可达50％以上。目前芒果细菌性黑斑病分布较广泛，南非、巴西、马拉西亚、印度、巴基斯坦、墨西哥、澳大利亚、日本，以及我国广东、广西、云南、四川、海南、福建、台湾等地均有报道。若病菌得不到有效清除，会残留在果实表面，在贮藏与运输过程中还会引起果实大量腐烂，造成严重的多次经济损失。
国内外目前对该病害的主要防治措施是清洁果园后，喷洒化学农药，单一大量频繁的使用化学农药，已经有报道黄单胞菌属病原菌对链霉素产生了抗性，而且化学农药会对芒果果实的质量安全及环境安全造成危害。也有报道将多种农药复配使用，虽然可提高功效，兼治几种病害，但对复配农药比例要求高，操作过程复杂。生防菌也用来防治芒果细菌性黑斑病的研究，对该病有拮抗作用的生防菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，但与对照农药的防效相比，生防菌的效率较低，仍需大量筛选验证工作。
噬菌体是一类能够专一裂解细菌的病毒，环境中即大量存在，是自然界中的天然杀菌成分，由于噬菌体的天然优势(专一性、高效性、安全性、无残留)，在其被发现并利用于治疗细菌性疾病至今，已有百余年历史，世界各地进行噬菌体研究的科研机构、公司和医院均致力于寻找能够解决细菌性疾病的噬菌体毒株，并取得了很多效果显著的科研成果，开发了多种治疗细菌性疾病的噬菌体产品，并且在医院已经成功治疗了无药可依的病患。
噬菌体能够高效感染宿主菌，且能够在有宿主菌的情况下不断繁殖、不断侵染细菌，裂解作用持久；且噬菌体只能依附于相应的宿主菌生存、繁殖，所以对人、动植物和非宿主微生物没有感染作用，安全无毒害；随着宿主菌的裂解，噬菌体也随之凋亡，对环境没有副作用。
噬菌体发酵液被做成喷雾制剂后，噬菌体颗粒可随雾气到达广泛的空间，附着在果树叶片、枝条和果实表面，既能预防黄单胞菌的侵染，又能作用于植株感病处，杀灭细菌，达到治疗果树细菌性疾病的效果。噬菌体制剂使用简便，只需对母液进行适当稀释即可直接喷洒，且对果树和土壤等环境安全无残留。
在探寻芒果细菌性黑斑病的领域里，目前多数研究是通过将以往应用的化学农药组合复配进行防效试验，也有研究应用生防细菌、颗粒剂，或基因合成的方法来防治细菌性疾病的报道，这些方法所提到的制剂普遍制作工艺复杂，需专业人员研究并配伍使用。
虽然对于黄单胞菌，现有技术中已有采用噬菌体进行防治的报道。但是黄单胞菌中种类很多，例如由水稻黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。而与特殊植株关联的细菌菌株已经比显示出来更加明显的遗传多样性。例如，一个与西红柿和辣椒椒斑点病相关的细菌，野油菜黄单胞菌，之前已经被认为是一个细菌物种，而到2004年后就已经变成了4个不同的物种(Jones et al,2004,Svircev et al.,2005)。由于噬菌体通常受限制与一个物种，所以不同种类的野油菜单胞菌需要提供不同噬菌体菌株(John，1994；Gill and Abedon，2003)。而针对野油菜黄单胞菌芒果致病型目前还未有对应的高效的噬菌体菌株。
此外噬菌体由于其特殊的性质，通常情况下稳定性不高，不能耐高温，并只能在比较小的pH范围内使用。这也限制了噬菌体的使用。
发明内容
针对上述防治芒果细菌性黑斑病的问题，本发明提出一种野油菜黄单胞菌芒果致病型噬菌体的分离方法与应用，该噬菌体能够快速裂解黄单胞菌，发酵制备后可为防治芒果细菌性黑斑病提供一个简单有效的方法，该噬菌体制剂具有开发成生物农药的潜能。
本发明一个方面提供了一种针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体，保藏编号为CGMCC NO.19975。
在本发明的技术方案中，针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体的头部为100-150nm的多面体，其非伸缩尾部长约120-150nm。
