CN101249267A - 可溶性转化生长因子-β受体基因在治疗皮肤瘢痕中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可溶性转化生长因子－β受体基因，应用于皮肤瘢痕的治疗。该基因是可溶性转化生长因子－β受体II型和III型受体基因，制备(1)提取人皮肤成纤维细胞的RNA，进行RT－PCR反应，克隆hsTβRII和hsTβRIII基因序列；(2)将hsTβRII和hsTβRIII基因序列构建入质粒载体pVAX1，形成重组质粒表达载体pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII；(3)将重组质粒转染COS－7细胞，检测目的基因的转录、表达以及目的蛋白的功能；(4)将pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII混合后注射于局部皮肤，用电穿孔的方法转染后作线性切口，观察切口部位基因表达和瘢痕的形成状况。hsTβRII和hsTβRIII基因能在一定程度上抑制创伤修复过程中瘢痕的形成，而使用质粒载体pVAX1，便于临床应用。
Description
技术领域
本发明属基因在治疗疾病中的应用领域，特别是涉及基因在治疗皮肤瘢痕中的应用。
背景技术
皮肤瘢痕是整形外科中最常见的疾病，也是医学界尚未克服的一大难题。除烧伤或严重创伤后继发的瘢痕及挛缩可导致功能障碍外，单纯的线状瘢痕也可严重损坏病人的容貌造成严重的心理障碍。对于此类疾病，整形外科近百年来的治疗方法仍然是手术切除瘢痕，然而术后造成的新的伤口在其愈合过程中又导致了新的瘢痕形成。
创伤愈合是一个包括多种细胞和因子相互作用的动态过程。皮肤的愈合过程主要包括炎症反应、组织增生和组织重塑这三个在时间上互有重叠的阶段。和皮肤创伤修复密切相关的生长因子主要是表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)和转化生长因子-β(TGF-β)。在创伤愈合的各个阶段，这些因子作用于不同时相的炎症细胞和修复细胞，影响细胞的迁移、增殖分化、细胞外基质合成和分泌等功能，其中TGF-β起着较为重要的作用。
上世纪90年代初，Longaker等在胚胎羊皮肤伤口愈合的实验中证实了胚胎羊伤口的无瘢痕愈合，提示即使在高等哺乳类动物中，伤口愈合并不一定要以瘢痕形成为代价。有关胚胎伤口无瘢痕愈合的机理涉及多个方面，但最为重要的因素是胚胎伤口中极低的TGF-β表达。实验结果证实胚胎无瘢痕愈合期的伤口中TGF-β及其受体的表达量远低于瘢痕形成期的伤口组织。更重要的是当人为的将TGF-β注射入胚胎伤口内可以使原本无瘢痕愈合的伤口转化为瘢痕愈合的伤口。与此相反，增生性瘢痕组织及其成纤维细胞的TGF-β1和TGF-β1受体的表达量远远高于正常皮肤组织及其成纤维细胞，瘢痕疙瘩细胞TGF-β及TGF-β受体的表达量也远远高于正常成纤维细胞。Koch等发现敲除TGF-β1基因小鼠的线性切口炎症反应明显减轻，伤口上皮化过程加快，伤口面积明显小于正常小鼠。Achcroft等进一步在敲除Smad3基因小鼠的线性切口中也证实了上述发现，表明阻断TGF-β信号转导可以减轻伤口炎症反应和促进上皮化，从而减少伤口的瘢痕形成。上述两项研究从理论上证实了从基因水平干预TGF-β的作用将有助于抑制伤口瘢痕形成的可行性，所以研究者普遍认为，抑制TGF-β的活性可能会成为治疗瘢痕增生的有效途径。
早在1992年，Shah等人就通过中和TGF-β活性减少了成年大鼠伤口的瘢痕形成，其后他们进一步证实了采用TGF-β中和抗体能够抑制大鼠皮肤瘢痕形成。其他一些学者也通过中和抗体或反义核苷酸等来对抗TGF-β的作用，从而抑制组织的纤维化。另一种抑制TGF-β活性的方法是采用截短型受体，我们研究小组先前的研究表明，利用截短型TGF-βII型受体可以阻断瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β的信号转导，降低其TGFβ1的自分泌，并证实截短型受体的过表达能够明显减少动物伤口瘢痕的形成。
可溶性受体和截短型受体类似，都缺乏膜受体的胞内段。可溶性受体是膜受体的代谢产物，具有与配体结合的位点，却因缺乏跨膜区和胞内段而无法传递信号。从阻断TGF-β效应的角度出发，可溶性TGF-β受体可能会较截短型受体更加有效地对抗TGF-β的功能，因为在基因转染过程中很难使所有细胞都得到转染，部分未转染的细胞将仍旧可能导致瘢痕形成，但可溶性受体不会被固定在细胞表面，而是分泌到细胞外主动结合尚未抵达细胞表面的TGF-β，可以使转染和未转染的细胞TGF-β信号转导均得到抑制。已有文献报道了将可溶性TGF-βII型受体重组蛋白用于肠道纤维化疾病治疗的实验研究，证明这种方法有较强的可行性。
TGF-β在哺乳类动物有TGF-βI、TGF-βII和TGF-βIII三种亚型。其中，TGF-βI和-βII为最主要的致瘢痕形成亚型。就与TGF-β结合能力而言，可溶性TGF-βII型受体能较好地与TGF-βI和TGF-βIII结合，而可溶性TGF-βIII型受体则与TGF-βII有较强的亲和力。瘢痕形成过程中，TGF-βII被认为与TGF-βI1有着同等重要的致瘢痕作用，因此，联合应用两种可溶性受体可能会起到更好的治疗作用。
