BR102022013219A2

BR102022013219A2 - Uso da proteína bvp10 para o controle de ácaros tetraniquídeos

Info

Publication number: BR102022013219A2
Application number: BR102022013219-4A
Authority: BR
Inventors: Xiaoyan Liu; Ling Chen; Yong Min; Ronghua Zhou; Ben RAO; Yan Gong; Yimin QIU; Lei Zhu; Xianqing Liao; Wei Chen; Zhigang Cao; Liqiao SHI; Jingzhong YANG
Original assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2023-01-17
Also published as: US20230019438A1; JP7263601B2; US11839219B2; JP2023008859A; EP4115736B1; KR102663880B1; CN113444152A; KR20230008623A; EP4115736A1; CN113444152B

Abstract

A invenção pertence ao campo técnico da microbiologia agrícola, e, em particular, refere-se a uma proteína BVP10 mostrada em SEQ ID NO.2 para o controle de ácaros tetraniquídeos, e seu uso. A proteína BVP10 tem uma concentração letal mediana de 19,07 μg/mL contra Tetranychus urticae, uma concentração letal mediana de 58,05 μg/mL contra Panonychus citri, uma concentração letal mediana de 36,08 μg/mL contra Tetranychus cinnabarinus, e um efeito de controle de 79,53%-95,45% contra ácaros aranha vermelha de morango. A proteína fornece uma nova opção para preparar um novo pesticida de ácaro.

Description

USO DA PROTEÍNA BVP10 PARA O CONTROLE DE ÁCAROS TETRANIQUÍDEOS

Campo da Invenção

[0001] A invenção pertence ao campo técnico da microbiologia agrícola, e, em particular, diz respeito a uma proteína BVP10 para o controle de ácaros tetraniquídeos, e seu uso.

Descrição do Estado da Técnica

[0002] Os ácaros tetraniquídeos, também conhecidos como ácaros aranha vermelha ou ácaros aranha, são ácaros que se alimentam de plantas da família Tetranychidae da subclasse Acarina. Eles comem folhas e frutos de plantas de interior e importantes plantas agrícolas (incluindo árvores frutíferas). Os ácaros tetraniquídeos passam por uma vida dividida em 5 estágios, incluindo ovos, larvas, ninfas precoces, ninfas tardias e adultos. Leva cerca de três semanas para eles crescerem dos ovos para os adultos. Eles têm um ciclo de vida curto e se reproduzem rapidamente, com o curso de uma geração concluída dentro de vários dias a dez dias e os cursos de várias gerações a dez gerações concluídos dentro de um ano. Isso muitas vezes causa danos extremamente graves às culturas. Os ácaros adultos são vermelhos, verdes ou marrons com um comprimento de aproximadamente 0,5 mm, e tecem teias soltas nas plantas. Quando as plantas são seriamente danificadas, as folhas se tornam severamente finas e esbranquiçadas e até caem completamente. Os ácaros tetraniquídeos podem ser espalhados por meio do vento, água corrente, insetos, aves e implementos agrícolas, ou com o transporte de mudas. Muitas espécies dos ácaros tetraniquídeos têm o hábito de fiar. No caso da deterioração nutricional, eles são capazes de se pendurar através de fiar para serem transportados junto com o vento.

[0003] Os ácaros da subfamília Tetranychidae infestam todas as plantas mais altas. Os gêneros mais comuns incluem Tetranychus, Panonychus, Eotetranychus, Oligonychus e Schiizotetranychus. Entre eles, Panonychus citri são amplamente distribuídos em áreas de produção cítrica em todo o mundo, e são grandes ácaros que afetam a produção cítrica. Eles infestam mudas cítricas e árvores, e as folhas afetadas exibem manchas esbranquiçadas. O Tetranychus urticae trazem danos a vegetais, soja, amendoim, milho, sorgos, maçãs, peras, pêssegos, damascos, ameixas, cerejas, uvas, algodões, feijões e uma variedade de outras culturas e quase uma centena de espécies de ervas. O Oligonychus perditus infesta árvores ciprestes e são distribuídos na China e no Japão. Em anos de seca, as árvores ciprestes são danificadas severamente, com coroas amareladas e folhas de agulha caindo. O Schizotetranychus yoshimekii, que são distribuídos no sudoeste da China e Tailândia, infestam severamente o arroz ao alimentar-se das folhas para transformar todas as folhas verdes em verde-acinzentadas para esbranquiçadas. As plantas de arroz afetadas têm orelhas curtas e grãos pequenos, com o rendimento reduzido em aproximadamente 10%, ou até mais de 30% em casos graves.

