CN106456659A - 一种用于减少疤痕形成的医药组合物和方法 - Google Patents

一种用于减少疤痕形成的医药组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及内容是有关于一种医药组合物，其用于一个有需要的个体以减少疤痕的形成。该医药组合物包含三种核酸及其药学上可接受的载体。本发明还涉及一种降低在一个有需要的个体减少疤痕的形成的方法。

Description

一种用于减少疤痕形成的医药组合物和方法
技术领域
本发明涉及内容是有关于用以减少一个个体的疤痕的医药组合物及方法。更具体来说，本发明涉及内容是有关于一种包含三种核酸的混合物的用途，其是可用以减少疤痕的形成。
背景技术
皮肤为人类最大的器官，可保护内部器官/组织免于外在环境的伤害。大多数人都有过皮肤受伤的经验，不论是源自于外伤、烧伤、其它外部物理因素，或是因压力、静脉淤滞(venous stasis)及糖尿病等疾病所造成。伤口治疗的主要目的包含使伤口快速愈合以及再生出外观良好的皮肤组织。然而，伤口愈合是一种涉及多种因子互动参与的动态过程，因此即便目前相关产业对于细胞及分子生物领域已有相当了解，肥厚性(hypertrophic)疤痕的发生率依旧偏高。肥厚性疤痕常会导致功能障碍及心理疾病，且往往产生更高的医疗费用。
已知胎儿的伤口是以几近完美而无疤的方式愈合。通过探讨胎儿及成人皮肤伤口愈合的差异，或可界定出参与疤痕形成过程的重要因子。在众多参与的因子中，转化生长因子(transforming growth factor-beta,TGF-β)于伤口愈合及疤痕形成过程中扮演着关键角色。
TGF-β是一种细胞激素(cytokine)，在生物系统中，广泛地调控细胞生长、分化、凋亡、纤维化及发育等过程。一般来说，TGF-β是以不易察觉的(latent)形式被分泌出来，再通过第一型TGF-β受体(TGF-βreceptor type I,TGFBRI)及第二型TGF-β受体(TGFBRII)进行蛋白分解而活化。人类的TGF-β具有三种同型异构式(isoforms)：TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3；该些同型异构式的功能彼此重迭，且主要是透过细胞内的SMAD路径来产生效用。在皮肤伤口愈合的过程中，已知TGF-β1与免疫抑制、纤维母细胞迁移及生长、伤口收缩、肉芽组织形成、胶原蛋白合成及堆积、血管新生及上皮再次形成(re-epithelialization)有关。研究胎儿及成人伤口中TGF-β同型异构式的个别表达可发现，在成人伤口会出现较高量的TGF-β1量，在胎儿伤口则是TGF-β3表达量较高，意即TGF-β1可能会在成人伤口造成疤痕的形成，而TGF-β3的表达增高则使胎儿伤口以无疤痕形式愈合。
相关领域已设法利用抗-TGF-β1抗体或靶向至TGF-β1的siRNA来降低伤口位置的TGF-β1的表达量，期望藉此达到无疤痕的愈合目标。然而，TGF-β/SMAD讯息传递路径牵涉到众多传递讯息的中间分子，且伤口愈合是一种需要不同分子参与的多阶段过程。因此，仅仅减低TGF-β1的表达量并无法产生令人满意的疗效。举例来说，在缺乏TGF-β1的老鼠(TGF-β1-deficient mice)中，全层伤口(full-thickness wounds)在早期可以正常地愈合；然而，TGF-β1的缺陷在晚期却会导致发炎进而阻碍伤口愈合。另外，相对于免疫缺陷(immuno-deficient,Scid-/-)却仍保有野生型的Tgfb1对偶基因(allele)的小鼠，缺乏T及B细胞的TGF-β1基因剔除鼠(knockout mice)(即Tgfb1-/-Scid-/-小鼠)，其伤口愈合时间约会延迟一周(Crowe M et al.,J.Invest.Dermatol,2000,115,3–11)。
有鉴于此，相关领域需要一种能减少疤痕形成的有效治疗方式或组合物。
发明内容
发明内容旨在提供本发明涉及内容的简化摘要，以使阅读者对本发明涉及内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明涉及内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施方式的重要/关键组件或界定本发明的范围。
在一方面中，本发明是有关于一种医药组合物，其是用于一个有需要的个体以减少该个体身上的疤痕。该医药组合物包含三种能靶向到人类第一型TGF-β受体(TGF-βreceptor type I,TGFBRI)基因的核酸。
依据本发明涉及内容不同的实施方式，所述医药组合物包含有效量的第一、第二及第三核酸，以及其药学上可接受的载体(carrier)。三种核酸可以是核糖核酸(ribonucleic acids,RNAs)或脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acids,DNAs)。在三种核酸为RNAs的情况下，所述三种核酸的序列分别包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ IDNO.3所示的序列。在三种核酸为DNAs的情况下，所述三种核酸的序列分别包含对应于SEQID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3的DNA序列。
