KR20230008623A

KR20230008623A - 잎응애를 방제하는 단백질 bvp10 및 그 응용

Info

Publication number: KR20230008623A
Application number: KR1020220082800A
Authority: KR
Inventors: 시아오얀 리우; 링 첸; 용 민; 롱화 조우; 벤 라오; 얀 공; 이민 치우; 레이 주; 시안칭 리아오; 웨이 첸; 지강 카오; 리치아오 쉬; 징종 양
Original assignee: 후베이 바이오페스티사이드 엔지니어링 리서치 센터
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2022-07-05
Publication date: 2023-01-16
Also published as: US11839219B2; EP4115736B1; BR102022013219A2; US20230019438A1; JP2023008859A; CN113444152A; JP7263601B2; CN113444152B; EP4115736A1

Abstract

본 발명은 농업 미생물학 기술 분야에 관한 것이며, 구체적으로 잎응애를 방제하는 단백질 BVP10 및 그 응용에 관한 것이며, 상기 단백질은 서열번호 2에 표시된 바와 같다. BVP10 단백질의 점박이응애에 대한 50% 치사농도는 19.07 μg/mL이고, 귤응애에 대한 50% 치사농도는 58.05 μg/mL이며, 점박이응애붙이에 대한 50% 치사농도는 36.08 μg/mL이고, 딸기응애에 대한 방제효과는 79.53%~95.45%이며, 상기 단백질은 신규한 잎응애 퇴치제의 제조를 위해 새로운 선택성을 제공한다.

Description

잎응애를 방제하는 단백질 BVP10 및 그 응용{BVP10 PROTEIN FOR CONTROLLING TETRANYCHID MITES AND USE THEREOF}

본 발명은 농업 미생물학 기술 분야에 관한 것이며, 구체적으로 잎응애를 방제하는 단백질 BVP10 및 그 응용에 관한 것이다.

잎응애는 붉은 거미, 거미 진드기(spider mite)로도 불리며, 진드기아강(Acarina), 응애과(Tetranychidae)의 식물 기생성 응애류에 속한다. 실내 식물 및 중요한 농업 식물(과수 포함)의 잎과 과일을 먹고 산다. 잎응애의 일생은 알, 유충, 전약충, 후약충 및 성충인 5개의 단계를 거치며, 알에서 성충이 되기까지 약 3주간의 시간이 필요하다. 잎응애는 생활 주기가 짧고 번식이 빠르며, 일반적으로 수일 내지 십여 일 동안 한 세대를 완성하며, 1년에 수 세대 내지 십여 세대를 완성할 수 있어, 작물에 매우 심각한 피해를 가져다준다. 성충은 체장(體長)이 약 0.5 mm이며, 체색(體色)이 붉은색, 녹색 또는 갈색을 띠며, 식물 상에서 느슨한 그물을 친다. 식물이 심각하게 손상되면 잎은 완전히 떨어지고 잎이 심하게 얇아지며 흰색으로 변한다. 잎응애는 바람, 흐르는 물, 곤충, 새와 짐승 및 농기구를 통해 전파되거나, 묘목의 운송과 함께 확산될 수 있다. 잎응애의 여러 종류는 실을 토해내는 습관이 있으며, 영양이 악화될 경우 토해낸 실이 낙하하여 바람에 따라 흔들릴 수 있다.

