CN111748581B - 一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法，涉及细胞生物学技术领域。本发明提供的方法，包括：将树突状细胞、液体培养基、缺氧诱导因子重组表达质粒和脂质体溶液混合后，静置，得到转染体系混合液树突状细胞培养液；将所述转染体系混合液和液体培养基、细胞因子混合，得到混合物，将所述混合物进行培养，得到转染细胞。利用本发明提供的转染方法，通过将树突状细胞过表达Hif‑1α基因，可显著缩短树突状细胞成熟和活化所需时间，并且提高树突状细胞抗原提呈及对T细胞激活的能力。

Description

一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法。
背景技术
肿瘤是危害人类健康的最严重的慢性疾病之一。临床上治疗肿瘤主要通过手术切除、放化疗及靶向治疗等措施，但大部分患者在治疗后易出现复发和转移。近年来，随着医学和免疫学技术的发展，免疫治疗展现出根治肿瘤的潜力，使其成为当前肿瘤治疗领域最热门的研究方向。
树突状细胞(DC细胞)是目前已知最主要的抗原提呈细胞。DC细胞通过摄取肿瘤细胞表面相关抗原，通过自身表面组织相容性复合体I/II(MHCI/II)提呈至免疫效应细胞，同时细胞表面免疫共刺激分子CD80/86表达显著增高，结合初始T细胞，激活其免疫功能；此外，活化的DC细胞还能够通过分泌IL-12、IFN-γ等细胞因子，共同激活免疫，实现对肿瘤细胞的杀伤。
近年来，随着对肿瘤与肿瘤免疫相关研究的深入，DC细胞在免疫治疗中的作用逐步得以开发。然而目前还存在肿瘤细胞通常增殖迅速，对微环境中的营养和氧气掠夺较多，使微环境形成类似缺氧的现象，导致周围免疫细胞获取能量不足，抑制DC细胞生长和发挥功能的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法。利用本发明提供的转染方法，通过将DC细胞过表达Hif-1α基因，可显著缩短DC细胞成熟和活化所需时间，并且提高DC细胞抗原提呈及对T细胞激活的能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法，包括：将树突状细胞、液体培养基、缺氧诱导因子重组表达质粒和脂质体溶液混合后，静置，得到转染体系混合液；将所述转染体系混合液和液体培养基、细胞因子混合，得到混合物，将所述混合物进行培养，得到转染细胞；
所述树突状细胞的数量与液体培养基的体积比为(0.8～1.2)×106个:1mL；
所述缺氧诱导因子重组表达质粒为pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒；所述pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒的质量与液体培养基的体积比为(500ng～2μg):1mL；
所述脂质体溶液与液体培养基的体积比为(2～3μL):1mL。
优选地，所述液体培养基为无血清培养基。
优选地，所述细胞因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4。
优选地，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在混合物中的质量浓度为20～50ng/mL。
优选地，所述白细胞介素4在混合物中的质量浓度为10～25ng/mL。
优选地，所述混合培养采用二氧化碳细胞孵箱进行培养。
优选地，所述混合培养的时间为6d～8d。
优选地，所述混合培养至第7d时，还包括加入脂多糖，所述脂多糖在混合物中的浓度为100～200ng/mL。
优选地，所述脂质体包括Lipofectamine2000或TransLipidHL。
优选地，所述静置的时间为15～35min。
本发明提供了一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法。通过本发明的转染方法，使树突状细胞(DC)过表达突变后的Hif-1α(P402A/P564A)，在细胞稳定表达Hif-1α的情况下，可以显著缩短DC细胞成熟时间，并且使得DC细胞获得免疫激活能力的提升。
附图说明
图1为小鼠DC细胞体外培养结果图，其中A为显微镜观察细胞培养状态；B为细胞培养至第7日，LPS活化后，流式细胞术检测DC表面标志物分子CD-11c表达水平；C为ELISA检测DC细胞分泌细胞因子IL-12表达水平；