在本发明涉及内容的某些实施方式中，医药组合物更包含一种转染(transfection)有效量的转染试剂。转染试剂的范例包含阳离子脂质或可穿透细胞的(cell-penetrating)多肽。
依据某些实施方式，第一核酸、第二核酸及第三核酸中至少有一种核酸是建构于一个病毒载体中。举例来说，病毒载体可以是腺相关病毒(Adeno-associated virus)载体或慢病毒(lentivirus)载体。在不同实施方式中，三种核酸可以分别建构至三个独立的病毒载体中；或者是，三种核酸可以建构至同一病毒载体中；或者是，三种核酸中的二种可以建构至同一病毒载体，而另一种则建构至一个不同的病毒载体。
依据本发明涉及内容不同的实施方式，第一核酸、第二核酸及第三核酸可以是小干扰核糖核酸(small interference ribonucleic acids,siRNAs)、小发夹核糖核酸(small hairpin ribonucleic acids,shRNAs)或微核糖核酸(micro-ribonucleic acids,miRNAs)。
在本发明涉及内容的某些实施方式中，第一核酸、第二核酸及第三核酸是siRNAs，其中第一、第二及第三核酸的正链(sense strand)分别具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示的序列。
在另一方面，本发明涉及内容在需要治疗的患者身上降低疤痕形成的方法。所述方法使用靶向TGFBRI基因的三种核酸。
在本发明涉及内容的某些实施方式中，所述方法包括向患者投予有效量的第一、第二及第三核酸的步骤。所述三种核酸的序列分别包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQID NO.3所示的序列，或者是其对应的DNA序列。
在本发明涉及内容的某些选择的实施方式中，所述方法进一步包括向患者投予转染有效量的转染剂的步骤。在不同的实施例中，siRNAs混合物可于投予转染试剂之前、同时或是之后投予。
根据不同的实施例，所述转染剂和siRNAs混合物可以制成单一或各自的剂型。
根据本发明涉及内容的不同的实施例，所述转染剂可以是一种或多种阳离子脂质、聚合物或可穿透细胞的多肽。
在参阅下文实施方式并结合附图后，本领域技术人员当可较好了解本发明的特点及优点。
附图说明
为让本发明能更明显易懂，所附图的说明如下：
图1为依据本发明涉及内容实施例1所阐明的人类肥厚性疤痕纤维母细胞(humanhypertrophic scar fibroblasts)于第3天的TGFBRI相对mRNA表达柱状图(n＝3)；
图2为依据本发明涉及内容实施例1所阐明的western blot代表图，其是为人类肥厚性疤痕纤维母细胞于第5天的TGFBRI及GAPDH蛋白表达；
图3为依据本发明涉及内容实施例1所呈现的以控制组siRNA(scrambled siRNA)或siTGBRI混合物(siTGFBRI-mix)进行转染5天后，TGFBRI的免疫荧光染色代表图；
图4为依据本发明涉及内容实施例2所阐明的以siTGBRI混合物或控制组siRNA转染人类肥厚性疤痕纤维母细胞后第3、7及10天的生长曲线(n＝5)；
图5为依据本发明涉及内容实施例2所阐明的以siTGBRI混合物或控制组siRNA转染人类肥厚性疤痕纤维母细胞，在有或无TGF-βI刺激下，第3、7及10天的生长曲线(n＝5)；
图6为依据本发明涉及内容实施例3所阐明的人类肥厚性疤痕纤维母细胞于第3天的不同基因的相对mRNA表达柱状图(n＝5)；
图7为依据本发明涉及内容实施例3所阐明的以控制组siRNA或siTGBRI混合物进行转染7天后，利用酶连结免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)来分析细胞分泌第一型胶原蛋白的结果(n＝5)；
图8为依据本发明涉及内容实施例3所阐明的以控制组siRNA或siTGBRI混合物进行转染6天后，纤维粘连蛋白(fibronectin)的免疫荧光染色代表图；
图9为依据本发明涉及内容实施例4所阐明的兔耳于受伤后第6、10及14周的伤口肉芽组织代表图；比例尺＝500μm；
图10为依据本发明涉及内容实施例4所阐明的柱状图，其归纳了兔耳于受伤后第6、10及14周的温哥华疤痕量表(Vancouver scar scale)；
图11为依据本发明涉及内容实施例5所提供的皮肤切面代表图，其是为受伤后第6、10及14周所采集的疤痕组织(左图；比例尺＝2μm)，而皮肤切面的局部放大图则显示于中图及右图(比例尺＝100μm)；以及
图12为依据本发明涉及内容实施例5所阐明的柱状图，其总结了兔耳于受伤后第6、10及14周的疤痕增高指数(scar elevation index)。
具体实施方式
为了使本发明涉及内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
