JP2010508854A - 幹細胞移植の後の生着を改善するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
I.概観
幹細胞および前駆細胞(stem and progenitor cell)(SPC)は再生されかつ特定の生物学的シグナルが特定の細胞型もしくは組織型へと上記細胞を分化するように誘導するまで、発生的潜在能力を維持する。成人幹細胞および前駆細胞(adult stem and progenitor cell)(ASPC)は、誕生後に生物の組織において保持される小さなSPC集団であり、生涯にわたって連続的に再生される。インビトロコロニーアッセイは、骨髄(BM)、動員末梢血(MPB)、および臍帯血(UCB)はすべて種々のASPCを含むことを実証した。骨髄は、多分化能(multipotential)ASPCが特に豊富である。
本明細書に記載される細胞集団は、広く種々の処置プロトコルのために使用され得る。このプロトコルにおいて、身体の組織または器官は、これら細胞集団の生着、移植もしくは注入によって、増大させられるか、修復されるかまたは置換される。本明細書において使用される場合、「処置」とは、有益なもしくは望ましい臨床結果(すなわち、「治療的応答」)を得るためのアプローチである。本発明の目的に関して、有益なもしくは望ましい臨床結果としては、検出可能であろうと、検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の事象の減少、疾患の安定化(すなわち、悪化していない)、疾患進行の遅延もしくは鈍化、上記疾患状態の改善もしくは軽減、および寛解(部分的であろうと完全であろうと)が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」とはまた、処置を受けていないかまたは異なる処置(すなわち、単一の細胞用量のみ、または24時間より長く間隔を空けて複数の細胞用量、または本明細書に包含されないいくつかの他の処置)を受けている場合に予期される生存と比較して、長期の生存を意味し得る。「処置」とは、治療的処置および予防的(prophylactic or preventative)手段の両方に言及する。処置を必要とするものは、障害を既に有するもの、および上記障害が予防されるべきものを包含する。疾患を「緩和」するとは、処置も異なる処置もない状況と比較して、疾患状態の程度および/または望ましくない臨床的発現が少なくされるか、そして/あるいはその進行の時間的推移が鈍化されるかまたは短縮されることを意味する。代表的には、上記「処置」は、上記被験体に、有効な幹細胞および前駆細胞を付加的に投与して、組織(特に、造血細胞)を再生する工程を包含する。
本発明の方法は、一般に、同種異系幹細胞治療の使用を包含する。同種異系細胞治療は、悪性疾患およびウイルス背得疾患のいくつかのタイプの重要な治癒力のある治療である。同種異系細胞治療は、被験体への細胞の注入もしくは移植(この注入もしくは移植される細胞は、上記被験体以外のドナーに由来する)を包含する。同種異系細胞治療プロトコルに利用されている同種異系ドナーのタイプとしては、以下が挙げられる:HLAがマッチしている同胞(sib)、マッチしていない血縁関係にないドナー、部分的にマッチしている家族構成員のドナー、血縁関係にある臍帯血ドナー、および血縁関係にない臍帯血ドナー。上記同種異系ドナー細胞は、通常、骨髄採取、末梢血回収または誕生時の胎盤の臍帯血回収によって得られる。
臍帯血は、任意の医療的にまたは薬学的に受容可能な様式で回収され得る。臍帯血の回収のための種々の方法が、記載されている。例えば、Coe,米国特許第6,102,871号;Haswell,米国特許第6,179,819 B1号を参照のこと。UCBは、例えば、血液バッグ、移動用バッグ(transfer bag)、または滅菌プラスチックチューブに回収され得る。それらから由来するUCBまたは幹細胞は、投与のために単一の個体(すなわち、単一単位として)から回収されたのと同様に貯蔵され得るか、またはその後の投与のために他の単位とともにプールされ得る。
本発明の種々の実施形態において、少なくとも上記第2の細胞集団は、ASPCについて富化される。いくつかの実施形態において、上記第1の細胞集団および上記第2の細胞集団はともに、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知の富化方法のうちの1つ以上を(任意の組み合わせにおいて)使用して富化される。本明細書で使用される場合、用語「富化される」または「富化」とは、細胞集団におけるASPC数と組み合わせて使用される場合に、ASPCの総数が操作されていない細胞集団と比較したか、または本明細書で開示されていない様式によって操作された集団と比較したときに、上記細胞集団中の総細胞数と比例して、一定であるかまたは増大されていることを意味する。