尽管腺病毒介导的截短型TGF-βII型受体皮肤转染能够显著减少动物瘢痕的形成，但腺病毒的临床应用尚存在一定的安全性问题。相对于病毒载体而言，质粒载体是较为安全的基因治疗载体，在国外，利用质粒DNA作为疫苗注射的方法已经得到广泛的开展并可在伤口愈合过程中起作用，国际上利用质粒注射进行疾病的基因治疗已经较多临床报道，并被证实为安全有效。
本研究采用美国FDA批准可用于基因疫苗的质粒载体pVAX1介导可溶性TGF-βII型受体和III型受体转染动物伤口，证明其具有抑制线性切口瘢痕形成的作用。目前国际上尚没有可溶性转化生长因子-β受体基因治疗皮肤瘢痕的报道和应用。
发明内容
本发明的目的是在于应用质粒介导的人可溶性TGF-βII型受体(hsTβRII)和人可溶性TGF-βIII型受体(hsTβRIII)阻断TGF-β胞内信号传导，抑制伤口瘢痕形成。
本发明的可溶性转化生长因子-β受体基因应用于皮肤瘢痕的治疗。
所述的可溶性转化生长因子-β受体基因是可溶性转化生长因子-β受体II型和III型受体基因。
所述的可溶性转化生长因子-β受体基因的制备方法，包括：
(1)提取人皮肤成纤维细胞的RNA，进行RT-PCR反应，克隆hsTβRII和hsTβRIII基因序列；
(2)将hsTβRII和hsTβRIII基因序列构建入质粒载体pVAX1，形成重组质粒表达载体pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII；
(3)将重组质粒转染COS-7细胞，检测目的基因的转录、表达以及目的蛋白的功能；
(4)将pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII混合后注射于局部皮肤，用电穿孔的方法转染后作线性切口，观察切口部位基因表达和瘢痕的形成状况。
所述的RT-PCR反应中，hsTβRII基因的上游引物序列为5′-GCTGGGGGCTCGGTCTATGA-3′，下游引物序列为5′-ACTAGTCAGGATTGCTGGTGTTATA -3′，hsTβRIII基因的上游引物序列为5′-CCAAGCTTGCTAAAGTGACTGGACGAGACG-3′，下游引物序列为5′-GCGAATTCTCAGTCCAGACCATGGAAAATTGG-3′，hsTβRII基因的PCR反应条件为95℃3min变性；95℃1min、62℃45s、72℃ 45s为一个循环，共27个循环；72℃延伸5min；hsTβRIII反应条件为95℃3min变性；95℃1min、66℃ 1min、72℃ 3min为一个循环，共27个循环；72℃延伸5min；
所述的pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII混合是等摩尔混合。
hsTβRII和hsTβRIII基因能在一定程度上抑制创伤修复过程中瘢痕的形成，将可溶性受体基因克隆入适合人类基因治疗的质粒载体pVAX1，是为了便于将来可能的临床应用。
附图说明
图1是可溶性转化生长因子-β受体基因在治疗皮肤瘢痕中的应用的技术路线；
图2是小儿包皮成纤维细胞中的hsTβRII和hsTβRIII基因的RT-PCR扩增序列电泳图；
图3是PCR鉴定pVAX1/hsTβRII和PstI酶切鉴定pVAX1/hsTβRIII电泳图；
图4是hsTβRII和hsTβRIII在转染的COS-7中过表达(RT-PCR)；
图5是hsTRII和hsTβRIII在转染的COS-7中过表达(Western blot)；
图6是可溶性受体在转染的COS-7中过表达。(a)pVAX1/EGFP转染(直接观察荧光)，(b)a的明视野，(c)pVAX1/hsTβRII转染(免疫细胞化学染色)，(e)pVAX1/hsTβRIII转染(免疫细胞化学染色)；(b，d)对照(原始放大倍数：×100)；
图7是在转染的COS-7细胞培养基中可溶性受体表达升高(Elisa)；
图8是转染的COS-7细胞上清可减轻TGF-β对MvlLu细胞生长的抑制；
图9是转染的基因在大鼠伤口内过表达(RT-PCR)；
图10是大体观察和组织学显示实验组瘢痕形成少于对照组，(原始放大倍数：×40)，Ctrl是对照组，Exp是实验组；
图11是大鼠瘢痕面积定量分析，Ctrl是对照组，Exp是实验组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取第5代小儿包皮皮肤成纤维细胞，提取RNA，进行hsTβRII和hsTβRIII基因的RT-PCR反应。PCR反应体系为：ddH2O12.65μl，25mM MgCl22μl，10×逆转录缓冲液2μl，10mM dNTP 0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，RT反应产物2μl，20pmol/μl目的基因上下游引物各0.3μl。hsTβRII基因的上游引物序列为5′-GCTGGGGGCTCGGTCTATGA-3′，下游引物序列为5′-ACTAGTCAGGATTGCTGGTGTTATA-3′，hsTβRIII基因的上游引物序列为5′-CCAAGCTTGCTAAAGTGACTGGACGAGACG-3′，下游引物序列为5′-GCGAATTCTCAGTCCAGACCATGGAAAATTGG-3′。hsTβRII基因的PCR反应条件为95℃3min变性，95℃1min、62℃45s、72℃ 45s为一个循环，共27个循环，72℃延伸5min；hsTβRIII反应条件为95℃3min变性，95℃1min、66℃1min、72℃3min为一个循环，共27个循环，72℃延伸5min。凝胶电泳结果见附图2，以DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。