잎응애아과는 모든 고등 식물을 해친다. 흔히 보이는 것은 Tetranychus속, Panonychus속, Eotetranychus속, Oligonychus속 및 Schizotetranychus속이 있다. 그 중, 귤응애(귤 붉은 거미) (Panoneychus citri)는 세계의 감귤 생산 지역에 광범위하게 분포되어 있으며, 감귤 생산의 중요한 해충응애이다. 점박이응애(Two-spotted spider mite; Tetranychus urticae koch)는 야채, 대두, 땅콩, 옥수수, 수수, 사과, 배, 복숭아, 살구, 자두, 체리, 포도, 목화, 콩 및 다양한 작물과 거의 100가지 종류의 잡초를 해친다. 측백응애(Oliginychus perditus)는 측백나무를 해치며 중국과 일본에 분포되어 있다. 가뭄이 든 해에는 측백나무가 피해를 심하게 입어 수관이 황색을 띠며, 침옆이 떨어진다. 벼응애(Schizotetranychus yo-shimekii Ehara et Wongsiri)는 중국 남서부 지역과 태국에 분포되어 있으며 벼에 심각한 피해를 준다. 피해를 입은 벼는 이삭이 짧고 알갱이가 작아 일반적으로 수확량이 약 10% 정도 감소되고, 심할 경우 30% 이상까지 감소되기도 한다.

잎응애의 방제 방법은 주로 농업 방제, 생물학적 방제 및 화학적 방제로 나뉜다. 농업 방제에는 겨울에 과수원을 정리하고, 병든 잎을 제거하고 이들을 집중적으로 태워 해충 응애의 월동 개수를 감소시키며, 액체 비료 관리를 강화시켜 과수원의 미기후를 개선하는 것 등이 포함된다. 생물학적 방제는 천적, 생물학적 잎응애 퇴치제 등의 친환경적이고 안전한 수단을 이용하여 예방 및 관리를 강화하는 것을 포함한다. 화학적 방제는 주로 화학적 잎응애 퇴치제 등의 약제를 사용하여 방제를 진행한다. 최근 잎응애 퇴치제의 업그레이드가 부족하여, 잎응애 퇴치제를 대량으로 반복적으로 사용하게 되어, 해충 응애의 저항성 발달이 가속화되고, 점점 더 심각한 응애 피해가 발생하여, 재배자들에게 막대한 경제적 손실을 초래하고 있다.

현재 국제적으로 개발된 잎응애 퇴치제 대부분은 물에 용해되기 어려운 화학물질 또는 고분자 항생제이며, 저분자 단백질에 대한 보고는 거의 없으므로, 이러한 배경을 기초로 잎응애를 방제하는 단백질 제제를 개발하여 잎응애의 생물 방제 분야에 사용할 필요가 있으며, 이는 생산에서 중요한 실용적 의미를 가진다.

본 발명은 서열번호 2에 표시된 잎응애를 방제하는 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 잎응애를 방제하는 단백질의 잎응애 퇴치제의 제조에서의 응용을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

서열번호 2에 표시된 잎응애를 방제하는 단백질을 제공하며, 서열번호 2에 표시된 단백질을 인코딩하는 유전자도 본 발명의 보호 범위에 속하며, 바람직한 유전자는 서열번호 1에 표시된 바와 같다.

상기 단백질의 당업계에서 통상적인 방식의 사용, 예를 들어 원핵생물, 진핵생물 발현 또는 직접 합성은 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.

잎응애를 방제하는 단백질의 잎응애 퇴치제의 제조에서의 응용은, 서열번호 2에 표시된 단백질의 유전자를 유효성분 중의 하나, 또는 유일한 유효성분으로 사용하여, 잎응애 퇴치제를 제조하는 것을 포함한다.

상기와 같은 응용에서, 상기 잎응애는 점박이응애, 귤응애, 점박이응애붙이 또는 딸기응애인 것이 바람직하다.

본 발명은 잎응애를 방제하는 신규한 단백질 및 그 잎응애 퇴치 활성에 대해 처음으로 공개하였으며, 신규한 잎응애 퇴치제를 제조하는데 새로운 선택성을 제공한다. 본 발명에서 제공한 BVP10 단백질로 제조한 잎응애 퇴치제는 효율이 높고 독성이 낮으며 친환경적인 장점들을 가진다.

도 1은 BVP10 단백질을 정제한 후의 SDS-PAGE 전기영동 분석도이다.

하기의 실시예에서의 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 보고된 미생물학의 통상적인 조작 방법이다. 상기 시약 또는 재료는 달리 명시되지 않는 한 당업계의 통상적인 방안이다.

