JP5271706B2 - 遺伝子産物の産生量を制御する方法及び産生量制御剤 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞内における遺伝子産物の産生量を制御する方法、特に産生量を増大させる方法及び産生量制御剤に関する。
従来、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA interference）と呼ばれる、二本鎖のＲＮＡで標的となるｍＲＮＡを切断して転写を抑制する方法が知られているが、通常、ＲＮＡｉは２０塩基対程度の塩基長であり（特許文献１：特開２００５−１３２２４号公報）、その二本鎖オリゴヌクレオチド及びそのアンチセンスＲＮＡのスクリーニング方法が開示されている。また、小核酸分子、例えば短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、インターロイキン遺伝子、インターロイキンスーパーファミリー遺伝子、または遺伝子発現及び／または活性のインターロイキン経路に関与する遺伝子の発現及び活性を調節するのに有用な化合物に関して開示されている（特許文献２：特開２００５−５２４３９３号公報）。
細胞内にアンチセンスＲＮＡが存在すると、それと相補的なｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳が阻害されるために遺伝子の発現を阻害することができる。人為的にアンチセンスＲＮＡを細胞内に導入すれば、ターゲット遺伝子の発現を阻害することができるので、現在、遺伝子の機能を解明する技術として使われており、医薬品への応用も検討されている。しかし、細胞内におけるＲＮＡの存在態様については不明な点も多く、ｍＲＮＡからタンパク質への転写過程をターゲットとしたその発現制御に関しては不明な点が多かった。
本発明は、細胞内における遺伝子産物の産生量を制御する方法、特に産生量を増大させる方法及び産生量制御剤を提供する。
本発明者らは、細胞内において、ｍＲＮＡに相補的な配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（アンチセンス転写物（アンチセンストランスクリプト）、通常はＤＮＡのアンチセンス鎖の転写物と考えられるが、その由来は問わない。）が存在し、それが従来のアンチセンスＲＮＡとは異なり、ｍＲＮＡの安定化に寄与しているケースがあることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の遺伝子産物の産生量を制御する方法、その方法が適用可能な遺伝子産物をスクリーニングする方法及び産生量制御剤に関する。
１．細胞内における遺伝子産物の産生量を増大させる方法であって、前記遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質を細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする前記遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
２．前記遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質が、細胞内においてｍＲＮＡの安定化に寄与する物質である前記１に記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
３．前記遺伝子産物がサイトカインまたはその前駆体である前記１または２に記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
４．前記遺伝子産物が誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）である前記１〜３のいずれかに記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
５．遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が細胞内に存在するか否かを判定する工程を含む前記１に記載の産生量増大方法が適用され得る遺伝子産物のスクリーニング方法。
６．前記アンチセンス転写物の存在の判定が、前記遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの５’末端及び３’末端またはこれらの近傍の一部のセンス配列を含むプライマーを用いて細胞内ｍＲＮＡから逆転写を行ない、逆転写産物の有無を確認することにより行なわれる前記５に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
７．アンチセンス転写物に含まれる塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を細胞内に導入し、前記遺伝子産物の産生量の増減を観察する工程をさらに含む前記５または６に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
８．サイトカインｍＲＮＡの全部または一部の配列と相補的な配列を含み、前記サイトカインの合成量を増大させる物質。
９．前記８に記載の物質を含むサイトカイン産生量制御剤。
１０．誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）ｍＲＮＡの全部または一部の配列と相補的な配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させる物質。
１１．配列番号１またはこれと７５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させる物質。
１２．誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）ｍＲＮＡの５’末端及び３’末端またはこれらの近傍の一部の配列を含むプライマーを用いて、細胞内ｍＲＮＡから逆転写により誘導されたｃＤＮＡから得られる配列に対応する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させるＲＮＡ。
１３．前記１０〜１２のいずれかに記載の物質を含むｉＮＯＳｍＲＮＡ発現制御剤。
１．細胞内における遺伝子産物の産生量を増大させる方法であって、前記遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質を細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする前記遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
２．前記遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質が、細胞内においてｍＲＮＡの安定化に寄与する物質である前記１に記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
３．前記遺伝子産物がサイトカインまたはその前駆体である前記１または２に記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
４．前記遺伝子産物が誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）である前記１〜３のいずれかに記載の遺伝子産物の産生量を増大させる方法。
５．遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が細胞内に存在するか否かを判定する工程を含む前記１に記載の産生量増大方法が適用され得る遺伝子産物のスクリーニング方法。
６．前記アンチセンス転写物の存在の判定が、前記遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの５’末端及び３’末端またはこれらの近傍の一部のセンス配列を含むプライマーを用いて細胞内ｍＲＮＡから逆転写を行ない、逆転写産物の有無を確認することにより行なわれる前記５に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
７．アンチセンス転写物に含まれる塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を細胞内に導入し、前記遺伝子産物の産生量の増減を観察する工程をさらに含む前記５または６に記載の遺伝子産物のスクリーニング方法。
８．サイトカインｍＲＮＡの全部または一部の配列と相補的な配列を含み、前記サイトカインの合成量を増大させる物質。
９．前記８に記載の物質を含むサイトカイン産生量制御剤。
１０．誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）ｍＲＮＡの全部または一部の配列と相補的な配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させる物質。
１１．配列番号１またはこれと７５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させる物質。
１２．誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）ｍＲＮＡの５’末端及び３’末端またはこれらの近傍の一部の配列を含むプライマーを用いて、細胞内ｍＲＮＡから逆転写により誘導されたｃＤＮＡから得られる配列に対応する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させるＲＮＡ。
１３．前記１０〜１２のいずれかに記載の物質を含むｉＮＯＳｍＲＮＡ発現制御剤。
本発明に従い、遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質を用いれば、対応する遺伝子産物の産生を制御することができ、幅広い分野での応用、例えば、がんや自己免疫疾患、炎症性疾患を含む疾病の治療及び予防に有用である。
本発明では、特定の遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質を用いて前記遺伝子産物の産生量を増大させる。
すなわち、従来のアンチセンスＲＮＡによる発現量制御方法では、例えば、アンチセンスＲＮＡがセンスＲＮＡとハイブリダイズすることにより、その翻訳を抑制する過程が含まれると考えられるが、本発明では、アンチセンス転写物と同一または類似する物質がセンス鎖による遺伝子産物の産生量を増大させる。その詳細な機構は不明であるが、例えば、アンチセンス転写物が、細胞内においてセンスｍＲＮＡの安定化に寄与すると考えられ、従来のアンチセンスＲＮＡによる発現量制御方法とは作用機序が全く異なる。なお、ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質は、通常は当該ｍＲＮＡの塩基配列に対して３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の塩基長を有すればよい。典型的にはＲＮＡ鎖であるが、部分的な修飾を受けていてもよいし他の物質（例えば、タンパク質や糖、低分子等）と結合していてもよい。前駆体は導入する細胞内または投与する生物体内での代謝により前記物質に転じるものであればよい。
ある遺伝子産物について本発明の方法が有効であるかを判定するには、初めに、細胞内において当該遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物が存在するか否かを判定する。アンチセンス転写物の存在の判定は、遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの５’末端及び３’末端またはこれらの近傍の一部のセンス配列を含むプライマーを用いて細胞内の全ＲＮＡから逆転写を行ない、逆転写産物（ｃＤＮＡ）の有無を確認することにより行なわれる。ｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲ法によりそのｃＤＮＡを増幅し、例えば、ＲＡＣＥ法により全構造を決定してもよい。
アンチセンス転写物の存在が確認された場合は、ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る物質（以下、これらを「本発明物質」という。）を細胞内に導入するか、アンチセンス転写物に含まれる塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド（以下、これらをセンスオリゴという。）またはその誘導体を細胞内に導入し、前記遺伝子産物の産生量の増減を観察する。本発明物質を投与して遺伝子産物（本来の遺伝子産物）の発現量が増大するのであれば、従来のアンチセンスＲＮＡとは反対に正の制御が可能である。また、センスオリゴはアンチセンス転写物と反応（ハイブリダイズ）することにより、細胞内におけるアンチセンス転写物の有効量を低減させると考えられるので、センスオリゴの投与により遺伝子産物（本来の遺伝子産物）の発現量が減少するのであれば、アンチセンス転写物は正の発現量制御に関与していると考えられる。
なお、本願において「正の発現量制御」という場合、アンチセンス転写物により発現量が増大する場合のみならず、アンチセンス転写物の投与がなければ発現量が減少するであろう場合における発現量の維持も含む。
上述のように、(1)対象とする遺伝子産物について、細胞内においてそのアンチセンス転写物が存在し、(2)アンチセンス転写物が遺伝子産物（本来の遺伝子産物）の発現量制御（特に正の制御）に寄与する限り、本発明の方法は有効である。従って、適用可能な遺伝子産物は、上記(1)及び(2)の方法により容易にスクリーニングできる。近年、こうしたアンチセンス転写物がかなり多くの種類存在することが明らかにされていることから（Science 309: 1564-1566 (2005)参照）、本発明物質としては様々なものが挙げられる。例えば、遺伝子産物がサイトカイン、炎症との関連が深いシクロオキシゲナーゼ２（cyclo-oxygenase 2；COX-2）、ケモカイン（chemokine）、ＣＩＮＣ−１（cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1）、ＮＦ−κＢ ｐ５０、ＩκＢ−α等、特に誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）またはその前駆体である場合に有用である。また、遺伝子産物が由来する種は問わない。
本発明における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ；inducible nitric oxide synthase）ｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるアンチセンス転写物は、ｉＮＯＳｍＲＮＡのセンス鎖プライマー（ｍＲＮＡだけにハイブリダイズする（ストランド（鎖）特異的な）プライマーを含む）を用いて逆転写を行って相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から得られる配列に対応する塩基配列を含む。
ｉＮＯＳのｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなる本発明物質は、配列番号１で表わされる塩基配列と同一又は実質的に同一な塩基配列を含むヌクレオチドである。実質的に同一なヌクレオチドは、配列番号１またはこれと７５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の合成量を増大させる物質である。
ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を含む物質もしくはその前駆体またはそれらと同等の作用を細胞内において有し得る本発明物質は、化学合成、公知の発現法及び精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
また、本発明は、これらのアンチセンス転写物等を含むサイトカイン産生量制御剤、特にｉＮＯＳ産生量制御剤にも及ぶ。
また、本発明は、これらのアンチセンス転写物等を含むサイトカイン産生量制御剤、特にｉＮＯＳ産生量制御剤にも及ぶ。
上記の、ｉＮＯＳｍＲＮＡのアンチセンス転写物に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチド（センスオリゴ）とは、アンチセンス転写物とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、核内の核酸分解酵素で分解されないように修飾されているものであればよい。
センスオリゴ設計は、Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003)及びJ. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)に開示されたプログラム「ｍｆｏｌｄ」（http://www.bioinfo.rpi.edu/~zukerm/rna/参照）を使用してＲＮＡの２次構造を予測して行うことができる。センスオリゴの候補配列は、熱力学的に安定でない部分（たとえばステム・ループ（stem-loop）構造のｓｔｅｍ部分以外の領域）、好ましくはステム・ループ構造のループ（loop）構造を含む部分に対するセンスオリゴヌクレオチドを設計する。
上記のセンスオリゴの候補配列について、細胞に配列非特異的な反応を起こす５’−ＣＧ−３’、５’−ＧＧＧＧ−３’、及び５’−ＧＧＧＧＧ−３’等の配列を含まない配列を選び、ラットゲノムで相同性検索を行ない、類似の配列が存在しないことを確認して好ましい配列を選択する（J. Neurochem. 86, 374382 (2003)参照）。
センスオリゴとしては、以下に示されるオリゴヌクレオチド等が挙げられる（下記の配列は修飾を省略して示す。）。
５’−ＧＣＣＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３６）
５’−ＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３７）
５’−ＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３８）
これらは、化学合成、公知の発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
５’−ＧＣＣＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３６）
５’−ＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡＧＡＴ−３’（配列番号３７）
５’−ＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３８）
これらは、化学合成、公知の発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。
センスオリゴは、核内の核酸分解酵素で分解されないように修飾されていればよく、その修飾に特に制限はない。センスオリゴヌクレオチドは細胞内では、５’または３’末端から順にヌクレオチドをはずしていく酵素エキソヌクレアーゼ（exonuclease）により、両端から消化されることから、例えば、両端から１つ以上のリン酸結合Ｐ＝ＯをＰ＝Ｓに置換した、分解酵素に安定なPhosphorothioate（フォスフォロチオエート）型に修飾するのが好ましい（以下、これを「Ｓ化センスオリゴヌクレオチド（Ｓ化センスオリゴ）」という。）（J. Neurochem. 86 , 374-382 (2003)参照）。ただし、すべてのリン酸結合をＳ化すると光学異性が生じ、ハイブリダイゼーションの面から不利になる。
Ｓ化センスオリゴヌクレオチド（Ｓ化センスオリゴ）の具体例としては、
５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ−３’
５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
５’−Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ−３’
（配列中、＊はＳ化した部分を示す。）等が挙げられる。
５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ−３’
５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
５’−Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ−３’
（配列中、＊はＳ化した部分を示す。）等が挙げられる。
他の修飾法としては、ＰＮＡ（peptide nucleic acids）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acids）、ＥＮＡ（2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids；シグマアルドリッチ社）、モルホリノ（Morpholino）オリゴ（Gene Tools社, OR, USA）等が挙げられる。
センスオリゴは、ｉＮＯＳｍＲＮＡのアンチセンス転写物の存在が確認された細胞内に導入することにより、アンチセンス転写物と反応（ハイブリダイズ）して、細胞内におけるアンチセンス転写物の有効量を低減させると考えられるので、センスオリゴの投与により本来の遺伝子産物（ｉＮＯＳ）の発現量を減少させ、ＮＯの過剰産生を抑制することができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
（１）ｉＮＯＳｍＲＮＡに相補的な配列であるアンチセンス転写物の配列と領域（塩基長）の決定方法
実施例１：ラットｉＮＯＳアンチセンス転写物
以下の方法により、ラットｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べ、この「アンチセンス転写物」がセンス遺伝子産物の産生の制御にどのように関わっているかを調べた。なお、ラットｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）によって既知である。
実施例１：ラットｉＮＯＳアンチセンス転写物
以下の方法により、ラットｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べ、この「アンチセンス転写物」がセンス遺伝子産物の産生の制御にどのように関わっているかを調べた。なお、ラットｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）によって既知である。
サイトカインや急性期タンパク質など、誘導的発現の起こる遺伝子のｍＲＮＡの３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）には、AU-rich element（ＡＲＥ）と呼ばれる配列、すなわち５’−ＡＵＵＵＡ−３’または５’−ＡＵＵＵＵＡ−３’という配列が存在している（Proc Natl Acad Sci USA 83: 1670-1674 (1986)参照）。ＡＲＥはヒト、ラット及びマウスのｉＮＯＳｍＲＮＡの３'ＵＴＲにも存在しているので、このＡＲＥを含む３'ＵＴＲに対応する（配列が相補的な）アンチセンス転写物が存在するかどうかを、鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。本法はオリゴｄＴプライマーのように、ｍＲＮＡだけにハイブリダイズする（ストランド（鎖）特異的な）プライマーを使って逆転写を行って相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した後、ＰＣＲ法を行ってｃＤＮＡを増幅し、ｍＲＮＡの量を測定する方法である。
すなわち、以下に示すｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２）
を用い、培地にＩＬ−１βを添加してｉＮＯＳ ｍＲＮＡを誘導したラット初代培養肝細胞の全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行ないｃＤＮＡを合成した。
５’−ＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２）
を用い、培地にＩＬ−１βを添加してｉＮＯＳ ｍＲＮＡを誘導したラット初代培養肝細胞の全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行ないｃＤＮＡを合成した。
ラット初代培養肝細胞から調製したＲＮＡ（１μｇ）と２ｐｍｏｌのプライマーを混ぜてから、７０℃、１０分間加熱後、０℃に急冷した。これにReverTra Ace反応バッファー（東洋紡）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）（最終濃度１ｍＭになるように）、20 units RNase inhibitor（東洋紡）、及び200 units ReverTra Ace逆転写酵素（東洋紡）を加え、全量を２５μｌとした。４７℃で６０分間保温して逆転写した後、７０℃、１５分間加温して逆転写酵素を失活させた。次に、5 unitsのTth RNase H（東洋紡）を加えて、３７℃、２０分間加温して鋳型ＲＮＡを分解した。合成したｃＤＮＡはエタノール沈澱を行なって回収し、２０μｌのＴＥバッファーで溶解した。
このようにして得られたｃＤＮＡ ２μｌに、ＰＣＲ反応バッファー（ニッポンジーン社）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ；ニッポンジーン社）（最終濃度１２５μＭになるように）、下記２種類のプライマー、順方向（Forward）プライマー４０ｐｍｏｌ、逆方向（Reverse）プライマー４０ｐｍｏｌ、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（ニッポンジーン社）、及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）#を加えて、全量を４０μｌとしてさらにＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）
逆方向：
５’−ＣＴＴＧＡＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡ−３’（配列番号４）
順方向：
５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）
逆方向：
５’−ＣＴＴＧＡＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡ−３’（配列番号４）
ＰＣＲの温度プロトコールには公知の方法、すなわちステップダウン法（Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri Y, Watanabe K, and Ito S. Close kinship of human 20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes. Genes Cells (2000) 5, 111-125）参照）に従って行った。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、１８６塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。
このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットｉＮＯＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲの配列に相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、アンチセンス転写物の存在を証明した。
このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットｉＮＯＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲの配列に相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、アンチセンス転写物の存在を証明した。
さらにｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物の全構造を調べるために、ＲＡＣＥ法（Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218: 340-356参照）による解析を試みた。ＲＡＣＥ法は既知のｃＤＮＡ配列から鎖特異的なプライマーを作製して逆転写を行い、５'側及び３'側のｃＤＮＡの配列を決定する方法である。
［５’側のｃＤＮＡの配列決定］
ラット初代培養肝細胞にＩＬ−１βを添加して、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡを誘導し、Trizol試薬（インビトロジェン）でＲＮＡを調製した。このＲＮＡを鋳型とし、配列番号２のプライマー（ｉＮＯＳのセンス（forward）プライマー；５'-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-３'）を使って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＣＡカセットアダプター（cDNA PCR Library Kit（タカラバイオ(株)）に添付）を連結した後、配列番号３のプライマー（ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するセンス（forward）プライマー）とＣＡプライマー（cDNA PCR Library Kit（タカラバイオ(株)）に添付）を使ってＰＣＲを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約２５０ｂｐのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクター（プロメガ）にクローニングして、塩基配列を決定した。
［３’側のｃＤＮＡの配列決定］