图2为RT-qPCR法检测转染后的DC细胞Hif-1a基因表达水平；
图3为转染后的DC细胞成熟、分化、分泌指标的检测；其中A为MTT法比较转染后DC细胞增殖速度；B为流式细胞术检测转染后DC细胞表面DC特异性分子CD-11c、活化标志CD80/CD86的表达水平变化；C-D为ELISA法检测转染后DC细胞分泌免疫活化性细胞因子IL-12、IFN-γ水平的变化。
具体实施方式
本发明提供了一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法，包括：将树突状细胞、液体培养基、缺氧诱导因子重组表达质粒和脂质体混合后，静置，得到转染体系混合液；将所述转染体系混合液和液体培养基、细胞因子混合，得到混合物，将所述混合物进行培养，得到转染细胞；所述树突状细胞的数量与液体培养基的体积比为(0.8～1.2)×106个:1mL；所述缺氧诱导因子重组表达质粒为pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒；所述pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒的质量与液体培养基的体积比为(500ng～2μg):1mL；所述脂质体溶液与液体培养基的体积比为(2～3μL):1mL。
在本发明中，所述树突状细胞(DC)优选为小鼠DC细胞；所述小鼠DC细胞优选采用以下提取分离方法，包括：将6～8周龄雌性小鼠，处死后进行消毒；在无菌状态下取双侧股骨，剪去骨头两端，取出骨髓细胞；过滤残余组织碎片，收集细胞悬液，去除红细胞；将悬液离心，弃去上层液体，用不含血清的细胞培养基重悬后，显微镜下细胞计数，按1×105～5×105个细胞/cm2接种至细胞培养皿，放置CO2细胞孵箱培养，加入细胞因子诱导骨髓细胞向DC细胞分化；每2d对细胞培养液进行半量换液，并按原浓度补足上述细胞因子；细胞培养至第7d，加入脂多糖(LPS)刺激DC细胞成熟。
在本发明中，所述消毒优选采用75％乙醇溶液进行消毒，所述消毒的时间优选为5min～15min，更优选为10min。
在本发明中，所述过滤残余组织碎片优选采用180目～220目，更优选为200目的筛网进行过滤。
在本发明中，所述去除红细胞优选采用红细胞裂解液去红细胞的方法。
在本发明中，所述细胞培养基优选为X-VIVO-15无血清培养基。所述X-VIVO-15无血清培养基为市售产品，瑞士LONZA公司生产，X-VIVO系列无血清培养基专用于免疫细胞的培养，型号有10、15、20等。在本发明实施例中使用的产品型号为X-VIVO-15。
在本发明中，所述CO2细胞孵箱培养的时间优选为5min～15min，更优选为10min。
在本发明中，所述离心优选转速为700rpm～900rpm，更优选为800rpm；所述离心时间优选为4min～6min，更优先为5min。
本发明在提取分离DC细胞中，所述细胞因子优选为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)；所述GM-CSF的质量浓度优选为20～50ng/mL，更优选为30～40ng/mL；所述IL-4的质量浓度优选为10～25ng/mL，更优选为15～20ng/mL。
在本发明所述转染方法中，所述树突状细胞的数量与液体培养基的体积比优选为(0.8～1.2)×106个:1mL，更优选为1×106个:1mL；所述液体培养基优选为无血清培养基，所述液体培养基为RPMI-1640细胞培养基(Sigma-aldrich公司)，不添加血清成分；主要成分含：四水合硝酸钙0.1g/L；硫酸镁(无水)0.04884g/L；氯化钾0.4g/L；碳酸氢钠2g/L；氯化钠6g/L；磷酸氢二钠(无水)0.8g/L；L-精氨酸0.2g/L；L-天冬酰胺0.05g/L；L-天冬氨酸0.02g/L；L-胱氨酸二盐酸盐0.0652g/L；L-谷氨酸0.02g/L；L-谷氨酰胺0.3g/L；甘氨酸0.01g/L；L-组氨酸0.015g/L；羟基-L-脯氨酸0.02g/L；L-异亮氨酸0.05g/L；L-亮氨酸0.05g/L；L-赖氨酸盐酸盐0.04g/L；L-甲硫氨酸0.015g/L；L-苯丙基氨酸0.015g/L；L-脯氨酸0.02g/L；L-丝氨酸0.03g/L；L-苏氨酸0.02g/L；L-色氨酸0.005g/L；L-酪氨酸二钠二水0.02883g/L；L-缬氨酸0.02g/L以及微量维生素等。在本发明实施例中优选为X-VIVO-15无血清培养基。