pVAX1表达质粒载体与DNA片断的摩尔比为1∶3设计10μl连接反应体系，转化感受态细菌，制备pVAX1/sTβRII重组质粒和pVAX1/sTβRIII重组质粒，分别用克隆引物进行PCR反应和PstI单酶切鉴定，结果见附图3。
按照转染试剂FuGENE6与重组质粒DNA的体积与质量比3∶1设定转染体系，其中实验组分别加入重组质粒pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII，对照组加入pVAX1/EGFP质粒。提取COS-7细胞RNA，进行RT-PCR、Western blot、免疫化学染色检测、培养基中目的蛋白的检测及可溶性受体中和TGF-β实验，结果见附图4、5、6、7、8。
4周SD大鼠在质粒注射之前腹腔内注射2.5％的戊巴比妥钠200微升麻醉大鼠，进行背部皮肤脱毛，第2天进行质粒注射。在每只大鼠背部距脊柱中线两侧1cm处各设计1个质粒注射点，左侧为对照pVAX1/EGFP，右侧为实验(pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsT βRIII等摩尔混合)。注射后5min，用ECM830电穿孔仪以800V/cm，6个方波，每个持续20ms，脉冲间隔为200ms的条件进行注射部位皮肤的电穿孔，与皮肤接触的卡钳电极约1cm×1cm，在电穿孔前将电极放置冰中预冷，电穿孔后立即冰敷电穿孔部位皮肤，以避免电穿孔损伤皮肤。在电穿孔后的第24hrs，在电穿孔部位作一个长1cm的全层皮肤切口，用镊子轻夹使其自然闭合。第2天取材进行RT-PCR检测(图9)，14天取材进行组织学检测(图10)、创伤面积测量(图11)，结果证实hsTβRII和hsTβRIII能在一定程度上抑制创伤修复过程中瘢痕的形成。
Claims (5)
1.可溶性转化生长因子-β受体基因应用于皮肤瘢痕的治疗。
2.根据权利要求1所述的可溶性转化生长因子-β受体基因应用于皮肤瘢痕的治疗，其特征在于：该基因是可溶性转化生长因子-β受体II型和III型受体基因。
3.根据权利要求1所述的可溶性转化生长因子-β受体基因应用于皮肤瘢痕的治疗，其特征在于：所述的可溶性转化生长因子-β受体基因的制备方法是(1)提取人皮肤成纤维细胞的RNA，进行RT-PCR反应，克隆hsTβRII和hsTβRIII基因序列；(2)将hsTβRII和hsTβRIII基因序列构建入质粒载体pVAX1，形成重组表达质粒pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII；(3)将重组质粒转染COS-7细胞，检测目的基因的转录、表达以及目的蛋白的功能；(4)将pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII混合后注射于局部皮肤，用电穿孔的方法转染后作线性切口，观察切口部位基因表达和瘢痕的形成状况。
4.根据权利要求3所述的可溶性转化生长因子-β受体基因应用于皮肤瘢痕的治疗，其特征在于： 所述的RT-PCR反应中，hsTβRII基因的上游引物序列为5′-GCTGGGGGCTCGGTCTATGA-3′，下游引物序列为5′-ACTAGTCAGGATTGCTGGTGTTATA-3′；hsTβRIII基因的上游引物序列为5′-CCAAGCTTGCTAAAGTGACTGGACGAGACG-3′，下游引物序列为5′-GCGAATTCTCAGTCCAGACCATGGAAAATTGG-3′。hsTβRII基因的PCR反应条件为95℃ 3min变性，95℃1min、62℃45s、72℃45s为一个循环，共27个循环，72℃延伸5min；hsTβRIII反应条件为95℃3min变性，95℃1min、66℃1min、72℃3min为一个循环，共27个循环，72℃延伸5min。
5.根据权利要求3所述的可溶性转化生长因子-β受体基因应用于皮肤瘢痕的治疗，其特征在于：所述的pVAX1/hsTβRII和pVAX1/hsTβRIII混合是等摩尔混合。
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|---|---|---|---|---|
| WO2015135138A1 (en) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | Yi-Wen Wang | Pharmaceutical composition and method for reducing scar formation |
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2007
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080827 |