上記と同様に、ＩＬ−１βで誘導したラット初代培養肝細胞からＲＮＡを調製した。PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ)を使って、ＰｏｌｙＡ−画分のＲＮＡを精製し、このＲＮＡを鋳型とし、アンカー配列(下線部)を付けたランダムプライマー（アンカーランダムプライマー；５'-TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-３'（配列番号５））を使って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＣＡカセットアダプターを連結した後、配列番号４のプライマー（ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するアンチセンス（reverse）プライマー）とＣＡプライマーを使ってＰＣＲを行なった。この反応液を精製して鋳型とし、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するアンチセンス（reverse）プライマー（５'-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-３'（配列番号６））とアンカープライマー（上記の「アンカーランダムプライマー」のアンカー配列に対するプライマー；５'-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-３'（配列番号７））を使って２次ＰＣＲを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、２００〜５００ｂｐのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。
この結果、アンチセンス転写物の全長はほぼ６００塩基以上と推定された。以下にその配列を示した（配列番号１；但し、ｃＤＮＡ配列として示す。）。すなわち、アンチセンス転写物はｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３'ＵＴＲに対応し、転写開始点（５'側）はｉＮＯＳ ｍＲＮＡのポリＡ付加部位の相補鎖にあった。
［５’側のｃＤＮＡの配列決定］
ラット初代培養肝細胞にＩＬ−１βを添加して、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡを誘導し、Trizol試薬（インビトロジェン）でＲＮＡを調製した。このＲＮＡを鋳型とし、配列番号２のプライマー（ｉＮＯＳのセンス（forward）プライマー；５'-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-３'）を使って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＣＡカセットアダプター（cDNA PCR Library Kit（タカラバイオ(株)）に添付）を連結した後、配列番号３のプライマー（ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するセンス（forward）プライマー）とＣＡプライマー（cDNA PCR Library Kit（タカラバイオ(株)）に添付）を使ってＰＣＲを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約２５０ｂｐのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクター（プロメガ）にクローニングして、塩基配列を決定した。
［３’側のｃＤＮＡの配列決定］
上記と同様に、ＩＬ−１βで誘導したラット初代培養肝細胞からＲＮＡを調製した。PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ)を使って、ＰｏｌｙＡ−画分のＲＮＡを精製し、このＲＮＡを鋳型とし、アンカー配列(下線部)を付けたランダムプライマー（アンカーランダムプライマー；５'-TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-３'（配列番号５））を使って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＣＡカセットアダプターを連結した後、配列番号４のプライマー（ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するアンチセンス（reverse）プライマー）とＣＡプライマーを使ってＰＣＲを行なった。この反応液を精製して鋳型とし、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに対するアンチセンス（reverse）プライマー（５'-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-３'（配列番号６））とアンカープライマー（上記の「アンカーランダムプライマー」のアンカー配列に対するプライマー；５'-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-３'（配列番号７））を使って２次ＰＣＲを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、２００〜５００ｂｐのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。
この結果、アンチセンス転写物の全長はほぼ６００塩基以上と推定された。以下にその配列を示した（配列番号１；但し、ｃＤＮＡ配列として示す。）。すなわち、アンチセンス転写物はｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３'ＵＴＲに対応し、転写開始点（５'側）はｉＮＯＳ ｍＲＮＡのポリＡ付加部位の相補鎖にあった。
実施例２：ヒトｉＮＯＳアンチセンス転写物
以下の方法により、ヒトｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、ヒトｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）により既知である。
以下の方法により、ヒトｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、ヒトｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）により既知である。
ヒトの組織（胎盤、肝臓、胃粘膜）または細胞（刺激していないリンパ球）から、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すヒトｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号８）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。具体的には、実施例１において、ラット初代培養肝細胞から調製したＲＮＡ１μｇと配列番号２で表わされるプライマー２ｐｍｏｌの代わりに、ヒトの組織または細胞から調製した全ＲＮＡ（１μｇ）と上記配列番号８で表わされる（２ｐｍｏｌ）を用いた他は、同様の方法でｃＤＮＡを合成した。
５’−ＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号８）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。具体的には、実施例１において、ラット初代培養肝細胞から調製したＲＮＡ１μｇと配列番号２で表わされるプライマー２ｐｍｏｌの代わりに、ヒトの組織または細胞から調製した全ＲＮＡ（１μｇ）と上記配列番号８で表わされる（２ｐｍｏｌ）を用いた他は、同様の方法でｃＤＮＡを合成した。
このようにして得られたｃＤＮＡ ２μｌに、ＰＣＲ反応バッファー（ニッポンジーン社）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ；ニッポンジーン社）（最終濃度１２５μＭになるように）、下記２種類のプライマー、順方向（Forward）プライマー４０ｐｍｏｌ、逆方向（Reverse）プライマー４０ｐｍｏｌ、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（ニッポンジーン社）、及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）#を加えて、全量を４０μｌとしてさらにＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＡＴＣＧＣＡＣＣＡＣＴ−３’（配列番号９）
逆方向：
５’−ＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１０）
順方向：
５’−ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＡＴＣＧＣＡＣＣＡＣＴ−３’（配列番号９）
逆方向：
５’−ＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲの方法は実施例１と同様の方法で行った。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡを用いたときに１５１塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。その他のｃＤＮＡ（肝臓、胃粘膜または刺激していないリンパ球）では増幅が見られなかった。
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ヒトｉＮＯＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒトｉＮＯＳアンチセンス転写物の存在を証明した。ヒトｉＮＯＳアンチセンス転写物の配列を配列番号１１に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ヒトｉＮＯＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒトｉＮＯＳアンチセンス転写物の存在を証明した。ヒトｉＮＯＳアンチセンス転写物の配列を配列番号１１に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
実施例３：マウスｉＮＯＳアンチセンス転写物
以下の方法により、マウスｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、マウスｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）により既知である。
以下の方法により、マウスｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。なお、マウスｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）により既知である。
ＲＡＷ２６４細胞から、から、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すマウスｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１２）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。具体的には、実施例１において、ラット初代培養肝細胞から調製したＲＮＡ１μｇと配列番号２で表わされるプライマー２ｐｍｏｌの替わりに、ＲＡＷ２６４細胞から調製した全ＲＮＡ（１μｇ）と配列番号１２で表わされる（２ｐｍｏｌ）を用いた他は、同様の方法でｃＤＮＡを合成した。
５’−ＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１２）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。具体的には、実施例１において、ラット初代培養肝細胞から調製したＲＮＡ１μｇと配列番号２で表わされるプライマー２ｐｍｏｌの替わりに、ＲＡＷ２６４細胞から調製した全ＲＮＡ（１μｇ）と配列番号１２で表わされる（２ｐｍｏｌ）を用いた他は、同様の方法でｃＤＮＡを合成した。
このようにして得られたｃＤＮＡ ２μｌに、ＰＣＲ反応バッファー（ニッポンジーン社）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ；ニッポンジーン社）（最終濃度１２５μＭになるように）、下記２種類のプライマー、順方向（Forward）プライマー４０ｐｍｏｌ、逆方向（Reverse）プライマー４０ｐｍｏｌ、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（ニッポンジーン社）、及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）#を加えて、全量を４０μｌとしてさらにＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号１３）
逆方向：
５’−ＡＴＡＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１４）
順方向：
５’−ＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号１３）
逆方向：
５’−ＡＴＡＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲの方法は実施例１と同様の方法で行った。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、１２７塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、マウスｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、マウスｉＮＯＳアンチセンス転写物の存在を証明した。マウスｉＮＯＳアンチセンス転写物の配列を配列番号１５に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、マウスｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、マウスｉＮＯＳアンチセンス転写物の存在を証明した。マウスｉＮＯＳアンチセンス転写物の配列を配列番号１５に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
（２）ｉＮＯＳｍＲＮＡに相補的なアンチセンス転写物（以下、単にアンチセンスと略す）によるｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化
実施例４：ラットｉＮＯＳアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化
ラットアンチセンスがｉＮＯＳｍＲＮＡを安定化しているかどうかを明らかにするために、ラットアンチセンスに相補的な配列を持ち、ラットアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つｉＮＯＳのセンスオリゴヌクレオチド（以下、センスオリゴと略す）をラット初代培養肝細胞に導入しｉＮＯＳｍＲＮＡ量を調べた。
センスオリゴはオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つを硫黄原子に置換（Ｓ化）することによって、細胞内における核酸分解酵によるオリゴヌクレオチドの分解を防いだ。ＩＢＡ社（Gottingen, Germany）のMagnet assisted transfection法による遺伝子導入試薬キット（MATra-A Reagent）により、Ｓ化センスオリゴをラット初代培養肝細胞に導入した。