本发明所述缺氧诱导因子重组表达质粒为pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒；所述pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒的质量与液体培养基的体积比为(500ng～2μg):1mL，优选为(800～1500ng):1mL，更优选为1000ng:1mL。
本发明所述脂质体溶液与液体培养基的体积比为(2～3μL):1mL，优选为2.5μL:1mL。在本发明中，所述脂质体优选为Lipofectamine2000或TransLipidHL，所述脂质体采用常规市售产品即可。在本发明中，所述Lipofectamine2000，简称“Lipo2000”，是Thermofisher公司的一款产品，在具体操作时吸取具体体积的脂质体加入适量体积的细胞培养液中混匀即可。
在本发明所述转染方法中，所述细胞因子优选包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在混合物中的质量浓度优选为20～50ng/mL，更优选为30～40ng/mL；所述白细胞介素4在混合物中的质量浓度优选为10～25ng/mL，更优选为15～20ng/mL。
在本发明中，所述混合培养采用二氧化碳细胞孵箱进行培养，所述培养的温度为37℃，所述二氧化碳的体积浓度为5％。在本发明所述混合培养至第7d时，还优选包括加入脂多糖，所述脂多糖在混合物中的浓度优选为100～200ng/mL，更优选为130～160ng/mL。在本发明中，加入脂多糖的作用是刺激DC细胞的成熟。
在本发明所述转染方法中，所述培养的时间优选为6d～8d，更优选为7d。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、提取并分离小鼠DC细胞
取6～8周龄雌性C57品系小鼠，脱颈处死后使用75％酒精浸泡消毒10min；在无菌状态下取双侧股骨；剪去骨头两端，使用1ml一次性注射器灌注无菌1×PBS缓冲液，插入骨髓腔冲洗3次，冲出骨髓细胞。使用200目筛网滤过残余组织碎片，收集细胞悬液，加入5×红细胞裂解液，37℃、5％CO2细胞孵箱反应10min，裂解悬液中的红细胞；将悬液离心，800rpm/min，5min，弃去上层液体，用不含血清的细胞培养基(X-VIVO-15无血清培养基)重悬后，显微镜下细胞计数，按1×105个细胞/cm2接种至细胞培养皿，放置37℃、5％CO2细胞孵箱培养，加入20ng/ml的GM-CSF以及10ng/ml的IL-4诱导骨髓细胞向DC细胞分化.。每日观察细胞状态、形态并拍照。每2d对细胞培养液进行半量换液，并按原浓度补足上述细胞因子。细胞培养至第7d，加入100ng/ml的脂多糖(LPS)刺激DC细胞成熟(图1)。
2、DC细胞纯度及活性的鉴定
向上述培养第6日细胞培养基中添加LPS前及刺激24h后，收集足量细胞，采用流式细胞术检测细胞CD11c阳性比例及CD80/CD86表达活化水平；收集细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞分泌免疫激活细胞因子IL-12、IFN-γ水平。
3、DC细胞转染Hif-1α(P402A/P564A)基因
上述步骤1获取的DC细胞培养24h后，观察细胞状态，生长良好则可进行基因转染操作。按每培养皿1×106个细胞计算，取2个无菌EP管，分别加入500μl无血清培养基，1管加入2μg纯化的pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒，另1管加入2μl脂质体(Lipo2000)，分别轻轻振荡混匀，静置5min；后将这两管混合，轻轻震荡混匀，静置20min。
随后将细胞培养液轻轻吸出，无菌1×PBS缓冲液漂洗1次，重新加入步骤1的培养液和细胞因子，轻摇混匀，将培养皿放回37℃、5％CO2细胞孵箱继续培养。每日观察细胞生长状态，继续按1步骤所述要求对细胞培养液进行更新。
4、对转染效率进行鉴定
在细胞转染后的第1、4、7日分别收集部分细胞，提取细胞总RNA，采用实时定量PCR(RT-qPCR)法测定细胞Hif-1α表达水平(图2)。
5、转染后的DC细胞成熟、分化、分泌指标的检测