为求方便，此处将本说明书、实施例与附随申请专利范围中所用的某些词汇整理余下。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员惯用用法相同。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。同时，在此处“至少一”以及“一或多”等词汇当包含一、二、三或更多种。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。
除非本说明书另有定义，否则本文中核苷酸的标记方式依循一般原则，即左手端是5’-端，而右手端为3’-端。
在此说明书中，“减少(reduce,reducing)”一词对于疤痕形成而言，是指相对于无人为介入治疗时自然形成的疤痕来说，能降低疤痕形成的发生率、疤痕大小(以现有或未来评估方法)、疤痕面积或疤痕体积。
“一种有效量(an effective amount)”一词在本文是指一种药物的用量足以产生所需要的疗效反应。具体的有效量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方。有效量亦指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。或者是，有效量亦可以医药组合物中活性成份的浓度来表示，例如摩尔浓度(molar concentration)、重量浓度(mass concentration)、体积浓度(volume concentration)、重量摩尔浓度(molality)、摩尔分数(mole fraction)、重量分数(mass fraction)及混合比例(mixingratio)。
具体来说，本文中用以形容核酸的“有效量(effective amount)”一词，是指足以减少一个个体疤痕形成的核酸量。相似地，“一种转染有效量(a transfection-effectiveamount)”是指足以造成核酸有效转染的转染试剂的用量。
于本说明书中，“一种药学上可接受的载体(a pharmaceutically acceptablecarrier)”是指一种物质，其适用于人类及/或动物而不会产生过度的有害副作用(如毒性、刺激及过敏反应)，具有一种适当的效益/危害比。另外，各载体必须为“可接受的”(acceptable)，即与该药剂组合物的其余成分兼容。载体可以是固态、半固态、液态稀释液、膏状物或胶囊的形式。
“载体”(carrier)一词此处是指任何惰性(inert)物质(例如粉末或液体)，其是能成为本发明涉及内容的核酸的载具(vehicle)/赋形剂(excipient)。载体可以是任何于医药业中已知可用以制备医药组合物的物质，例如填充剂、稀释剂、黏着剂、黏结剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
“应用”(application)或“投予”(administration)在此为可互换的词汇，皆是用以阐述将本发明的核酸或包含本发明核酸的医药组合物提供至一个体，以减少或改善疤痕的方法。依据本发明涉及内容不同的实施方式，局部的投予、局部的注射及透过皮肤来传送为常见的传送路径。举例来说，本发明涉及内容的核酸或医药组合物是局部投予至个体的皮肤，通过将核酸或医药组合物涂抹至靶向处(例如皮肤)来减少或改善疤痕的形成。
“个体(subject)”一词是指一种包含人类的哺乳动物，其可接受本发明的核酸、医药组合物及/或方法的治疗。除非特定指出单一性别，否则“个体”一词同时意指雄性及雌性。
本发明部份是基于发明人首次发现三种可靶向至人类TGFBRI基因(NM_004612.2)不同区域的混合物，其能于伤口愈合过程中减少疤痕的形成。特别是，组合使用三种siRNAs可较仅使用单一一种siRNA减少疤痕增加功效。因此，一方面，本发明涉及内容是有关于一种包含所述三种siRNAs的混合物。另外，该siRNA混合物依据本发明涉及内容可用以减少(包含预防)疤痕的形成；举例来说，其可用以制备(例如，包含于一种医药组合物中)一种可减少疤痕组织的药物。本发明的siRNA混合物及包含该siRNA混合物的医药组合物，亦可应用于一种用以减少疤痕形成的方法。因此，本发明涉及内容亦是有关于用以在一种有需要的个体上减少疤痕形成的方法。
依据本发明涉及内容的某些实施方式，三种siRNAs分别具有一种包含SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3的正链。siRNAs通常为具有平滑末端(blunt)、3’-凸出(overhang)或5’-凸出的双链形式。以下提供的操作例中，siRNAs为平滑末端，且siRNAs的负链(anti-sense strands)为相对于正链的完全互补。