実施例４：ラットｉＮＯＳアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化
ラットアンチセンスがｉＮＯＳｍＲＮＡを安定化しているかどうかを明らかにするために、ラットアンチセンスに相補的な配列を持ち、ラットアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つｉＮＯＳのセンスオリゴヌクレオチド（以下、センスオリゴと略す）をラット初代培養肝細胞に導入しｉＮＯＳｍＲＮＡ量を調べた。
センスオリゴはオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つを硫黄原子に置換（Ｓ化）することによって、細胞内における核酸分解酵によるオリゴヌクレオチドの分解を防いだ。ＩＢＡ社（Gottingen, Germany）のMagnet assisted transfection法による遺伝子導入試薬キット（MATra-A Reagent）により、Ｓ化センスオリゴをラット初代培養肝細胞に導入した。
ラット初代培養肝細胞は公知の方法（J. Hepatol. 40, 616-623, 2004）で調製し、６穴プレートに（１ウェルあたり３×１０５細胞）蒔いた。２時間後に、１ウェルあたり１．５ｍｌの新しい培地（Williams' E培地（ＷＥ）に、１０％ウシ胎児血清、１０ｎＭデキサメタゾン及び１０ｎＭインスリンを含む培地。ＷＥＳ−ＤＩと略す）と交換した。さらに４時間後、オリゴ（２μｇ）とＷＥ（２００μｌ）を混合し、次に２μｌのMATra-A Reagent（ＩＢＡ社）を混ぜて室温で２０分間静置した後、肝細胞の入っているウェルに全量を滴下した。６穴プレートを磁石盤（ＩＢＡ社）の上に載せ、室温で１５分間静置してオリゴを細胞に導入した。１０％ウシ胎児血清を含むＷＥ（１ウェルあたり１．５ｍｌ）と交換してから、一晩３７℃に置いた。翌朝、１ｎＭのＩＬ−１βを含むＷＥに培地交換し、４時間、３７℃に置いた後、全ＲＮＡを調製した。
肝細胞をＩＬ−１βで刺激すると、ｉＮＯＳｍＲＮＡの量が顕著に増加するが、上記のＳ化センスオリゴを導入してＩＬ−１βで刺激して、ＲＴ−ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量の測定を行った。この結果を図１及び２に示す。
肝細胞をＩＬ−１βで刺激すると、ｉＮＯＳｍＲＮＡの量が顕著に増加するが、上記のＳ化センスオリゴを導入してＩＬ−１βで刺激して、ＲＴ−ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量の測定を行った。この結果を図１及び２に示す。
ここで用いたｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖配列、すなわちｉＮＯＳｍＲＮＡと同じ配列を持つＳ化オリゴヌクレオチドは以下の配列で示される。実験ではＳ２、Ｓ４とＳ５に相当する。
Ｓ２：５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ−３’
Ｓ４：５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
Ｓ５：５’−Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ−３’
（Ｓ化した部分は＊で示した。）
Ｓ２：５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ−３’
Ｓ４：５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
Ｓ５：５’−Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ−３’
（Ｓ化した部分は＊で示した。）
一方、陰性対照として塩基組成が同じでありながら配列が異なるため、ｉＮＯＳｍＲＮＡやその転写物、あるいは他のＲＮＡとハイブリダイズしないことが確認されている配列を持つ「スクランブルオリゴ」を導入した。スクランブルオリゴの配列を以下に示す。
Ｓｃｒ２：５’−Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊ＡＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＡＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ−３’
Ｓｃｒ４：５’−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ−３’
Ｓｃｒ５：５’−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊ＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＡＧＡＣ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ−３’
これらのスクランブルオリゴもセンスオリゴと同様、細胞内での分解を防ぐために、Ｓ化して用いた。「スクランブルオリゴ」についてはラットゲノムとの相同性検索により、類似の配列が存在しないことを確認してある。
Ｓｃｒ２：５’−Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊ＡＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＡＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ−３’
Ｓｃｒ４：５’−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ−３’
Ｓｃｒ５：５’−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊ＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＡＧＡＣ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ−３’
これらのスクランブルオリゴもセンスオリゴと同様、細胞内での分解を防ぐために、Ｓ化して用いた。「スクランブルオリゴ」についてはラットゲノムとの相同性検索により、類似の配列が存在しないことを確認してある。
さらに、もう一つの陰性対照として、ｉＮＯＳｍＲＮＡのステム・ループ構造のステム部分に対するＳ化センスオリゴヌクレオチドＳ１を導入した。Ｓ１の配列を以下に示す。
Ｓ１：５‘−Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊ＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ−３’
（＊は前記と同様の意味を表わす。）
Ｓ１：５‘−Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊ＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ−３’
（＊は前記と同様の意味を表わす。）
センス鎖（ｍＲＮＡと同じ配列を持つ鎖）と同じ配列のプライマーを用いて鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を行うと、「アンチセンス転写物」に対するｃＤＮＡのみが逆転写されるので、「アンチセンス転写物」の量を測定することができる。なお、逆転写を行なわずにＰＣＲを行なった対照を置き、肝細胞の全ＲＮＡに混入したゲノムが、ＰＣＲによって増幅しないことを確認した。図の中ではＲＴ（−）で示した。
この結果、Ｓ２、Ｓ４、及びＳ５のＳ化センスオリゴを導入した場合にはｉＮＯＳｍＲＮＡの量が減少した。これは、Ｓ化センスオリゴが、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解されたために、ｉＮＯＳｍＲＮＡも分解されたことを示している。一方、スクランブルオリゴを導入した場合には、ｉＮＯＳｍＲＮＡの量は大きく変動しなかった。また、ステム部分に対するＳ１を導入した場合にも、ｉＮＯＳｍＲＮＡの量は大きく変動しなかった。
また、センスオリゴＳ５またはスクランブルオリゴＳｃｒ５を肝細胞に導入した時に、IL-1βを添加後のｉＮＯＳｍＲＮＡ量を、逆転写したｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法で測定した。その結果、スクランブルオリゴＳｃｒ５を導入すると、ｉＮＯＳｍＲＮＡ量が２倍になるのに要した時間は１１９分間であった。これに対し、センスオリゴＳ５を導入した時には４６１分間であった（図２）。
ｉＮＯＳと同様に、ｉＮＯＳ以外の初期応答遺伝子Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1；ＣＩＮＣ−１も肝細胞においてＩＬ−１β刺激下で顕著なｍＲＮＡの誘導を起こす。そして、ＣＩＮＣ−１のｍＲＮＡの３'非翻訳領域（３’ＵＴＲ）にも、ｉＮＯＳｍＲＮＡと同様にＡＲＥ配列が存在する。ｉＮＯＳのセンスオリゴを肝細胞に導入した際に、ＣＩＮＣ−１のｍＲＮＡ量を測定したところ、センスオリゴを入れない場合とｍＲＮＡ量に差がなかった。すなわち、ｉＮＯＳのセンスオリゴの働きはｉＮＯＳに限定されるものであることを示していた（図１）。
以上の結果を併せると、ｉＮＯＳのセンスオリゴはｉＮＯＳアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズしてｉＮＯＳｍＲＮＡの分解を促進して、その結果としてｉＮＯＳｍＲＮＡの量を特異的に減少させることが示された。
以上の結果を併せると、ｉＮＯＳのセンスオリゴはｉＮＯＳアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズしてｉＮＯＳｍＲＮＡの分解を促進して、その結果としてｉＮＯＳｍＲＮＡの量を特異的に減少させることが示された。
実施例５：マウスｉＮＯＳアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化
マウスアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つｉＮＯＳセンスオリゴヌクレオチドのＳ化センスオリゴを、マウスマクロファージ由来のＲＡＷ２６４細胞に導入して、マウスアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡの発現抑制を調べた。
以下に記載しない操作は実施例４と同様の方法により行なった。マウスＲＡＷ２６４細胞を、ウェルあたり５×１０５細胞蒔き、DMEM培地を交換してＣＯ２恒温器で培養した。
ＩＢＡ社（Gottingen, Germany）のMagnet assisted transfection法によりＳ化センスオリゴを、ＲＡＷ２６４細胞に導入した。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（１ウェルあたり１．５ｍｌ）と交換してから、一晩、３７℃に置いた。翌朝、大腸菌ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、４時間、３７℃に置いた後、全ＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲに供した。なお、全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。
センスオリゴは、マウスアンチセンス転写物に対応する、マウスｉＮＯＳｍＲＮＡに対して作製した。
マウスアンチセンスにハイブリダイズする性質を持つｉＮＯＳセンスオリゴヌクレオチドのＳ化センスオリゴを、マウスマクロファージ由来のＲＡＷ２６４細胞に導入して、マウスアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡの発現抑制を調べた。
以下に記載しない操作は実施例４と同様の方法により行なった。マウスＲＡＷ２６４細胞を、ウェルあたり５×１０５細胞蒔き、DMEM培地を交換してＣＯ２恒温器で培養した。
ＩＢＡ社（Gottingen, Germany）のMagnet assisted transfection法によりＳ化センスオリゴを、ＲＡＷ２６４細胞に導入した。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（１ウェルあたり１．５ｍｌ）と交換してから、一晩、３７℃に置いた。翌朝、大腸菌ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、４時間、３７℃に置いた後、全ＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲに供した。なお、全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。
センスオリゴは、マウスアンチセンス転写物に対応する、マウスｉＮＯＳｍＲＮＡに対して作製した。
ここで用いられたマウスｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖の配列、すなわちｉＮＯＳｍＲＮＡと同じ配列を持つＳ化オリゴヌクレオチドは配列で示される。実験ではＳ１、Ｓ２とＳ３に相当する。
Ｓ１：５’−Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ−３’
Ｓ２：５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
Ｓ３：５’−Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊ＡＴＡＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＡ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ−３’
（Ｓ化した部分は＊で示した。）
Ｓ１：５’−Ｇ＊Ａ＊Ａ＊ＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ−３’
Ｓ２：５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
Ｓ３：５’−Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊ＡＴＡＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＡ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ−３’
（Ｓ化した部分は＊で示した。）
実施例４で行なった鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法に従って、マウスｉＮＯＳｍＲＮＡの量を測定した。
この結果、マウスｉＮＯＳｍＲＮＡの量が減少した。これは、Ｓ化センスオリゴが、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解または競合されたために、ｉＮＯＳｍＲＮＡも分解されたことを示した（図３）。