本発明の方法において有用な細胞集団は、種々の治療レジメンおよび診断レジメンにおける適用を有する。それら細胞集団は、好ましくは、被験体への投与の前に、適切なキャリア(例えば、緩衝化生理食塩水)中に希釈される。上記細胞は、任意の生理学的に受容可能なビヒクルにおいて投与され得る。細胞は、患者の臨床的管理を促進するために、中心線を介して、注射、カテーテルなどによって、従来どおり、血管内に投与される。この投与経路は、肺血管系を介して、最初の通過循環(pass circulation)に細胞を送達する。通常、少なくとも約1×105個細胞/kgおよび好ましくは、約1×106個細胞/kg以上が、上記第1の細胞集団において、または上記第1の細胞集団および上記第2の細胞集団の組み合わせで、投与される。例えば、Sezerら(2000)J.Clin.Oncol.18:3319およびSienaら(2000)J.Clin.Oncol.18:1360を参照のこと。望ましい場合、さらなる薬物(例えば、5−フルオロウラシルおよび/または増殖因子)がまた、同時に導入され得る。適切な増殖因子としては、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−3、IL−6、IL−11、G−CSF、M−CSF、GM−CSF、γ−インターフェロン、およびエリスロポエチン)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の細胞集団は、有益なサイトカインの分泌および/または幹細胞増殖、ホーミングもしくは分化を誘導するシグナルを送達し得る細胞表面タンパク質の提示が挙げられるが、これらに限定されない任意の手段によって、生着を支援または高める他の細胞集団と組み合わせて投与され得る。これらの実施形態において、上記第2の細胞集団のうちの100%未満が、富化された幹細胞を含む。
本発明の方法における第1の幹細胞集団および第2の幹細胞集団の使用によれば、上記ドナー細胞の免疫学的拒絶を低下させるために上記宿主を処置し得る(例えば、米国特許第5,800,539号(1998年9月1日発行);および米国特許第5,806,529号(1998年9月15日発行)に記載されるもの(これらはともに、本明細書に参考として援用される))。
被験体における治療応答をモニターするための方法は、被験体における、総合的かつ事象なしの生存、血小板生着、ANC生着、疾患の再発などのうちの1種以上の評価を包含する。処置に対する応答は、適切なコントロールに対して比較され得る。これら応答をモニターするための方法は、当該分野で周知であり、本明細書において例示される。
実施例1:血縁関係にないミスマッチのUCB移植後の免疫再構築
免疫再構築は、UCB移植の約100名の生存者において評価し、650日間のメジアン(範囲は121〜2450日間)で追跡した。この研究の結果は、Kleinら(2001)Biol Blood and Marrow Trans 7:454−466において見いだされ得る。簡潔には、機能的パラメーターおよび免疫表現型パラメーターは、移植後3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、24ヶ月および36ヶ月で、移植した患者の末梢血においてアッセイした。患者を、一般に、移植後最初の3ヶ月間にわたってメチルプレドニゾロン(methyprednisolone)、および移植後最初の1年間にわたってシクロスポリンで維持した。移植後2年間および3年間に、免疫化を再び設けた。活動性の慢性のGvHDがない全ての生存している患者は、通常のCDC推奨に従って、死滅ワクチンおよび生ワクチンの完全な量(full complement)を受けた。乳児および2歳齢未満の幼児は、CD4数およびPHA応答によって測定される場合、移植後6ヶ月までにT細胞免疫機能を回復した。2歳〜12歳の小児は、移植後9〜12ヶ月までに同様の機能を回復した。対照的に、ティーンエイジャーおよび成人は、移植後3年までに免疫機能を回復した。上記宿主の胸腺は、上記UCB移植片からの免疫再構成に寄与するようである。患者が若くかつ胸腺が健康であるほど(例えば、移植前に放射線に曝露されていない)、胸腺の回復はより早くかつ上記移植片からの免疫再構築により早く寄与する。小児は、移植後1年までに正常化した一方で,成人は、移植後3年で年齢に対する正常の下限に近づいた。その間に、成人は、末梢機構によってT細胞を再構築した。より早い免疫再構築を有するそれらの患者は、全体的に、移植でより好転した。彼らは、移植後最初の2〜4ヶ月で、日和見感染症を発症させる可能性が低かった。この分類の患者は、優れた生存を有した。CD4細胞%は、日和見感染症なしという最良の予測変数であった(p=<0.001)。
臍帯血移植研究(COBLT)(複数施設の、見込みのある、NIHにより支援された、血縁関係にないドナー臍帯血移植の治験)からの最近の結果は、UCBTの分野をさらに進化させた。Kurtzbergら.(2005)Biology of Blood and Marrow Transplantation 11(2):2(abst 6);Kurtzbergら.(2005)Biology of Blood and Marrow Transplantation 11(2):82(Abst 242)を参照のこと。