본 발명에 관한 BVP 단백질은 당업계의 통상적인 방식, 예를 들어 원핵생물 발현, 통상적인 합성 등의 방식을 이용하여 얻을 수 있다. 본 발명은 BVP 단백질의 원핵생물 발현시키는 것을 예로 하고, 그의 잎응애 억제 기능에 대해 설명하며, 기타 방식으로 얻은 상기 단백질도 동일한 기능을 수행할 수 있다.

실시예 1:

잎응애 퇴치용 BVP10 단백질의 획득:

1) 서열번호 1에 표시된 서열(서열번호 2에 표시된 단백질을 인코딩함)에 따라, BVP10 단백질 유전자 조각(생공 생물 공정(상해)Co., Ltd.(生工生物工程（上海）股

有限公司))을 인공적으로 합성시키고, 대장균 발현 벡터 pet28a 플라스미드 상에 연결하여 재조합 발현 플라스미드 pet28a-BVP10을 조성하였다.

2) 대장균 BL21에서 잎응애 퇴치용 BVP10 단백질의 발현 및 정제

상기 코딩 서열을 가진 재조합 발현 플라스미드 pet28a-BVP10을 대장균 BL21에 형질전환시켜, 재조합 박테리아 BL21/pet28a-BVP10을 수득하였다. 상기 재조합 박테리아를 5 mL의 LB 액체 배지에 접종시키고, 37℃ 진탕기(shaker)에 넣고 0.6의 OD600까지 배양한 후, 유도를 위해 1.0 mmol/L의 이소프로필-B-D티오갈락토시드(즉 IPTG, Sigma사로부터 구입함)를 첨가하여 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 상술한 50 mL의 재조합 박테리아 BL21/pet28a-BVP10의 3시간 유도된 배양액을 12,000 rpm으로 30초 동안 원심분리시켜 세포를 수집하고, 초음파(기술 파라미터: 300 W, 파쇄 30초, 간격 30초)를 이용하여 세포를 파쇄한 후, 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리를 하고 상등액을 취한 후, 구멍 크기가 0.4 μm인 필터로 여과하여 불순물을 제거하고, GST 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피로 각 단백질을 정제시켰다. 최종 정제 산물은 SDS-PAGE 전기영동에 의해 검출되었고, 그 결과는 도 1에서 도시된 바와 같이, 정제된 단백질을 단백질 분자량 표준과 비교하였고, 추정된 분자량은 10 kDa이었으며, 이는 예상된 BVP10 단백질 분자량인 10.07 kDa에 기본적으로 일치되므로, 본 발명의 BVP10 단백질이 대장균 BL21에서 성공적으로 발현되었음을 증명하였다.

실시예 2:

BVP10 단백질의 잎응애 퇴치제의 제조에서의 응용

1) BVP10 단백질의 점박이응애( Tetranycus urticae )에 대한 퇴치

FAO(국제연합식량농업기구)에서 권장하는 해충응애를 측정하는 표준 방법인 슬라이드-침지 방법(Slide-dip method)을 참조한다. 양면 테이프를 2-3cm 길이로 잘라서 현미경 슬라이드의 한쪽 끝에 부착하고, 핀셋으로 테이프 상의 종이 조각을 뜯어내고, 0호 붓으로 크기가 같고 체색이 선명하며 움직임이 활발한 암컷 성충을 선별하고, 그 뒷면은 양면 테이프로 부착시키고(주의점: 응애의 발, 수염 및 입 부분은 부착하지 말것), 시트마다 4줄, 줄마다 10마리를 부착한다. 온도가 25℃이고, 상대 습도가 약 85%인 생화학 배양기에 4시간 동안 넣고, 쌍안 현미경으로 관찰하여 사망하거나 움직임이 활발하지 않은 개체를 제외시킨다. 사전 테스트를 근거로 하여, 약물을 물로 5-7개의 농도로 희석시키고, 잎응애가 있는 슬라이드 글라스의 한쪽 끝을 약물 용액에 넣고 5초 동안 살살 흔든 후 꺼내고, 흡수지로 신속하게 잎응애 몸 및 그 주위의 남은 약물 용액을 흡수하여 말린다. 상술한 생화학 배양기에 넣고, 24시간 후에 쌍안 현미경으로 결과를 검사한다. 붓으로 잎응애 몸을 살짝 터치하여, 발을 움직이지 않는 잎은애는 사망한 것으로 간주하였다. 매 농도마다 3번 반복하고, 맑은 물에 침지하는 것을 대조군으로 하였다. 상기 실험 절차에 따라, BVP10 단백질 현탁액의 점박이응애에 대한 생물 검정 결과는 하기의 표 1에 나타낸 바와 같이 19.07 μg/mL이다. LC₅₀값은 SPASS 19.0 데이터 처리 소프터웨어를 이용하여 계산하였다.