この結果、マウスｉＮＯＳｍＲＮＡの量が減少した。これは、Ｓ化センスオリゴが、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解または競合されたために、ｉＮＯＳｍＲＮＡも分解されたことを示した（図３）。
［実施例１〜５まとめ］
実施例４及び５の結果から、ラットのみならず、マウスでもｉＮＯＳのセンスオリゴはｉＮＯＳアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズすることにより、ｉＮＯＳｍＲＮＡの分解を促進して、その結果としてｉＮＯＳｍＲＮＡの量を特異的に減少させることが示された。
このように、ラット肝細胞でも、マウスの細胞でも、センスオリゴヌクレオチドを用いてｉＮＯＳｍＲＮＡの発現を抑制することができた。従って、センスオリゴヌクレオチドを用いたｉＮＯＳｍＲＮＡの発現抑制は、肝臓などの炎症時のｉＮＯＳ誘導及びＮＯ産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となるといえる。
実施例４及び５の結果から、ラットのみならず、マウスでもｉＮＯＳのセンスオリゴはｉＮＯＳアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズすることにより、ｉＮＯＳｍＲＮＡの分解を促進して、その結果としてｉＮＯＳｍＲＮＡの量を特異的に減少させることが示された。
このように、ラット肝細胞でも、マウスの細胞でも、センスオリゴヌクレオチドを用いてｉＮＯＳｍＲＮＡの発現を抑制することができた。従って、センスオリゴヌクレオチドを用いたｉＮＯＳｍＲＮＡの発現抑制は、肝臓などの炎症時のｉＮＯＳ誘導及びＮＯ産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となるといえる。
（３）ｉＮＯＳ遺伝子以外の初期応答遺伝子のｍＲＮＡに相補的な配列であるアンチセンス転写物の配列と領域（塩基長）の決定方法
炎症の時に誘導されて発現する遺伝子（いわゆる「初期応答遺伝子」）には、ｉＮＯＳのみならず、サイトカインやケモカインなどの生理活性物質の遺伝子が含まれる。これらの初期応答遺伝子は炎症を増悪させたり、改善させたりするなど、多彩な働きを持っている。初期応答遺伝子の発現を調節することは、最終的には炎症を調節することにつながる。そこで、ｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物以外にも、他の初期応答遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。次に、種間でよく保存されており、かつ複数のＡＲＥ配列を含んでいる３’ＵＴＲの配列に対して、アンチセンス転写物が発現されていると予想した。そして、この部分に対して、逆転写用のセンスプライマーと、ＰＣＲ用の１対のプライマーをデザインし、ラットのｉＮＯＳ遺伝子でアンチセンス転写物を検出した実施例４と同様に、鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を行なって、ラット肝細胞においてアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。
炎症の時に誘導されて発現する遺伝子（いわゆる「初期応答遺伝子」）には、ｉＮＯＳのみならず、サイトカインやケモカインなどの生理活性物質の遺伝子が含まれる。これらの初期応答遺伝子は炎症を増悪させたり、改善させたりするなど、多彩な働きを持っている。初期応答遺伝子の発現を調節することは、最終的には炎症を調節することにつながる。そこで、ｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物以外にも、他の初期応答遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。次に、種間でよく保存されており、かつ複数のＡＲＥ配列を含んでいる３’ＵＴＲの配列に対して、アンチセンス転写物が発現されていると予想した。そして、この部分に対して、逆転写用のセンスプライマーと、ＰＣＲ用の１対のプライマーをデザインし、ラットのｉＮＯＳ遺伝子でアンチセンス転写物を検出した実施例４と同様に、鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を行なって、ラット肝細胞においてアンチセンス転写物が発現しているかどうかを調べた。
ｉＮＯＳ以外の初期応答遺伝子のうち、３’ＵＴＲに複数のＡＲＥ配列を含むもので、かつ種間（ヒト、マウス、ラット）で３’ＵＴＲの配列がよく類似している３つの典型的な遺伝子を例にとって調べた。すなわち、以下の３遺伝子である。
(a) Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1（ＣＩＮＣ−１）：Chemokine (C-X-C motif) Ligand 1 (CXCL1)とも呼ばれ、IL-1βで刺激したラット肝細胞で誘導されるケモカインである。
(b) ＮＦ−κＢ ｐ５０：転写因子ＮＦ−κＢのサブユニットの１つであり、炎症に深く関与しているタンパク質である。
(c) ＩκＢ−α：ＮＦ−κＢの活性を抑制するタンパク質である。
なお、ヒト、マウス及びラットにおけるこれらのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）により既知である。
(a) Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant 1（ＣＩＮＣ−１）：Chemokine (C-X-C motif) Ligand 1 (CXCL1)とも呼ばれ、IL-1βで刺激したラット肝細胞で誘導されるケモカインである。
(b) ＮＦ−κＢ ｐ５０：転写因子ＮＦ−κＢのサブユニットの１つであり、炎症に深く関与しているタンパク質である。
(c) ＩκＢ−α：ＮＦ−κＢの活性を抑制するタンパク質である。
なお、ヒト、マウス及びラットにおけるこれらのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）により既知である。
実施例６：ラットCINC-1アンチセンス転写物
以下の方法により、ラットCINC-1のｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例１と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すラットCINC-1遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡ−３'（配列番号１６）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
以下の方法により、ラットCINC-1のｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例１と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すラットCINC-1遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡ−３'（配列番号１６）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡと以下に示すラットCINC-1遺伝子のセンス鎖の２種類のプライマー：
順方向：
５’−ＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＧＴ−３'（配列番号１７）
逆方向：
５’ −ＣＴＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＣＡＣＴＴＡ−３'（配列番号１８）
を用いて、実施例１と同様の方法のステップダウン法に従ってＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＧＴ−３'（配列番号１７）
逆方向：
５’ −ＣＴＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＣＡＣＴＴＡ−３'（配列番号１８）
を用いて、実施例１と同様の方法のステップダウン法に従ってＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、１２２塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。この増幅したバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットCINC-1 ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ラットCINC-1遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラットCINC-1遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号１９に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
実施例７：ラットNF-κB p50アンチセンス転写物
以下の方法により、ラットNF-κB p50のｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例６と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すラットNF-κB p50遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＣＴＧＴＣＡＴＴＡＡＧＧＴＡＴＣＧＣＡＧＴＣＣ−３'（配列番号２０）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
以下の方法により、ラットNF-κB p50のｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例６と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すラットNF-κB p50遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＣＴＧＴＣＡＴＴＡＡＧＧＴＡＴＣＧＣＡＧＴＣＣ−３'（配列番号２０）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡと以下に示すラットNF-κB p50遺伝子のセンス鎖の２種類のプライマー：
順方向：
５’−ＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＡＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２１）
逆方向：
５’−ＧＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２２）
を用いて、実施例１と同様の方法のステップダウン法に従ってＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＡＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２１）
逆方向：
５’−ＧＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２２）
を用いて、実施例１と同様の方法のステップダウン法に従ってＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、１９２塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットNF-κB p50 ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ラットNF-κB p50遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラットNF-κB p50遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号２３に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
実施例８：ラットIκB-αアンチセンス転写物
以下の方法により、ラットIκB-αのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例６と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すラットIκB-α遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＡＣＣＡＣ−３'（配列番号２４）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
以下の方法により、ラットIκB-αのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べた。以下に特に記載のない操作は実施例６と同様の方法で行なった。
初代培養ラット肝細胞をIL-1βで刺激してから、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、以下に示すラットIκB-α遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＡＣＣＡＣ−３'（配列番号２４）
を用い、逆転写を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡと以下に示すラットＩκＢ−α遺伝子のセンス鎖の２種類のプライマー：
順方向：
５’−ＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡＴＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２５）
逆方向：
５’−ＧＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴ−３'（配列番号２６）
を用いて、実施例１と同様の方法のステップダウン法に従ってＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡＴＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２５）
逆方向：
５’−ＧＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴ−３'（配列番号２６）
を用いて、実施例１と同様の方法のステップダウン法に従ってＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、１０２塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットIκB-α ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ラットIκB-α遺伝子のアンチセンス転写物の存在を証明した。ラットIκB-α遺伝子のアンチセンス転写物の配列を配列番号２７に示す。但し、ｃＤＮＡ配列として示す。
［実施例６〜８のまとめ］