如相关领域技术人员所知，可以通过siRNAs以外的核苷酸分子来沉默(silencing)或抑制mRNA的翻译(translation)，而该些核苷酸分子亦涵盖于本发明内容。举例来说，shRNA为一种RNA分子，其是通过一小段核苷酸所形成的间距(spacer)来连结正链及负链，因而形成一环形(loop)结构，且依据本发明涉及内容的实施方式，第一、第二及第三核酸可以是shRNAs，其中该些shRNAs的正链分别等同于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示的序列。在其它实施方式中，核酸是以miRNA或其前体(例如，pri-miRNA或pre-miRNA)的形式提供，且miRNA或其前体分别具有一种包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示的序列。或者，本核酸可以是任何双链或单链的负链寡核苷酸(oligonucleotides)，其是分别包含SEQ ID NO.1-3的序列(或相对应的DNA序列)。
在某些实施方式中，所述医药组合物可以进一步包含一种足以使siRNAs转染至靶(宿主)细胞的转染试剂。可以想见，转染试剂及siRNA混合物可以配制为单一制剂或独立制剂。另外，可通过一种或多种如电穿孔(electroporation)或磷酸钙的外来刺激处理靶细胞，以增加转染效率。
依据本发明涉及内容的某些实施方式，转染试剂可以是阳离子脂质。市面上可得的阳离子脂质包含，但不限定于OligofectamineTM、LipofectArnineTM及LipofectAmine2000TM(Invitrogen)。在某些实施方式中，转染试剂可以是能穿透细胞的多肽，例如PepMuteTM(SignaGen)、N-TERTM纳米粒子(N-TERTM Nanoparticle,Sigma-Aldrich)及DeliverXTM(Isogen)。
所述包含siRNAs的医药组合物还可以包含额外的成份，以稳定siRNA、延长siRNA的效期、促进siRNA的功效或将siRNA靶向至特定组织/细胞。
在可任选的实施方式中，可将包含于本医药组合物的三种核酸建构于一个或多个病毒载体上；例如腺相关病毒(Adeno-associated virus)载体或慢病毒(lentivirus)载体。在不同实施方式中，一个病毒载体可以带有三种核酸；或者是，一个以上的病毒载体分别带有三种核酸中的一种或二种。
依据本发明涉及内容不同的实施方式，可以将所述siRNA混合物(或者是shRNA混合物、miRNA混合物或一种或多种上述病毒载体；以下与此含义等同)或包含该混合物的医药组合物投予至一个个体；特别是，投予至该个体的特定靶位置，通过这种方法在伤口的愈合过程中改善疤痕的形成。举例来说，可以局部投予siRNA混合物或包含该siRNA混合物的医药组合物至一个个体的受伤部位。或者是，可以将siRNA混合物或包含该siRNA混合物的医药组合物配制为一种药剂形式，使该药剂在投予至个体的表皮后，能穿透皮肤到达位于真皮层的受伤部位。还可以是，可以局部注射siRNA混合物或包含该siRNA混合物的医药组合物至伤口位置。除了局部给予外，亦可通过诸如静脉注射等全身性地投予方式对该个体投予该siRNA混合物或包含该siRNA混合物的医药组合物，再循环至受伤组织部位。在该些例子中，医药组合物可以非必要地包含一种或多种载体，以改善siRNA混合物于局部或全身性的传送过程。
依据本发明涉及内容可任选的实施方式，用以减少疤痕形成的方法更包含投予个体一种转染有效量的转染试剂。在不同的实施方式中，siRNA混合物可于投予转染试剂之前、同时或是之后投予。在同时投予siRNA混合物及转染试剂的例子中，siRNA混合物及转染试剂可以配制为单一制剂或独立制剂。
下文举出多种实施例来阐明本发明的部分方面，以使本领域技术人员能实现本发明。因此不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。本领域技术人员基于此处的说明，当可在不需过度推衍的情形下运用本发明。此处提及的所有文献，皆视为已完全引用而成为本说明书的一部份。
实施例
材料及方法
培养人类肥厚性疤痕纤维母细胞
初代培养的人类肥厚性疤痕纤维母细胞(human hypertrophic scarfibroblasts,hHSF)是取自于5个皮肤检体(4位男性及1位女生，年龄分别介于36–86岁之间)。所有的皮肤检体皆为疤痕修复手术中的废弃疤痕组织。检体采集流程遵照三军总医院审查委员会(Institutional Review Board of Tri-Service General Hospital,Taipei,Taiwan,R.O.C.)的准则来执行，且告知各捐赠者经其同意后签署书面同意书。样本是依照下述步骤来进行。简单来说，先将样本切块，并以含有0.2％分离酶(Dispase II,RocheApplied Science,Mannheim,Germany)的Leibovitz's L-15培养液(Gibco,Grand Island,NY)进行分解以移除上皮组织。再将真皮层浸泡在含有0.05％胶原酶(collagenase)及10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Gibco)的改良伊格尔培养液(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium,DMEM,Gibco)中，置于37℃且含有5％CO2的环境下24小时。所得的细胞培养于含有10％FBS的DMEM中。每隔2–3天置换一次培养液。收集第3到6代的纤维母细胞进行下述实验。