在96孔板中接种细胞，细胞转染后第1、3、5日采用MTT比色法检测，比较转染后的DC细胞增殖能力的变化；
在细胞转染后第5日分别收集部分细胞，采用流式细胞术检测细胞CD11c、CD80/CD86表达活化水平；在培养第7日收集细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞分泌免疫激活细胞因子IL-12、IFN-γ水平(图3)。
实施例2
1、提取并分离小鼠DC细胞
取6～8周龄雌性C57品系小鼠，脱颈处死后使用75％酒精浸泡消毒10min；在无菌状态下取双侧股骨与胫骨)；剪去骨头两端，使用1ml一次性注射器灌注无菌1×PBS缓冲液，插入骨髓腔冲洗4次，冲出骨髓细胞。使用200目筛网滤过残余组织碎片，收集细胞悬液，加入5×红细胞裂解液，37℃、5％CO2细胞孵箱反应10min，裂解悬液中的红细胞；将悬液离心，800rpm/min，5min，弃去上层液体，用不含血清的细胞培养基(X-VIVO-15无血清培养基)重悬后，显微镜下细胞计数，按5×105个细胞/cm2接种至细胞培养皿，放置37℃、5％CO2细胞孵箱培养，加入50ng/ml的GM-CSF以及25ng/ml的IL-4诱导骨髓细胞向DC细胞分化.。每日观察细胞状态、形态并拍照。每2d对细胞培养液进行半量换液，并按原浓度补足上述细胞因子。细胞培养至第7d，加入200ng/ml的脂多糖(LPS)刺激DC细胞成熟。
2、DC细胞纯度及活性的鉴定
向上述培养第6日细胞培养基中添加LPS前及刺激24h后，收集足量细胞，采用流式细胞术检测细胞CD11c阳性比例及CD80/CD86表达活化水平；收集细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞分泌免疫激活细胞因子IL-12、IFN-γ水平。
3、DC细胞转染Hif-1α(P402A/P564A)基因
上述步骤1获取的DC细胞培养24h后，观察细胞状态，生长良好则可进行基因转染操作。按每培养皿1×106个细胞计算，取2个无菌EP管，分别加入500μl无血清培养基，1管加入2μg纯化的pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒，另1管加入2μl脂质体(Lipo2000)，分别轻轻振荡混匀，静置5min；后将这两管混合，轻轻震荡混匀，静置20min。
随后将细胞培养液轻轻吸出，无菌1×PBS缓冲液漂洗1次，重新加入步骤1的培养液和细胞因子，轻摇混匀，将培养皿放回37℃、5％CO2细胞孵箱继续培养。每日观察细胞生长状态，继续按1步骤所述要求对细胞培养液进行更新。
4、对转染效率进行鉴定
在细胞转染后的第1、4、7日分别收集部分细胞，提取细胞总RNA，采用实时定量PCR(RT-qPCR)法测定细胞Hif-1α表达水平。
5、转染后的DC细胞成熟、分化、分泌指标的检测
在96孔板中接种细胞，细胞转染后第1、3、5日采用MTT比色法检测，比较转染后的DC细胞增殖能力的变化；
在细胞转染后第1、3、5日分别收集部分细胞，采用流式细胞术检测细胞CD11c、CD80/CD86表达活化水平；
收集细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞分泌免疫激活细胞因子IL-12、IFN-γ水平。
实施例3
提取并分离小鼠DC细胞
取6～8周龄雌性C57品系小鼠，脱颈处死后使用75％酒精浸泡消毒10min；在无菌状态下取双侧股骨；剪去骨头两端，使用1ml一次性注射器灌注无菌1×PBS缓冲液，插入骨髓腔冲洗4次，冲出骨髓细胞。使用200目筛网滤过残余组织碎片，收集细胞悬液，加入5×红细胞裂解液，37℃、5％CO2细胞孵箱反应10min，裂解悬液中的红细胞；将悬液离心，800rpm/min，5min，弃去上层液体，用不含血清的细胞培养基(X-VIVO-15无血清培养基)重悬后，显微镜下细胞计数，按2×105个细胞/cm2接种至细胞培养皿，放置37℃、5％CO2细胞孵箱培养，加入40ng/ml的GM-CSF以及20ng/ml的IL-4诱导骨髓细胞向DC细胞分化.。每日观察细胞状态、形态并拍照。每2d对细胞培养液进行半量换液，并按原浓度补足上述细胞因子。细胞培养至第7d，加入200ng/ml的脂多糖(LPS)刺激DC细胞成熟。
2、DC细胞纯度及活性的鉴定