[0004] Os métodos de controle dos ácaros tetraniquídeos incluem principalmente controle agrícola, controle biológico e controle químico. O controle agrícola inclui: limpar pomares no inverno, e remover e queimar intensamente folhas doentes para reduzir o número de ácaros que vivem durante o inverno; e reforçar o manejo de fertilizantes e água para melhorar o microclima dos pomares, etc. O controle biológico inclui: controlar os ácaros usando meios ecologicamente corretos e seguros, como seus inimigos naturais e pesticidas biológicos. O controle químico é usado principalmente para controlar os ácaros através do uso de produtos químicos, como pesticidas químicos. Nos últimos anos, devido á ausência de variedades substitutas aos pesticidas de ácaros, os pesticidas de ácaros têm sido usados de forma pesada e repetida, o que acelerou a geração de resistência em pragas de ácaros, resultando em danos cada vez mais graves. Isso causa grandes perdas econômicas aos produtores.

[0005] Atualmente, a maioria dos pesticidas de ácaros desenvolvidos no mundo são substâncias químicas ou antibióticos macromoleculares, que são insolúveis em água, e substâncias proteináceas micromoleculares têm sido menos relatadas. Portanto, considerando o estado da arte acima, é necessário desenvolver um agente proteináceo para o controle dos ácaros tetraniquídeos para uso no campo do controle biológico dos ácaros tetraniquídeos, que é de importante importância na produção e na prática.

Descrição Resumida da Invenção

[0006] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína mostrada em SEQ ID NO.2 para o controle de ácaros tetraniquídeos.

[0007] Outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso da proteína para o controle de ácaros tetraniquídeos na preparação de um pesticida de ácaro tetraniquídeo.

[0008] Para alcançar os objetos acima, uma solução técnica utilizada na presente invenção é a que segue.

[0009] Uma proteína para controlar ácaros tetraniquídeos é mostrada em SEQ ID NO.2; e um gene codificando a proteína mostrada em SEQ ID NO.2 também está dentro do escopo de proteção da presente invenção. De preferência, o gene é mostrado em SEQ ID NO.1.

[0010] A proteína acima preparada por métodos convencionais, como expressão procariótica, expressão eucariótica ou síntese direta, no estado da arte também se enquadra no escopo de proteção da presente invenção.

[0011] O uso da proteína para controlar os ácaros tetraniquídeos na preparação de um pesticida de ácaros tetraniquídeos inclui a preparação do pesticida de ácaro tetraniquídeo tomando a proteína mostrada em SEQ ID NO.2 como um ingrediente eficaz, ou como um ingrediente efetivo único.

[0012] Durante o uso acima, de preferência, os ácaros tetraniquídeos são Tetranychus urticae, Panonychus citri, Tetranychus cinnabarinus, ou ácaros aranha vermelha de morango.

[0013] Em comparação com o estado da arte anterior, a presente invenção tem as seguintes características.

[0014] A presente invenção relata uma nova proteína para controlar ácaros tetraniquídeos e sua atividade acaricida pela primeira vez, o que fornece uma nova opção para a preparação de um novo pesticida de ácaro. O pesticida de ácaro preparado a partir da proteína BVP10 de acordo com a presente invenção tem as vantagens de alta eficiência, baixa toxicidade e preservação ambiental.

Breve Descrição das Várias Versões dos Desenhos

[0015] A Figura 1 é um gráfico de análise de eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) de uma proteína BVP10 purificada.

Descrição Detalhada da Invenção

[0016] Os métodos experimentais nas realizações abaixo são todos métodos convencionais de operação microbiológica que já foram relatados, a menos que especificados de outra forma. Reagentes ou materiais mencionados são todos soluções convencionais do estado da arte, salvo especificação em contrário.

[0017] A proteína BVP mencionada na presente invenção pode ser preparada por métodos convencionais, como expressão procariótica e síntese comercial, no estado da arte. A invenção ilustra o efeito de supressão de ácaros de uma proteína BVP expressa procarioticamente, por exemplo. A proteína derivada por outros meios também pode alcançar o mesmo efeito.