siRNA转染
靶向TGFBRI的siRNA是参考BLOCK-iTTM RNAi Designer(Invitrogen,Carlsbad,CA)及NCBI-BLAST两种程序来设计。三种选定的siRNA双链(duplexes)(即，siTGBRI-a:GACAUCUAUGCAAUGGGCUUAGUAU(SEQ ID NO.1)；siTGBRI-b:GCAUCUCACUCAUGUUGAUGGUCUA(SEQ ID NO.2)及siTGBRI-c:AGUAAGACAUGAUUCAGCCACAGAU(SEQ ID NO.3))涵盖了人类TGFBRI mRNA(NM_004612.2)正链的不同区域。三种siRNA双链亦设计为可与兔子的TGFBRImRNA(XM_002708153.1)相吻合。该些靶向至TGFBRI的siRNA序列由Invitrogen委托合成。对照组则包含一种不具靶向专一性的控制组siRNA(scrambled siRNA,5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',MDbio,Taipei,Taiwan)。利用PepMute转染试剂盒(PepMutetransfection kit,SignaGen,Rockville,MD)，个别地或共同地将三种TGFBRI siRNAs及控制组siRNA反转染至纤维母细胞。简单来说，将TGFBRI siRNA混合物或单一个TGFBRI siRNA稀释于100μl的转染缓冲液后，加入1μl的PepMute试剂，再将混合物置于室温15分钟。将细胞以含有10％FBS的900μl的DMEM均匀分散后，种植于含有100μl的稀释siRNA双链体的6孔培养板(2×105细胞/孔)中，置于含有5％CO2的37℃环境。siRNA的最终浓度为60nM，此浓度为经测试后所决定出的最佳浓度。24小时后，以含有5％FBS且有或无添加2ng/ml TGF-βI(Invitrogen)的DMEM置换培养液。五种hHSF细胞株以相同步骤进行处理。
分离、反转录及以实时定量聚合酶连锁反应定量RNA
经siRNA转染72小时后，分析细胞的基因表达。先利用RNeasy Mini kit(QiagenGmbH,Hilden,Germany)来分离总RNA。通过NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE)来测定RNA的质与量。再以MultiScript高通量cDNA反转录试剂盒(MultiScript High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，Applied Biosystems,Foster City,CA)将RNA转换为cDNA。使用 Probe Assay kit(Qiagen)来进行实时定量聚合酶连锁反应(quantitative real-time PCR)以分析TGFBRI及3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的基因表达量。关于第一型胶原蛋白(Type I collagen)、第三型胶原蛋白(Type III collagen)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及纤维粘连蛋白的基因表达，是以适当的引子(表1)及Power SYBR Green PCR master mix(Invitrogen)来进行定量，而GAPDH的基因表达在此则是作为组间对照之用。TaqMan实时定量聚合酶连锁反应及SYBR Green实时定量聚合酶连锁反应皆是以LightCycler 480System(Roche Applied Science)来进行测定及分析。
表1
以western blot法来分析TGFBRI的蛋白表达量
以western blot法来分析经TGFBRI siRNA转染5天后，细胞内TGFBRI的蛋白表达量。先以含有蛋白酶抑制剂(protease inhibitors,Roche Applied Science)的Pro-Prep蛋白萃取溶液(Pro-Prep protein extraction solution,Intron,Seoul,Korea)来溶解细胞。将蛋白萃物注入4-20％不同浓度的凝胶(gradient gel,Bio-Rad,Hercules,CA)后，再将其转印(transferred)至PVDF膜上。以兔抗人TGFBRI抗体(GeneTex,San Antonio,TX)及作为组间对照的鼠抗GAPDH抗体(GeneTex,San Antonio,TX)对PVDF膜进行免疫检测。再将膜浸置于适当且结合HRP的二抗中，以活化后续的化学发光底物(chemiluminescentsubstrate,Visual protein,Taipei,Taiwan)。最后以UVP BioImaging System(UVP,Upland,CA)来检测及定量蛋白表达量。