向上述培养第6日细胞培养基中添加LPS前及刺激24h后，收集足量细胞，采用流式细胞术检测细胞CD11c阳性比例及CD80/CD86表达活化水平；收集细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞分泌免疫激活细胞因子IL-12、IFN-γ水平。
3、DC细胞转染Hif-1α(P402A/P564A)基因
上述步骤1获取的DC细胞培养24h后，观察细胞状态，生长良好则可进行基因转染操作。按每培养皿1×106个细胞计算，取2个无菌EP管，分别加入500μl无血清培养基，1管加入2μg纯化的pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒，另1管加入2μl脂质体(Lipo2000)，分别轻轻振荡混匀，静置5min；后将这两管混合，轻轻震荡混匀，静置20min。
随后将细胞培养液轻轻吸出，无菌1×PBS缓冲液漂洗1次，重新加入步骤1的培养液和细胞因子，轻摇混匀，将培养皿放回37℃、5％CO2细胞孵箱继续培养。每日观察细胞生长状态，继续按1步骤所述要求对细胞培养液进行更新。
4、对转染效率进行鉴定
在细胞转染后的第1、4、7日分别收集部分细胞，提取细胞总RNA，采用实时定量PCR(RT-qPCR)法测定细胞Hif-1α表达水平。
5、转染后的DC细胞成熟、分化、分泌指标的检测
在96孔板中接种细胞，细胞转染后第1、3、5日采用MTT比色法检测，比较转染后的DC细胞增殖能力的变化；
在细胞转染后第1、3、5日分别收集部分细胞，采用流式细胞术检测细胞CD11c、CD80/CD86表达活化水平；
收集细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定细胞分泌免疫激活细胞因子IL-12、IFN-γ水平。
由以上结果可知，通过转染Hif-1α(P402A/P564A)的DC细胞增殖速度快，且DC细胞特征性标志物CD11c表达纯度优于普通培养方式。通过免疫活化后，共刺激因子CD80/86的表达、免疫活化性细胞因子分泌的水平均超过未转染的DC细胞。具有显著的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种缺氧诱导因子重组表达质粒转染树突状细胞的方法，其特征在于，包括：将树突状细胞、液体培养基、缺氧诱导因子重组表达质粒和脂质体溶液混合后，静置，得到转染体系混合液；将所述转染体系混合液和液体培养基、细胞因子混合，得到混合物，将所述混合物进行培养，得到转染细胞；
所述树突状细胞的数量与液体培养基的体积比为(0.8～1.2)×106个:1mL；
所述缺氧诱导因子重组表达质粒为pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒；所述pcDNA3-Hif-1αP402A/P564A质粒的质量与液体培养基的体积比为(500ng～2μg):1mL；
所述脂质体溶液与液体培养基的体积比为(2～3μL):1mL；
所述脂质体包括Lipofectamine2000或TransLipid HL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为无血清培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在混合物中的质量浓度为20～50ng/mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述白细胞介素4在混合物中的质量浓度为10～25ng/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物进行 培养采用二氧化碳细胞孵箱进行培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物进行 培养的时间为6d～8d。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述混合物进行 培养至第7d时，还包括加入脂多糖，所述脂多糖在混合物中的浓度为100～200ng/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静置的时间为15～35min。
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