在本发明的技术方案中，针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体为肌尾噬菌体科。
本发明另一个方面提供了一种制剂，其包含本发明的噬菌体。
在本发明的技术方案中，所述的制剂为液体制剂。
在本发明的技术方案中，所述的制剂为喷雾剂。
本发明另一个方面提供了所述噬菌体制备治疗或预防野油菜黄单胞菌芒果致病型所致病症的药物制剂或保鲜剂中的用途。
在本发明的技术方案中，针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体所致病症选自芒果细菌性黑斑病。
本发明另一个方面提供了所述噬菌体作为器具或环境的杀菌消毒制剂中的应用；优选为针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的杀菌消毒制剂。
本发明另一个方面提供了所述噬菌体制剂作为水果保鲜剂中的作用，所述水果优选为芒果。
在本发明的技术方案中，噬菌体对野油菜黄单胞菌芒果致病型的应用浓度为1×103PFU/mL-1×108PFU/mL，优选为1×104PFU/mL-1×106PFU/mL。
本发明另一个方面提供了一种治疗芒果黑斑病的方法，其包括在患有芒果黑斑病的植株上喷洒包含本发明所述的噬菌体的制剂的步骤。优选地，该方法中施用噬菌体效价为104pfu/mL以上。
本发明另一个方面提供了一种预防芒果黑斑病的方法，其包括在可能感染芒果黑斑病的植株上喷洒包含本发明所述的噬菌体的制剂的步骤。优选地，该方法中施用噬菌体效价为106pfu/mL以上。
本发明另一个方面提供了一种为芒果保鲜的方法，其包括了在芒果表面喷洒包含本发明所述的噬菌体的制剂的步骤。优选地，该方法中施用噬菌体效价为104pfu/mL以上。
在本发明中，野油菜黄单胞菌芒果致病型噬菌体(Xanthomonasphage)，名称为PP02，保藏编号为CGMCC NO.19975，于2020年5月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心。
分离方法
本发明提供了一株具有高效裂解性的黄单胞菌噬菌体(Xanthomonasphage)，其特征在于，名称为PP02，保藏编号为CGMCC NO.19975，于2020年5月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心。
本发明所述噬菌体分离自芒果种植园的土壤，根据黄单胞菌生长特性优选噬菌体分离方法为，取宿主菌与土壤样品置于TSB培养液中，28℃，170rpm孵育24h。将混合液过滤后用宿主菌以双层平板法进行纯化培养。
预防作用
本发明提供所述黄单胞菌噬菌体在预防野油菜黄单胞菌芒果致病型感染芒果植株的应用方法。
上述噬菌体的应用方法为，在幼果期果树新梢期、芒果落花期、果实如黄豆大小时期施用噬菌体制剂进行预防黑斑病。施用噬菌体效价为104pfu/mL，使用方法为喷雾。
保鲜作用
本发明提供了噬菌体制剂在芒果储存和运输过程中，作为果实保鲜剂的使用方法，优选地，在芒果表面喷雾，施用噬菌体效价为104pfu/mL。且贮藏与运输过程避免阳光直射。噬菌体制剂能够防止芒果被表面携带的残余菌株攻击。
治疗效果
本发明还提供了一种噬菌体制剂作为生物农药的开发方法，其能够治疗由黄单胞菌感染引起的初期芒果细菌性黑斑病(细菌性黑腐病、芒果枯萎病)。
上述噬菌体的应用方法为，在果树发病初期，第1次喷雾后，每间隔2天喷雾一次，共喷4次。施用噬菌体制剂的效价为106pfu/mL。噬菌体对黑斑病的拮抗作用明显，有效抑制果树发病进程，恢复感病叶片的活力，有效阻断病菌的传播，提高芒果产量。
有益效果
本发明提供了一种野油菜黄单胞菌芒果致病型噬菌体，由于噬菌体针对不同致病型的野油菜黄单胞菌具有特异性，本发明提供的噬菌体可以特异性的针对野油菜黄单胞菌芒果致病型，能够防治因野油菜黄单胞菌芒果致病型引起的芒果细菌性黑斑病，可以实现对养殖环境、树木、幼苗及养殖器具的消毒。能够起到预防野油菜黄单胞菌芒果致病型感染芒果植株的作用。