[0018] Realização 1:

[0019] Preparação da proteína acaricida BVP10:

1) Com base na sequência (codificação da proteína mostrada em SEQ ID NO.2) mostrada em SEQ ID NO.1, os fragmentos genéticos de proteínas BVP10 (de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) foram artificialmente sintetizados, e depois ligados a um vetor de expressão do plasmídeo pet28a para Escherichia coli para construir uma expressão dos recombinantes pet28a-BVP10 recombinantes.
2) Expressão e purificação da proteína acaricida BVP em Escherichia coli B21

[0020] A expressão dos plasmídeos pet28a-BVP10 recombinantes acima carregando uma sequência de codificação foram transformadas em Escherichia coii BL21 para preparar bactérias recombinantes BL21/pet28a-BVP10. As bactérias recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio líquido Luria-Bertani (LB) e cultivadas em uma incubadora com agitação orbital (incubadora shaker) a 37°C até que OD600 fosse 0,6. 1,0 mmol/L isopropil-B-D-tiogalactosida (IPTG, Sigma) foi adicionado para o cultivo induzido por 3h a 30°C. 50 mL de uma cultura induzida de 3 horas da bactéria recombinante acima mencionada BL21/pet28a-BVP10 foi centrifugada a 12.000 rpm por 30 s para coletar células bacterianas. As células bacterianas foram desmembradas por ondas ultrassônicas (parâmetros técnicos: 300 W; 30 s; e um intervalo de 30 s), e depois centrifugadas a 12.000 por 15 minutos para obter sobrenadante, que foi filtrado com uma membrana filtrante tendo um tamanho de poros de 0,4 μm para remover impurezas. Várias proteínas foram purificadas pela cromatografia de afinidade para proteínas de fusão GST. Um produto purificado final foi detectado pela SDS-PAGE, com os resultados mostrados na Figura 1. As proteínas purificadas foram comparadas com um marcador de peso molecular proteico para derivar um peso molecular estimado de 10 kDa, que estava basicamente em linha com o peso molecular de 10,07 kDa como previsto para a proteína BVP10. Isso demonstrou a expressão bem sucedida da proteína BVP10 de acordo com a invenção em Escherichia coli BL21.

[0021] Realização 2:

[0022] Uso da proteína BVP10 na preparação de pesticida de ácaro tetraniquídeo:

1) Proteína BVP10 para matar Tetranychus urticae:

[0023] Referindo-se ao método padrão para determinar pragas de ácaros, ou seja, o método de corrediça mergulho (dipslide), recomendado pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO), uma fita adesiva de dupla face foi cortada em pedaços de 2-3 cm de comprimento e presa a uma extremidade de uma corrediça de microscópio, e o papel na fita adesiva foi removido com pinças. Ácaros adultos do sexo feminino com tamanhos semelhantes, cor do corpo brilhante e alta vitalidade foram colhidos com uma caneta pincel chinesa n° 0, e ficaram presos à fita adesiva de dupla face (nota: os pés, bigodes e partes bucais dos ácaros não devem ser presos) em suas costas, com 4 linhas presas a cada peça e 10 ácaros em cada linha. Os ácaros foram colocados e deixados em uma incubadora bioquímica por 4h com temperatura de 25°C e umidade relativa de aproximadamente 85%, e depois foram observados com binóculos. Indivíduos mortos ou inativos foram eliminados. O agente foi diluído 5-7 vezes com base de água em um teste preliminar. Uma extremidade da corrediça com os ácaros foi mergulhada na solução agente, sacudida levemente por 5 s, e depois retirada. Os ácaros, bem como a solução excessiva de agentes ao redor, foram rapidamente secos com papel absorvente. A corrediça foi colocada e deixada na incubadora bioquímica acima. Após 24h, os resultados foram verificados com os binóculos. Os corpos dos ácaros foram levemente tocados com a caneta pincel chinesa, e aqueles sem qualquer movimento de seus pés foram considerados mortos. O teste foi repetido três vezes em cada concentração, e os ácaros mergulhados em água doce foram tomados como controle. Seguindo os passos experimentais acima, o resultado do bioensaio resultante de uma suspensão proteica BVP10 contra Tetranychus urticae foi mostrado na Tabela 1 abaixo, que foi de 19,07 μg/mL. Um valor de CL50 foi calculado através da utilização do software de processamento de dados SPASS 19.0.

2) Proteína BVP10 para matar Panonychus citri.