炎症の時に発現する初期応答遺伝子として、ｉＮＯＳ以外の代表的な３つの遺伝子（CINC-1、NF-κB p50、IκB-α）を選んだが、いずれにおいても３’ＵＴＲに複数のＡＲＥ配列を含み、かつ種間（ヒト、マウス、ラット）で３’ＵＴＲの配列がよく似ている。ｉＮＯＳと同様に、この３遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現していることが確認された。
炎症の時に発現する初期応答遺伝子として、ｉＮＯＳ以外の代表的な３つの遺伝子（CINC-1、NF-κB p50、IκB-α）を選んだが、いずれにおいても３’ＵＴＲに複数のＡＲＥ配列を含み、かつ種間（ヒト、マウス、ラット）で３’ＵＴＲの配列がよく似ている。ｉＮＯＳと同様に、この３遺伝子においてもアンチセンス転写物が発現していることが確認された。
このことから、アンチセンス転写物はＡＲＥ配列を含み、かつ種間で３’ＵＴＲの配列がよく似ている初期応答遺伝子では共通に見られる分子であることが推察される。さらに、アンチセンス転写物がこれらのｍＲＮＡの安定性を調節している可能性が強く示唆される。したがって、肝臓などの炎症において初期応答遺伝子のアンチセンス転写物の働きを抑制することにより、炎症を抑える事が期待される。
（４）ラット急性肝不全モデルを用いた生体（in vivo）でのｉＮＯＳとアンチセンス転写物の発現誘導と肝臓保護剤（IGF-IとFR183998）によるｉＮＯＳとアンチセンス転写物の発現誘導の抑制効果
実施例１及び実施例４の結果より、ラット初代培養肝細胞（in vitro）の系において、ｉＮＯＳ誘導時にｉＮＯＳｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対応するアンチセンス転写物が発現し、ｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化を促進することを示した。肝障害ラット（in vivo）においてもｉＮＯＳ誘導に呼応して、ｉＮＯＳアンチセンス転写物が発現することを以下に示す。さらに、Insulin-like growth factor-I（IGF-I）やNa+/H+ exchanger 阻害剤（FR183998）などの肝臓保護剤の投与による生存率の変化と炎症性サイトカイン、ｉＮＯＳｍＲＮＡ、及びアンチセンス転写物の誘導との関係を以下に示す。
実施例１及び実施例４の結果より、ラット初代培養肝細胞（in vitro）の系において、ｉＮＯＳ誘導時にｉＮＯＳｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対応するアンチセンス転写物が発現し、ｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化を促進することを示した。肝障害ラット（in vivo）においてもｉＮＯＳ誘導に呼応して、ｉＮＯＳアンチセンス転写物が発現することを以下に示す。さらに、Insulin-like growth factor-I（IGF-I）やNa+/H+ exchanger 阻害剤（FR183998）などの肝臓保護剤の投与による生存率の変化と炎症性サイトカイン、ｉＮＯＳｍＲＮＡ、及びアンチセンス転写物の誘導との関係を以下に示す。
実施例９
(I) 急性肝不全モデルの作製と肝臓保護剤の投与
雄Sprague-Dawleyラット（250−300 g）に、Ｄ−ガラクトサミン（D-galactosamine）(400 g/kg)と細菌エンドトキシンであるＬＰＳ（16 μg/kg）との混合液（D-GalN/LPS）を静注し、急性肝不全モデルを調製した。Insulin-like growth factor-I（IGF-I；3.2 mg/kg）あるいはNa+/H+ exchanger 阻害剤（FR183998; 1 mg/kg）をD-GalN/LPS処理の30分前に投与した。血中及び肝臓の炎症性サイトカイン（TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1）、MIP-2及び一酸化窒素（ＮＯ）を測定した。肝臓より全ＲＮＡを調製し、ｉＮＯＳｍＲＮＡ及びｉＮＯＳアンチセンス転写物をＲＴ−ＰＣＲで検討した。
(I) 急性肝不全モデルの作製と肝臓保護剤の投与
雄Sprague-Dawleyラット（250−300 g）に、Ｄ−ガラクトサミン（D-galactosamine）(400 g/kg)と細菌エンドトキシンであるＬＰＳ（16 μg/kg）との混合液（D-GalN/LPS）を静注し、急性肝不全モデルを調製した。Insulin-like growth factor-I（IGF-I；3.2 mg/kg）あるいはNa+/H+ exchanger 阻害剤（FR183998; 1 mg/kg）をD-GalN/LPS処理の30分前に投与した。血中及び肝臓の炎症性サイトカイン（TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1）、MIP-2及び一酸化窒素（ＮＯ）を測定した。肝臓より全ＲＮＡを調製し、ｉＮＯＳｍＲＮＡ及びｉＮＯＳアンチセンス転写物をＲＴ−ＰＣＲで検討した。
(II) ＲＮＡの解析
Ｄ−ガラクトサミンとＬＰＳ混合液の静注後、３または６時間後に、ラットの肝臓を取り出して、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。
この全ＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーを用いて、逆転写を行ない、次に実施例１等と同様の方法でＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ法）を行なった。ｉＮＯＳｍＲＮＡや、内部標準となるelongation factor-1α（ＥＦｌ）ｍＲＮＡの定量には、逆転写のときオリゴｄＴプライマーを用い、ＰＣＲのときには
ｉＮＯＳｍＲＮＡ：
ＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧ（配列番号２８）及び
ＧＴＣＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣ（配列番号２９）；及び
ＥＦｍＲＮＡ：
ＴＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣ（配列番号３０）及び
ＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴ（配列番号３１）
を用いた。なお、ＰＣＲ反応液にはanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）を添加した。
また、ｉＮＯＳアンチセンス転写物の定量は、実施例１の方法に従った。なお、逆転写を行なわずにＰＣＲを行なった対照を置き、肝細胞の全ＲＮＡに混入したゲノムが、ＰＣＲによって増幅しないことを確認した。ｉＮＯＳｍＲＮＡ検出結果を図４に示し、ｉＮＯＳアンチセンス転写物の検出結果を図５に示す。図中、ＲＴ（−）は逆転写（−）の陰性対照を示す。
Ｄ−ガラクトサミンとＬＰＳ混合液の静注後、３または６時間後に、ラットの肝臓を取り出して、常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。
この全ＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーを用いて、逆転写を行ない、次に実施例１等と同様の方法でＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ法）を行なった。ｉＮＯＳｍＲＮＡや、内部標準となるelongation factor-1α（ＥＦｌ）ｍＲＮＡの定量には、逆転写のときオリゴｄＴプライマーを用い、ＰＣＲのときには
ｉＮＯＳｍＲＮＡ：
ＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧ（配列番号２８）及び
ＧＴＣＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣ（配列番号２９）；及び
ＥＦｍＲＮＡ：
ＴＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣ（配列番号３０）及び
ＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴ（配列番号３１）
を用いた。なお、ＰＣＲ反応液にはanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）を添加した。
また、ｉＮＯＳアンチセンス転写物の定量は、実施例１の方法に従った。なお、逆転写を行なわずにＰＣＲを行なった対照を置き、肝細胞の全ＲＮＡに混入したゲノムが、ＰＣＲによって増幅しないことを確認した。ｉＮＯＳｍＲＮＡ検出結果を図４に示し、ｉＮＯＳアンチセンス転写物の検出結果を図５に示す。図中、ＲＴ（−）は逆転写（−）の陰性対照を示す。
(III) リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物の定量
逆転写して合成したｃＤＮＡは、日本バイオラド社のiCycler Systemを用いて、リアルタイムＰＣＲによっても定量を行なった。ＰＣＲ反応液にSYBR Green I（ロシュ・ダイアグノスティクス社）及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でＰＣＲを行なった。実際のＰＣＲプロトコールは次の通りである。
１サイクル（94℃, 1 min)、
５０サイクル（94℃, 30 sec; (72−0.3×n) ℃, 1 min; 72℃, 30 sec）；nはサイクル数。結果を図６に示す。図中、「*」は「p<0.05 vs. GalN/LPSラット(n= 3-6ラット/グループ)」を示す。
逆転写して合成したｃＤＮＡは、日本バイオラド社のiCycler Systemを用いて、リアルタイムＰＣＲによっても定量を行なった。ＰＣＲ反応液にSYBR Green I（ロシュ・ダイアグノスティクス社）及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でＰＣＲを行なった。実際のＰＣＲプロトコールは次の通りである。
１サイクル（94℃, 1 min)、
５０サイクル（94℃, 30 sec; (72−0.3×n) ℃, 1 min; 72℃, 30 sec）；nはサイクル数。結果を図６に示す。図中、「*」は「p<0.05 vs. GalN/LPSラット(n= 3-6ラット/グループ)」を示す。
(IV) 肝臓保護剤によるｉＮＯＳｍＲＮＡ及びｉＮＯＳアンチセンス転写物量の変化
肝臓保護剤を投与しなかった場合、D-GalN/LPSの静注後、約２４時間でほとんどの動物（９０％以上）が死亡した。血中及び肝臓に、経時的（１〜１２時間）に炎症性メディエイター（TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1, MIP-2, NO）が増加した。肝臓のｉＮＯＳｍＲＮＡ誘導に呼応してアンチセンス転写物が増加を示し（ｉＮＯＳｍＲＮＡ及びｉＮＯＳアンチセンス転写物とも６時間後に最大）、その結果過剰なＮＯ産生が認められた。
IGF-Iの投与により死亡率は２０〜３０％以下に減少した。そして、上述の炎症性サイトカイン、ＮＯ産生に加えてｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された（図４〜６）。
FR183998の投与によっても死亡率は２０〜３０％以下に減少し、上述の炎症性サイトカイン、NO産生に加えてｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された（図７〜９）。
(IV-1) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤IGF-IのｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図４の結果より、Ｄ−ガラクトサミサンとＬＰＳを投与したラット；GalN/LPSラットは、は３〜６時間でｉＮＯＳｍＲＮＡレベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
図５及び６の結果より、ＲＴ（−）ではほとんど増幅したｃＤＮＡが見られないことから、全ＲＮＡに混入したゲノムＤＮＡは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは３〜６時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
(IV-2) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤FR183998のｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図７の結果より、GalN/LPSラットは３〜６時間でｉＮＯＳｍＲＮＡレベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
図８及び９の結果より、ＲＴ（−）ではほとんど増幅したｃＤＮＡが見られないことから、全ＲＮＡに混入したゲノムＤＮＡは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは３〜６時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
肝臓保護剤を投与しなかった場合、D-GalN/LPSの静注後、約２４時間でほとんどの動物（９０％以上）が死亡した。血中及び肝臓に、経時的（１〜１２時間）に炎症性メディエイター（TNF-α, IL-1β, IL-6, インターフェロンγ, CINC-1, MIP-2, NO）が増加した。肝臓のｉＮＯＳｍＲＮＡ誘導に呼応してアンチセンス転写物が増加を示し（ｉＮＯＳｍＲＮＡ及びｉＮＯＳアンチセンス転写物とも６時間後に最大）、その結果過剰なＮＯ産生が認められた。
IGF-Iの投与により死亡率は２０〜３０％以下に減少した。そして、上述の炎症性サイトカイン、ＮＯ産生に加えてｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された（図４〜６）。
FR183998の投与によっても死亡率は２０〜３０％以下に減少し、上述の炎症性サイトカイン、NO産生に加えてｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物誘導の増加が同様に抑制された（図７〜９）。
(IV-1) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤IGF-IのｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図４の結果より、Ｄ−ガラクトサミサンとＬＰＳを投与したラット；GalN/LPSラットは、は３〜６時間でｉＮＯＳｍＲＮＡレベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
図５及び６の結果より、ＲＴ（−）ではほとんど増幅したｃＤＮＡが見られないことから、全ＲＮＡに混入したゲノムＤＮＡは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは３〜６時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、IGF-Iを投与したラットはこの増加が抑制された。