점박이응애에 대한 BVP10 단백질의 잎응애 퇴치 활성

조제량 (μg/mL)	사망율 (%)	조제량 로그	확률 단위 (P+5)	회귀방정식	50% 치사 농도 (LC₅₀, μg/mL)
389.5	68.4	2.591	5.483	Y=4.5286+0.3682X（r=0.8832）	19.07
77.9	55.9	1.892	5.148
38.95	60.6	1.591	5.268
19.475	47.2	1.289	4.927

2) BVP10 단백질의 귤응애( Panonychus citri )에 대한 퇴치

FAO(국제연합식량농업기구)에서 권장하는 해충응애를 측정하는 표준 방법인 슬라이드-침지 방법(Slide-dip method)을 참조한다. 양면 테이프를 2-3cm 길이로 잘라서 현미경 슬라이드의 한쪽 끝에 부착하고, 핀셋으로 테이프 상의 종이 조각을 뜯어내고, 0호 붓으로 크기가 같고 체색이 선명하며 움직임이 활발한 암컷 성충을 선별하고, 그 뒷면은 양면 테이프로 부착시키고(주의점: 응애의 발, 수염 및 입 부분은 부착하지 말것), 시트마다 4줄, 줄마다 10마리를 부착한다. 온도가 25℃이고, 상대 습도가 약 85%인 생화학 배양기에 4시간 동안 넣고, 쌍안 현미경으로 관찰하여 사망하거나 움직임이 활발하지 않은 개체를 제외시킨다. 사전 테스트를 근거로 하여, 약물을 물로 5-7개의 농도로 희석시키고, 잎응애가 있는 슬라이드 글라스의 한쪽 끝을 약물 용액에 넣고 5초 동안 살살 흔든 후 꺼내고, 흡수지로 신속하게 잎응애 몸 및 그 주위의 남은 약물 용액을 흡수하여 말린다. 상술한 생화학 배양기에 넣고, 24시간 후에 쌍안 현미경으로 결과를 검사한다. 붓으로 잎응애 몸을 살짝 터치하여, 발을 움직이지 않는 잎응애는 사망한 것으로 간주하였다. 매 농도마다 3번 반복하고, 맑은 물에 침지하는 것을 대조군으로 하였다. 상기 실험 절차에 따라, BVP10 단백질 현탁액의 귤응애에 대한 생물 검정 결과는 하기의 표 2에 나타낸 바와 같이 58.05 μg/mL이다. LC₅₀ 값은 SPASS 19.0 데이터 처리 소프터웨어를 이용하여 계산하였다.

귤응애에 대한 BVP10 단백질의 잎응애 퇴치 활성

조제량 (μg/mL)	사망율 (%)	조제량 로그	확률 단위 (P+5)	회귀방정식	50% 치사 농도 (LC₅₀, μg/mL)
389.5	78.6	2.591	5.793	Y=3.0472+1.1072X（r=0.9548）	58.05
77.9	63.6	1.892	5.349
38.95	47.1	1.591	4.922
19.475	23.5	1.289	4.276

3) BVP10 단백질의 점박이응애붙이( Tetranychus cinnabarinus )에 대한 퇴치

상기 실험 절차에 따라, BVP10 단백질 현탁액의 점박이응애붙이에 대한 생물 검정 결과는 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이 36.08 μg/mL이다. LC₅₀ 값은 SPASS 19.0 데이터 처리 소프터웨어를 이용하여 계산하였다.