本发明的野油菜黄单胞菌芒果致病型噬菌体，在芒果储存和运输过程中作为果实保鲜剂的用途，本发明噬菌体无毒副作用，安全性高，同时可以防止芒果被表面携带的残余菌株攻击的作用。
本发明的野油菜黄单胞菌芒果致病型噬菌体能够治疗由黄单胞菌感染引起的芒果细菌性黑斑病(细菌性黑腐病、芒果枯萎病)，或者能够控制芒果细菌性黑斑病的发展。
本发明的噬菌体裂解率高，pH和温度耐受性好，杀灭野油菜黄单胞菌芒果致病型。
所述噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液或消毒液。
附图说明
图1为噬菌体PP02在双层培养基平板上裂解宿主菌的噬菌斑图；
图2为本发明的噬菌体PP02的电子显微镜观察结果；
图3为噬菌体PP02体外裂解野油菜黄单胞菌的效果图；
图4为噬菌体PP02的热稳定性检测结果；
图5为噬菌体PP02的pH稳定性检测结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一噬菌体的分离纯化方法
(一)复苏和增殖宿主菌
挑取宿主菌-80℃冻存菌液在TSB平板上复苏，以三区划线分离单菌落的方式，于28℃恒温箱中培养48h。挑取单菌落，接种于5mL TSB培养液中，28℃，170rpm振荡培养24h，得到单一的新鲜的菌悬液。
(二)分离与纯化噬菌体
噬菌体提取样品来自于芒果种植园土壤，取土壤样品20g加入100mL TSB培养液中，混匀后先以11000rpm离心5min，再用0.22μm滤器过滤。将新鲜培养的宿主菌按照1％的体积比加入滤液中，混合均匀后，于28℃的空气振荡器中，170rpm振荡培养24h，11000rpm离心5min，用0.22μm的细菌滤器过滤除菌，得到含有噬菌体的滤液。
将等体积的滤液与宿主菌混合，于室温孵育10min后倒TSA双层平板，待培养基凝固后放入28℃的恒温箱中倒置培养，18h后观察结果。在培养基上形成圆形透明、规则的空斑，即为噬菌斑，噬菌斑形态见图1。
纯化噬菌体时用无菌镊子抠取单个噬菌斑，于1mL TSB培养液中，在28℃的空气振荡器中孵育30min，11000rpm离心5min，取上清与等体积宿主菌混合，再用上述双层平板法得到单个的噬菌斑。再抠取单个噬菌斑如此重复3～5次直至得到大小、形态一致的噬菌斑。
将分离得到的噬菌体命名为PP02。噬菌体PP02保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年5月15日，保藏编号为CGMCC NO.19975。
实施例二噬菌体生物学特性研究
(一)噬菌体在透射电镜下的形态观察
噬菌体效价应大于1×109PFU/mL，取20μL噬菌体样品滴于微孔铜网上，静止15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μL的2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后在透射电镜下观察。噬菌体的形态见图2。
观察噬菌体结果为：PP02确定为肌尾噬菌体科，头部为直径120nm左右的多面体，其非伸缩尾部长约140nm。
(二)噬菌体生物学特性的检测
1、噬菌体的增殖和效价测定
抠取纯化好的噬菌斑，于1.5mL装有灭菌TSB培养液的离心管中，在28℃空气振荡器中，170rpm振荡浸出30min，11000rpm离心5min。取100μl宿主菌和200μl噬菌体抠斑浸出液加入到5mL TSB培养液中，于28℃的空气振荡器中，170rpm培养12h左右，直至混合液变澄清，且有明显细菌碎片，即得到清澈的噬菌体增殖液，噬菌体增殖液与正常增殖的菌液对照对比状态见图3。
10倍倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。计数时，统计30～300个噬菌斑的平板，取平板数，计算效价。