[0024] Referindo-se ao método padrão para determinar pragas de ácaros, ou seja, o método de corrediça mergulho (dipslide), recomendado pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO), uma fita adesiva de duas caras foi cortada em pedaços de 2-3 cm de comprimento e presa a uma extremidade de uma corrediça de microscópio, e o papel na fita adesiva foi removido com pinças. Ácaros adultos do sexo feminino com tamanhos semelhantes, cor do corpo brilhante e alta vitalidade foram colhidos com uma caneta pincel chinesa n° 0, e ficaram presos à fita adesiva de dupla face (nota: os pés, bigodes e partes bucais dos ácaros não devem ser presos) em suas costas, com 4 linhas presas a cada peça e 10 ácaros em cada linha. Os ácaros foram colocados e deixados em uma incubadora bioquímica com temperatura de 25°C e umidade relativa de aproximadamente 85% por 4h, e depois foram observados com binóculos. Indivíduos mortos ou inativos foram eliminados. O agente foi diluído 5-7 vezes com base de água em um teste preliminar. Uma extremidade da corrediça com os ácaros foi mergulhada na solução do agente, sacudida levemente por 5 s e depois retirada. Os ácaros, bem como a solução excessiva de agentes ao redor, foram rapidamente secos com papel absorvente. A corrediça foi colocada e deixada na incubadora bioquímica acima. Após 24h, os resultados foram verificados com os binóculos. Os corpos dos ácaros foram levemente tocados com a caneta pincel chinesa, e aqueles sem qualquer movimento de seus pés foram considerados mortos. O teste foi repetido três vezes em cada concentração, e os ácaros mergulhados em água doce foram tomados como controle. Seguindo os passos experimentais acima, o resultado do bioensaio de uma suspensão de proteína BVP10 contra Panonychus citri foi mostrado na Tabela 2 abaixo, que foi de 58,05 μg/mL. Um valor de CL50 foi calculado através da utilização do software de processamento de dados SPASS 19.0.

3) Proteína BVP10 para matar Tetranychus cinnabarinus

[0025] Seguindo os passos experimentais acima, o resultado do bioensaio de uma suspensão da proteína BVP10 contra Tetranychus cinnabarinus foi mostrado na Tabela 3 abaixo, que foi de 36,08 μg/mL. Um valor de CL50 foi calculado através da utilização do software de processamento de dados SPASS 19.0.

[0026] Realização 3:

[0027] Uso da proteína BVP10 no controle de campo de ácaros aranha vermelha de morango:

[0028] Agentes de teste: suspensão de 20% de avermectina spirodiclofeno (Hebei Xingbai Agricultural Technology Co., Ltd.), diluída 3000 vezes durante o uso; e ο pesticida de ácaro biológico BVP10 com a concentração proteica efetiva de 389,5 μg/mL.

[0029] O teste incluiu três tratamentos, cada um repetido três vezes; blocos foram aleatoriamente permutados; e os agentes foram aplicados em 3 plantas em cada bloco, com linhas de proteção fornecidas ao redor das plantas. Os agentes foram pulverizados uniformemente para ambos os lados das folhas ao anoitecer (em dias ensolarados) com um pulverizador manual 3WBS-16 controlável por pressão, de modo que as folhas estavam em pleno contato com os agentes, que não pingavam, preferencialmente. Dez plantas de morango foram retiradas de cada bloco, com uma folha rotulada para cada planta. O número de ácaros aranha vermelha em ambos os lados de cada uma das dez folhas foram inspecionados. Os ácaros aranha vermelha foram diretamente observados com uma lente de lupa portátil, e o número de todos os ácaros vivos foi retirado. O número populacional inicial dos ácaros aranha vermelha foi investigado antes da aplicação, e um total de três investigações foram realizadas nos dias 1, dia 4 e 7, respectivamente, após a aplicação.

[0030] Método de cálculo do efeito pesticida: o efeito de controle foi calculado com base no número populacional inicial dos ácaros aranha vermelha antes da aplicação e no número de ácaros aranha vermelha vivos em cada dia após a aplicação, e a fórmula de cálculo foi mostrada abaixo: Os dados foram analisados para significância usando o novo método de alcance múltiplo de Duncan do software DPS.

[0031] Os resultados dos efeitos de controle de campo de vários pesticidas de ácaros contra os ácaros aranha vermelha de morango foram mostrados na Tabela 3.

Claims

Uso da proteína consistindo na SEQ ID NO.2 , caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um pesticida de ácaro tetraniquídeo para controle de ácaros tetraniquídos.
Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ácaros tetraniquídeos são Tetranychus urticae, Panonychus citri, Tetranychus cinnabarinus, ou ácaros aranha vermelha de morango.