纤维母细胞增殖试验
利用细胞计数套组-8(Cell Counting Kit-8,Boster Biological Technology,Wuhan,China)来定量纤维母细胞的增生。简单来说，将这些由5种皮肤检体取得的hHSF种植于96孔板(5×103细胞/孔洞)，并予以三次重复实验，而后再投予如上所述的60nM的TGFBRIsiRNAs。投予一天后，以包含或不包含2ng/ml TGF-βI的细胞培养液置换培养液。每二天置换一次培养液。于投予后的第3、7及10天，先于不含酚红(phenol red)的90μl DMEM中加入10μl CCK-8溶液，再一起加至各孔洞。培养1小时后，在450nm纪录吸光值。
以酶连免疫吸附法来分析第一型胶原蛋白
为测定以TGFBRI siRNA转染后的纤维母细胞上清液中第一型胶原蛋白的表达量，将经siRNA转染的纤维母细胞培养于含有2ng/ml的TGF-βI的培养液中，而后置于37℃、5％CO2环境培养。每隔一天置换一次培养液。于第7天时，收集培养液，并利用酶连免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)来检测上清液，其中酶连免疫吸附法是使用人类第一型胶原蛋白酶连结免疫吸附套组(human collagen Type I ELISA kit,BlueGene,Shanghai,China)来进行。通过分光光度计(Bio-Rad)在450nm来纪录吸光值，并佐以标准曲线来计算。所有的测定皆是于5种hHSF细胞株中，以三次重复实验来进行，且以μg/mL作表示。
动物模型
饲养于国防医学院动物中心的成年纽西兰白兔(Adult New Zealand whiterabbits)购买自动物卫生研究所(New Taipei City,Taiwan)。所有手术操作方式及实验流程皆经由国防医学院动物中心及使用委员会认证许可。将六个月大的兔子(3–3.5公斤)由肌肉打入舒泰(zoletil,1mg/kg)及赛拉嗪(xylazine,3mg/kg)予以镇定处理，再吸入1.5–4％的异氟烷(isoflurane)进行麻醉。在实验操作过程中，施予凯妥普洛芬(Ketoprofen,10mg/kg)作为止痛剂。于每耳的凹面侧切割四个1.8×1.8平方公分且移除软骨膜(perichondrium)的全层皮肤缺损伤口。以凡士林纱布覆盖伤口，并以弹性绷带(CoBan,3MHealthcare,St Paul,MN)加以固定，二周的复原期间，除非伤口发生感染，否则不需更换敷布。依此步骤会在第14天于伤口的边缘形成约5mm的肉芽组织。将总计88个伤口分成TGFBRIsiRNA治疗组及对照组。在以TGFBRI siRNA治疗的组别中，在受伤后的第2、3及4周分别于各伤口的肉芽处注入240pmol的TGFBRI siRNAs，其溶于含有2.5μl的PepMute试剂的40μl转染缓冲液中。对照组除了不投予siRNA之外，其余操作步骤皆相同。在注入siRNA前，先以上述方式使动物镇定。于皮肤缺损手术后的第6、10及14周，以温哥华疤痕量表(Vancouver scarscale,VSS)(Fearmonti,R.,Bond,J.,Erdmann,D.&Levinson,H.(2010).A review of scarscales and scar measuring devices.Eplasty 10:e43.)来评估伤口的修复程度。最后将动物以过量麻醉的方式予以犠牲后，收集其疤痕检体。疤痕检体依序以10％福尔马林固定、再以石蜡包埋、切为5μm薄片后置于玻璃玻片上，最后以梅森三色染色法(Masson'strichrome stain,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行染色。利用疤痕增高指数(scarelevation index,SEI)(Kloeters,O.,Tandara,A.&Mustoe,T.A.(2007).Hypertrophicscar model in the rabbit ear:a reproducible model for studying scar tissuebehavior with new observations on silicone gel sheeting for scarreduction.Wound Repair Regen 15Suppl 1:S40-45.)来评估皮肤增厚的程度。
统计分析
所有结果皆表示成平均值±标准差。以单向(one-way)ANOVA进行统计分析。除非说明书另有定义，否则p值小于0.05即代表具有统计上的显著差异(P<0.05)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实施例1
TGBRI siRNA混合物可减少TGFBRI的基因表达