(IV-2) ラット急性肝不全モデルにおける肝臓保護剤FR183998のｉＮＯＳｍＲＮＡ及びアンチセンス転写物の発現誘導への効果
図７の結果より、GalN/LPSラットは３〜６時間でｉＮＯＳｍＲＮＡレベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
図８及び９の結果より、ＲＴ（−）ではほとんど増幅したｃＤＮＡが見られないことから、全ＲＮＡに混入したゲノムＤＮＡは極めて微量であると考えられる。GalN/LPSラットは３〜６時間でアンチセンス転写物レベルが増加したが、FR183998を投与したラットはこの増加が抑制された。
（５）ラット肝細胞でのセンスオリゴの効果（ｉＮＯＳタンパク質と一酸化窒素（ＮＯ）量の変化）
実施例１０
実施例４と同様の方法で、実施例４において得られたセンスオリゴＳ５またはスクランブルオリゴＳｃｒ５を肝細胞に導入し、培地中の一酸化窒素（ＮＯ）量をNitric Oxide Colorimetric Assay kits (ロシュ・ダイアグノスティクス社)で測定した。ただし、翌朝、１ｎＭのIL-1βを含むＷＥに培地交換し、８〜１０時間、３７℃に置いた後、測定した。また、細胞から全タンパク質を抽出して、ＥＣＬキット（GEヘルスケア社）を用いたウェスタン法でｉＮＯＳタンパク質を検出した。結果を図１０に示す。
その結果、ラット肝細胞にセンスオリゴＳ５を導入することで、ｉＮＯＳタンパク質及び培地中の一酸化窒素（ＮＯ）量が減少することが示された。
実施例１０
実施例４と同様の方法で、実施例４において得られたセンスオリゴＳ５またはスクランブルオリゴＳｃｒ５を肝細胞に導入し、培地中の一酸化窒素（ＮＯ）量をNitric Oxide Colorimetric Assay kits (ロシュ・ダイアグノスティクス社)で測定した。ただし、翌朝、１ｎＭのIL-1βを含むＷＥに培地交換し、８〜１０時間、３７℃に置いた後、測定した。また、細胞から全タンパク質を抽出して、ＥＣＬキット（GEヘルスケア社）を用いたウェスタン法でｉＮＯＳタンパク質を検出した。結果を図１０に示す。
その結果、ラット肝細胞にセンスオリゴＳ５を導入することで、ｉＮＯＳタンパク質及び培地中の一酸化窒素（ＮＯ）量が減少することが示された。
（６）ノーザン法によるｉＮＯＳアンチセンス転写物の検出
実施例１１
IL-1βで刺激したラット肝細胞において、ｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物が存在することを、Northern blot analysis (以下、ノーザン法と略す)で確認した。
(I) ＲＮＡの調製
ラット肝細胞を一定時間、IL-1βで刺激してから、Trizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。Poly(A)+とpoly(A)- RNAは、PolyATract mRNA Isolation System（プロメガ社）で分画した。非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐため、リボゾームRNA（rRNA）を、終濃度5%ポリエチレングリコール6000及び終濃度0.75Ｍ ＮａＣｌ存在下で沈澱させて除き、上清をエタノール沈澱により回収して電気泳動に用いた。
実施例１１
IL-1βで刺激したラット肝細胞において、ｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物が存在することを、Northern blot analysis (以下、ノーザン法と略す)で確認した。
(I) ＲＮＡの調製
ラット肝細胞を一定時間、IL-1βで刺激してから、Trizol試薬（インビトロジェン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。Poly(A)+とpoly(A)- RNAは、PolyATract mRNA Isolation System（プロメガ社）で分画した。非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐため、リボゾームRNA（rRNA）を、終濃度5%ポリエチレングリコール6000及び終濃度0.75Ｍ ＮａＣｌ存在下で沈澱させて除き、上清をエタノール沈澱により回収して電気泳動に用いた。
(II) ノーザン法：電気泳動
上記のRNA、すなわち無刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)+ RNA、及びIL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)- RNAの４つを、2.2Ｍホルマリン含有アガロースで電気泳動を行ない、分離した。
上記のRNA、すなわち無刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA、IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)+ RNA、及びIL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)- RNAの４つを、2.2Ｍホルマリン含有アガロースで電気泳動を行ない、分離した。
(III) ノーザン法：ハイブリダイゼーション
常法に従い、ゲル中のＲＮＡをNytran Nフィルター（ワットマン社）に移した。次に、DIG EasyHybバッファー（ロシュダイアグノスティクス社）中で、ディゴキシゲニン（DIG）標識したｉＮＯＳの３’ＵＴＲのセンスプローブと、73℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行なった。翌朝、ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、フィルターを洗った。なお、ｉＮＯＳの３’ＵＴＲのセンスプローブは、DIG-11-UTP（ロシュダイアグノスティクス社）とT3 RNAポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用いて、試験管内でRNAを合成することによって作製した。
常法に従い、ゲル中のＲＮＡをNytran Nフィルター（ワットマン社）に移した。次に、DIG EasyHybバッファー（ロシュダイアグノスティクス社）中で、ディゴキシゲニン（DIG）標識したｉＮＯＳの３’ＵＴＲのセンスプローブと、73℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行なった。翌朝、ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、フィルターを洗った。なお、ｉＮＯＳの３’ＵＴＲのセンスプローブは、DIG-11-UTP（ロシュダイアグノスティクス社）とT3 RNAポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用いて、試験管内でRNAを合成することによって作製した。
(IV) ノーザン法：検出
ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、ブロッキングを行ない、アルカリフォスファターゼと結合した抗ＤＩＧ抗体（ロシュダイアグノスティクス社）とインキュベートした。洗浄後、基質であるCDP-Star（アプライドバイオシステムズ社）と反応させ、エックス線フィルムで、ｉＮＯＳセンスプローブとハイブリダイズするＲＮＡのバンドを検出した。
ロシュダイアグノスティクス社のマニュアルに従って、ブロッキングを行ない、アルカリフォスファターゼと結合した抗ＤＩＧ抗体（ロシュダイアグノスティクス社）とインキュベートした。洗浄後、基質であるCDP-Star（アプライドバイオシステムズ社）と反応させ、エックス線フィルムで、ｉＮＯＳセンスプローブとハイブリダイズするＲＮＡのバンドを検出した。
(V) 結果と考察
上記４種のＲＮＡのノーザン法による解析結果（エックス線フィルムのオートラジオグラム）を図１１に示す。
「IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA」と「IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)-RNA」では、600〜1000ヌクレオチド(nt)のスメア状の濃いバンドが観察された。ｉＮＯＳの３’ＵＴＲのセンスプローブを用いているので、これらのスメア状バンドは、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物のバンドと考えられる。従って、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物の長さは一定ではなく、さまざまな長さ（600〜1000ヌクレオチド）の転写物の集合であることがわかった。
上記４種のＲＮＡのノーザン法による解析結果（エックス線フィルムのオートラジオグラム）を図１１に示す。
「IL-1β刺激ラット肝細胞の全RNA」と「IL-1β刺激ラット肝細胞のPoly(A)-RNA」では、600〜1000ヌクレオチド(nt)のスメア状の濃いバンドが観察された。ｉＮＯＳの３’ＵＴＲのセンスプローブを用いているので、これらのスメア状バンドは、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物のバンドと考えられる。従って、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物の長さは一定ではなく、さまざまな長さ（600〜1000ヌクレオチド）の転写物の集合であることがわかった。
ＲＡＣＥの結果とリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果とを併せると、図１２に示すように、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物が合成されていると考えられた。図中、点線は600ヌクレオチド以上のさまざまなサイズのアンチセンス転写物ができていることを示す。図中の数字はｉＮＯＳ遺伝子のエクソンの番号、黒い部分はタンパク質の翻訳領域で、白抜きのボックスはエクソン２７にある３’ＵＴＲである。ｉＮＯＳのｍＲＮＡは遺伝子の図中上側に示す。
（７）ｉＮＯＳアンチセンス転写物の過剰発現によるｍＲＮＡの安定化
実施例１２
ラット肝細胞において、ｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物を過剰発現させると、ｉＮＯＳの３’ＵＴＲを介してｍＲＮＡが安定化されることを確認した。
ふつうのレポーターの場合、ｉＮＯＳ遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を結合する。ｉＮＯＳ遺伝子のプロモーターは「誘導型プロモーター」であるため、ラット肝細胞においてはIL-1β刺激により、プロモーター活性が大きく変化してしまい、レポーター遺伝子の後に結合した３’ＵＴＲの働きがよく観察できない。そこで、刺激にかかわらず、一定量の発現を促す「構成的プロモーター」である、elongation factor-1α（ＥＦ）遺伝子のプロモーターを用いることにした。従って、ＥＦプロモーターでコントロールされるルシフェラーゼ遺伝子やβガラクトシダーゼ遺伝子は、刺激にかかわらず、ほぼ一定量で発現する。これにより、ポリ（Ａ）シグナル配列を含むｉＮＯＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲが、ルシフェラーゼｍＲＮＡの安定性に与える影響のみを観察することができる。
実施例１２
ラット肝細胞において、ｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物を過剰発現させると、ｉＮＯＳの３’ＵＴＲを介してｍＲＮＡが安定化されることを確認した。
ふつうのレポーターの場合、ｉＮＯＳ遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を結合する。ｉＮＯＳ遺伝子のプロモーターは「誘導型プロモーター」であるため、ラット肝細胞においてはIL-1β刺激により、プロモーター活性が大きく変化してしまい、レポーター遺伝子の後に結合した３’ＵＴＲの働きがよく観察できない。そこで、刺激にかかわらず、一定量の発現を促す「構成的プロモーター」である、elongation factor-1α（ＥＦ）遺伝子のプロモーターを用いることにした。従って、ＥＦプロモーターでコントロールされるルシフェラーゼ遺伝子やβガラクトシダーゼ遺伝子は、刺激にかかわらず、ほぼ一定量で発現する。これにより、ポリ（Ａ）シグナル配列を含むｉＮＯＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲが、ルシフェラーゼｍＲＮＡの安定性に与える影響のみを観察することができる。
以下の３種のベクターを、pGL3-Basicプラスミド（プロメガ社）をもとに構築した。構築したベクターの模式図を図１３に示す。
（i）レポーター（ルシフェラーゼベクター）：
ＥＦプロモーター ＋ ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）＋ ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲ
ＥＦプロモーター＋ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）＋ ＳＶｐＡ
（ルシフェラーゼｍＲＮＡが構成的に発現するが、ルシフェラーゼ遺伝子の後の部分でｍＲＮＡの安定性を制御されうる）
（ii）ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター：
ＣＭＶプロモーター ＋ ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを逆方向に挿入 ＋ ＳＶｐＡ
（ｉＮＯＳアンチセンス転写物が、細胞内で過剰に発現する）
（iii）内部標準（βガラクトシダーゼベクター）：
ＥＦプロモーター ＋ βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子 ＋ ＳＶｐＡ
（βガラクトシダーゼｍＲＮＡが構成的に発現する）
なお、ＳＶｐＡとは、ＳＶ４０ウイルス由来のポリ（Ａ）シグナルの配列で、安定な３’ＵＴＲとして知られており、ＳＶｐＡの付加されたｍＲＮＡは壊れにくい。ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲの対照である。ＣＭＶプロモーターとは、サイトメガロウイルス由来で、ＥＦプロモーターよりはるかに強い構成的プロモーターである。
（i）レポーター（ルシフェラーゼベクター）：
ＥＦプロモーター ＋ ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）＋ ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲ
ＥＦプロモーター＋ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）＋ ＳＶｐＡ
（ルシフェラーゼｍＲＮＡが構成的に発現するが、ルシフェラーゼ遺伝子の後の部分でｍＲＮＡの安定性を制御されうる）