取稀释度为10-7的3个平行样计数，结果分别为：97、103、99个噬菌斑，计算效价为9.97×109PFU/mL。
2、噬菌体PP02的裂解谱检测
选取53株分别为来自四川、广西、广东、海南、云南省的野油菜黄单胞菌芒果致病型菌株，采用双平板滴定法检测PP02的裂解谱。各取100μl菌液制备TSA双层平板，再取1μl的噬菌体增殖液滴于平板上，待自然干燥后置于28℃的恒温箱中倒置培养18h左右，观察PP02对各株菌的裂解情况。
裂解谱结果显示，PP02能够裂解其中的43株野油菜黄单胞菌芒果致病型，裂解率高达81.13％84.3％，对各株菌拮抗作用见表1。说明该噬菌体宿主谱较宽，有潜力裂解更多的芒果细菌性黑斑病病原菌，能够在植株和果实的培育及运输过程起到预防和保护的作用。
表1噬菌体对黄单胞菌的拮抗作用信息表
Figure BDA0002944729950000061
Figure BDA0002944729950000071
3、噬菌体对温度敏感性检测
将噬菌体PP02增殖液分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。双层平板法测定噬菌体的效价。
结果见图4，由图可知，噬菌体PP02的初始效价为9.97×109PFU/mL，在40℃和50℃条件下保存1h后基本保持原活性，且3h后效价仍可维持在109PFU/mL以上；60℃作用20min后仍保持在2.84×108PFU/mL，1h后效价为1.95×107PFU/mL；但在70℃与80℃的高温作用下，20min噬菌体效价快速降低。因此，噬菌体PP02的热稳定性较好，可适应正常的环境温度。
4、噬菌体对pH的稳定性检测
取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的TSB肉汤4.5mL，各三支，置于28℃的水浴锅中预热，待温度稳定之后，各加入500μl噬菌体，混匀后28℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，立即双层平板法测定噬菌体的效价。
结果见图5，噬菌体初始效价为9.97×109PFU/mL，在pH4～9范围内噬菌体PP02效价几乎没变或略有降低，仍然在109PFU/mL以上；当pH为3处理1h，仍有部分活性，当pH为10处理3h时，噬菌体PP02的效价下降不到1个数量级，可见该噬菌体能够适应的pH范围较宽，能够在极端pH条件下存活，对产品开发过程有更大的pH弹性空间。
5、噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定
按照上述方法增殖噬菌体PP02和宿主菌，测定噬菌体及宿主菌效价，并将噬菌体PP02和宿主菌进行适当的稀释。按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例各取100μl PP02和宿主菌加入到TSB肉汤中。于28℃，170rpm振荡培养至液体变澄清，记录液体变澄清时间。11000rpm离心5min，双层平板法测定噬菌体的效价，结果如表2。
表2噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定结果
Figure BDA0002944729950000081
结果可见噬菌体的最佳感染复数是0.01，噬菌体PP02在该条件下增殖的效价为1.58×1010PFU/mL，在6个感染复数中噬菌体滴度最高。
实施例三黄单胞菌噬菌体在预防野油菜黄单胞菌感染芒果植株的应用
田间试验供试芒果品种为台芒。首先配制PP02噬菌体制剂，调整其效价为1×104pfu/mL，使用方法为喷雾。每隔2天施药一次，共施药3次，以无菌水作为阴性对照，以波尔多液为阳性对照。施药后每组随机选取20片叶片，每片叶片打孔接种1×105CFU/mL黄单胞菌5个点，20天后计数20片叶子上的病斑个数。具体噬菌体防治芒果树感染黄单胞菌的预防试验结果如表3。