在此实施例中，人类肥厚性疤痕纤维母细胞是以60nM的siTGBRI-a、siTGBRI-b、siTGBRI-c或控制组siRNA，或是包含siTGBRI-a、siTGBRI-b及siTGBRI-c的60nM的siTGBRI混合物进行转染。依据上述步骤，于第3天利用定量反转录PCR分析来确认TGFBRI的基因表达。将以控制组siRNA转染的细胞的mRNA量定量为1，第1图所显示的数据是以对照组及各治疗组间的倍数差异来表示。
如第1图所示，不论是单独或是合并投予，三种siRNAs皆可显著降低TGFBRI基因的mRNA表达量。然而，本发明发现相较于三种siRNAs个别的单一投予，siRNA混合物(siTGBRI-mix)更能有效地抑制TGFBRI的mRNA表达。换言之，将三种siRNAs合并投予能产生协同效应(synergistic effect)。再者，统计分析显示，以siTGFBRI混合物治疗的组别与任一种以单一siRNA治疗的组别的差异相当显著。因此，该协同效应乃是本领域相关现有技术所无法轻易达成或推知的结果。
western blot分析(第2图)及免疫荧光染色(第3图)亦进一步确认siTGFBRI混合物可减少TGFBRI的蛋白表达量。
实施例2
TGBRI siRNA混合物可抑制人类皮肤纤维母细胞的增生
在以siRNA转染后的第3、7及10天，分析这些以不同浓度(15、60或150nM)siTGBRI混合物进行转染的人类肥厚性疤痕纤维母细胞的细胞增生情形。如第4图所示，投予15-150nM的siTGBRI混合物能有效抑制纤维母细胞增生。在转染后的早期(例如第一周)，siTGBRI混合物的浓度并不会显著地影响抑制效果；然而，于转染后10天，可观察到与剂量相关地抑制作用，其中较高浓度的siTGBRI混合物可对纤维母细胞的增生产生较佳的抑制作用。
另外，以60nM的siTGBRI混合物或60nM的控制组siRNA转染人类肥厚性疤痕纤维母细胞后，选择性地加入TGF-βI(2ng/ml)。第5图总结了在转染后第3、7及10天，各组的细胞数量。通过比较投予“控制组siRNA+TGF-βI”及“siTGBRI混合物+TGF-βI”的组别，可发现投予siTGBRI混合物，可显著地抑制纤维母细胞增生。
实施例3
降低TGFBRI可抑制ECM生成
细胞外基质(extracellular matrix)的形成需要不同的中间分子及成份参与其中，例如第一型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、纤维粘连蛋白及结缔组织生长因子。在此实施例中，为了解上述蛋白的相对mRNA表达量，以60nM的siTGBRI混合物或控制组siRNA转染人类肥厚性疤痕纤维母细胞，并外加或不外加TGF-βI处理，利用实时定量聚合酶连锁反应于转染72小时后进行分析。将以控制组siRNA转染且以TGF-β1刺激(正对照组)的初始的细胞的mRNA定量为1，第6图的结果是以各组相对于正对照组的倍数差异来表示。
第6图的结果显示，相较于投予“控制组siRNA+TGF-βI”的组别，投予“siTGBRI混合物+TGF-βI”组别的第一型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、纤维粘连蛋白及结缔组织生长因子的mRNA表达皆会明显下降。
在以siRNA转染后的第7天，收集细胞的培养液，且以ELISA来分析细胞分泌的第一型胶原蛋白。如第7图的ELISA结果显示，以siTGBRI混合物转染可大幅降低第一型胶原蛋白于纤维母细胞中的生成。
第8图为纤维粘连蛋白的免疫荧光染色照片。如第8图所示，于转染后6天可观察到以siTGBRI混合物进行转染可减少ECM中的纤维粘连蛋白。
有鉴于此，投予siTGBRI混合物可减少转染的纤维母细胞中ECM的生成。
实施例4
TGFBRI siRNA混合物可在活体中减少肥厚性疤痕的形成
在受伤后的2、3及4周，将siTGBRI混合物注入兔子耳朵受伤部位的肉芽组织。再于受伤后的6、10及14周对该些愈合组织进行摄影。
在第9图中，相较于对照组的伤口，投予siTGBRI混合物的兔子的伤口愈合较佳。具体来说，接受siTGBRI混合物的兔子的疤痕面积及疤痕体积皆较对照组小许多。另外，由疤痕的愈后颜色更浅来看，投予siTGBRI混合物的兔子的伤口亦较不具有色素沉淀。
利用温哥华疤痕量表(Vancouver scar scale,VSS)来评估伤口的修复程度，第10图总结这些结果。VSS是评估修复组织的血管分布、高度/厚度、柔韧性及色素沉淀，且已广泛使用于治疗的评估及烧伤研究的测量。依据VSS量表，0级代表完美或接近完美的愈合组织。第10图的结果证实投予siTGBRI混合物可有效改善活体的肥厚性疤痕的形成。
实施例5
TGFBRI siRNA混合物可在活体中减少胶原蛋白的堆积
于受伤后的6、10及14周分离这些接受上述实施例4治疗的兔子疤痕组织，并以上述的“材料及方法”步骤制备组织切片。
第11图提供了代表性的修复组织显微照片。如第11图所示，接受siTGBRI混合物治疗的组别，其胶原蛋白(蓝色部份)会较不密集，显示投予siTGBRI混合物可显著地减少胶原蛋白于修复组织的堆积。