（ii）ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター：
ＣＭＶプロモーター ＋ ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを逆方向に挿入 ＋ ＳＶｐＡ
（ｉＮＯＳアンチセンス転写物が、細胞内で過剰に発現する）
（iii）内部標準（βガラクトシダーゼベクター）：
ＥＦプロモーター ＋ βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子 ＋ ＳＶｐＡ
（βガラクトシダーゼｍＲＮＡが構成的に発現する）
なお、ＳＶｐＡとは、ＳＶ４０ウイルス由来のポリ（Ａ）シグナルの配列で、安定な３’ＵＴＲとして知られており、ＳＶｐＡの付加されたｍＲＮＡは壊れにくい。ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲの対照である。ＣＭＶプロモーターとは、サイトメガロウイルス由来で、ＥＦプロモーターよりはるかに強い構成的プロモーターである。
（i）と（iii）のプラスミドを同時にラット肝細胞に導入したとき、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）とβガラクトシダーゼｍＲＮＡ（βＧａｌ）の合成量は、ＥＦプロモーターが構成的であることから、ほぼ一定である。さらにｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター（ii）を加えた時と加えない時で差があれば、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ／βＧａｌ ｍＲＮＡ（Ｌｕｃ／βＧａｌ値）にも差があるはずである。もしＬｕｃ／βＧａｌ値が、ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターの有無により変化するならば、ｉＮＯＳアンチセンス転写物の過剰発現が、ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを介してルシフェラーゼｍＲＮＡの安定性に影響を与えたことになる。
［方法］
(I) トランスフェクション
初代培養ラット肝細胞に、前述の方法（MATra）により以下のプラスミドを導入した。
（i）レポーター（400 ng/ウェル）、
±（ii）iNOSアンチセンス転写物発現ベクター（50 ng/ウェル）、
（iii）内部標準（400 ng/ウェル）。
ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを入れたものはＡＳ（＋）、入れないものは
ＡＳ（−）とした。
(I) トランスフェクション
初代培養ラット肝細胞に、前述の方法（MATra）により以下のプラスミドを導入した。
（i）レポーター（400 ng/ウェル）、
±（ii）iNOSアンチセンス転写物発現ベクター（50 ng/ウェル）、
（iii）内部標準（400 ng/ウェル）。
ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを入れたものはＡＳ（＋）、入れないものは
ＡＳ（−）とした。
(II) ＲＮＡの調製
トランスフェクションして、一晩経った肝細胞の培地を交換した後、経時的に全ＲＮＡを抽出した。常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて行なった。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写を行ない、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。
トランスフェクションして、一晩経った肝細胞の培地を交換した後、経時的に全ＲＮＡを抽出した。常法に従いTrizol試薬（インビトロジェン社）を用いて行なった。得られた全ＲＮＡは、DNaseを含むTURBO DNA-free Kit（アプライドバイオシステムズ社）で処理し、混入するゲノムＤＮＡを除去した。この全ＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写を行ない、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。
(III) リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
合成したｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲによって定量を行なった。日本バイオラド社のiCyclerシステムを用いた。ＰＣＲ反応液にSYBR Green I (ロシュ・ダイアグノスティクス社) 及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体。東洋紡）を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でＰＣＲを行なった。実際のＰＣＲプロトコールは次の通りである。
１サイクル (94℃, 1 min)、
５０サイクル (94℃, 30 sec; (72 - 0.3×n)℃, 1 min; 72℃, 30 sec)（nはサイクル数）。
レポーターであるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）のｍＲＮＡのＰＣＲに用いたプライマーは次の２種類である。
順方向：
５’−ＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣ−３'（配列番号３２）
逆方向：
５’−ＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＣ−３'（配列番号３３）
内部標準であるβガラクトシダーゼ(βGal)のｍＲＮＡのＰＣＲに用いたプライマーは次の２種類である。
順方向：
５’−ＧＴＣＡＣＡＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡ−３'（配列番号３４）
逆方向：
５’−ＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＧ−３'（配列番号３５）
リアルタイムＰＣＲを行なった後、ｉＣｙｃｌｅｒシステムの解析ソフトウェアを用いて、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）とβガラクトシダーゼｍＲＮＡ（βＧａｌ）のthreshold cycle（Ｃｔ）値を求めた後、除して、Ｌｕｃ／βＧａｌ値を求めた。
合成したｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲによって定量を行なった。日本バイオラド社のiCyclerシステムを用いた。ＰＣＲ反応液にSYBR Green I (ロシュ・ダイアグノスティクス社) 及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体。東洋紡）を添加して、公知の方法であるタッチダウン法でＰＣＲを行なった。実際のＰＣＲプロトコールは次の通りである。
１サイクル (94℃, 1 min)、
５０サイクル (94℃, 30 sec; (72 - 0.3×n)℃, 1 min; 72℃, 30 sec)（nはサイクル数）。
レポーターであるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）のｍＲＮＡのＰＣＲに用いたプライマーは次の２種類である。
順方向：
５’−ＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣ−３'（配列番号３２）
逆方向：
５’−ＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＣ−３'（配列番号３３）
内部標準であるβガラクトシダーゼ(βGal)のｍＲＮＡのＰＣＲに用いたプライマーは次の２種類である。
順方向：
５’−ＧＴＣＡＣＡＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡ−３'（配列番号３４）
逆方向：
５’−ＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＧ−３'（配列番号３５）
リアルタイムＰＣＲを行なった後、ｉＣｙｃｌｅｒシステムの解析ソフトウェアを用いて、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）とβガラクトシダーゼｍＲＮＡ（βＧａｌ）のthreshold cycle（Ｃｔ）値を求めた後、除して、Ｌｕｃ／βＧａｌ値を求めた。
［結果］
ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを加えた場合と加えない場合について、Ｌｕｃ／βＧａｌ値を経時的に示した。結果を図１４に示す。
（i）レポーター（ＥＦプロモーター ＋ Ｌｕｃ ＋ ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲ）、
±（ii）ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター、
（iii）内部標準。
この場合、ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを加えたときＡＳ（＋）、加えないときＡＳ（−）に比べると、有意にＬｕｃ／βＧａｌ値が増加した。図中、「**」は「p<0.01 versus AS(-)」を表わす。
すなわち、ｉＮＯＳアンチセンス転写物はｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを介して、ルシフェラーゼｍＲＮＡが安定化させた。
対照として、ＳＶｐＡを連結したレポーターを用いた結果を図１５に示す。
（i）レポーター（ＥＦプロモーター ＋ Ｌｕｃ ＋ ＳＶｐＡ）、
±（ii）ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター、
（iii）内部標準。
この場合、ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを加えると［ＡＳ（＋）］、加えないとき［ＡＳ（−）］に比べて、Ｌｕｃ／βＧａｌ値は増加しなかった。すなわち、ＳＶｐＡではｍＲＮＡの安定性に影響を与えなかった。
ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを加えた場合と加えない場合について、Ｌｕｃ／βＧａｌ値を経時的に示した。結果を図１４に示す。
（i）レポーター（ＥＦプロモーター ＋ Ｌｕｃ ＋ ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲ）、
±（ii）ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター、
（iii）内部標準。
この場合、ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを加えたときＡＳ（＋）、加えないときＡＳ（−）に比べると、有意にＬｕｃ／βＧａｌ値が増加した。図中、「**」は「p<0.01 versus AS(-)」を表わす。
すなわち、ｉＮＯＳアンチセンス転写物はｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを介して、ルシフェラーゼｍＲＮＡが安定化させた。
対照として、ＳＶｐＡを連結したレポーターを用いた結果を図１５に示す。
（i）レポーター（ＥＦプロモーター ＋ Ｌｕｃ ＋ ＳＶｐＡ）、
±（ii）ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクター、
（iii）内部標準。
この場合、ｉＮＯＳアンチセンス転写物発現ベクターを加えると［ＡＳ（＋）］、加えないとき［ＡＳ（−）］に比べて、Ｌｕｃ／βＧａｌ値は増加しなかった。すなわち、ＳＶｐＡではｍＲＮＡの安定性に影響を与えなかった。
［意義］
以上の結果（ｉＮＯＳアンチセンス転写物の過剰発現実験）より、ｉＮＯＳアンチセンス転写物には、ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲに働きかけてｍＲＮＡを安定化させるという作用を有すると考えられる。Ｓ化センスオリゴヌクレオチドによるｉＮＯＳｍＲＮＡのノックダウン実験の結果と併せると、ｉＮＯＳアンチセンス転写物が、ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを介して、ｉＮＯＳｍＲＮＡを安定化させていることがいえる。
従って、ｉＮＯＳアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡを安定性の制御機構は、肝臓などの炎症の際に重要な働きを果たしていることが強く示唆される。また、この機構はＮＯが関与している多くの疾病の治療のターゲットになり得る。
以上の結果（ｉＮＯＳアンチセンス転写物の過剰発現実験）より、ｉＮＯＳアンチセンス転写物には、ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲに働きかけてｍＲＮＡを安定化させるという作用を有すると考えられる。Ｓ化センスオリゴヌクレオチドによるｉＮＯＳｍＲＮＡのノックダウン実験の結果と併せると、ｉＮＯＳアンチセンス転写物が、ｉＮＯＳ ３’ＵＴＲを介して、ｉＮＯＳｍＲＮＡを安定化させていることがいえる。
従って、ｉＮＯＳアンチセンス転写物によるｉＮＯＳｍＲＮＡを安定性の制御機構は、肝臓などの炎症の際に重要な働きを果たしていることが強く示唆される。また、この機構はＮＯが関与している多くの疾病の治療のターゲットになり得る。
肝臓保護剤の投与により、ｉＮＯＳｍＲＮＡとアンチセンス転写物の誘導が抑制された。以上の結果はアンチセンス転写物がインビボ（in vivo）においてもｉＮＯＳｍＲＮＡ発現誘導の制御因子として関与していることを強く示唆する。従って、肝臓保護剤を用いたアンチセンス転写物の発現抑制は、肝臓などの炎症時のｉＮＯＳ誘導及びＮＯ産生を軽減し、肝障害の有効な治療方法となると考える。
Claims (2)
- 細胞内における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の産生量を増大させる方法であって、ｉＮＯＳｍＲＮＡの３’非翻訳領域の塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物を細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
- 細胞内における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の産生量を増大させる方法であって、ｉＮＯＳｍＲＮＡの３’非翻訳領域の塩基配列に相補的な配列であって、少なくともｉＮＯＳｍＲＮＡの３’非翻訳領域に存在するステム−ループ構造のループ部分の塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンス転写物を細胞内に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
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