表3噬菌体预防黄单胞菌感染的试验结果
分组 病斑数
噬菌体 7
波尔多液 11
无菌水 96
接种致病菌前施用噬菌体，能够有效减少植株叶片上的病斑数，略优于传统植物抗菌剂。
实施例四噬菌体制剂在芒果储存和运输过程中的使用
筛选同一批大小均匀的芒果，随机分为2组，每组100个果实，试验组以喷雾的形式在果实表面均匀施用1×104PFU/mL噬菌体制剂，对照组以无菌水喷雾，晾干后装箱，同条件下贮存15天，统计各组果实表面出现黑斑的数目，按照黑板数目给果实分级，分级标准见表4，两组不同级别的果实数目见表5。
表4芒果根据黑斑数目分级标准
级别 黑斑数目
1 0
2 1～2
3 3～5
4 6～8
5 9个及以上
表5试验中不同级别的芒果占比
级别 噬菌体组 对照组
1 83％ 59％
2 11％ 24％
3 5％ 7％
4 1％ 6％
5 0 4％
经噬菌体处理后，1级果实比对照组多24％，6个黑斑以上的的果实少9％，且噬菌体处理组没有5级果实。试验组果实的整体级别较对照组高，果实质量更好，说明噬菌体对芒果表面附着的黄单胞菌有一定的杀菌作用，其作为保鲜剂处理芒果后有利于延长贮存期。
实施例五噬菌体治疗由野油菜黄单胞菌感染引起的芒果细菌性黑斑病
每组随机选取20片叶片，每片叶片打孔接种1×105CFU/mL黄单胞菌5个点，待叶片空洞周围出现黑色病灶时，配制效价为1×106PFU/mL PP02噬菌体制剂，喷雾治疗。首次施药后间隔2天施药一次，共施药4次，以无菌水作为阴性对照，以波尔多液为阳性对照。20天后计数20片叶子上的病斑个数，具体叶片病斑计数结果如表6。
表6噬菌体治疗黄单胞菌感染的试验结果
分组 病斑数
噬菌体 14
波尔多液 35
无菌水 137
噬菌体制剂能够有效控制野油菜黄单胞菌芒果致病型的感染蔓延，从而达到治疗的效果；噬菌体制剂治疗作用优于波尔多液，可开发用于治疗又野油菜黄单胞菌引起的芒果黑斑病。

Claims (10)

1.一种针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体，其特征在于，其于2020年5月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏编号为CGMCC NO.19975。
2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的噬菌体的头部为100-150nm的多面体，其非伸缩尾部长约120-150nm。
3.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为肌尾噬菌体科噬菌体。
4.一种制剂，其特征在于，其包含权利要求1-3任一项所述的噬菌体；
优选地，所述制剂为液体制剂；
更优选地，所述制剂为喷雾剂。
5.权利要求1-3任一项所述的噬菌体中制备治疗或预防野油菜黄单胞菌芒果致病型所致病症的药物制剂或保鲜剂中的用途。
6.权利要求1-3任一项所述的噬菌体作为器具或环境的杀菌消毒制剂中的应用；
所述杀菌消毒制剂优选为针对野油菜黄单胞菌芒果致病型的杀菌消毒制剂。
7.权利要求1-3任一项所述的噬菌体在作为水果保鲜剂中的作用，
所述水果保鲜剂优选为芒果保鲜剂。
8.一种治疗芒果黑斑病的方法，其特征在于，其包括在患有芒果黑斑病的植株上喷洒包含权利要求1-3任一项所述的噬菌体的制剂的步骤；
优选地，该方法中施用噬菌体效价为104pfu/mL以上。
9.一种预防芒果黑斑病的方法，其特征在于，其包括在可能感染芒果黑斑病的植株上喷洒包含权利要求1-3任一项所述的噬菌体的制剂的步骤；
优选地，该方法中施用噬菌体效价为106pfu/mL以上。
10.一种为芒果保鲜的方法，其特征在于，其包括了在芒果表面喷洒包含权利要求1-3任一项所述的噬菌体的制剂的步骤；
优选地，该方法中施用噬菌体效价为104pfu/mL以上。
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