更进一步利用疤痕增高指数(scar elevation index,SEI)来评估修复组织。SEI为一种组织测量，其是用以量测疤痕相对于正常疤痕组织的高度。各疤痕的肥厚程度为总创伤区域相对于正常组织的组织高度比，其中SEI为1时表示疤痕的高度没有增加。第12图总结了SEI结果，该结果指出接受siTGBRI混合物治疗的兔子，其疤痕相较于对照组的兔子，疤痕增加的高度较少。
当可理解上述实施方式与实施例仅为例示，且本领域技术人员可对其进行各种修饰。上文提出的说明书、实施例与数据的目的在于使本说明书的结构完备，并作为实现本发明的例示。虽然本发明涉及内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明涉及内容，任何本领域技术人员，在不脱离本发明涉及内容的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明涉及内容的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

Claims (20)

1.一种用于减少疤痕形成的医药组合物，包含：
一种有效量的第一核酸，其中所述第一核酸的序列包含SEQ ID NO.1所示的序列或与其相对应的DNA序列；
一种有效量的第二核酸，其中所述第二核酸的序列包含SEQ ID NO.2所示的序列或与其相对应于的DNA序列；
一种有效量的第三核酸，其中所述第三核酸的序列包含SEQ ID NO.3所示的序列或与其相对应的DNA序列；以及
一种药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的医药组合物，更包含一种转染有效量的转染试剂。
3.如权利要求2所述的医药组合物，其中所述转染试剂为一种阳离子脂质或一种可穿透细胞的多肽。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其中所述转染试剂包含一或多种可穿透细胞的多肽。
5.如权利要求1所述的医药组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸中至少有一个是建构于病毒载体中。
6.如权利要求5所述的医药组合物，其中所述病毒载体为一种腺相关病毒载体或一种慢病毒载体。
7.如权利要求5所述的医药组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸分别建构于三个病毒载体中。
8.如权利要求1所述的医药组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸为小干扰核糖核酸、小发夹核糖核酸或微核糖核酸。
9.如权利要求8所述的医药组合物，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸为小干扰核糖核酸。
10.一种用于减少有需要个体的疤痕形成的方法，包含以下步骤：
对所述个体投予：一种治疗有效量的第一核酸，其中所述第一核酸的序列包含SEQ IDNO.1所示的序列或与其相对应的DNA序列；一种治疗有效量的第二核酸，其中所述第二核酸的序列包含SEQ ID NO.2所示的序列或与其相对应的DNA序列；以及一种治疗有效量的第三核酸，其中所述第三核酸的序列包含SEQ ID NO.3所示的序列或与其相对应的DNA序列。
11.如权利要求10所述的方法，还包含以下步骤：对所述个体投予一种转染有效量的转染试剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中在将所述第一核酸、所述第二核酸与所述第三核酸投予所述个体之前或之后，将所述转染试剂投予所述个体。
13.如权利要求11所述的方法，其中在将所述第一核酸、所述第二核酸与所述第三核酸投予所述个体的同时，将所述转染试剂投予所述个体。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述转染试剂为一种阳离子脂质或一种可穿透细胞的多肽。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述转染试剂包含一种或多种可穿透细胞的多肽。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸中至少有一个是建构于一个病毒载体中。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述病毒载体为一种腺相关病毒载体或一种慢病毒载体。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸分别建构于三个病毒载体中。
19.如权利要求10所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸为小干扰核糖核酸、小发夹核糖核酸或微核糖核酸。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸及所述第三核酸为小干扰核糖核酸。
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