移植のために選択された臍帯血単位を、細胞、ヘスパン(hespan)および10% DMSOの合計25mlで、2区画の低温保存バッグ(20%/80% 分割)中に保存する。移植の−5日目に、その20%(5ml)画分を、液体窒素から取り出し(手順 5D.160.01)、どろどろした粘稠性になるまで37℃で融解する。デキストラン/アルブミンを添加して、最初の容積の4倍に希釈し、上記細胞を洗浄し、ペレット化し、ALDESORT(登録商標)アッセイ緩衝液/100U/ml DNase I(Aldagen,Inc.,Durham,NC)中に再懸濁する。赤血球 対 白血球の比を、<1x10e8個細胞/mlに調節する。上記細胞は、細胞を標識するために、EASYSEP(登録商標)(StemCell Technologies)抗グリコホリンAおよびCD14カクテルで除去した系統である。上記標識した細胞を、EASYSEP(登録商標)磁性ナノ粒子と混合し、室温で10分間インキュベートする。次いで、上記サンプルを、系統陽性細胞を除去するEASYSEP(登録商標)磁性に露出する。残っている系統除去細胞を、コニカルチューブの中へと穏やかに吸引する。RBC:WBC比をチェックすると、<1:10であるはずである。RBC:WBC比がより高ければ、上記EASYSEP(登録商標)除去を反復する。
上記系統除去細胞を、活性化ALDESORT(登録商標)試薬で染色し、37℃で15分間インキュベートする。上記反応を停止させ、コントロールを調製して、上記ALDHbr細胞を、FACSAriaソーター(BD Biosciences)での高速フローソーティングによって単離する。ALDHbr細胞を単離するための方法は、Stormsら,1999(前出)およびPCT公開番号WO 2005/083061(これらはともに、それらの全体が本明細書に参考として援用される)中により十分に記載される。上記細胞を凍結し得るか、または以下に記載されるようにすぐに注入し得る。
UCBのバッグを、フード下で無菌技術を使用して、実験室で融解する。上記UCBを37℃のウォーターバス中で融解し、5% アルブミン/デキストラン溶液[アルブミン25%(12.5gms/50ml)(500mlデキストラン中に25gms)]を使用して1:1容積まで希釈して、細胞生存性を保つ。上記5% アルブミン/デキストラン溶液を、ストップコック付き移動用バッグを使用して、上記融解したUCBにゆっくりと添加し、穏やかに混合する。上記融解しかつ希釈したUCBを次に秤量し、遠心分離する(4℃で2000rpm×20分間)。標本を、細胞数および生存性、培養、クローン産生性アッセイ、ならびに表現型のために得る。DMSOおよび上記アルブミン/デキストラン溶液を含む上清を除去し、上記UCBペレットを、5% アルブミン/デキストラン溶液を使用して1:1容積まで再び再懸濁する。上記UCBを患者同定情報で標識し、注入のためにベッドサイドに移動する。上記UCBを、上記患者の中心静脈カテーテルを介して、1〜3ml/分の速度で注入する。UCBを、インラインフィルターなしで注入し、照射しない。上記患者が胸部締め付けまたは他の症状を発生させる場合、注入の残りを続行する前に、短期間の休憩(1〜2分間)が必要とされ得る。大容積のUCB(>15ml/kg)が注入されるべきである場合、上記UCBの半分を注入し得、続いて、30分間の休憩がとられ、次いで、上記UCBのその残りが注入される。バイタルサインを、注入が完了して2時間後まで、15分ごとにとる。水和(2.5〜3.0ml/kg/時間)を、UCB注入が完了して12時間後にわたって維持する。容積過負荷または減少した尿排出が生じる場合、フロセミド(0.5〜1.0mg/kg/用量)を与える。
上記UCB細胞を融解し、ALDHbrを分類する(凍結前に分類されない場合)。0日目(移植日)に、従来のUCB移植片を注入して約4時間後、上記ALDHbr UCB細胞を採取し、計数し、生存性およびグラム染色についてチェックし、注入セットに接続し、注入のための骨髄移植ユニットへと運ばれる。
同種異系BMTを受けているALLを有する患者のための標準的細胞減少(cytoreduction)は、シクロホスファミド(100〜200mg/kg)および全身照射(TBI、1,000〜1440cGy)を包含する。これらのレジメンを用いると、事象のない生存率は、2回目の軽減において、ALLを有する小児の20〜45%および成人の20%で、およびマッチしている血縁関係のある同種異系BMTを受けているANLLを有する患者の最大60%で達成され得る。その後の軽減では、事象のない生存は、再発で移植した場合に治癒した患者のうちのわずか8%で減少する。ATGは、さらなる免疫抑制治療のために使用される;メチルプレドニゾロンは、患者がATGを許容できない場合の代わりになる。
同種異系BMTを受けている非悪性状態を有する患者についての標準的細胞減少は、4日間にわたってブスルファン16mg/kg(m2あたりの投与に対して小児患者について調節され、そして第1の用量PKによる目的レベルで追跡される)、4日間にわたってシクロホスファミド200mg/kgおよび3日間にわたってATG 90mg/kgを含む。このレジメンを使用する血縁関係のないドナー臍帯血による生着速度は、80〜90%の間に及ぶ。TBIは、後期の有害事象(例えば、増殖遅延、内分泌機能不全、認知障害、慢性肺疾患または心筋症)を最小にするために避けられる。