점박이응애붙이에 대한 BVP10 단백질의 잎응애 퇴치 활성

조제량 (μg/mL)	사망율 (%)	조제량 로그	확률 단위 (P+5)	회귀방정식	50% 치사 농도 (LC₅₀, μg/mL)
389.5	94.7	2.591	6.616	Y=2.3766+1.6846X（r=0.9797）	36.08
77.9	80.0	1.892	5.840
38.95	51.4	1.591	5.039
19.475	27.8	1.289	4.413

실시예 3:

밭에서 딸기응애( Tetranychus cinnabarinus )에 대한 BVP10 단백질의 방제에서의 응용

테스트 시약: 20% 아바멕틴.스피로디클로펜 현탁제 (하북흥백농업과학기술유한회사, 사용할 때 다시 3000배 희석); 생물학적 잎응애 퇴치제 BVP10 유효 단백질 농도는 389.5 μg/mL임.

시험은 총 3번의 처리를 진행하였고 각 처리는 3번 반복하였으며, 랜덤 구역으로 배열되었고, 각 구획에서 3그루에 약물을 살포하였으며 주변에는 보호 라인을 설치하였다. 저녁(맑은 날)에 약물을 분무하고, 3WBS-16형 압력 제어식 수동 분무기로 잎에 분무하였으며, 잎의 앞면 및 뒷면에 모두 균일하게 분사하여 잎이 충분히 약물과 접촉하게 하였고, 액체 약물이 떨어지지 않을 정도가 적당하다. 각 구획에서 0그루의 딸기 식물을 채취하고, 각 식물마다 하나의 잎을 표시하여, 총 10개의 잎의 앞면 및 뒷면에서 잎응애 개수를 조사하였고, 휴대용 돋보기로 직접 관찰하여 살아있는 모든 잎응애 개수를 기록하였다. 약물 투여 전 조사 기준수에서 약물 투여 후의 1일, 4일 및 7일에 총 3번의 조사를 진행하였다.

약물 효과 계산 방법: 약물 투여 전의 잎응애 기준수와 약물 투여 후 각 일자의 잎응애 생존 개수에 따라 방제 효과를 계산하며, 계산식은 아래와 같다. 데이터는 DPS 소프터웨어 던컨의 새로운 다중 범위 테스트(Duncan's new multiple range test)를 사용하여 유의성 분석을 진행하였다.

여러 가지 잎응애 퇴치제로 딸기응애를 방제하는 딸기밭에서의 약물 효과 결과는 표 4와 같다.

여러 가지 잎응애 퇴치제의 딸기응애를 방제하는 약물 효능 결과

처리	약물 투여전 잎응애 기준수	약물 투여후 1일			약물 투여후 4일			약물 투여후 7일
처리	약물 투여전 잎응애 기준수	잎응애 잔여 개수	잎응애 감소율 （%）	방제효과 （%）	잎응애 잔여 개수	잎응애 감소율 （%）	방제효과 （%）	잎응애 잔여 개수	잎응애 감소율 （%）	방제효과 （%）
BVP10 단백질 현탁액	350	206	41.14	79.53	234	33.14	83.71	80	77.14	95.45
20% 아바멕틴.스피로디클로펜 액상수화제 희색 3000배	57	33	42.11	79.86	70	-22.81	70.08	194	-240.35	32.21
맑은 물을 대조군으로한다	48	138	-187.50	-	197	-310.42	-	241	-402.08	-

Claims

서열번호 2에 표시된 단백질을 포함하는 잎응애 퇴치용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 잎응애는 점박이응애, 귤응애, 점박이응애붙이 또는 딸기응애인 것인, 잎응애 퇴치용 조성물.