末梢血サンプルを、キメラ現象について+30日またはそのあたり、60日またはそのあたり、および100日またはそのあたりで試験する。骨髄吸引液および生検を、細胞質状(cellularity)およびドナーキメラ現象について、41〜44日目に、上記患者がこのときまでに好中球回復を示していなければ行う。次いで、血小板数、ANC、GvHD、および成功裏の生着の種々の他の臨床的指標を、当該分野で公知のように評価する。
Claims (20)
- 被験体における血液組織を再構築するための方法であって、該方法は、該被験体に、第1の細胞集団および第2の細胞集団を導入する工程を包含し、ここで該第2の細胞集団は、該第1の細胞集団の2時間後から24時間後に導入され、そして少なくとも該第2の細胞集団は生着する能力がある、方法。
- 前記第2の細胞集団は、前記第1の細胞集団の約4時間後に導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団の両方が生着する能力がある、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団は、臍帯血、骨髓、および動員末梢血(mobilized peripheral blood)からなる群より選択される供給源から由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団は、同じ供給源に由来する、請求項4に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団は、異なる供給源に由来する、請求項4に記載の方法。
- 前記被験体は、骨髓破壊(bone marrow ablation)後に造血再構築(hematopoietic reconstitution)の必要がある、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも前記第2の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の細胞集団は、前記第1の集団の約4時間後に導入される、請求項8に記載の方法。
- 癌を有する被験体における骨髄破壊性処置後の血液機能を回復させるための方法であって、該方法は、第1の細胞集団および第2の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第2の細胞集団は、該第1の細胞集団の2時間後から24時間後に導入され、少なくとも該第2の集団は生着する能力がある、方法。
- 少なくとも前記第2の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項10に記載の方法。
- 前記被験体は、癌治療に関連した後遺症のための処置が必要である、請求項10に記載の方法。
- 被験体における幹細胞集団の生着を強化するための方法であって、該方法は、第1の細胞集団および第2の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第2の細胞集団は、該第1の細胞集団の2時間後から24時間後に導入され、少なくとも該第2の集団は生着する能力がある、方法。
- 少なくとも前記第2の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項13に記載の方法。
- 前記被験体における好中球生着までの時間は、コントロール被験体における好中球生着までの時間と比較して短縮される、請求項13に記載の方法。
- 血小板生着までの時間は、コントロール被験体における血小板生着までの時間と比較して短縮される、請求項13に記載の方法。
- 遺伝性障害を有する被験体における骨髄破壊性処置後の血液機能を回復させるための方法であって、該方法は、第1の細胞集団および第2の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第2の細胞集団は、該第1の細胞集団の2時間後から24時間後に導入され、少なくとも該第2の集団は生着する能力がある、方法。
- 少なくとも前記第2の細胞集団は、成人幹細胞および前駆細胞が豊富である、請求項17に記載の方法。
- 癌を有する被験体における骨髄破壊性処置後の骨髄の幹細胞もしくは前駆細胞の活性を回復させるための方法であって、該方法は、第1の細胞集団および第2の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第2の細胞集団は、該第1の細胞集団の2時間後から24時間後に導入され、少なくとも該第2の集団は富化されたALDHbr幹細胞集団である、方法。
- 遺伝性障害を有する被験体における骨髄破壊性処置後の骨髄の幹細胞もしくは前駆細胞の活性を回復させるための方法であって、該方法は、第1の細胞集団および第2の細胞集団を該被験体に導入する工程を包含し、ここで該第2の細胞集団は、該第1の細胞集団の2時間後から24時間後に導入され、少なくとも該第2の集団は富化されたALDHbr幹細胞集団である、方法。
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